Degradación de Pentaclorofenol (PCP) a partir de hongo de pudrición blanca Phanerochaetes Chrysosporium. Bordon, Antonio [email protected] Universidad Tecnológica Nacional. Facultad Regional Villa María. Córdoba. Argentina. El pentaclorofenol (PCP) es un hidrocarburo halogenado de amplio espectro de toxicidad que se forma durante el proceso de manufactura del papel, su nombre químico es 2,3,4,5,6-pentaclorofenol. Comenzó a utilizarse por primera vez como conservante de la madera en la década de 1930 y se ha destinado a varias aplicaciones más (biocida, plaguicida, desinfectante, defoliante, agente contra la decoloración de, agente antimicrobiano y en textiles). El PCP se produce mediante la reacción de cloro con fenol a altas temperaturas en presencia de un catalizador. Durante el proceso de producción se generan contaminantes como, penta y hexaclorobenceno, dioxinas y furanos PCP no se utiliza o está prohibido en todos los Estados miembros de la Unión Europea, la India, Indonesia, Nueva Zelanda, la Federación de Rusa y Suiza. Solo está permitido utilizar PCP para conservar la madera, en Belice, el Canadá, y los Estados Unidos. Para México en adhesivos y en las industrias de curtido, papel y textil para. En nuestro país el uso de pentaclorofenol actualmente es de uso prohibido declarado por la Secretaria de Salud resolución MSN 356/1994 publicada en el Boletín Oficial del 05-ene-1995 Número: 28054 donde expone: se prohíbe la producción, importación, fraccionamiento, almacenamiento y comercialización del pentaclorofenol y sus derivados. La degradación del PCP puede producirse por fotólisis, que es la vía más rápida, así como por biodegradación. Existe mucha desinformación entre la población acerca de los riesgos que representa para la salud y el ambiente, el manejo inadecuado de estas sustancias. Los desechos contaminados con PCP se generan durante la producción industrial, el uso en la industria maderera y a partir de los sobrantes de la madera tratada y la incineración de los residuos de PCP. La EPA (Environmental Protection Agency) estimó que, de 1989 a 1993, ingresaron al ambiente alrededor de 52 toneladas provenientes principalmente de la industria de explosivos (43 %), preservación de madera (20 %) y el resto, de otras industrias (37%) distribuidos 48 % en el suelo, 45 % en sedimentos, 5.5 % en el agua y 1.4 % en el aire. El PCP es un compuesto lipofílico, persistente y acumulable y está considerado como uno de los contaminantes orgánicos prioritarios desde 1977. En el ser humano puede ingresar por las vías oral, dérmica y respiratoria, tiende a acumularse en el hígado, riñones, cerebro y grasa. A largo plazo puedo provocar anemia y leucemia. un aumento significativo en la incidencia de infecciones por alteración al sistema inmunológico, no se han realizado estudios correctos, pero se estima que es un probable cancerígeno tendiendo a incrementar riesgos de sarcomas del tejido suave y de linfoma. Este compuesto tiene una dosis letal de 27 a 211 mg/kg. Causa irritación de las membranas mucosas, piel y ojos. La penetración por la piel puede ser la forma de exposición más dañina: se conocen alrededor de 50 casos de envenenamiento con PCF, 30 de los cuales fueron mortales. La inmersión de una mano humana en una solución al 0.4% de PCF durante 10 minutos causa dolor e inflamación Es resistentes a la degradación biológica lo que los hace muy persistentes en el ambiente y permite que sus residuos sean arrastrados por el agua de lluvia, se adhieran a las partículas del suelo o incluso ingresen directamente en las fuentes de agua En el suelo, tiene una vida media en el suelo superior a los 5 años y se calcula que contiene un 48 % del PCP que se ha liberado en el ambiente. En el medio acuático, las condiciones más favorables para la biodegradación del pentaclorofenol, la aportan la luz, los valores altos de pH y la elevada concentración de oxígeno disuelto. Para condiciones aeróbicas se han informado tiempos de vida medios en el rango 12,8 – 18,6 días; para la condición anaeróbica se ha reportado un tiempo de vida medio igual a 79,8 día, es más persiste en los sedimentos que en la columna de agua, lo cual está asociado a la lentitud de la biodegradación anaeróbica. Las concentraciones de PCP detectadas en el agua están por debajo de las concentraciones que se consideran tóxicas (1 µg/L). Tabla 1 Concentraciones de PCP detectadas en el medio ambiente. El PCF es un hidrocarburo clorado, con la siguiente estructura química: Fig. 1 PROPIEDADES FÍSICAS y Datos: Apariencia: A temperatura ambiente, el PCF es cristalino, incoloro, sólido, con un olor fenólico. El color puede variar de blanco a café oscuro, dependiendo de la pureza del compuesto. Número CAS: 87-86-5 Peso Molecular: 266.34 Solubilidad en agua: 80 mg/L Solubilidad en otros solventes: acetona, alcoholes, éter y benceno. También en éter de petróleo, tetracloruro de carbono y parafinas. Punto de Fusión: 191°C En la naturaleza existen muchas estructuras químicas que son resistentes, en mayor o menor grado, a la degradación microbiológica en suelos y aguas. Estos compuestos, considerados como recalcitrantes, pueden entrar en la biosfera, a través de procesos naturales, biológicos, o a través de las actividades industriales del hombre. Se ha encontrado que hongos pertenecientes al grupo de los basidiomicetos poseen enzimas que oxidan compuestos fenólicos. A pesar de los beneficios que nos ofrecen estas enzimas, los microorganismos que las producen son de lento crecimiento. El uso de los hongos para la degradación de tóxicos mas adecuado son los basidiomicetos los denominados de pudrición blanca. El Phanerochaetes chrysosporium hongo de pudrición blanca capaz de degradar compuestos xenobióticos (sustancias que no se producen naturalmente) como el pentaclorofenol, el benzopireno y el trifenilmetano, gracias a un sistema enzimático extracelular. El sistema enzimático de los hongos basidiomicetos son ligninolíticos, formado principalmente por peroxidasas, es capaz de degradar tanto la lignina como otros compuestos tóxicos. La lignina es un compuesto natural que estando en la tierra se degrada muy lentamente, se estima que son necesarios unos 60 años para la perdida del 99% de su carbono en forma de dióxido de carbono. Es el segundo polímero natural más abundante, después de la celulosa, y ambos forman parte de la madera, esta imparte la rigidez y disminuye la permeabilidad de las paredes celulares de los vegetales, así como la invasión microbiana de sus tejidos. La celulosa y lignina se degradan en la naturaleza por la acción de enzimas en conjunción con las celulasas. Sin embargo, la mayoría de los microorganismos de origen microbiano utilizados experimentalmente en procesos de degradación no tienen un efecto significativo sobre la lignina. La degradación de la lignina no pudo ser investigada mientras no se dispuso de los primeros modelos de la estructura de este polímero. La primera aportación importante al conocimiento de la estructurá de la lignina, como heteropolímero formado por la condensación enzimática de los alcoholes hidroxicinamnicos, procede de los estudios de biosíntesis en la década del 70. El grupo de organismos más eficiente en la degradación de la madera es el de los basidiomicetos, que metabolizan todos los polímeros estructurales (celulosa, hemicelulosa y lignina), a los que convierte en CO2, agua y biomasa En la degradación enzimática de la lignina intervienen una serie de reacciones inespecíficas que originan la formación de radicales libres en el biopolímero y dan como resultado la desestabilización de los enlaces y finalmente la ruptura de la macromolécula En el laboratorio se ha demostrado que Polyporus anceps y Coriolus Versicolor degradan a un 50% la lignina, pero los máximos valores obtenidos son para el Phanerochaete chrysosporium, registrando porcentajes de degradación del 90% en 2-3 meses en condiciones controladas. Este basidiomiceto degradó la madera hasta un 62 % de pérdida de peso en 6 meses, en condiciones naturales de temperaturas alrededor de 22°C mientras que otras en las mismas condiciones no superaban el 6%. Las primeras identificaciones de este hongo se realizaron en 1974 (Burdsall y Eslyn), anterior mente se lo llamaba de otra manera dado a su forma imperfecta, se estudio en distintos medios de cultivo para determinar la cinética variando las temperaturas, se emplearon agar malta, agar gálico y agar tánico. Se obtuvieron relaciones de temperaturas vs crecimiento promedio: Tabla 2 Temperatura 12ºC 16ºC 20ºC 24ºC 28ºC 32ºC 36ºC 40ºC 44ºC 50ºC Crecimiento (radio /dia) 2-3 mm 3-5 mm 9-13 mm 14-19 mm 18-24 mm 26-32 mm 30-36 mm 35-42 mm 28-33 mm 0-6 mm Phanerochaete chrysosporium. es un hongo termotolerante, con una temperatura óptima de crecimiento de 39°C, pudiendo crecer desde los 12 a los 50 °C. Fig. 2. Cultivos de Phanerochaete chrysosporium cultivados a 25C, 5. en agar de malta después de tres días crecimiento. 6. En agar de ácido gálico después de una semana. 7. En agar de ácido tánico después de una semana. El Panerochaete chrysosporium ataca a la madera de manera que las hifas progresan a través de las conexiones existentes entre las células (vasos, poros , etc), penetran atravesando las paredes, causando la degradación de la celulosa, desorganizando las fibras. En laboratorio, la descomposición de la lignina requiere una fuente de carbono, sea celulosa o glucosa, ya que el crecimiento con lignina, como una fuente de carbono fue despreciable o nulo. (Kirk 1976), también se observó que había un efecto inhibidor de la fuente de nitrógeno por encima de la concentración de 2mM ya sea de origen NO3-, NH4+ o aminoácidos. Se produjo un incremento en la degradación aumentando la eficiencia entre un 200% en una atmosfera de 100% de oxígeno respecto al aire, observando una inhibición en la agitación y la necesidad de presencia de tiamina como única vitamina para el crecimiento. La degradación de la lignina ocurre solo en la fase estacionaria y de autolisis, lo que sugiere que es un proceso metabolito secundario (Kirk 1977). La composición de lignina, celulosa y hemicelulosa va dependiendo del tipo de planta, los rangos mas comunes son: Celulosa 38-58%; Hemicelulosa 23-32% y lignina 1525%. La estéreo irregularidad de la lignina la hace muy resistente a los ataques enzimáticos, hace difícil que sea degradada por enzimas intracelulares. aromáticos polímero. que forman este Dado que las peroxidasas ligninolíticas requieren una fuente de H202 extracelular, la producción enzimática de este compuesto ha sido también investigada. Al menos dos oxidasas extracelulares, glioxal oxidasa y arilalcohol oxidasa han sido relacionadas con la generación de H202 durante la degradación enzimática de la lignina. Pese a esto, el sistema enzimático extracelular del hongo Phanerochaete chrysosporium la degrada produciendo una zona coloreada alrededor del micelio en agar que contienen taninos o sustratos fenoliticos. La degradación es llevada a cabo por una batería de enzimas extracelulares, oxidasa y peroxidasas interviniendo en la despolimerización de la compleja estructura de la lignina. La existencia de enzimas de tipo peroxidasa involucradas en la degradación de la lignina por P. chrysosporium, fue descrita por primera vez en 1983. Un año después del descubrimiento de la LiP, y colaboradores describieron una segunda peroxidasa ligninolítica, denominada Mn-peroxidasa (MnP) El ataque a la estructura química de esta, requiere de enzimas no especificas que oxiden los anillos Fig. 3 Estructura de la lignina: Su estructura esta basada en tres moléculas precursoras: alcohol cumarçílico( unidad 4-hidroxicinamil) ,alcohol coniferilicov(unidad 4hidroxi-3metoxicinamil) y alcohol sinapilico (unidad 3,5-dimetoxi4hidroxiciminail). Un esquema general de las diferentes enzimas involucradas y reacciones producidas durante la degradación de la lignina se presenta en la figura 4. La formación de un radical catiónico aromático (a,b) que posteriormente evoluciona de diferentes formas (c-f), es el primer paso en este proceso. Las reacciones incluidas en el esquema son las siguientes: a) oxidación de unidades nofenólicas por LiP, b) oxidación de unidades fenóllcas por MnP/Mn2+ o lacasa, c) rotura éter en C4 dando un radical fenoxilo, d) apertura del anillo aromático, e) rotura Ca-C~ y formación de un grupo carbonilo, f)desmetoxilación/desmetilación, g) repolimerización de radicales, h) reducción de radicales por enzimas como la quinona-reductasa (QR) y la celobiosa deshidrogenasa (CDH), i) formación de uinona/hidroquinona a partir del radical fenoxilo, j) «redox cycling» quinonahidroquinona (reducción por QR y oxidación espontánea), k) reducción de aldehídos aromáticos por AAD, l) oxidación de alcoholes aromáticos por AAO y formación de H202' m) generación de radicales del 02' n) ataque no-enzimático a la lignina por radicales Los hidrocarburos aromáticos son moléculas altamente recalcitrantes, pudiendo persistir en el medio ambiente debido a su hidrofobia y baja solubilidad en agua. La biodegradación de estos compuestos ha demostrado ser dependiente del sistema de degradación de la lignina, donde para los hidrocarburos policíclicos con bajo peso molecular son en su mayoría completamente degradado. La biodegradación por Basidiomycetes se considera un proceso no específico, oxidativo y que es llevado a cabo fundamentalmente por la acción diferentes tipos de enzimas: Lignina peroxidasa (LiPs), Mn-Peroxidasas (Mn-Ps), las cuales dependen de peróxido de hidrógeno. La actividad lignolítica de P. Chrysosporium se ha correlacionado estrechamente con la secreción de dos peroxidasas específicas; lignina peroxidasa (LiP) y Manganeso peroxidasa (MnP) (Gold & Allic 1993). LiP, también denominada ligninasa se ha considerado como la enzima clave en el proceso lignolítico, principalmente por su alto potencial redox, que la hace capaz de oxidar las unidades no-fenólicas que representan mas del 80% del polímero de lignina. La no-especificidad de los sistemas que degradan lignina genera la posibilidad de degradación de un amplio espectro de sustancias recalcitrantes que muestran similitudes estructurales con lignina. Teniendo en cuenta que el sistema enzimático del P. Chrysosporium tiene capacidad de atacar a estructuras complejas que contienen estructuras cíclicas orgánicas, es interesante estudiar el desarrollo de estas enzimas lignolíticas para la aplicación de biorremediación de sustancias altamente recalcitrantes. Fig. 4 Esquema de la degradacíón de la lignina como un sistema multienzimático Durante la degradación de la pared celular de las plantas, las interacciones entre el polímero de la lignina y las enzimas o productos de bajo peso molecular implicados en su degradación no se producen al azar. En primer lugar, el ataque a la lignina en la pared celular se ve limitado por condicionamientos físicos derivados de la estructura relativamente compacta de la matriz lignocelulósica y por condicionamientos químicos derivados de las uniones covalentes entre los diferentes polímeros vegetales que limitan la penetración y la actividad de las enzimas y de los compuestos de bajo peso molecular involucrados en la degradación. En segundo lugar, resulta lógico imaginar que las enzimas que forman parte del sistema enzimático responsable de la degradación de la lignina, no se encuentran libres en el medio extracelular sino inmovilizadas en la vaina extracelular que rodea al micelio, de forma que su acción conjunta resulta optimizado. Fig. 5 Esquema de una hita fúngica, con su vaina creciendo sobre un sustrato sólido. Finalmente, las enzimas intracelulares participan en reacciones rédox de productos aromáticos de bajo peso molecular. Las deshidrogenasas miceliares parecen desempeñar un importante papel en la reducción de compuestos de tipo quinona que son tóxicos y muestran tendencia a la repolimerización. Por otra parte, el catabolismo de los productos aromáticos de bajo peso molecular en los basidiomicetos, tiene lugar a través de reacciones enzimáticas intracelulares Biorremediación implica el uso de organismos vivos, generalmente bacterias o hongos, para eliminar contaminantes, es potencialmente más rentable que las técnicas tradicionales como el suelo. Incineración y filtración de fluidos. Podemos imaginarnos que le puede utilizar el hongo Phanerochaetes Chrysosporium para desarrollar sus enzimas de acción inespecífica para tratar contaminantes ambientales de estructuras orgánicas. Ligninasas es un nombre genérico para un grupo de enzimas que catalizan la despolimerización oxidativa de la lignina. Las ligninasas a partir de los Basdiomycete Phanerochaete Chrysosporium son extracelulares y se producen durante el metabolismo secundario provocada por la inanición de nutrientes. Varios artículos científicos han descrito la capacidad de estos hongos para mineralizar un amplio espectro de clorocarbonos y aromaticos policíclicos. El hongo degrada recalcitrantes organohalogenos como el DDT, pentaclorofenol (PCP), bifenilos policlorados,dibenzo- p- dioxinas policloradas, indano (у-BHC), y alcanos clorados. Tanto el Phanerochaetes Chrysosporium como su sistema enzimático son prometedores para llevar a cabo la aplicación para tratamientos residuos peligrosos desarrollando los procesos biotecnológicos, analizando cuales son los posibles fermentaciones y sistemas de biorreactores viables. Hay algunos estudios que involucran sistemas de reactores con hongos de la podredumbre blanca para el tratamiento de residuos peligrosos. Sin embargo, todos estos sistemas de reactores anteriores exhiben limitaciones en términos de mantener un alto constante nivel de actividad enzimática para que pueda ser aprovechada de manera continua. Para pode iniciar con el intento de generar un proceso biotecnológico para aprovechar la acción de Phanerochaetes Chrysosporium en su generación de enzimas y capacidad de biodegradar compuestos dañinos para el medio ambiente, comenzamos por analizar el medio de crecimiento optimo, y demás cuestiones del entorno de desarrollo. El mantenimiento de los hongos y la preparación de inoculo; Los cultivos de P. chrysosporium (cepa BKM-F-1767; ATCC 24725) son mantenido en agarres de malta suplementados. Composición del agar para mantenimiento y producción de esporas (por litro): Glucosa, 10 g Extracto de malta, 10 g Peptona, 2 g Extracto de levadura, 2 g Asparagina, 1 g KH 2 PO 4 , 2 g MgSO 4 · 7H 2 O, 1 g Tiamina-HCl, 1 mg Agar, 20 g La producción generalmente requiere de 2 a 5 días a 39 °, se preparan por suspensión en agua estéril. Se suplementa (por litro) con: KH 2 PO 4 , 20 g MgSO 4 , 5 g CaCl 2 , 1 g Elementos de trazas (por litro): MgSO 4 , 3 g MnSO 4 , 0.5 g NaCl, 1,0 g FeSO 4 · 7H 2 O, 0,1 g COCl 2 , 0.1 g ZnSO 4 · 7H 2 O, 0,1 g CuSO 4 , 0.1 g AlK (SO 4 ) 2 · 12H 2 O, 10 mg H 3 BO 3 , 10 mg Na 2 MoO 4 · 2H 2 O, 10 mg Nitrilotriacetato, 13 1.5 g En el medio cabe destacar que contiene 1% de glucosa, 1.1 mM (condiciones de bajo nitrógeno) de tartrato de amonio, dimetilsuccinato 20 mM (como pH Tampón de 4.5), tiamina y oligoelementos. Luego de la preparación del medio con los componentes detallados, se lo esterilizo bajo autoclave habitualmente, se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos, luego se procede a realizar la inoculación, tomando una alícuota del medio preparado junto con 0.2 ml de conidium (como ayuda de dispersión biológico) y un bioportador como soporte del desarrollo, se lo expone a oxigeno esteril luego de la inoculación. Después de 3 días, se le adiciona 40mM de VA (Alcohol Varatrilico) y un y un surfactante no iónico Tween80 al 0,05%, la adición de alcohol veratrílico al medio de cultivo incrementaba los niveles de actividad de las enzimas. El efecto positivo del alcohol veratrílico sobre la producción de LiP no se debe a que este compuesto actúe como inductor, sino al hecho de que, al reducir a la enzima oxidadasa, impide que ésta pase a un estado superior de oxidación, que es inactivo. Por otra parte la presencia del alcohol veratrílico permite la oxidación por la LiP de compuestos que no pueden ser oxidados por la enzima sola. Se realiza la incubación del inoculo durante 5 días, luego se lo lleva a una solución de mayor volumen que posee las mismas composiciones nutricionales del medio de inoculación a una temperatura de 30°C durante unos 30 días, en condiciones de oscuridad. Se utilizan dos especies de hongos debido a tu alta actividad enzimática que exhiben (cepa BKM-F-1767; ATCC 24725). Algunos estudios y análisis del desarrollo del Phanerochaetes Chrysosporium en distintos sistemas de rectores se han tenido en cuenta para tomar algunas consideraciones según la actividad de las enzimas. MICROORGANISMO SISTEMA DE REACTOR CEPAS VARIAS DE HONGOS DE PODREDUMBRE BLANCA. Tela de nylon y poliuretano. Insertado en el biorreactor. PALLETS DE P. CHRYSOSPORIUM Reactores de tanque agitado a escala piloto P.CHRYSOSPORIUM B KM-F-1767 O ME-446 Reactor de air-lift VARIAS CEPAS MUTANTES DE HONGOS DE PODREDUMBRE. P. CHRYSOSPORIUM BKM-F-1767 Y SC26 P.CHRYSOSPORIUM BKM-F-1767 P.CHRYSOSPORIUM ME-446 P.CHRYSOSPORIUM I-1512 Tabla 3 VOLUMEN DE REACTOR (LITROS) ACTIVIDAD DE LIGNINAPEROXIDAS A (LIP) (U/ML) 10 0.1–0.75 30 200 5 0,062 Reactor con soporte de vidrio sintetizado Reactor con soporte de Hoja de Nylon 40 2.2 8 1,035 Poliuretano insertado en reactor estacionario 0,03 2,43 Poliuretano insertado en reactor agitado 0,1 2,58 2,8 0,08 5 0,074 0,2 1,5 0,19 0,23 0,02 Sin datos 0,25 0,6 LiP 3,6 MnP 0,78 Reactor biológico rotativo Reactor de Tanque agitado Reactor de fibra hueca Reactor de membrana de silicona Bioreacctor de tubos giratorios Red de Nylon insertada en el reactor Se eligió a modo ensayo un biorreactor de 8.0 L útiles. Cilindro de 0.16m de diámetro interno. Con un calentador de camisa externo, el cual se usa con vapor para calefaccionar y esterilizar, un difusor de oxígeno de forma tubo perforado en el cual se inyecta aire. La concentración de oxígeno disuelto se fue controlando para que sea a aproximadamente 1 mg / L en la parte superior del Reactor por aireación a 0.5 vvm. El oxígeno disuelto contenido, temperatura y pH de la solución en el reactor fue monitoreado y controlado por una computadora utilizando sensores electrónicos. El medio utilizado en la inoculación en las fases enzimáticas de P. chrysosporium para aplicaciones del reactor fueron similar al medio de crecimiento. Aunque la fuente de nitrógeno se agotó después de 5 días, una fuente de medio con nitrógeno no se introdujo con el fin de crear adecuadas condiciones para la inducción enzimática. El reactor fue operado por lotes, conocido como batch alimentado de manera que se extiendan las fases de crecimiento de las enzimas. Después de 5 días de crecimiento, el medio en el reactor se reemplazó con el medio inductivo del crecimiento. En el día 12, el medio fue reemplazado nuevamente con el medio de crecimiento. El medio de crecimiento en el reactor fue entonces reemplazado con el medio de inducción el día 14. Este ciclo se repitió durante todo el período experimental. Descripción gráfica del reactor Fig. 4 Luego de alcanzado los 5 días, en condiciones estacionarias, donde ya se ha producido la fase de crecimiento de las enzimas, se añade el pentaclorofenol desde arriba con una corriente de alimentación que contiene 30mg/l de PCP a una velocidad de 2 L/día, para analizar la acción del sistema para degradar este hidrocarburo clorado. En las redes de acero inoxidable del biorreactor se probaron distintos Bioportadores o biosoportes, así utilizar el mas conveniente. Astillas de madera (Mitsui Home Co., Ltd., Tokio, Japón), Biostages (hoja Tsutsunaka Waterproof Systems Co., Ltd., Tokio, Japón), Biolace (Hoja de Tsutsunaka Waterproof Systems Co., Ltd., Tokio, Japón), Balones de cerámica (Iuchiseieido Co., Ltd., Tokio, Japón), y espuma de poliuretano (Chiyoda Co., Ltd., Tokio, Japón), como se indica en la Tabla 4, se emplearon y probaron para apoyar el inmovilizar micelio de P. Chrysosporium. s Bioportadores utilizados. Tabla 4. BIOSOPORTES MATERIAS PRIMAS GRAVEDAD ÁREA CANTIDAD ESPECIFICA SUPERFICIAL DE 3 (G/CM ) ESPECIFICA USO (M2/M3) ASTILLAS DE MADERA BIOSTAGE RK10Z098 Madera 0.12 450 200g Polipropileno 0.98 800 375g (2.5 L) BIOLACE (BL-35) Cloriro de vinilo 1.7 73 35g (0.15m) BOLA DE CERÁMICA ESPUMA DE POLIURETANO POLIURETANO Cerámico 0.85 320 2500g (2.5L) Poliuretano 0.03 (35 poros/cm) -- En los distintos bioportadores que fueron cargados dentro del biorreactor, se analizó la actividad enzimática, usando (U) como unidad de medida para LiP, definida como la cantidad de enzima necesaria para Oxidar 1.0μmol de VA alcohol veratrílico por minuto y la velocidad de reacción fue medido por longitud de onda usando un espectrofotómetro. La actividad de la ligninasa de MnP, donde su Unidad (U) se define como la cantidad de enzima necesaria para oxidar 1.0 μmol de guaniacol por minuto, donde la velocidad de reacción se mide 50g (2.5L) también usando espectrofotómetro. el Para medir el oxígeno disuelto, temperatura y pH se usaron electrodos IM55G, de TOADKK, sus especificaciones son: Tabla 5. En el día 5, estamos en las condiciones estacionarias de crecimiento de la fase de enzimas, fase de metabolitos secundarios donde los micelios dejan de crecer para auto mantenerse generando la autolisis, en esta etapa es donde junto a esto, se introduce por la parte superior el PCP, y elcon el medio de crecimiento sin fuente de nitrógeno para asegura que la fase se mantenimiento y lisis se prolongue. Para seguir la evolución de la degradación se toma muestras de 20ml en la salida de efluentes. Se realiza una centrifugación para separar la solución de los micelios que fueron arrastrados. Estos ensayos se realizaron como dijimos en diferentes biosoportes, para las cepas ME-446 y BKM-F1767, apoder comparar los efectos sobre el hongo y su adherencia, asi como a actividad enzimática. Ambas cepas se adhirieron de forma similar a los biosoportes, donde sobre ellos se generaban tapetes de micelios delgados cubriendo toda la superficie. Fig. 5. Principio de medición galvánica (electroquímica). Para estudiar el crecimiento en ellos se lo determino por el peso seco, pesando previamente los soportes y sometidos a vibración por 3 min a 50 rpm. Se observo que en todos los biosoportes excepto en las bolas de cerámica se adherían y se generó un mayor crecimiento de los micelios sobre la espuma de poliuretano. Ambas cepas tenían en casa uno una densidad de micelios similares. Fig. 6 Peso en seco de biomasa de ME-446 y BKM-F-1767 en cada bioportador después de 5 días de cultivo. A: espuma de poliuretano; B: Biolace; C: Biostage; D: Bola de cerámica ME-446; Los resultados de la inmovilización indican que la forma de la superficie del portador y los materiales son un factor importante en la adhesión y crecimiento. Los efectos de los biosoportes en las enzimas peroxidasas degradantes de lignina, se resumen en la figura 7 y tabla 6. Se detecto al actividad de LiP eran máximos en los dias 7 a 10 y mas tarde disminuyo, esto fue casi iguales para ambas cepas. La mayor actividad enzimática se observo en el soporte de Biostage (echo de Polipropileno) en condiciones de bajo nitrógeno con 8.1 U/mL. sintetizado peroxidasas. El trabajar sin sporte biologico se genera una sedimentación celular lo cual genera una falta de oxígeno, donde no puede ser las enzimas El inmovilizar la célula, el hongo puede sintetizar un contenido alto de LiP en la superficie de los biosportes. Con estas evidencias, para llevar este proceso a un nivel mas grande es deseable que se haga una producción de celular inmovilizadas, en un bioportador. Una inmovilización tiene varias ventajas: mejora el crecimiento del hongo, produce mayor actividad de las enzimas y tiempos mas duraderos de la misma. Fig. 7 Variación temporal en la actividad de LiP producida en BKMF-1767. A: Cepa sin bioportador; B: A + bola de cerámica; C: A + espuma de poliuretano; D: A + biolace; E: A+biostage. E: A+biostage. Tabla 6 Actividad de la enzima LiP (U / mL) de ME-446 y BKM-F-1767 para varios bioportadores en un sistema bajo dos condiciones de nitrógeno medido en cultivo de 7 días. La producción de peroxidasa ha mejorado notablemente. El uso de biosoportes proporciona otro enfoque para la enzima con un alto nivel de actividad. Sobre Biostage se produjo la actividad mas alta en el día 11 de 22.6/mL. En el día 12, se remplaza el medio de crecimiento danto una disminución de la actividad enzimática, dado que se produjo un crecimiento de los micelios durante ese periodo, y comenzó a incrementarse en el día 14, por el echo que se fue consumiendo el nitrógeno y el micelio produjo actividad enzimática nuevamente. Podemos decir que lo sometimos a periodos cíclicos de crecimiento y de desarrollo de metabolitos secundarios, teniendo un nivel promedio alto y casi continua de enzimas lignoliticas. La actividad media de esta operación es de 12 U/mL de LiP y una actividad promedio de MnP de 4.9 U/mL, usando Biostage como biosoporte. La mejora de aumento de las enzimas ligninolíticas en el medio de cultivo del Phanerochaetes Chrysosporium al desarrollarlo en un lecho empaquetado sobre biosoportes de polipropileno, se tradujo en una significativa degradación del pentaclorofenol. Al analizar el efluente del reactor con la cepa inmovilizada, se detectó una porción muy pequeña de pentaclorofenol, durante el periodo desde el día 5 hasta un periodo extendido. El contaminante de interés era ingresado continuamente a una concentración de 30mg/L con un caudal de 2L/día. La relación de degradación observada fue superior al 80%, lo cual indica que P. chrysosporium- inmovilizado contribuyó a la degradación de la PCP. El funcionamiento del biorreactor tuvo una duración de 20 días aproximadamente, desde el dia 1 al 5 para alcanzar un estado de crecimiento adecuado considerado un estado estacionario, y desde allí el ingreso del PCP donde se realizaron los ensayos en los diferentes soportes, se le dio medio para prolongar la fase de los metabolitos en condiciones de bajo nitrógeno, el proceso tuvo periodos en el cual la actividad de la enzima vario, pasando por una etapa de actividad máxima al día 11, luego de una disminución de la actividad retomando nuevamente actividades significativas al día 14 llevándolo a una retención hasta el día 20 aproximadamente. Vía (s) propuesta (s) para la degradación de PCP (I) por P. Chrysosporium. productos de oxidación generados por la lignina peroxidasa (LiP) y la manganeso peroxidasa (MnP) . La vía es iniciada con la decloración oxidativa, catalizada por estas enzimas. Sin embargo, hasta la fecha la ruta completa de degradación para PCP no ha sido completada, estas enzimas están involucradas en la degradación de la PCP ,aparentemente están participan solo en el paso inicial, la oxidación de PCP a la tetraclorobenzoquinona. Los pasos restantes en el La ruta se lleva a cabo bajo condiciones limitadas de nitrógeno y altas de carbono disponible, sugiriendo que no pueden ser parte del clásico sistema de degradación de la lignina (Kirk y Farrell, 1987). Fig. 8 (I) PCF. (II) Tetraclorobenzoquinona, (III) Tetraclorodihidroxibenceno. (V) Triclorodihidroxibenceno, (VI)Triclorotrihidroxibenceno, (VII) Diclorotrihidroxibenceno, (VIII) Clorotrihidroxibenceno, (XI) 2,5-diclorodihidroxibenceno, (XIV) 2-cloro-1,4-dihidroxibenceno, (XVIII) Trihidroxibenceno. Esta vía de degradación se dedujo a partir de la caracterización de los metabolitos del hongo y de los El primer paso en la (s) vía (s) es el la Oxidación de PCP catalizada por MnP o LiP a tetracloro benzoquinona(II). El tetraclorodihidroxibenceno (III) fue identificado como el metabolito principal obtenido de tetraclorobenzoquinona. La degradación de PCP (I) es una parahidroxilación que produce tetraclorodihidroxibenceno (III) directamente (Ha $ ggblom et al ., 1989; Xun & Orser, 1991;Xun et al ., 1992). Metabolitos producidos a partir de tetraclorodihidroxi el benceno (III) incluía tetraclorobenzoquinona (II), triclorodihidroxibenceno (V) y diclorotrihidroxi benceno (VII). Bajo condiciones metabólicas secundarias, limitantes del nitrógeno, el basidiomycete Phanerochaete chrysosporium degrada rápidamente pentaclorofenol. La vía para la degradación del pentaclorofenol ha sido dilucidado por la caracterización de metabolitos fúngicos y productos de oxidación generados por la lignina peroxidasa purificada (LiP) y peroxidasa de manganeso (MnP). Finalmente, en varios puntos, las reacciones de hidroxilación se convierten, dihidroxibencenos clorados a trihidroxibencenos clorados, que unen las dos vías en cada uno de estos pasos. La producción de cada vía se divide en anillos con la subsiguiente degradación a CO2. Aparentemente, los cinco átomos de cloro son removidos del sustrato. antes de la escisión del anillo.
