FGL029 Guia de trabajo No. 8 Purificacioìn de aìcidos nucleicos meìtodos de columna AVALADA CiBi (1)

GUÍA DE TRABAJO PRÁCTICO EXPERIMENTAL
Talleres y Laboratorios de Docencia ITM
Código FGL 029
Versión 01
Fecha
2014-08-20
1. IDENTIFICACIÓN DE LA GUÍA
Nombre de la guía:
Purificación de Ácidos Nucleicos mediante
método de columna
Código de la guía (No.):
08
Taller(es) o Laboratorio(s) aplicable(s):
Laboratorio de Ingeniería Biomédica
Tiempo de trabajo práctico estimado:
2 horas
Asignatura(s) aplicable(s):
Bioquímica médica II
Programa(s) Académico(s) / Facultad(es):
Ingeniería Biomédica/ Ciencias exactas y
aplicadas
COMPETENCIAS
Análisis
del
proceso
de
purificación de ácidos nucleicos a
partir de muestras biológicas
CONTENIDO TEMÁTICO
INDICADOR DE LOGRO
Naturaleza química de los
ácidos nucleicos
Etapas de la purificación de
ácidos nucleicos
Fundamento purificación de
ADN mediante método de
columna
Comprende el fundamento
de los métodos de
purificación de ácidos
nucleicos mediante
método de columna
utilizando kit comercial
ASPECTOS DE BIOSEGURIDAD
Para la presente práctica se manipularán muestras biológicas y reactivos como sales, solventes
orgánicos para lo cual se utilizarán todos los elementos de protección personal detallados en esta
guía más adelante.
Todo el material plástico contaminado con restos biológicos y los restos de sangre, células o tejidos
serán descartados en bolsa roja rotulada con el símbolo de riesgo biológico para su disposición final
con la empresa encargada de la recolección de residuos biológicos en el ITM. Para el caso de los
restos de material biológico estos serán almacenados a -20°C hasta su recolección. Para el caso
del material plástico contaminado con químicos serán descartados en bolsa roja rotulada con el
símbolo de riesgo químico para su disposición final con la empresa encargada de la recolección de
residuos químicos. Los restos de químicos serán descartados en contenedor de plástico con tapa
rotulado según el tipo de químico (orgánicos, inorgánicos, ácidos y bases o sales), componentes y
concentración para su entrega final con la empresa encargada de la recolección de residuos
químicos en el ITM.
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2. FUNDAMENTO TEÓRICO
2.1 Estructura de los ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos son macromoléculas biológicas, conformadas por cadenas de nucleótidos. El
nucleótido constituye la unidad o monómero, por lo que es quien les confiere las diferentes
características bioquímicas a los ácidos nucleicos. Un nucleótido está conformado por un azúcar,
un fosfato y una base nitrogenada. Existen dos tipos de ácidos nucleicos: ácido desoxirribonucleico
(ADN) contiene nucleótidos con azúcar tipo desoxirribosa, y el ácido ribonucleico (ARN) que
contiene nucleótidos con azúcar tipo ribosa. Los azúcares, son tipo aldehídos de cinco carbonos
(pentosas). La diferencia entre los dos azucares, radica en presencia de un grupo hidroxilo (-OH)
en el extremo 2´ de la ribosa, lo que hace a la molécula de ARN más inestable y reactiva, es decir
más sensible a la degradación en comparación al ADN.
Las bases nitrogenadas, son moléculas orgánicas cíclicas conformadas por átomos de carbono,
oxigeno, hidrogeno y nitrógeno. Se clasifican en purinas, si tienen dos anillos y en pirimidinas las
que tiene un solo anillo. Estas son complementarias entre sí, formando parejas o pares de bases
(Adenina-Timina/ Uracilo, Guanina-Citosina), y son las que les confieren la estructura a los ácidos
nucleicos, como también la base de los procesos biológicos de replicación y transcripción. En el
ADN encontramos los pares de bases Adenina-Timina, Guanina-Citosina, y en el ARN encontramos
Uracilo en reemplazo de la Timina, que se diferencian por el grupo funcional CH3.
Nucleótido de Ribosa
Bases Nitrogenadas de los ácidos nucleicos
Nucleótido de desoxirribosa
Los fosfatos, son los encargados de unir los nucleótidos entre sí, en una misma cadena. Esta
unión está dada por un enlace fosfodiéster que se forma entre el fosfato y el carbono 5´del
azúcar. Estos provienen del ácido fosfórico, le confieren la característica ácida al ADN y al ARN,
la carga negativa y el carácter hidrofílico que poseen las biomoléculas. En la estructura de los
ácidos nucleicos, hay enlaces débiles llamados puentes de hidrogeno, formados entre átomos
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electronegativos (Oxígeno y Nitrógeno) y un átomo de hidrógeno. La formación de estos enlaces
está dada por la complementariedad de las bases nitrogenada, que determinan la conformación de
doble cadena a las moléculas de ADN y la formación de estructuras secundarias en el RNA.
Adicionalmente en el ADN, se forman estructuras llamadas doble hélice, dadas por el enroscamiento
de las dos cadenas. La separación de estos puentes de hidrógeno, se denomina
desnaturalización, que es un proceso reversible y puede hacerse mediante tratamiento con calor,
álcalis, entre otros. El proceso de separación de los enlaces fosfodiéster, constituye un proceso de
degradación de los ácidos nucleicos; esto puede darse por procesos de hidrólisis causados por
enzimas (DNasas, RNasas) o por compuestos reactivos. Este proceso es irreversible.
Enlace Fosfodiéster
Puentes de hidrógeno
2.2 Fundamento del Método
En general, existen diferentes metodologías para la purificación o aislamiento de ácidos nucleicos,
las cuales incluyen métodos caseros y métodos comerciales, que varian dependiendo el tipo de
muestra, el fundamento utilizado y el grado de pureza final (calidad y cantidad). Las muestras
biológicas pueden ser tener diferentes orígenes (vegetal, animal, bacteriano, viral). En el caso de
muestras de origen animal estas incluyen muestras de sangre total, suero o plasma, tejido, líneas
celulares, entre otros. ADN (Nuclear, mitocondríal) o ARN (ARN total, ARN ribosomal, ARN
mensajero o ARN de transferencia). Sin embargo, los pasos generales siguen un mismo algoritmo:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Obtención y almacenamiento de la muestra 2
Rompimiento de las estructuras que contienen el material genético
Separación del material genético de los componentes homogenizados
Precipitación de los ácidos nucleicos
Purificación
Elusión
Preservación del material
Los Kits comerciales permiten la purificación rápida de ácidos nucleicos a partir de órganos, tejidos
y células provenientes de Animales, vegetales, microorganismos y virus. En el caso del presente
laboratorio se utilizará un kit comercial el cual permite la purificación de ADN en muestras de sangre,
a través de un método de columna. Una vez purificado el ADN, este podrá ser amplificado mediante
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PCR, digerido por enzimas de restricción, y/o sometido a las diferentes técnicas de ADN
recombinante utilizadas en clonación y expresión génica.
La extracción de ADN mediante el método de columna, se basa en la utilización de una columna de
sílica-gel en presencia de sales caotrópicas. La muestra de sangre será digerida con Proteinasa K
a 55ºC con la ayuda de una solución estabilizante (Buffer de digestión). Cualquier resto de ARN
será destruido (digerido) mediante la digestión con RNasa A la cual ataca específicamente los
fosfatos unidos a nucleótidos de pirimidinas (T o C) en presencia de iones monovalentes. El
homogenizado es mezclado con etanol y el buffer genómico de adsorción, permitiendo la adherencia
del ADN a la membrana de sílica en la columna. Una vez adherido el ADN las impurezas (Lípidos y
proteínas) se remueven mediante lavados sucesivos con buffers. Al final del proceso, el DNA
genómico podrá ser solubilizado con el Buffer de Elución.
Esquema de la columna de Silica-Gel, permitiendo la adherencia del ADN
Aunque todos los pasos de este procedimiento general son cruciales para el aislamiento de material
genético, la obtención de la muestra, su identificación y preservación son vitales para la realización
ulterior de análisis sobre el ADN o el ARN. Por regla general, el material obtenido deberá será
transportado y almacenado a la menor temperatura posible (Desde 4 hasta -86°C), evitando
procesos de descongelación y congelaciones sucesivas.
2.2.1 Etapas de la Purificación de Ácidos Nucleicos
ü Homogenización y Lisis.
Consiste en rompimiento de las estructuras celulares que contienen el material genético,
ocasionando la liberación de los ácidos nucleicos de las células animales, vegetales,
microorganismos o virus presentes en la muestra de interés. Para esto se utilizan soluciones de lisis
que contienen detergentes que emulsifican los lípidos de las membranas celulares o lisozima que
degrada las estructuras de la pared bacterianas; proteasas y sales caotrópicas que facilitan la
precipitación y homogenización de las diferentes biomoléculas presentes en la muestra.
ü Separación del material de los componentes homogenizados.
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Es la extracción de los lípidos y proteínas presentes en la muestra. Se utilizan solventes orgánicos
(fenol, cloroformo) que actúan como desnaturalizantes, los cuales permiten separar
diferencialmente las biomoléculas en dos fases. Fase acuosa donde permanecen los ácidos
nucleicos (hidrofílicos) y una fase orgánica donde se atrapan las proteínas y lípidos.
ü 2.2.3 Precipitación de Ácidos Nucleicos.
Se basa en la neutralización de las cargas y la deshidratación de los ácidos nucleicos, utilizando
soluciones salinas (NaCl; EDTA; Tris) y alcoholes (etanol, isopropanol), lo que hace que los ácidos
nucleicos se separen de la fase acuosa y se precipiten, mediante el uso de centrifugación de alta
velocidad. Esta precipitación es reversible, mediante la solubilización en medios acuosos. En el
caso de los métodos basados en columna, en esta etapa se adiciona la mezcla proveniente de la
etapa de lisis a la columna de sílica-gel, con el fin de que se dé la adherencia de los ácidos nucleicos
a la columna.
ü Lavado.
Esta fase consiste en la eliminación de impurezas y trazas de contaminantes presentes en la
muestra (solventes, proteínas, restos celulares) y se realiza generalmente con Etanol al 70-95%, el
cual puede inhibir la amplificación posterior; por esto una vez se realiza el lavado se debe eliminar
el etanol y dejar secar bien la columna. Este paso puede repetirse varias veces con el fin de
obtenerse un extracto de ácidos nucleicos de alta pureza.
2.2.5 Elución.
En esta etapa se da la rehidratación o solubilización de los ácidos nucleicos precipitados. Para esta
fase se utiliza agua de alta pureza libre de DNasas o RNasas. Específicamente, la solublización de
los ácidos nucleicos que se encuentran adheridos a la columna ocurre mediante la adición del buffer
de elución, el cual rompe las interacciones electrofílicas mediante el cambio de las cargas presentes
en la sílica-gel. Una vez solubilizado el material, este se deberá alicuotar (dividir en pequeñas
porciones a otros microtubos) para evitar que los procesos de descongelaciones sucesivas
ocasionen el deterioro del material genético. Así mismo, se deberá procurar almacenar el material
a una temperatura entre -20°C a -70°C y en el caso del ARN adicionar inhibidores de RNasas para
estabilizar la molécula.
3. OBJETIVO(S)
•
Comprender el fundamento de los métodos de purificación de ácidos nucleicos mediante el
método de columna
4. RECURSOS REQUERIDOS
4.1 Instalaciones
Laboratorio de Ingeniería Biomédica H-204, Campus Robledo
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4.2 Equipos
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•
•
Vortex
Baño serológico o placa de calentamiento 25ºC - 95ºC
Centrífuga para microtubos (1,5 ml – 2 ml), con capacidad de hasta 14,000
xg
4.2.1 Indicaciones sobre el manejo del equipo
Vortex:
1. Seleccionar el modo de agitación (Continua o toque).
2. Colocar los tubos en la parte superior para agitar.
3. Limpiar con alcohol desinfectante y desconectar al terminar la práctica.
Baño Serológico:
1. Llenar con agua destilada estéril hasta el nivel indicado.
2. Encender y programar a 37ºC.
3. Cuando termine la práctica completa, apagar el equipo.
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Microcentrífuga:
Será manejada únicamente por el docente o los coordinadores de laboratorio.
1. Encender y oprimir el botón para abrir la cubierta.
2. Ubicar los tubos para microcentrífuga en el rotor asegurando que cada posición del rotor
contenga la misma cantidad de volumen al frente. En caso de no tener tubos pareados con
muestras, se debe llenar con agua destilada un tubo del mismo tamaño, adicionando el mismo
volumen de la muestra.
3. Programar la centrifuga a más de 10.000 x g durante el tiempo requerido.
4. Al finalizar los periodos de centrifugación el equipo debe limpiarse con alcohol antiséptico.
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4.3 Herramientas
•
Micropipetas de volumen variable 0.5 - 10μL y de 10 - 100 μL
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4.4 Reactivos
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Solución de Lisis T.
Solución de Lisis C.
Solución para la preparación de la columna.
Solución de lavado
Solución de elución
Proteinasa K
Etanol
4.5 Materiales
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Guantes (Estudiantes).
Bata (Estudiantes)
Gafas de laboratorio (Estudiantes)
Tapabocas (Estudiantes)
Canecas de bolsa roja para el desecho de químicos y biológicos
Toallas absorbentes
Tubos de 1,5 ml (microtubos) para Microcentrifuga, estériles y libres de
DNasa
Puntas nuevas y estériles con capacidad para tomar micro-volúmenes entre
1 μl y 1000 μl
Columna “GenElute Miniprep Binding Columns”
Tubos colectores
5. PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA PARA EL DESARROLLO
Notas antes de comenzar:
•
•
•
•
•
•
•
•
Realice todos los pasos de centrifugación a temperatura ambiente (15-25 °C).
Si algún reactivo se precipita, incube a 55-65°C, hasta que no se visualice el precipitado,
deje enfriar a temperatura ambiente antes de usarlo.
Agregue etanol a la solución de lavado.
Tempere los gránulos de células o tejidos congelados a temperatura ambiente.
Precaliente el baño serológico a 56 ° C.
Identifique los guardianes o recipientes con bolsa roja que utilizará para desechar el
material de plástico contaminado, y los frascos de vidrio debidamente marcados para
descartar los reactivos del estuche comercial.
Utilice bata, guantes, gafas de laboratorio y tapabocas para manipular los reactivos del
estuche comercial y el ADN (Este ácido nucleico es sensible a DNasas presentes en la
saliva, la piel y las superficies. Se recomienda no hablar durante el procedimiento ni tocar
la parte interna de los tubos).
Limpie la superficie de trabajo con hipoclorito y alcohol antiséptico (70%).
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Marque claramente los microtubos en los que se hará el procedimiento, indicando la fecha,
su grupo de trabajo y el curso.
Muestra
Para la extracción de ADN se empleará una muestra de tejido animal (ej. hígado de res o de cerdo
comercial)
Procedimiento:
1.Tejido: Corte el tejido (≤10 mg de bazo o ≤25 mg de otro tejido) en trozos pequeños, y colóquelo
en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL. Agregue 180 μL de solución de lisis T. Luego agregue 20
µL de la solución de proteinasa K. Mezcle mediante agitación Vórtex e incube la muestra a 55°C
durante 15 minutos. Agite con Vórtex ocasionalmente durante la incubación.
2. Agregue 200 μL de la Solución de Lisis C, a la muestra. Mezcle completamente agitando en el
Vórtex por 15 segundos. Incubar a 70 ° C durante 10 min.
3. Ubique la columna GenElute en el tubo colector de 2 mL. Agregue 500 μL de la solución de
preparación de columnas, y centrifugue a 12.000 x g por un minuto. Descarte el líquido.
4. Agregue 200 μL de etanol (95-100%) al tubo que contiene la muestra. Mezcle completamente
agitando en el Vórtex.
5. Pipetee la mezcla en la columna, que fue previamente tratada en el paso 3. Centrifugue a ≥6500
x g por 1 minuto. Deseche el tubo de recolección
6. Coloque la columna giratoria en un nuevo tubo de recolección de 2 mL. Agregue 500 μL de la
solución de lavado. Centrifugar durante 1 minuto a ≥6500 x g. Deseche el tubo de flujo y de
recolección.
7. Coloque la columna en un nuevo tubo de recolección de 2 mL. Agregue 500 μL de solución de
lavado. Centrifugar durante 3 minuto a la velocidad máxima (12.000-16.000 x g). Nota: La columna
debe estar libre de etanol antes del siguiente paso, centrifugue a la velocidad máxima 1
minuto adicional, si se observa etanol residual. Deseche el tubo de flujo y de recolección.
8. Coloque la columna en un nuevo tubo de recolección de 2 mL, agregue 200 μL de la solución de
elución, directamente en el centro de la columna. Incube durante 5 minutos a temperatura ambiente
(15-25 ° C). Centrifugar durante 1 minuto a ≥6500 x g. Deseche el tubo de flujo y de recolección.
9. Opcional: repita el paso 8 para aumentar el rendimiento de ADN.
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6. PARÁMETROS PARA ELABORACIÓN DEL INFORME
6.1 Explique el efecto de cada uno de los componentes del Buffer de Lisis en la etapa de
homogenización del ADN.
6.2. Realice un esquema/dibujo y un diagrama de flujo del procedimiento donde explique el
fundamento bioquímico de cada una de las etapas de la extracción de ADN.
6.3 Explique el fundamento bioquímico que permite la Elución de ADN de la columna de sílica-gel
6.4 Realice una comparación e indique las ventajas y desventajas entre el método de separación
de ADN mediante métodos de columna (en inglés: Spin Column), y los métodos caseros de
extracción de ácidos nucleicos como fenol-cloroformo y Salting out. De una breve fundamentación
de estos métodos.
6.5 Explique cómo se puede analizar la calidad y pureza del ADN purificado ¿Cómo se puede
asegurar que el producto final de extracción es Acido desoxirribonucleico (ADN) y no Ácido
ribonucleico (ARN)?
6.6 Describa cómo se realiza la cuantificación de ácidos nucleicos mediante espectrofotometría
¿Cuál es el componente del ADN que absorbe a la longitud de 260nm y para que puede servir esta
característica en la cuantificación del ADN? ¿Qué sustancias absorben a 280nm? ¿Qué se puede
decir si un extracto de ADN presenta un radio de absorbancia 260/280:>1.8?
6.7 Describa algunas aplicaciones biomédicas de la extracción de ácidos nucleicos
7. BIBLIOGRAFÍA
Instituto Tecnológico Metropolitano. Manual de Bioseguridad, generalidades de bioseguridad en
el laboratorio nivel II de biología celular y molecular. Laboratorio de Ingeniería Biomédica, ITM.
Gerald Karp. Biología celular y molecular: Conceptos y experimentos. Editorial Mcgraw
Hill. GUÍA DE TRABAJO Ingeniería Biomédica Código FDE 048 Versión 03 Fecha 200906-09
Geofrey M Cooper. The Cell a molecular approach. Editorial Sinauer Associates. Aysha Divan
and Janice Royds. Tools and Techniques in Biomolecular Science. Editorial Oxford.
McKee, Trudy; McKee, James R; Palacios Martínez, Juan Roberto. Bioquímica: la base
molecular de la vida (4a ed). 2009.
Karp, Gerald. Biología Celular y Molecular. Quinta edición. Edit: Mc Graw Hill. 2009. Mary K.
Campbell, Shawn O. Farrell. Bioquímica. Sexta edición. 2010
Lodish. Biología Celular y Molecular. Tercera edición. Edit: Panamericana. 2003.
Comparisons of direct extraction methods of microbial DNA from different paddy soils. Islam
MR, Sultana T, Melvin Joe M, Cho JC, Sa T. Saudi J Biol Sci. 2012 Jul;19(3):33742.
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A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of
DNA from faecal samples. Claassen S, du Toit E, Kaba M, Moodley C, Zar HJ, Nicol MP. J
Microbiol Methods. 2013 Aug;94(2):103-10.
Comparison of protocols for DNA extraction from long-term preserved formalin fixed tissues.
Paireder S, Werner B, Bailer J, Werther W, Schmid E, Patzak B, Cichna-Markl M. Anal
Biochem. 2013 Aug 15;439(2):152-60.
A simple Chelex protocol for DNA extraction from Anopheles spp. Musapa M, Kumwenda T,
Mkulama M, Chishimba S, Norris DE, Thuma PE, Mharakurwa S. J Vis Exp. 2013 Jan
9;(71).
Extraction of viral nucleic acids: comparison of five automated nucleic acid extraction platforms.
Verheyen J, Kaiser R, Bozic M, Timmen-Wego M, Maier BK, Kessler HH. J Clin Virol. 2012
Jul;54(3):255-9.
Elaborado por:
Revisado por:
Versión:
Fecha:
Fabian M. Cortés Mancera – Natalia Restrepo
Johanna Carolina Arroyave
Nombre del profesional del Laboratorio
008
04/septiembre/2018
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