ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIÓN TÉRMICA, SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. DIANA DEL PILAR GÛIZA PÉREZ LINA MARÍA RINCÓN PRIETO PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÌA INDUSTRIAL Bogotá, D.C. Octubre de 2007 ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIÓN TÉRMICA, SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. DIANA DEL PILAR GÜIZA PÉREZ LINA MARÍA RINCÓN PRIETO TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar el título de: MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL ANA KARINA CARRASCAL. Directora PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÌA INDUSTRIAL Bogotá, D.C. Octubre de 2007 Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946 “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIÓN TÉRMICA, SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. DIANA DEL PILAR GÛIZA PÉREZ LINA MARÍA RINCÓN PRIETO APROBADO _______________________________ ANA KARINA CARRASCAL CAMACHO. MSc Directora _________________ __________________ NADENKA MELO ADRIANA PÁEZ Jurado Jurado ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIÓN TÉRMICA, SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. DIANA DEL PILAR GÜIZA PÉREZ LINA MARÍA RINCÓN PRIETO APROBADO ______________________ ____________________ ANGELA UMAÑA MUÑOZ JANETH ARIAS PALACIOS BIOLOGA PhD Decana Acadêmica MICROBIÓLOGA MSc. Director de Carrera AGRADECIMIENTOS • A la Dra. Ana Karina Carrascal por su dirección, apoyo y oportunidades que nos brindó para complementar los conocimientos en la realización de este trabajo. • A Luz Marina Melgarejo por su oportuna colaboración. • A Nathalia Chica por su paciencia, optimismo y gran ayuda. • A Fabián Torres por su valiosa asesoría. • A Aura Marina Pedroza por su contribución en el análisis estadístico. • A Inesita y al personal de lavado y esterilización por su paciencia y colaboración. A Dios, por iluminarme y acompañarme en todos mis proyectos A mi mamá, por ser mi amiga, por tanto amor y por estar siempre ahí A mi papá por sus consejos y apoyo A Yiya, por compartir tantas cosas A mis tíos y primos por su ayuda y apoyo incondicional A Luz Amanda por ser tan especial A Diana, por su amistad y por vivir conmigo la gran experiencia de iniciar y culminar este trabajo. Lina María. A Dios, por darme la sabiduría, fuerza y paciencia en la culminación de este trabajo y de esta etapa de mi vida. A mi mamá y mi papá por esa confianza que depositaron en mí, por ser mis amigos y por darme todo su apoyo y amor. A mi hermano por desearme lo mejor. A Luis Gabriel Rivera Mora por ese amor y compañía incondicionales. A mis familiares y amigos por su interés. A Lina, por su amistad, por su comprensión y por hacer posible la finalización de este trabajo. Diana del Pilar. TABLA DE CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 3 2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 5 2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos ................................................ 5 2.1.1 Métodos de prevención de enfermedades transmitidas por alimentos . 8 2.2 Tratamiento térmico .................................................................................. 8 2.2.1 Esterilización comercial ......................................................................... 9 2.2.2 Pasteurización ..................................................................................... 10 2.2.3 Causas de la muerte térmica y mecanismo de termorresistencia ........ 11 2.2.4 Valores D y Z ....................................................................................... 12 2.2.5 Factores que influyen sobre la determinación de la termorresistencia. 13 2.2.6 Las conservas y el tratamiento térmico................................................ 13 2.2.7 Transmisión del calor en el alimento envasado ................................... 14 2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos ............................ 15 2.3.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas ........... 16 2.3.2 Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites esenciales ...................................................................................................................... 18 2.3.2.1 Método de difusión en agar .............................................................. 19 2.3.2.2 Método de dilución ............................................................................ 19 2.4 Minthostachys mollis ............................................................................... 20 2.5 Listeria monocytogenes .......................................................................... 23 2.5.1 Generalidades ..................................................................................... 23 2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes .............................................. 24 2.6 Bacillus cereus ........................................................................................ 25 2.6.1 Generalidades ..................................................................................... 25 2.6.2 Termoresistencia de Bacillus cereus ................................................... 25 3. JUSTIFICACIÓN .......................................................................................... 28 4. OBJETIVOS ................................................................................................. 29 4.1 Objetivo general ...................................................................................... 29 4.2 Objetivos específicos .............................................................................. 29 5. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 30 1 5.1. Obtención de cepas ............................................................................... 30 5.2 Elaboración del banco de células primario (BCP) ................................... 30 5.3 Curvas de crecimiento ............................................................................ 30 5.4 Evaluación de la termorresistencia ......................................................... 32 5.4.1 Elaboración de curvas de inactivación térmica .................................... 32 5.4.2 Elaboración de la salsa y evaluación de termorresistencia en salsa. .. 32 5.5 Obtención de la planta ............................................................................ 33 5.5.1 Obtención del aceite esencial de Minthostachys mollis ....................... 33 5.6 Evaluación de la actividad antimicrobiana. ............................................. 33 5.6.1 Método difusión en agar con disco para bacterias ............................... 33 5.6.1.1. Preparación del inóculo ................................................................... 33 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................... 35 6.1 Prueba de pureza y viabilidad de los bancos de células......................... 35 6.2 Cinética de crecimiento de Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. .. 37 6.3 Elaboración de la conserva..................................................................... 41 6.4 Evaluación de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus (en caldo BHI y sobre alimento) .......................................................................... 43 6.4.1 Inactivación térmica de L. monocytogenes .......................................... 43 6.4.2 Inactivación térmica de Bacillus cereus ............................................... 46 6.5 Extracción del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluación de la actividad antimicrobiana ................................................................................... ...................................................................................................................... 51 7. RECOMENDACIONES ................................................................................ 59 8. CONCLUSIONES ......................................................................................... 59 9. REFERENCIAS ............................................................................................ 60 Recursos electrónicos .................................................................................. 71 2 1. INTRODUCCIÓN La mayoría de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), son de origen microbiano, siendo uno de los problemas con mayor impacto en el mundo. Debido a que estas enfermedades se adquieren por el consumo de alimentos y/o agua contaminados, representan un gran riesgo para la población en general. De acuerdo con lo anterior, es importante considerar la existencia de microorganismos de carácter patógeno que son los principales responsables de dichas enfermedades y la aparición de graves intoxicaciones alimentarias. Algunos de los microorganismos que se han asociado a las ETA son Listeria monocytogenes y Bacillus cereus, ya que han tenido gran impacto en salud pública. L. monocytogenes, tiene mayor trascendencia ya que el consumo de este microorganismo, puede generar tasas de mortalidad altas (30 %). (Vázquez et al, 2001). Por otra parte, B. cereus tiene un efecto mayor en cuanto a la cantidad de personas que afecta, porque no tiene grupos blanco específicos, generando tasas de morbilidad altas (ICMSF, 2000). Por lo anterior, la presencia de estos microorganismos en los alimentos conduce a buscar alternativas de inhibición y eliminación con una mayor posibilidad de aplicación como pueden ser las sustancias naturales, y al mismo tiempo fusionarlas con métodos convencionales como el tratamiento térmico con altas temperaturas. El estudio de la inactivación térmica es importante pues es uno de los métodos más aplicables, con una efectividad comprobada en el control y prevención de la transmisión de estas enfermedades, al mismo tiempo puede reemplazar otros métodos más complejos como la irradiación, almacenamiento a bajas temperaturas, conservantes químicos, entre otros. No obstante el tratamiento a temperaturas altas modifica el valor nutricional de los alimentos, lo que explica 3 la tendencia actual a utilizar sustancias antimicrobianas debido a su conocido efecto microbicida. De acuerdo con esto, es importante resaltar que el estudio de sustancias de origen natural tales como extractos y aceites vegetales se ha llevado a cabo para evaluar su efecto antimicrobiano, fungicida, insecticida y plaguicida. Algunas especies vegetales tales como Minthostachys mollis se han reportado como poseedoras de características antimicrobianas, antifúngicas y fitoterapéuticas, las cuales la hacen una especie promisoria para su uso en actividades farmacéuticas, control de plagas en el sector agrícola y la preservación de los alimentos para evitar la proliferación de microorganismos causantes de enfermedades. Esto conlleva a la realización de una investigación con el propósito de evaluar la actividad bactericida del aceite esencial extraído de M. mollis sobre dos microorganismos causantes de enfermedades transmitidas por alimentos como L. monocytogenes y B. cereus. Lo anterior debido a que M. mollis ha sido utilizada en Colombia como condimento para alimentos, por lo que podría utilizarse como antimicrobiano en la industria de alimentos. Por lo descrito anteriormente, se pretende llevar a cabo la obtención del aceite esencial de M. mollis por medio de una técnica de hidrodestilación, para su posterior evaluación mediante un protocolo donde se evaluará el aceite en una prueba in Vitro determinando la actividad antimicrobiana frente a los microorganismos mencionados anteriormente; luego probarlo en un producto inoculado y al mismo tiempo alternar este protocolo con un método más convencional como el tratamiento térmico. 4 2. MARCO TEÓRICO 2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos La enfermedad transmitida por alimentos (ETA) ha sido definida por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como “una enfermedad de carácter infeccioso o tóxico causada por, o que se cree que es causada por, el consumo de alimentos o de agua” (Adams, 1997). Las ETA pueden manifestarse a través de: • Infecciones transmitidas por alimentos: son enfermedades que resultan de la ingestión de alimentos que contienen microorganismos perjudiciales vivos. Por ejemplo: salmonelosis, hepatitis viral tipo A y toxoplasmosis (www.panalimentos.org). • Intoxicaciones causadas por alimentos: ocurren cuando las toxinas o venenos de bacterias u hongos están presentes en el alimento ingerido. Estas toxinas generalmente no poseen olor o sabor y son capaces de causar enfermedades después que el microorganismo es eliminado. Algunas toxinas pueden estar presentes de manera natural en el alimento, como en el caso de ciertos hongos y animales como el pez globo. Ejemplos: botulismo, intoxicación estafilocócica o por toxinas producidas por hongos (www.panalimentos.org). • Toxi-infección causada por alimentos: es una enfermedad que resulta de la ingestión de alimentos con una cierta cantidad de microorganismos causantes de enfermedades, los cuales son capaces de producir o liberar toxinas una vez que son ingeridos. Ejemplos: cólera (www.panalimentos.org) 5 Las enfermedades causadas por el consumo de alimentos contaminados tienen un amplio impacto en la salud pública y en la economía en todo el mundo (Gandhi y Chikindas. 2007). Entre los factores asociados a estos cambios globales se pueden señalar el crecimiento de la población, la pobreza, la urbanización en los países subdesarrollados, el comercio internacional de alimentos para humanos y animales así como también la aparición de nuevos agentes productores de ETA o nuevas mutantes con una mayor patogenicidad. Otros factores importantes en cuanto a la manipulación incorrecta de los alimentos que contribuyen a los brotes producidos por estos se muestran a continuación en la figura 1 (McCabe-Sellers y Beattie. 2004). La temperatura inadecuada es el principal factor reportado que contribuye a la transmisión de enfermedades producidas por alimentos (Olsen, et al, 2000). Figura 1. Factores que contribuyen a los brotes producidos por los alimentos a partir de 1993 - 1997 Fuente: McCabe-Sellers y Beattie. 2004 6 Por esta y otras razones en países latinoamericanos, donde estos problemas se intensifican desde 1989, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) ha estado trabajando con sus Estados Miembros para formar la capacidad nacional de vigilancia de ETA. Las debilidades todavía persisten en muchos países en la vigilancia epidemiológica: notificación de enfermedades, detección e investigación de los brotes y el análisis de datos para la toma de decisiones en las políticas y programas. Es por consiguiente difícil evaluar adecuadamente la situación de las ETA en la región latinoamericana (www.aam.org.ar). En el caso particular de Colombia y de la capital del país, las enfermedades transmitidas por alimentos constituyen un grave problema de salud pública (www.comunidadandina.org), pues se ha demostrado un incremento en los últimos años. Entre 1991 y 1998 se han reportado 21443 casos individuales de ETA. En cuanto al reporte de brotes de las ETA, ha mostrado un leve incremento desde 1998 hasta el año 2000. Para 1998 fueron reportados por el Sistema Alerta Acción un total de 28 brotes de ETA, y para los siguientes dos años un total de 35 y 37 brotes, con rangos de variación de dos a cuatrocientas personas afectadas (http://www.saludcapital.gov.co). Para el 2007 se notificaron al sistema nacional de vigilancia 1594 casos de enfermedades transmitidas por alimentos, lo que representa una disminución del 22.65 % con respecto al mismo periodo del año anterior en el cual se notificaron 2061 casos. Hasta el tercer periodo epidemiológico del 2007, se presentó el mayor número de casos, debido a la ocurrencia de cuatro brotes, uno en el Municipio de Soledad (Atlántico) que aportó 199 casos, otro en el municipio de Tena (Cundinamarca) que aportó 69 casos, otro en Maicao (La Guajira) que aportó 53 casos y otro en el municipio de Chinchiná (Caldas) que aportó 48 casos de los 469 notificados en esa semana. De las 36 Unidades Notificadoras Departamentales y Distritales, el 80.55% notificó casos de ETA´s al SIVIGILA: La Secretaría de Salud de Atlántico notificó el 14.49 %, siendo el mayor notificador, seguida de Bogotá D.C con el 8.59 %, Cundinamarca con el 7.15 %, Sucre con el 6.34, Caldas con el 5.90 %, Antioquia con 5.83 %, La Guajira con el 5.58 %, Córdoba con el 4.33 %, Bolívar 7 con el 4.27 %, Magdalena con el 4.20%, Boyacá con el 4.14 % y en menor porcentaje: Santander, Quindío, Meta, Valle, Huila, Vichada, Arauca, Cesar, Casanare, Nariño, Chocó, Cauca, Putumayo, Amazonas, Barranquilla, Risaralda, Norte de Santander, Cartagena. No notificaron casos de ETA: Caquetá, Guainía, Guaviare, San Andrés, Santa Marta, Tolima y Vaupés. Por lo anterior es necesario que la comunidad en general tenga y maneje algunos elementos mínimos que le permita prevenir estas enfermedades. (ttp://www.ins.gov.co). 2.1.1 Métodos de prevención de enfermedades transmitidas por alimentos Se han utilizado diversos procesos que tienen como fin evitar la proliferación microbiana en los alimentos, evitando así la aparición de ETA. Dentro de los métodos de control más utilizados se encuentran el tratamiento térmico (pasteurización, esterilización), irradiación (radiación UV), almacenamiento a bajas temperaturas (congelación, refrigeración), conservantes químicos (nitritos), conservación por medio de sustancias naturales que poseen actividad antimicrobiana, tales como los aceites esenciales derivados de plantas, entre otros (Adams, 1997). 2.2 Tratamiento térmico Desde hace varias décadas, el tratamiento de conservación por calor, ha sido la tecnología más utilizada para la conservación de alimentos. A través de los años, se ha conseguido la elaboración de alimentos microbiológicamente seguros y con baja actividad enzimática (Torres, 2007). El objetivo primordial de un tratamiento térmico consiste en la destrucción de microorganismos capaces de multiplicarse en el producto a la temperatura prevista de distribución o de poner en peligro la salud del consumidor. Para un número cada vez mayor de productos, el tratamiento térmico representa 8 solamente una parte del proceso de conservación, y suele aplicarse en combinación con otros procesos. Actualmente, el tratamiento térmico es uno de los tratamientos que hacen posible la existencia de productos sanos de larga vida comercial. El tratamiento térmico permite que las conservas se puedan almacenar a temperatura ambiente garantizando su seguridad (Rees, 1994). Las formas vegetativas de bacterias, levaduras y hongos se destruyen casi instantáneamente a 100°C y normalmente no constituyen ningún problema en el tratamiento térmico de las conservas, pero las esporas de ciertas especies bacterianas son extraordinariamente resistentes al calor y para su destrucción se necesita exponerlas, durante periodos prolongados de tiempo a altas temperaturas. La velocidad de destrucción es función del tiempo y la temperatura y varia con las diferentes especies; permaneciendo constantes los demás factores, la destrucción es tanto mas rápida cuanto más alta sea la temperatura. Por ello, las condiciones letales para un microorganismo no pueden expresarse diciendo que muere a tal temperatura, si no que es preciso señalar un tiempo de exposición a una temperatura determinada. (Herson, 1980). Los dos métodos mas utilizados hoy en día para la conservación de alimentos son la esterilización y la pasteurización (Torres, 2007). 2.2.1 Esterilización comercial La esterilización comercial es un tratamiento de conservación por calor que tiene como objetivo inactivar la totalidad de microorganismos patógenos y alteradores, y de enzimas presentes en el alimento permitiendo prolongar la vida útil del producto en condiciones microbiológicamente seguras a temperatura ambiente. Por lo general este tratamiento se denomina también HTST (high temperature-short time) o UHT (ultra high temperature) que supone aplicar temperaturas de proceso entre 100-120 ºC durante un periodo corto de tiempo (2-5 s) (Torres 2007). 9 La esterilización, como método de conservación se aplica con el fin de evitar la entrada de microorganismos y de oxígeno. El objetivo de la conserva, cuyo punto principal es la esterilización comercial, es destruir todos los microorganismos patógenos que puedan existir en el producto y prevenir el desarrollo de aquellos que puedan causar deterioro (Paltrinieri y Figuerola, 1993). La esterilización evita que sobrevivan los organismos patógenos o productores de enfermedades cuya existencia en el alimento y su multiplicación acelerada durante el almacenamiento, produciría serios daños a la salud de los consumidores. Los microorganismos se destruyen por el calor, pero la temperatura necesaria para destruirlos varía. Muchas bacterias pueden existir en dos formas, vegetativa o de menor resistencia a las temperaturas, y esporulada, o de mayor resistencia. Los microorganismos esporulados son los más difíciles de destruir mediante tratamientos térmicos, de manera que si el tratamiento es eficiente con ellos lo será con mayor razón con aquellos microorganismos más termosensibles (Paltrinieri y Figuerola, 1993). 2.2.2 Pasteurización La pasteurización es una de las más antiguas técnicas sabidas para la preservación de alimentos, basado en la degradación térmica parcial de microorganismos y en la desnaturalización de enzimas que presentan un riesgo potencial para los alimentos. Los procesos industriales de la pasteurización tienen que asegurar la prolongación del curso de la vida del alimento, mientras que por otra parte la calidad del producto debe ser preservada. La realización de ambos propósitos depende de las condiciones del proceso que aseguran el curso adecuado de la temperatura durante el proceso, donde está la consideración del perfil de temperatura dentro del producto de gran importancia (Plazl, 2006). 10 2.2.3 Causas de la muerte térmica y mecanismo de termorresistencia Estudios realizados por algunos autores reportan diferentes aspectos de la lesión térmica y recuperación de formas vegetativas. Estos autores concluyen que los datos que relacionan la estabilidad térmica de los ribosomas con la máxima temperatura de crecimiento indican que el RNA ribosómico juega un papel clave. Estudios recientes han demostrado que las alteraciones del DNA de las bacterias después de su choque térmico, son debidas posiblemente a la acción de las nucleasas nativas que se liberan o activan con tratamientos térmicos suaves. La lesión de la membrana citoplasmática que da lugar a una salida de los componentes celulares también se ha señalado como una causa que lleva a la incapacidad de recuperarse de la lesión térmica de las formas vegetativas. (Herson y Hulland, 1980). Durante el desarrollo de las esporas aumenta la termorresistencia de los microorganismos. Se han avanzado una serie de teorías en torno a la diferencia entre las células vegetativas y las esporas. Una de esas teorías es la deshidratación protoplasmática y la corteza contráctil y la otra teoría es la que implica el papel del ácido dipicolínico (DPA). Se ha descrito que la termorresistencia esporular es debida a que una gran porción de su contenido acuoso se encuentra en forma no disponible para participar en la coagulación de la proteína celular. La termorresistencia aumenta de forma gradual a medida que la concentración de agua del entorno disminuye. La gran resistencia de ciertas esporas en medios acuosos exige que la cubierta esporular tenga una permeabilidad acuosa muy baja, lo que es difícil por la permeabilidad de los materiales orgánicos. Por esta razón, otros autores postularon la corteza contráctil, según la cual la corteza de la espora se mantiene en un estado seco ejerciendo presión hidrostática a continuación de la contracción. Murrel y Warth lo interpretaron como apoyo a que la contracción de la corteza esporular estaba relacionada con la termorresistencia; sugirieron que en el mecanismo de contracción podía estar implicada la significativa relación entre cociente Mg/Ca y termorresistencia (Herson y Hulland, 1980). 11 Por otro lado Powell y Starng comprobaron que la sal cálcica del DPA constituye hasta 15% del peso seco de la espora, pero no de las formas vegetativas. Después de la germinación se libera esta sustancia con perdida de termorresistencia. Otras teorías apoyan la explicación que se basa en la deshidratación osmótica del protoplasma por la corteza que lo rodea, que es expansible e impermeable a los cationes multivalentes. Las condiciones más rigurosas exigidas para la destrucción de las esporas por calor seco son probablemente necesarias para los efectos deshidratantes suplementarios y la temperatura mayor que la necesaria puede lesionar el DNA de la espora. (Herson y Hulland, 1980). 2.2.4 Valores D y Z Para establecer la reducción en el número de microorganismos se requiere conocer el número inicial de microorganismos presentes en el alimento y someter los productos a diferentes métodos de eliminación. La gráfica que representa el logaritmo del número de células que permanecen vivas, en una suspensión bacteriana o esporular, en función del tiempo de exposición, a una temperatura constante, se le conoce como curva de supervivencia térmica (Herson y Hulland, 1980). En el caso de la inactivación térmica como es el secado (calor-seco) y cocción (calor-húmedo), la mortalidad de los microorganismos necesita ser determinada estimando el valor total de la destrucción (valor F0). La destrucción de microorganismos por calor es uno de los objetivos en el secado y la cocción. Estimar los valores F0 en las condiciones especificas de proceso, es importante para conocer los valores D y Z. El valor D es el tiempo de reducción decimal (h), indica el tiempo requerido para matar al 90% de población bacteriana a una temperatura específica. Otros autores resaltan que es el tiempo requerido para una reducción unidad log10 en el número de microorganismos a una temperatura del sistema (James, 2006). Valor Z, es la constante de resistencia térmica (ºC), es la medida del incremento de temperatura requerida para causar una reducción del 90% en el 12 tiempo de reducción decimal, se puede calcular si la inactivación térmica de las pruebas se realiza con diferentes temperaturas (James, 2006). Estos dos valores ofrecen la base para calcular el tiempo en los procesos del sector alimenticio. (Rahmana, 2004). 2.2.5 Factores que influyen sobre la determinación de la termorresistencia. Por otra parte, la disponibilidad del agua tiene también un gran impacto en la transferencia del calor a los microorganismos. La influencia de la actividad de agua en los microorganismos es compleja, combinando los factores intrínsecos (el potencial nutritivo, el pH, y los compuestos antimicrobianos como el SO2, nitratos, y nitritos) y factores extrínsecos (temperatura, oxígeno, tratamientos químicos, e irradiación), que varían en función de las clases de alimentos y de microorganismos. Los estudios han demostrado que la resistencia térmica de microorganismos aumenta mientras que su contenido en agua disminuye y ese nivel óptimo de la resistencia ocurre entre aw = 0.20 y 0.50, dependiendo del microorganismo estudiado (Larochea et al, 2005). Con independencia de las influencias evidentes del medio de suspensión, pH, actividad de agua, concentraciones de sal, etc. El factor más importante a tener en cuenta en un estudio de termorresistencia es la velocidad y el mecanismo de transferencia de calor. La penetración de calor es más lenta en alimentos más viscosos que en los tampones o en agua (Rees, 1994). 2.2.6 Las conservas y el tratamiento térmico Las conservas son productos que se mantienen durante largo tiempo contenidos en recipientes (de metal, vidrio o material flexible) herméticamente cerrados. La capacidad de conservación se logra con preferencia mediante tratamiento térmico, cuya acción consiste en reducir, destruir o frenar el notable desarrollo de los microorganismos presentes en las materias primas 13 conservadas (Sielaff, 2000). Durante el proceso es necesario, conservar las cualidades organolépticas y nutritivas (Hersom y Hulland, 1980). Para alcanzar la deseada capacidad de conservación resultan determinantes la temperatura utilizada y el tiempo de actuación de ésta. Los métodos más importantes de conservación son la pasteurización y la esterilización. En ellos, la temperatura y el tiempo de actuación son distintos. En la pasteurización se suelen aplicar temperaturas inferiores a 100ºC y no se logran destruir las esporas de los géneros Bacillus y Clostridium, pero si se garantiza la muerte de los microorganismos vegetativos. La esterilización se realiza con temperaturas superiores a 100ºC, con lo cual se logra la eliminación de las esporas de los géneros mencionados (Sielaff, 2000). 2.2.7 Transmisión del calor en el alimento envasado La velocidad con que se difunde el calor en el producto, depende decisivamente de la composición de éste. Los principales factores de influencia son la estructura, densidad, proporción entre componentes sólidos y líquidos, viscosidad y tamaño de los trozos o partículas. Atendiendo al mecanismo de transmisión del calor, los contenidos de las conservas pueden clasificarse así: 1. Productos en los que el calor se transmite por convección sin obstáculos. Entre ellos se cuentan por ejemplo, la leche condensada sin azúcar y determinadas salsas y sopas. 2. Productos calentados por conducción, como el jamón cocido y embutidos escaldados. 3. Productos calentados simultáneamente por conducción y convección. En este grupo se incluyen la mayoría de los productos cárnicos y preparados de pescado, fruta y verduras (Sielaff, 2000). 14 2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos Las sustancias esenciales naturales, se han utilizado desde épocas antiguas, como sustancias aromáticas y como preservantes. Los aceites esenciales cubren un amplio espectro de actividades tales como efectos farmacológicos, antiinflamatorios, antioxidantes y anticancerígenos. Otros son biocidas contra una amplia gama de organismos como bacterias, hongos, virus, protozoos, insectos y plantas. También se ha estudiado la importancia de estos aceites debido a su disponibilidad, a los pocos efectos secundarios o a la toxicidad que puedan causar, así como la mejor biodegrabilidad comparado con antibióticos y preservativos disponibles (Kalemba, 2003). Por todas estas propiedades, se ha evaluado el control que pueden ejercer estos compuestos contra microorganismos patógenos en alimentos, y por tanto, la posibilidad de ser utilizados como un método de eliminación. Muchas hierbas y especias han sido usadas durante siglos para proporcionar sabores diferentes a los alimentos y éstas pueden presentar también actividad antimicrobiana (Ultee et al, 2002). Los compuestos responsables de esta actividad son a menudo fracciones del aceite esencial, las cuales consisten principalmente en compuestos fenólicos (Conner, 1993). esenciales de plantas y sus componentes que Los aceites presentan actividad antimicrobiana (Akgul y Kivanc, 1988), tienen gran aplicación para el control del crecimiento de patógenos de alimentos por lo que se utilizan como método de preservación (Hao et al, 1998). Se ha reportado que la actividad antimicrobiana se deriva de terpenoides y compuestos fenólicos en los aceites (Yamazaki et al, 2003). Las plantas producen una gran cantidad de compuestos secundarios como protección contra ataques microbianos e insectos. De hecho muchos de éstos compuestos han sido usados en forma pura o extractos vegetales como alimento o aplicaciones médicas en humanos (Wallace, 2004). 15 Los aceites esenciales comúnmente se concentran en una región particular como hojas, corteza o frutos; y cuando esto ocurre en diferentes órganos en la misma planta, frecuentemente su composición es diferente (Oussalah et al, 2005). Aunque comúnmente se piensa que son derivados de hierbas y especias, están presentes hasta cierto punto en muchas plantas con un papel protector contra el ataque de bacterias, hongos o insectos. Éstos comprenden principalmente monoterpenos, hidrocarburos cíclicos y su alcohol, aldehído o derivados esteres. Recientemente, por ejemplo, se han demostrado los efectos positivos contra bacterias patógenas (Wallace, 2004). Se ha comprobado que los aceites de Cinnamomum osmophloeum poseen actividad antimicrobiana frente a Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Salmonella spp y Vibrio parahemolyticus, donde el cinamaldehído es el principal componente de la mezcla (Chang et al, 2001). E.coli O157:H7 es inhibido por el aceite del orégano (Elgayyar et al, 2001), de la hierbabuena (Imai et al, 2001) y aceites esenciales de otras plantas (Marino et al, 2001). Helicobacter pylori es altamente sensible al aceite de la menta verde (Imai et al, 2001). 2.3.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas Las plantas tienen una capacidad casi ilimitada para sintetizar sustancias aromáticas, siendo la mayoría fenoles o sus derivados oxígeno – sustituídos. En general son metabolitos secundarios (es decir, que no tienen un papel esencial en el metabolismo de las plantas) (Walton et al, 1999), de los cuales por lo menos el 10% se han aislado. En muchos casos, estas sustancias sirven a la planta como mecanismos de defensa contra el ataque de microorganismos, insectos y herbívoros. Algunos como los terpenoides, proporcionan a la planta sus olores, otros (quinonas y taninos) son responsables del pigmento de la planta (Murphy, 1999). 16 Dentro de los compuestos presentes en los extractos vegetales que poseen actividad antimicrobiana, se pueden mencionar el timol, el carvacrol, o el eugenol; algunos autores como Conner en 1993, reportaron la alta actividad antimicrobiana de éstos compuestos en forma pura. Con respecto al carvacrol, se ha visto que se encuentra presente en aceites esenciales de orégano (60% a 70% de carvacrol) y tomillo (45% de carvacrol). La inhibición del crecimiento de muchos patógenos por el carvacrol, ha sido reportada en varios artículos, sin embargo no se ha definido el mecanismo de acción de éste. Usando B. cereus, un esporoformador patógeno en alimentos, como organismo modelo, se ha demostrado que la exposición de las células vegetativas a concentraciones de carvacrol mayores a 1 mM, conduce a una extensión de la fase de latencia, una tasa baja de crecimiento máximo específico y una densidad final de población baja. También se ha visto que a concentraciones por encima de 1 mM, la viabilidad de B. cereus decrece exponencialmente. Al mismo tiempo hay un incremento en la fluidez de la membrana y salida de protones e iones potasio, conduciendo a una disminución en el gradiente de pH a través de la membrana citoplasmática, un colapso en el potencial de membrana e inhibición de la síntesis de ATP. Finalmente estos eventos, son seguidos por la muerte celular (Ultee et al, 2002). Por otra parte, el timol es un isómero del carvacrol que se ha visto implicado en la desintegración de la membrana externa y en el incremento de la permeabilidad de la membrana citoplasmática al ATP en células de Escherichia coli y Salmonella thyphimurium. El timol y el cimol (precursor biosintético del timol) son ejemplos de preservativos naturales que han sido reportados por tener efectos inhibitorios sobre bacterias y hongos (Delgado et al, 2003). Otros de los compuestos derivados de plantas que poseen actividad antimicrobiana son los fenólicos y polifenoles dentro de los cuales se encuentran: quinonas; flavonas, flavonoides y flavonoles; taninos; y cumarinas. 17 Otros son los terpenoides y aceites esenciales, los alcaloides, lecitinas y polipéptidos, entre otros (Murphy, 1999). 2.3.2 Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites esenciales Para la evaluación antimicrobiana de aceites esenciales, se aplican generalmente métodos convencionales probados con capacidades antibióticas. Hay dos técnicas básicas usadas para la valoración de ambas actividades, antibacteriales y antimicóticas de los aceites esenciales: 1. El método de difusión en agar (pozo o disco de papel) y 2. El método de dilución (agar o caldo líquido). Las pruebas y evaluación de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales son difíciles debido a su volatilidad, insolubilidad en agua y complejidad (Kalemba y Kunicka, 2003). Los aceites esenciales son de naturaleza hidrofóbica y de gran viscosidad. Estas características pueden reducir la capacidad de la dilución o pueden causar distribución desigual del aceite a través del medio, aún si se usa un agente correcto disgregante o solubilizante. Se tiene que comprobar si las concentraciones aplicadas del emulsor o del solvente no afectan el crecimiento y la diferenciación de los microorganismos de prueba (Kalemba y Kunicka, 2003). Los cultivos de microorganismos se realizan en medios líquidos, bajo condiciones físicas óptimas para las especies individuales. Los microorganismos tienen que alcanzar una fase apropiada del crecimiento, y un número especificado de células tiene que ser utilizado para la prueba (Kalemba y Kunicka, 2003). 18 2.3.2.1 Método de difusión en agar El método permite estimar el grado de inhibición del crecimiento de los microorganismos y sus cambios morfológicos de una manera simple. En las cajas de Petri con agar se inocula el microorganismo de prueba; existen dos métodos posibles para la incorporación del aceite esencial que son: en un disco de papel (Omer et al, 1998.) o en un pozo hecho en medio del agar (LisBalchin et al, 1998). El aceite esencial no se usa a menudo en forma pura, generalmente se utilizan sus soluciones. Se preparan en cajas de Petri, soluciones del aceite esencial en diferentes concentraciones y los discos de papel son sometidos a inmersión. Las placas se almacenan durante algún tiempo para permitir que todos los componentes del aceite esencial se difundan dentro del agar, después se incuban. La eficacia del aceite esencial es demostrada por tamaño de la zona de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor del disco y se expresa generalmente como el diámetro de esta zona (milímetros o centímetros) (Kalemba, 2003). 2.3.2.2 Método de dilución El método de dilución en serie en agar se utiliza para bacterias y hongos y su modificación con caldo líquido se usa solo para hongos. Los cultivos de agar se realizan en cajas de Petri o en tubos, mientras que los cultivos líquidos se realizan en frascos cónicos con un volumen de 100 ml de medio. Para el caldo líquido en frascos cónicos, el índice de crecimiento inhibitorio se calcula (% de los cambios en la biomasa del hongo comparando con el cultivo control) (Kalemba y Kunicka, 2003). Los resultados se pueden presentar en dos maneras: *El índice de inhibición de crecimiento definido como la proporción porcentual para el cultivo de crecimiento de control sin aceite esencial. 19 * La concentración mínima inhibitoria (MIC) o la máxima dilución inhibitoria (MID). La restricción en el crecimiento de los microorganismos (análisis de la actividad bacteriostática y fungistática) o la concentración mínima letal (MLC) (análisis de la actividad bactericida y fungicida) (Kalemba, 2003). La actividad de aceites esenciales contra hongos puede ser también investigada comprobando la inhibición de la esporulación (Akgül et al, 1988) y productividad de la toxina. La concentración mínima inhibitoria se define como la concentración más baja del aceite esencial en el caldo, dando por resultado la carencia de los cambios visibles del crecimiento del microorganismo (Kalemba, 2003). Para estimar la actividad letal del aceite esencial, los microorganismos se transfieren del caldo líquido o al agar donde no se observa crecimiento en un nuevo medio. La concentración más baja del aceite esencial que da por resultado la inhibición total del crecimiento, se reconoce como la concentración mortal mínima, MCB para las bacterias (concentración mínima bactericida) y MCF para los hongos (mínima concentración fungicida). A veces MCL (concentración mínima letal) se define como la concentración resultante dando por resultado una reducción del >99.9% del número de microorganismos en el inóculo (Kalemba, 2003). 2.4 Minthostachys mollis Una especie promisoria por sus aceites esenciales es Minthostachys mollis (Lamiaceae), planta nativa de la cordillera de los Andes desde Venezuela hasta Bolivia, con amplio rango altitudinal (1000-3400 m). Es un subarbusto aromático de hasta 50 cm de altura, leñoso hacia la base, con hojas ovadas y pubescentes e inflorescencias axilares en cimas (Alkire et al, 1994) (Figura 2). En Colombia ésta se encuentra en las tres cordilleras y la Sierra Nevada de Santa Marta (Chica-Balaguera et al, 2006). 20 Figura 2. Fotografía de Minthostachys mollis Fuente: Autores M. mollis es conocida como muña en el Perú, peperina en Argentina y orégano en Colombia, y es utilizada en medicina popular para tratar los cólicos estomacales y ciertos trastornos gripales (White, 1985; Acero Coral y Rive, 1994; Beltrán y Cedillo, 1994). El uso más conocido tiene que ver con la preservación de la papa en condiciones de almacenamiento; se ha señalado que los campesinos de la sierra peruana la han utilizado desde hace muchos años con este fin, igualmente ha tenido uso como condimento y preservativo de alimentos. En Colombia es utilizada en forma similar por los campesinos del altiplano cundiboyacense. De otro lado, Raman y Booth (1987) encontraron que posee propiedades repelentes que controlan la polilla de la papa (Phthorimaea operculella); además según Aliaga y Feldeheim (1985) reduce el brotamiento y daño de este tubérculo al ser almacenado en cámaras que contengan esta planta. En algunos lugares de Colombia la emplean como repelente contra las pulgas y podría igualmente utilizarse para el control del gorgojo del fríjol, Acanthoscelide obtectus (Chica-Balaguera et al, 2006). 21 Diferentes estudios de la composición química del aceite esencial de Minthostachys han reportado los compuestos carvacrol , pulegona, mentona, isomentona, β-pineno y limoneno, mentol en cantidades relativas que varían desde 9.3% hasta 65.8% (Figura 3) Figura 3. Algunos de los componentes de Minthostachys mollis determinada por Chica, et al 2006, con su respectiva estructura. Fuente: (Kalemba y Kunicka, 2003) 22 2.5 Listeria monocytogenes 2.5.1 Generalidades Listeria monocytogenes es un bacilo Gram positivo, aerobio, psicrótrofo, halo tolerante, no móvil, no esporulado, este microorganismo se ha aislado de muchos alimentos, tales como carnes y productos cárnicos, quesos blandos, helados, verduras y hortalizas y alimentos de origen marino (ICMSF, 2000). L. monocytogenes es un microorganismo que no era considerado como un importante patógeno transmitido a través de los alimentos hasta hace relativamente poco tiempo y, en consecuencia, no había recibido mucha atención por parte de la industria alimentaria (Bell et al, 2000); sin embargo actualmente L. monocytogenes es un microorganismo zoonótico emergente en la industria de alimentos (Torres et al, 2004), es un contaminante ambiental ampliamente distribuido cuyo medio primario para la transmisión al hombre es a través de la contaminación de los alimentos en cualquier punto de la cadena alimentaria, desde el origen hasta la cocina y ha sido reportada como la causante de la listeriosis humana, por esta razón resulta de gran interés para la salud pública (Bell et al, 2000). Es importante enfocarse en la enfermedad producida por el consumo de alimentos contaminados con este microorganismo, pues la listeriosis humana ha sido reportada y es considerada de grave naturaleza desde la década de los 80, puesto que cursaba con altos índices de mortalidad, en particular sobre los miembros mas vulnerables de la población como son los niños neonatos, los ancianos y los inmunosuprimidos. (Bell, et al, 2000). Los individuos susceptibles tienden a ser muy jóvenes, mayores o mujeres embarazadas quienes son particularmente susceptibles a la listeriosis. 23 2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes L. monocytogenes ha causado una considerable preocupación en la industria alimenticia, a funcionarios reguladores de la salud y consumidores (Selby et al, 2006), pues este microorganismo puede adaptarse para sobrevivir, crecer en una gran variedad de condiciones ambientales y causar listeriosis (Mead et al. 1999), entre éstas condiciones se encuentra la capacidad de crecer sobre una amplia gama de temperaturas (2-45°C), su supervivencia y crecimiento en las temperaturas de refrigeración (2-4°C) (Gandhi y Chikindas, 2007) y la mayor resistencia térmica concerniente a otros patógenos transmitidos por los alimentos (Piyasena, 1998). Se sabe que las células contienen varios blancos para la acción térmica, pero ha sido propuesto por Miller, et al (2006) que la resistencia basal de calor de estos microorganismos podría ser debida a la estabilidad intrínseca de macromoléculas, o sea ribosomas, ácidos nucleicos, enzimas y proteínas dentro de la célula y la membrana (Miller et al, 2006). Los lípidos en las membranas de las células bacterianas son un fluido, su condición cristalina y ésta condición física es importante para mantener la fluidez y la función de la membrana. Los cambios en la temperatura conducen a una alteración en la composición de los lípidos de la membrana para mantener la fluidez ideal requerida para la actividad enzimática y el transporte de solutos a través de la membrana. Una proporción alta de ácidos grasos iso y anteiso con números impares de cadenas conectadas, caracterizan la membrana de la célula de Listeria (Gandhi y Chikindas. 2007). 24 2.6 Bacillus cereus 2.6.1 Generalidades B. cereus es un microorganismo esporoformador, aerobio facultativo, Gram positivo, móvil que se puede aislar de una variedad de sitios diferentes. (Kotiranta et al, 2000). Este microorganismo es capaz de causar enfermedad transmitida por alimentos. Dos síndromes pueden ser distinguidos, un síndrome emético y un síndrome diarreico. El síndrome emético es causado por la toxina cereulida, un péptido estable al calor y al pH. El síndrome diarreico es causado por enterotoxinas que son producidas durante el crecimiento de B. cereus en el intestino delgado. Se presentan tres enterotoxinas capaces de causar el síndrome diarreico y pueden ser descritas como: hemolisina BL (HBL), enterotoxina no hemolítica (NHE) y citotoxina K. HBL Y NHE tienen tres componentes proteicos, mientras que la cititoxina K es una sola proteína. El mecanismo del síndrome se cree que es: el consumo de comida contaminada con las esporas y/o las células vegetativas de B.cereus. Las esporas pasan a través del estómago y alcanzan el intestino delgado, germinan, crecen y de este modo se producen las enterotoxinas. Las células vegetativas se cree que son muy susceptibles a las condiciones del estómago por lo tanto es difícil el alcance al intestino delgado. (Wijnands et al, 2006). La forma clásica de intoxicación alimentaria por B .cereus se conoce desde comienzos del siglo, pero es a partir de 1950 cuando se han escrito numerosos brotes atribuibles de forma definitiva a este microorganismo (ICMSF, 2000). 2.6.2 Termorresistencia de Bacillus cereus Los microorganismos aeróbicos formadores de esporas como las especies de Bacillus reciben especial atención en producción de alimentos, por su amplia distribución en el ambiente. Se ha demostrado la resistencia de sus endosporas a condiciones adversas y a varias condiciones de estrés debido a 25 su aislamiento de muchos alimentos crudos y procesados alrededor del mundo (Claus y Berkeley, 1986). Debido a la capacidad de B. cereus para producir esporas que sobreviven a altas temperaturas y crecer a bajas temperaturas (Gonzáles et al, 1995), este microorganismo representa un riesgo asociado a enfermedad transmitida por alimentos (Amodio et al, 1998). Se ha reportado que la resistencia al calor de las esporas bacterianas depende de la actividad del agua del medio en el cual éstas son suspendidas durante el calentamiento. La máxima termoestabilidad para esporas de muchos microorganismos fue encontrada en una actividad de agua de un rango entre 0.2 – 0.4 (Pfeiffer y Kessler, 1994); también se ha visto que la resistencia al calor de las esporas microbianas incrementa cuando se someten al calor en presencia de altas concentraciones de soluciones de sales y azúcares ( Bell y De Lacy, 1984). En general, las esporas son resistentes a los tratamientos de pasteurización, el tratamiento térmico en productos procesados (90-95°C por 6-10 min) usualmente no es suficiente para inactivar todas las esporas (Rozier y Carlier, 1997). Es importante conocer y predecir la habilidad de las esporas para sobrevivir al tratamiento térmico y el efecto de las condiciones ambientales en su subsiguiente crecimiento en alimentos. La resistencia térmica y la duración de la fase de germinación después del tratamiento térmico son dos parámetros importantes para estimar la seguridad de los alimentos (Laurent et al, 1999). Se ha reportado que las esporas Bacillus cereus son capaces de resistir una temperatura de 95°C (Byrne et al, 2006; Anonymous, 2000). Además se ha visto que las condiciones del medio como pH, naturaleza de los acidulantes y temperatura, también se relacionan con la resistencia al calor de las esporas (Laurent et al, 1999). La termorresistencia de las esporas bacterianas se ve muy influenciada por factores ambientales durante: (1) la esporulación; (2) el tratamiento térmico y (3) la recuperación. Además, cuanto mayor sea el número inicial de esporas, 26 mayor será el tiempo necesario para llevar a cabo su destrucción (Hersom y Hulland 1980). 27 3. JUSTIFICACIÓN Los alimentos pueden ser un vehículo de transmisión de microorganismos patógenos y por tanto tienen gran trascendencia en la salud de los consumidores. La adquisición de enfermedades por el consumo de alimentos contaminados con microorganismos como L. monocytogenes y B. cereus ha hecho que cada vez más países reconozcan la necesidad de someter estos productos a ciertas pruebas o estudios enfocados a evaluar su inocuidad y su calidad. Actualmente se conocen muchas técnicas para el control e inhibición de microorganismos con el fin de preservar los alimentos, una de éstas es la adición de sustancias de origen natural que le provean al alimento calidad microbiológica y al mismo tiempo permitan sustituir los aditivos químicos. Igualmente el tratamiento térmico ha sido uno de los métodos más comúnmente utilizados para la conservación de los alimentos, especialmente en conservas. Por lo anterior, en el presente estudio se quiso evaluar la actividad antimicrobiana del extracto de Minthostachys mollis sobre L. monocytogenes y B. cereus y determinar el tiempo y temperatura necesarios para inactivar éstos microorganismos mediante curvas de inactivación tanto en medio de cultivo como directamente en el alimento, en este caso una conserva. 28 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general Evaluar el efecto de la inactivación térmica y el aceite esencial de M. mollis sobre cepas de Bacillus cereus y Listeria monocytogenes. 4.2 Objetivos específicos • Determinar el tiempo que requieren las monocytogenes y Bacillus cereus para llegar a cepas de Listeria la fase estacionaria, mediante curvas de crecimiento. • Evaluar la termorresistencia de las cepas, mediante la elaboración de curvas de muerte térmica en caldo BHI y en conserva a base de tomate. • Obtener el aceite esencial de la planta, mediante una técnica de hidrodestilación. • Establecer el efecto bacteriostático o bactericida del aceite esencial obtenido de Minthostachys mollis, sobre Listeria monocytogenes y Bacillus cereus en conservas a base de tomate. • Combinar la inactivación térmica y el aceite esencial sobre las cepas a evaluar para realizar la prueba en conservas. 29 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Obtención de cepas Se trabajó con las cepas 146, 142, y 196 de Listeria monocytogenes aisladas previamente de productos cárnicos y la cepa de Bacillus cereus que se obtuvo de una colección del cepario de la Pontificia Universidad Javeriana (Correa, 2004). 5.2 Elaboración del banco de células primario (BCP) Las cepas de L. monocytogenes se recuperaron en agar Oxford. Para su posterior criopreservación fue necesario tomar una parte de este cultivo, inocularla en 36 mL de caldo BHI adicionado con 0.5% de glucosa y llevar a incubación durante 24 horas a 37ºC, 130 rpm. Finalizado este tiempo, se le adicionó al cultivo 4 mL de glicerol estéril y se distribuyó en tubos eppendorf cada uno conteniendo un volumen de 1 mL (Molina et al, 2005). Los tubos fueron almacenados a – 70ºC durante todo el estudio. Por otra parte la cepa de B. cereus se recuperó en agar Bacillus cereus y se procedió de la misma forma para su criopreservación sustituyendo la glucosa al 0.5% por almidón al 1% , para su posterior almacenamiento. Durante los 6 meses del estudio se realizaron pruebas de pureza a las cepas utilizadas; esto se hizo mediante tinciones de Gram. 5.3 Curvas de crecimiento Se realizaron curvas de crecimiento para cada una de las 3 cepas de L. monocytogenes por triplicado. Para esto se descongeló un vial de cada cepa y se inoculó en 20 mL caldo BHI adicionado de 0.5% de glucosa (preinóculo), después se incubó a 37°C con agitación de 130 rpm durante toda la noche. Posteriormente se adicionaron los 20 mL de cultivo crecido en 200 mL del 30 mismo caldo para iniciar la curva de crecimiento, en el transcurso de este tiempo se tomaron muestras del inóculo, las dos primeras horas cada 15 minutos y después de estas dos horas cada 30 minutos, este procedimiento seguido de la medición por duplicado de la absorbancia del inóculo a 620 nm, utilizando caldo BHI estéril con glucosa al 0.5% como blanco, al finalizar las 12 horas, se observó que el cultivo alcanzó la fase estacionaria (Román, 2004., Rojas, 2007). Para B. cereus la cinética de crecimiento se obtuvo como se describe a continuación: las curvas se llevaron a cabo durante 24 horas, bajo agitación 130 rpm y una temperatura de 30°C. Para esto fue necesario descongelar las cepas, inocularlas en 20 ml de caldo BHI con almidón al 1% y dejar en incubación durante toda la noche, posteriormente se transfirió el cultivo a 200 mL de caldo BHI con almidón al 1%, se tomaron muestras y se hizo lectura de absorbancia y recuento en placa, (Delgado et al, 2003). Adicionalmente se realizó un modelo matemático de la cinética de crecimiento de B. cereus en “Combase predictor”, para identificar las fases de crecimiento del microorganismo bajo condiciones estándar (caldo tripticasa de soya, pH 7, temperatura de 30 °C, Aw de 0.997). Durante la realización de las curvas de crecimiento se hicieron diluciones seriadas en agua peptonada al 0.1 % y se sembraron en profundidad las diluciones 10-7 y 10-8 en agar TSAYE y TS para L. monocytogenes y B. cereus respectivamente, para luego hacer recuentos. 31 5.4 Evaluación de la termorresistencia 5.4.1 Elaboración de curvas de inactivación térmica Para realizar las curvas de inactivación térmica de B. cereus fue necesario descongelar los viales y colocarlos a crecer durante 18 horas en caldo BHI con almidón al 1% para que el cultivo alcanzara la fase estacionaria (Román, 2004). Posteriormente, se sirvieron tubos con 10 mL de cultivo para someterlos a las temperaturas a evaluar (55ºC, 60ºC y 70ºC) durante 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 60 minutos. De cada tiempo se realizaron diluciones seriadas de 10-1 a 10-10 en agua peptonada al 0.1% para hacer recuentos en profundidad en agar TS por duplicado. Cada curva se realizó por triplicado para cada temperatura. (Molina et al, 2006) Por otra parte, las curvas de L. monocytogenes se realizaron de la misma forma pero evaluando temperaturas de 52, 55 y 57°C y, tiempos de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30 y 60 minutos. Los recuentos se realizaron de la misma manera que con las curvas de B.cereus, reemplazando el agar TS por TSAYE. 5.4.2 Elaboración de la salsa y evaluación de termorresistencia en salsa. Para la elaboración de la salsa sobre la cual se evaluó la termorresistencia se pesaron diferentes cantidades de los ingredientes a utilizar (tomate, cebolla, ajo, aceite, sal, salsa de tomate y azúcar) hasta obtener el sabor, color y contextura deseada. Se obtuvieron 11 conservas con características distintas y se realizó una selección de una de ellas con base en las características organolépticas requeridas y al mismo tiempo teniendo en cuenta las opiniones de las personas del laboratorio de microbiología de alimentos de la Universidad Javeriana, acerca de sabor, color, etc. Después de seleccionar la salsa, se llevó a esterilización y se sirvieron 200 mL en frascos de vidrio; para después inocular 20 mL del cultivo crecido previamente durante 12 y 24 horas para L.monocytogenes y B.cereus respectivamente. Luego, se procedió a evaluar 32 las mismas temperaturas usadas durante la elaboración de las curvas ya mencionadas. Igualmente se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada de cada tiempo y recuentos en agar TS para B. cereus y TSAYE para L. monocytogenes. Para esto fue necesario pesar 10 g de salsa e inocularlos en 90 mL de agua peptonada para seguir haciendo las diluciones (Carrascal y col. 2003) 5.5 Obtención de la planta Las plantas de M. mollis se recolectaron en el jardín botánico de la Universidad Nacional, Bogotá, Colombia. Este procedimiento de recolección se realizó en compañía de un asesor experto en la obtención de Minthostachys mollis. 5.5.1 Obtención del aceite esencial de Minthostachys mollis De una misma población de individuos de M. mollis propagados bajo condiciones controladas, se tomaron muestras frescas (500 g) de la parte aérea de plantas en el mismo estado de desarrollo (vegetativo, floración o fructificación), se sometieron a hidrodestilación por 2 horas. La fracción de aceite esencial extraída se recolectó en un vial, para congelarlo a -10 °C y centrifugarlo a 12000 rpm durante 10 min, con el fin de separar la fase acuosa de la oleosa, y se almacenaron a 4 ºC para los análisis posteriores (ChicaBalaguera et al, 2006., Tepe et al, 2005). 5.6 Evaluación de la actividad antimicrobiana. 5.6.1 Método difusión en agar con disco para bacterias 5.6.1.1. Preparación del inóculo Para la obtención del inóculo de L. monocytogenes se realizó un pool con las cepas 146, 142 y 196, las cuales se adicionaron en 200 mL de caldo BHI con 33 glucosa al 0.5% y se llevaron a incubación durante 12 horas a 37ºC, 130 rpm. En el caso de B. cereus, se inoculó en 200 mL de caldo BHI adicionado con almidón al 1% y se llevó a incubación durante 18 horas a 30ºC, 130rpm. Transcurrido el tiempo de incubación para cada microorganismo, se ajustó la concentración del inóculo haciendo diluciones con caldo BHI adicionado de 0.5% de glucosa o 1% de almidón para L. monocytogenes y B. cereus respectivamente, y se midió su absorbancia con el espectrofotómetro GENESYS, hasta obtener un valor de 0.25 equivalente a concentración de 108 células/ mL (Molina et al, 2005). A partir de este inóculo se realizó una siembra masiva en cajas de Petri; para L. monocytogenes se utilizó agar para antibiótico adicionado de sangre al 5% y extracto de levadura al 0.5% (comunicación personal Gallegos, 2006) y para B. cereus agar para antibiótico. Las placas de Petri se utilizaron de la siguiente forma: se realizaron 5 réplicas donde una caja contenía el disco impregnado con el aceite esencial puro, otra caja el disco con el control positivo (ampicilina o vancomicina para Listeria monocytogenes y Bacillus cereus respectivamente) y la última caja el control negativo que en este caso se utilizó un disco estéril. Los discos utilizados se cortaron de papel Whatman No 3 (6mm) y se esterilizaron previamente (Bauer-Kirby, 1966; NCCLS, 2003). 5.7. Análisis estadístico Se realizó una comparación de medias para establecer si existía diferencia estadísticamente significativa entre las diferentes temperaturas utilizadas para cada una de las cepas de inactivación térmica, usando el programa SAS-9 para Windows. 34 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 Prueba de pureza y viabilidad de los bancos de células. Los resultados de pureza y viabilidad de las cepas evaluadas, se muestran en las tablas 1 y 2 respectivamente. Tabla 1. Pruebas de pureza FECHA DE PRUEBA 14 de Enero de 2007 20 de Febrero de 2007 Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo positivo esporulado Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo positivo CEPA L. monocytogenes código 146 L. monocytogenes código 142 L. monocytogenes código 196 Bacillus cereus 17 de 10 de 22 de Marzo de Abril de Mayo de 2007 2007 2007 COLORACIÓN DE GRAM Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo positivo esporulado 8 de Junio de 2007 Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo pequeño positivo Bacilo positivo esporulado Tabla 2. Pruebas de viabilidad de los BCP. CEPA Fecha de prueba : 14 de Enero de 2007 Recuento (UFC/mL) Listeria monocytogenes código 146 30x108 Listeria monocytogenes código 142 17x108 Listeria monocytogenes código 196 21x108 Bacillus cereus 12x109 35 Figura 4. Fotografía de coloración de Gram de L. monocytogenes. Fuente: Autores Figura 5. Fotografía de la coloración de Gram de B.cereus. Fuente: Autores En la tabla 1 se muestran los resultados de las pruebas de pureza realizadas durante el estudio, en las cuales se obtuvieron las morfologías que se muestran en la figura 4, coincidiendo con lo reportado por Bell et al, 2000 para Listeria monocytogenes, que corresponden a bacilos Gram positivos en algunos casos en forma de Y o V. En el caso de la morfología de B. cereus (figura 5), se observaron bacilos Gram positivos esporulados, coincidiendo con lo reportado por Delgado et al, 2004. Lo anterior demuestra que el método de preservación 36 utilizado en este caso, criopreservación con glicerol, fue favorable ya que es un método que protege a las bacterias durante el almacenamiento en congelación (Lynn, 2004). El glicerol actúa a nivel de membrana celular limitando el efecto de la deshidratación celular, disminuyendo el punto de congelación de líquidos biológicos intra y extracelulares y promoviendo la vitrificación en lugar de la formación de cristales de hielo intracelulares (Rojas, 2007). Con relación a L. monocytogenes, podría decirse también que su tolerancia al frío se relaciona con la lipoproteína OppA, pues ésta media el transporte de ologopéptidos dentro de la pared celular, involucrándose en la crioprotección por medio de la acumulación de osmolitos como la glicina betaína (Borezee et al, 2000). Se ha reportado que L. monocytogenes acumula glicina betaína para adaptarse a bajas temperaturas (Molina et al, 2006). Un banco de células es un cultivo microbiano puro, homogéneo; almacenado bajo condiciones que aseguran su estabilidad genética (Meza, 2004), evita la alteración de las características bioquímicas, secuencia nucleotídica, estabilidad plasmática, reconocimiento inmunológico, actividad biológica, características morfológicas, retarda la muerte de los microorganismos, previene la contaminación y mantiene la viabilidad de los microorganismos (Monroy et al, 2002). De acuerdo a lo anterior, se evidenció que las cepas de L. monocytogenes y B. cereus conservaron sus características y mantuvieron estabilidad, pues durante todo el estudio hubo poblaciones de 108 UFC/mL y 109 UFC/mL para L. monocytogenes y B. cereus respectivamente (tabla 2). 6.2 Cinética de crecimiento de L. monocytogenes y B. cereus. Con la realización de las curvas de crecimiento de las 3 cepas de L. monocytogenes en estudio, se evidenció que todas alcanzaron la fase estacionaria en 12 horas (Fig. 6), lo cual corresponde con lo mencionado por Aldana, 2000 y Robinson et al, 2001. En este estudio se pretendía conseguir la fase estacionaria ya que se ha reportado que es el momento en el cual los 37 microorganismos adquieren mayor resistencia; además en esta fase se han encontrado ciclos de división reductiva, incremento en la estabilidad del ARN y en la resistencia a condiciones de estrés en bacterias patógenas (Arraíz et al, 2002). Según Robinson et al, 2001, las células en fase exponencial son generalmente más frágiles y susceptibles a la injuria que en la fase estacionaria. L. monocytogenes en fase estacionaria aumenta la expresión del gen prfA, el cual proporciona un mecanismo por el que las células pueden responder a condiciones adversas de crecimiento. También se sabe que las células contienen varios blancos para la acción térmica, pero ha sido propuesto por Miller et al, 2006, que la resistencia basal de calor de estos microorganismos podría ser debida a la estabilidad intrínseca de macromoléculas, o sea ribosomas, ácidos nucleicos, enzimas y proteínas dentro de la célula y la membrana (Rojas, 2007). 38 C u rva crecim ien to Listeria mon ocytogenes C ep a 142 curva 2 Abs a 620 nm 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 12 13 12 13 Tie m po (hora s) C u rv a c re c im ie n to L is te ria m o n o cy to ge n e s C epa 196 Abs 620 nm 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 T ie m p o (h o ra s) C urva crecimiento Listeria monocytogenes C epa 146 Abs 620 nm 0,6 0,4 0,2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tie m po (hora s) Figura 6. Curvas de crecimiento de Listeria monocytogenes 39 Por otra parte, B. cereus alcanzó su fase estacionaria en un tiempo de 18 horas como se puede observar en la figura 7. Al comparar los datos obtenidos en el programa “Combase predictor”, donde B. cereus en condiciones ideales alcanza la fase estacionaria en 12 horas, los resultados obtenidos en esta investigación difieren por la siguiente razón: el medio utilizado en el programa es caldo tripticasa de soya, mientras que en este estudio se utilizó caldo BHI suplementado con almidón, lo que podría explicar el alargamiento de la fase logarítmica; B. cereus posee amilasas que son activadas en presencia de almidón, y como sucedió en este estudio, la cepa inició una segunda fase (fase de diauxia), una vez terminado el consumo de glucosa en el medio, pues en este caso tenía dos sustratos alternativos (Fernández, 1999). Es posible que si en esta investigación no se hubiera adicionado almidón al medio, la fase estacionaria se hubiera obtenido en 12 horas. La razón por la que se adicionó almidón, fue simular las condiciones de las conservas donde se usan almidones modificados que mantienen la estabilidad reológica del producto, pues este microorganismo causa deterioro en las conservas (Hersom y Hulland, 1980) el cual se evidencia por la aparición de vetas blancas y acidez en el producto (Rees y Bettison, 1994). Cabe resaltar que en estudios para evaluar actividad antimicrobiana o temperaturas altas, se trabaja con las cepas en fase estacionaria ya que éstas corresponden a condiciones adversas y como ya se mencionó, los microorganismos son más resistentes durante la fase estacionaria (Robinson et al, 2001). 40 Curva de crecimiento Bacillus cereus Abs 620 nm 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Tiempo (horas) Figura 7. Curva de crecimiento de B. cereus 6.3 Elaboración de la conserva En la figura 8 se muestran los componentes, cantidades y apariencia de la salsa escogida. Como se mencionó en la metodología, se prepararon conservas con diferentes cantidades de ingredientes y se seleccionó la que cumpliera con las características requeridas como viscosidad, olor, sabor, color, etc. para una conserva a base de tomate. La valoración de la calidad sensorial puede servir para determinar los efectos del tratamiento térmico sobre los alimentos, o sobre su aceptabilidad (gustan-no gustan). Por ejemplo, el sabor se valora mediante el sentido del gusto (dulce, salado, amargo, ácido) y del olfato (compuestos volátiles), y suele ser valorado en la boca a la temperatura en que el alimento (o bebida) es consumido normalmente. La textura puede ser valorada visualmente, por ejemplo la viscosidad mediante el tacto (Rees y Bettison, 1994). Otros requerimientos para salsa de tomate por ejemplo, son: su aspecto debe ser completamente homogéneo; su color rojo uniforme, no deberá presentar partes decoloradas o ennegrecimiento, su olor y 41 sabor deben ser propios del producto (Quintero, 2003). Con base en esto, se seleccionó la salsa número 10 y se descartaron las otras 10 obtenidas (anexo 3). Ingrediente Tomate Azúcar Cebolla Ajo Color Agua Aceite Salsa de tomate Sal Cantidad 150 g 1g 5g 0.5 g 0.2 g 20 mL 2 mL 4g 0.1 g Figura 8. Salsa seleccionada a base de tomate. 42 6.4 Evaluación de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus (en caldo BHI y sobre alimento) 6.4.1 Inactivación térmica de L. monocytogenes Al analizar los datos obtenidos en las curvas de inactivación térmica (figura 9) se puede observar que durante la evaluación en las diferentes temperaturas, la cepa mostró una mayor termorresistencia cuando se sometió a la temperatura en caldo BHI adicionado de 0.5% de glucosa, que lo obtenido en la evaluación directamente sobre el alimento (conserva a base de tomate). Aunque podría esperarse una mayor termorresistencia en la conserva debido a su composición, viscosidad, Aw que al ser menor induce una mayor termorresistencia (Hersom y Hulland, 1980); no fue así probablemente porque esta resistencia por parte de la célula pudo verse afectada por el pH del medio, pues el alimento evaluado poseía un pH ácido (5.0) y se ha demostrado que la mayoría de microorganismos generalmente presentan su resistencia máxima a pH neutro, disminuyendo su termorresistencia a medida que el pH aumenta o disminuye (Hersom y Hulland, 1980); en este caso se pudo dar una mayor destrucción de los microorganismos debido a la acidez del medio. Se ha demostrado que el comportamiento de L. monocytogenes en los alimentos, depende de la interacción de los efectos de temperatura, pH, tipo de acidulante, contenido de sal, Aw, así como tipos y concentraciones de aditivos presentes (Ryser, 1999), y en este estudio se presentó la interacción de 3 factores: temperatura, pH y concentración de NaCl. Es importante señalar, que en los 2 medios evaluados (medio de cultivo y conserva) la transferencia de calor es igual, es decir, la viscosidad del fluido no afecta la transferencia de calor porque en los 2 casos se da por convección; con lo cual se puede afirmar que el pH del medio afectó en gran medida la resistencia celular al calor. 43 Otros factores que probablemente pudieron afectar la termorresistencia en la conserva, fueron las sustancias antimicrobianas presentes en algunos de los componentes de la salsa como son la cebolla, el ajo y la sal, pues se ha reportado que estas sustancias poseen un efecto antimicrobiano. Se sabe que existen diversos productos de origen botánico los cuales poseen una actividad antimicrobiana como el ajo, orégano, mostaza, canela, albahaca, tomillo, pimienta, mejorana, chile, achiota, cebolla, cilantro, té, limón y naranja (Barboza et al, 2004). Por ejemplo el ajo es comúnmente utilizado como saborizante y condimento en los alimentos. El ajo (Allium savitum), pertenece a la familia de las liláceas junto con la cebolla, el puerro y el tulipán. Es probablemente el alimento con potencial antimicrobiano mas consumido. Las propiedades medicinales del ajo han sido estudiadas desde hace ya varios siglos. Sin embargo, es hasta los años cuarentas, que aparecen evidencias científicas de sus propiedades antimicrobianas; Cavallito y Bailey en 1944, fueron los primeros en aislar el componente antimicrobiano del ajo a partir de bulbos frescos y lo identificaron como alicina o ácido dialitiosulfónico, el cual es el responsable del olor característico del ajo y la cebolla. Se ha estudiado que en concentraciones de 1:85,000, tiene actividad bactericida frente a microorganismos Gram positivos y Gram negativos (Hernández, 2003). Adicionalmente, la presencia de sal en el alimento también pudo haber afectado la resistencia de las células al calor; pues estudios realizados por Lynn y col en 1991 en carne de cerdo, demostraron que el aumento en las concentraciones de NaCl (1-3%), resultó en una disminución en la inactivación térmica de L. monocytogenes a una temperatura de 60ºC. Otro factor que pudo verse implicado fue la tasa de calentamiento. Las tasas de calentamiento rápidas o lentas, influyen en el grado de destrucción de L. monocytogenes. En estudios realizados sobre muestras de cerdo molido inoculado, se observó que un calentamiento lento (1.3ºC/min) permitió que una 44 mayor concentración de L. monocytogenes sobreviviera, que en un calentamiento rápido (Doyle, 2001). Curvas de inactivación térmica a 52, 55 y 57 °C en caldo BHI L. monocytogenes 10 Log UFC/mL 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 52°C 10 15 55° C 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 55 60 65 Tiempo ( minutos) 57°C Curvas inactivación térmica a 52, 55 y 57 °C en salsa L. monocytogenes 11 10 Log UFC /mL 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 52°C 5 55°C 10 15 57°C 20 25 30 35 40 45 50 Tiempo (minutos) Figura 9. Curvas de inactivación térmica de L. monocytogenes a 52, 55 y 57 ° C en caldo BHI y salsa. 45 En cuanto a los valores D encontrados para L. monocytogenes en caldo BHI (tabla 3) se observa que hubo una disminución de éstos a medida que la temperatura aumentó, lo cual puede indicar que el proceso de inactivación tuvo los resultados esperados ya que con una mayor temperatura de exposición como lo es 57°C se observa un mayor efecto sobre la viabilidad de la cepa y por lo tanto se verá inhibido su crecimiento en un menor tiempo, esto puede compararse con el análisis estadístico que muestra una diferencia estadísticamente significativa entre los valores de la temperaturas de 55 y 57 (tablas 4 y 5). De lo anterior, se podría concluir que el tratamiento con el que más rápido se destruye un ciclo logarítmico en la población de L. monocytogenes corresponde a 57°C durante 3.3 minutos. Con respecto a los valores D obtenidos en la salsa también se observó una disminución para 57°C, lo que indica que a mayor temperatura sea sometida la conserva menos tiempo de exposición necesita, sin embargo se observó que el tiempo de exposición necesario para inactivar un ciclo logarítmico a las diferentes temperaturas no varía sustancialmente, lo que podría apoyarse con el análisis estadístico, pues se observa que no hubo una diferencia estadísticamente significativa en el tratamiento con las tres temperaturas (tablas 6 y 7), por lo cual en una industria de alimentos es suficiente un tratamiento térmico que trabaje con 52°C durante 60 minutos, para erradicar la contaminación por L. monocytogenes. Esto ratifica que la transferencia de calor se da por convección de calor en la salsa y en el caldo sin obstáculos. Tabla 3. Valores D para L. monocytogenes en caldo BHI y conserva D52 (minutos) D55 (minutos) D57 (minutos) Cepa CALDO SALSA CALDO SALSA CALDO SALSA L.monocytogenes 15 5 6.6 5 3.3 2 46 Tablas 4 y 5. Comparación de medias por temperaturas en caldo BHI (L. monocytogenes). Alfa Grados de libertad Error de la media Valor critico de t Mínima diferencia significativa 0.05 78 7.543851 1.99085 1.4882 Agrupación t Media N Tem 7.9107 27 57 A 7.1070 27 52 AB 5.7937 27 55 B Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Tablas 6 y 7. Comparación de medias por temperaturas en salsa (L. monocytogenes). Alfa Grados de libertad Error de la media Valor critico de t Mínima diferencia significativa 0.05 78 7.632015 1.99085 1.4969 Agrupación t Media N Tem 7.2811 27 57 A 7.2374 27 52 A 7.1581 27 55 A Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes. 6.4.2 Inactivación térmica de Bacillus cereus De acuerdo con los resultados obtenidos en las curvas de inactivación térmica (figura 10) y los valores D (tabla 8) de B. cereus, se observó que en las curvas de inactivación en caldo BHI y en la conserva a base de tomate no hubo una diferencia considerable en la reducción de las unidades logarítmicas, en cuanto a los valores D presentados en caldo son iguales en las tres temperaturas evaluadas (55, 60 y 70 ºC), lo mismo ocurrió en los valores D en la conserva; claro esta que hay que tener en cuenta que al analizar los datos obtenidos estadísticamente se encontró que hubo diferencia estadísticamente significativa 47 en el caldo BHI entre 55°C y las otras dos temperaturas (60 y 70°C), esta diferencia se podría explicar porque los datos para los valores D son tomados manualmente lo que podría tener un mayor porcentaje de error, por lo cual en el presente estudio se tuvo en cuenta el resultado obtenido mediante el análisis estadístico donde se confirma que es mejor un tratamiento a 60 o 70°C, para una industria de alimentos es de mayor utilidad aplicar 60°C porque representa menor costo. Otro punto clave para discutir estos resultados es que el tratamiento térmico para B. cereus según reportes, tiene una mayor efectividad durante el desarrollo de las esporas porque aumenta la termorresistencia de los microorganismos. Se han avanzado una serie de teorías en torno a la diferencia entre las células vegetativas y las esporas. Una de esas teorías es la que implica el papel del ácido dipicolínico (DPA). Se ha descrito que la termorresistencia de la espora se debe a que una gran porción de su contenido acuoso se encuentra en forma no disponible para participar en la coagulación de la proteína celular. La termorresistencia aumenta de forma gradual a medida que la concentración de agua del entorno disminuye (deshidratación del protoplasto de la espora). La gran resistencia de ciertas esporas en medios acuosos exige que la cubierta esporular tenga una permeabilidad acuosa muy baja, lo que es difícil por la permeabilidad de los materiales orgánicos, se ha demostrado que existen diferencias en termorresistencia asociados al tamaño de la molécula que ejerce el pH ácido (Martínez, 2007). (Herson y Hulland, 1980). Además existen factores en el medio que afectan la resistencia térmica de las esporas, como el pH, la naturaleza de los acidulantes, la temperatura y la concentración de NaCI (Laurent et al, 1999). En contraste, se ha encontrado que la resistencia al calor por las esporas de muchas especies incrementa cuando son sometidas al calentamiento en presencia de soluciones con altas concentraciones de azúcar y sal (Mazas, et al, 1999). Si bien se observó una mayor termorresistencia por parte de B. cereus en la conserva, esto pudo ser por la exposición a factores diferentes al calor, como a 48 etanol o ácido, lo que puede resultar en un incremento de la termotolerancia. Igualmente, se ha reportado que en una gran variedad de bacterias, la respuesta al choque térmico incluye el aumento de una serie de proteínas del choque térmico (HSPs). Estudios realizados por Derré et al, 1999 con B. subtilis, concluyeron que los genes inducidos por calor son divididos en cuatro clases diferentes según sus mecanismos regulatorios; los genes de la clase II son inducidos por estrés térmico y otras condiciones como sal o etanol. También se ha visto que la repuesta al choque térmico de las células de B. subtilis preexpuestas a calor suave, producen esporas más estables al calor (Periago et al, 2002), esta preexposición al calor puede corresponder a la temperatura de incubación utilizada en el presente estudio antes de la exposición a las diferentes temperaturas de evaluación. Durante el desarrollo de las esporas aumenta la termorresistencia de los microorganismos y por lo tanto puede ser mas difícil su destrucción, por esta razón se puede decir que B. cereus tuvo valores D constantes en las diferentes temperaturas evaluadas 55, 60 y 70 ºC, pues estas temperaturas no son suficientes para la destrucción de las esporas, se ha reportado que la temperatura óptima para inactivar las esporas es aproximadamente 90, 95 y 100 ºC, (Byrne et al, 2006) y que el tratamiento térmico mínimo para productos procesados (90 -95 º C por 6 – 10 minutos) usualmente no es suficiente para inactivar a todas las esporas (Fernández et al, 2002). En el caso de este estudio no se utilizaron estas temperaturas tan altas, porque se pensaba combinar el efecto de la temperatura con el agente antimicrobiano (aceite de M. mollis) y además las temperaturas altas hacen que se pierdan más fácil los componentes por volatilización. Asimismo se observa en la figura 7 que las concentraciones de células iniciales vegetativas son altas, por lo cual se ve un decrecimiento más rápido del minuto 1 al 5, lo que explica los bajos valores D en estos primeros minutos. Por otra parte, después del minuto 5 se observa una tendencia más constante lo que puede hacer pensar que la cepa empieza a esporular en este momento. Además, debido a la naturaleza logarítmica de la curva de muerte térmica, cuanto mayor sea el número de esporas mayor será el tiempo necesario para llevar a cabo su destrucción (Hersom y Hulland, 1980) por esta 49 razón se evaluaron tiempos largos. Por todo lo anterior era recomendable la evaluación de la termorresistencia de B. cereus directamente sobre las esporas sin la presencia de células vegetativas para dar una aproximación mas cercana a la temperatura óptima de inactivación. Curvas de inactivación térmica a 55, 60 y 70 °C en caldo BHI B.cereus 10 Log UFC/mL 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 55 ° C 10 60 °C 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Tiempo (minutos) 70 °C Curvas de inactivación térmica a 55, 60 y 70 °C en SALSA B.cereus 8 Log UFC/mL 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 55°C 10 60°C 15 20 70°C 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Tiempo (minutos) Figura 10. Curvas de inactivación térmica de B. cereus a 55, 60 y 70 ° C en caldo BHI y salsa. 50 Tabla 8. Valores D para B. cereus en caldo BHI y conserva D55 (minutos) D60 (minutos) D70 (minutos) Cepa CALDO SALSA CALDO SALSA CALDO SALSA B. cereus 0.98 1 0.98 1 0.98 1 Tablas 9 y 10. Comparación de medias por temperaturas en caldo BHI (B. cereus). Alfa Grados de libertad Error de la media Valor critico de t Mínima diferencia significativa 0.05 78 3.464374 1.99085 0.975 Agrupación t Media N Tem 5.3978 27 55 A 3.6600 27 60 B 3.5100 27 70 B Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes. Tablas 11 y 12. Comparación de medias por temperaturas en la conserva (B. cereus). Alfa Grados de libertad Error de la media Valor critico de t Mínima diferencia significativa 0.05 78 3.464374 1.99085 1.0085 Agrupación t Media N Tem 3.8026 27 55 A 3.3100 27 60 A 3.2244 27 70 A Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes. 51 6.6 Extracción del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluación de la actividad antimicrobiana. En la tabla 13 se muestra la cantidad de aceite esencial obtenido a partir de las plantas de M. mollis recolectadas. Tabla 13. Volumen de aceite esencial obtenido Cantidad de planta sometida a Cantidad de aceite esencial obtenida hidrodestilación 500 g 0.5 mL Los aceites esenciales son tradicionalmente obtenidos por destilación con vapor o por hidrodestilación. Estos procesos son realizados a temperaturas muy altas y pueden conducir a la degradación de los compuestos termolábiles, resultando la formación de compuestos indeseables y desagradables. Además que pueden tener una composición heterogénea. Aceites de superior calidad, libres de productos degradados por hidrólisis y degradación térmica; pueden ser aislados usando dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2) como solvente (Bocevska y Sovová, 2007). Debido a que la extracción con dióxido de carbono supercrítico puede ser llevado a cabo a bajas temperaturas (cerca de 313 K), se preservan las propiedades y composición original del aceite (Zizovic et al, 2005). La extracción del aceite esencial de M. mollis en el presente estudio, se realizó por medio de hidrodestilación y se obtuvo una baja cantidad a partir de la planta (Tabla 13), posiblemente porque como se mencionó anteriormente, esta técnica se hace a temperaturas muy altas y la volatilización de los componentes del aceite se hace mucho más fácil. Lo anterior hizo que la evaluación de la actividad antimicrobiana fuera limitada y dependiera de la cantidad de aceite obtenida. En las tablas 14 y 15 se muestran los datos obtenidos de la actividad antimicrobiana del aceite esencial 52 Tabla 14. Actividad antimicrobiana del aceite esencial (zona inhibición en mm) Microorganismo Listeria monocytogenes Bacillus cereus Aceite esencial puro Control positivo (ampicilina) Control negativo (disco estéril) Aceite esencial puro Control positivo (vancomicina) Control negativo (disco estéril) Réplica 1 0 Tamaño del halo (mm) Réplica Réplica Réplica 2 3 4 0 0 0 Réplica 5 0 15 18 14 16.3 15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 36 36 28 32 31 0 0 0 0 0 Tamaño del halo: Diámetro halo + disco – diámetro disco (0.6mm) Tabla 15. Susceptibilidad de las cepas evaluadas con el aceite esencial de M. mollis Disco Aceite esencial puro Control positivo Control negativo Listeria monocytogenes R S R Bacillus cereus R S R S: Cuando la CMI del antimicrobiano para una bacteria se puede conseguir in vivo a dosis terapéuticas. R: Cuando el microorganismo no es inhibido por las concentraciones que normalmente se pueden obtener en el sito de infección. I: Cuando las bacterias no se inhiben a concentraciones normales, pero pueden inhibirse a concentraciones mas altas sin resultar tóxicas. Para evidenciar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de M. mollis, fue necesario utilizar un método de difusión en agar con el aceite esencial de la 53 planta, el cual se mostró inactivo y no tuvo inhibición como se demuestra (tabla 14) pues no hubo presencia de halos en ninguna de las cepas analizadas, mostrando la resistencia de estos microorganismos al aceite con la concentración utilizada para L. monocytogenes y B. cereus (tabla 15). El presente estudio no tenía como objetivo determinar la composición del aceite esencial de M. mollis, por tanto se tomaron como base datos obtenidos en estudios anteriores acerca de los principales componentes presentes. Alkire et al, 1993, reportaron que el aceite contiene principalmente mentona, pulegona, β-pineno, entre otros (anexo 2). Otros estudios acerca de la composición química, encontraron que el aceite contiene carvona, pulegona, mentona, isomentona, β-pineno and limoneno, en cantidades relativas que varían de 9.3% a 65% (Chica et al, 2006). Sin embargo Chica et al, 2006, encontró 3 compuestos adicionales en proporciones significativas: carvacrol, acetato de carvacril y trans-β-cariofileno. De éstos, el carvacrol ha sido muy estudiado por su potencial actividad antimicrobiana y antifúngica frente a distintos microorganismos. La inhibición del crecimiento de muchos patógenos por el carvacrol, ha sido reportada en varios artículos, sin embargo no se ha definido el mecanismo de acción de éste. Usando B. cereus, un esporoformador patógeno en alimentos, como organismo modelo, se ha demostrado que la exposición de las células vegetativas a concentraciones de carvacrol mayores a 1 mM, conduce a una extensión de la fase de latencia, una tasa baja de crecimiento máximo específico y una densidad final de población baja. También se ha visto que a concentraciones por encima de 1 mM, la viabilidad de B. cereus decrece exponencialmente. Al mismo tiempo hay un incremento en la fluidez de la membrana y salida de protones e iones potasio, conduciendo a una disminución en el gradiente de pH a través de la membrana citoplasmática, un colapso en el potencial de membrana e inhibición de la síntesis de ATP. Finalmente estos eventos, son seguidos por la muerte celular (Ultee et al, 2002). Por otra parte, también se ha reportado la actividad del carvacrol frente a L. monocytogenes. Gill y Holley, 2006 encontraron que es capaz de inhibir la 54 actividad ATPasa en la membrana celular. También se ha encontrado que este tipo de agentes pueden inhibir la generación de adenosina trifosfato de dextrosa y afectar la membrana y que concentraciones de carvacrol de 5 a 10 mM tienen actividad bactericida frente a L. monocytogenes (Gill y Holley, 2006). Por lo anterior, posiblemente la ausencia de actividad antimicrobiana pudo ser porque en el aceite esencial obtenido en el presente estudio, no contenía carvacrol dentro de sus componentes, siendo este el componente con mayor actividad antimicrobiana reportado. Es probable que lo anterior se haya dado porque la composición química del aceite obtenido de la planta puede variar según las condiciones de crecimiento, geográficas, geológicas, climáticas y estaciónales de la planta, por lo tanto sus características o propiedades antimicrobianas pueden también variar (Chica et al, 2006). Posiblemente la composición del aceite obtenido por Chica et al 2006 fue diferente al obtenido en el presente estudio, pues la recolección de la planta se llevó a cabo en diferentes lugares. Se ha reportado que las bacterias Gram negativas son menos resistentes a la acción de los aceites que las Gram positivas como resultado de las cadenas alifáticas como sustituyentes en los anillos fenólicos de los componentes del aceite (Chica et al, 2006). Además se ha reportado que L. monocytogenes es la menos sensible entre un número de bacterias evaluadas (Kalemba y Kunicka 2003). La variabilidad de la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales hacia diferentes microorganismos se puede atribuir a las diferencias cualitativas y cuantitativas en componentes de aceites individuales, mientras que algunos aceites esenciales estimulan el crecimiento de algunos microorganismos, otros son capaces de inhibirlos (Demo et al, 2005). Las características letales también dependen de los componentes del aceite esencial, y puede depender del número de las células del inóculo. Algunos productos químicos, como por ejemplo la pulegona, han expresado una mayor inhibición en el crecimiento de 55 Erwinia amylovora en concentraciones más bajas (103 UFC/ml), otros compuestos como la β-pinona en 107 UFC/ml. y para otros componentes no se ha encontrado. (Kalemba y Kunicka, 2004). Otra de las posibles razones por las que no se obtuvo un efecto antimicrobiano del aceite esencial, fue porque el método utilizado para evaluar la actividad no fue el mejor; pues se ha reportado que el método de difusión en agar es inadecuado para aceites esenciales, sus componentes volátiles se pueden evaporar con el solvente de dispersión durante el tiempo de incubación, mientras que sus componentes mas solubles no se difunden bien en el agar. No obstante, es la técnica más común para evaluar actividad antibacteriana y antifúngica de aceites esenciales porque es mas fácil llevarla a cabo y requiere solo pequeñas cantidades del aceite esencial (Kalemba and Kunicka 2003). Debido a la difícil tarea que es la recolección de la planta, pues es una especie que únicamente florece en verano (Ojeda, 2004), el aceite esencial no se consideró rentable para su posible uso en preservación de alimentos, ya que Colombia es un país donde no se presentan estaciones y por lo tanto no hay periodos largos de luz para favorecer la constante floración de la planta. Por esta razón se dificultó una segunda recolección de ésta para evaluar nuevamente la actividad antimicrobiana, debido a las siguientes razones: los cambios climáticos que se presentaron en el momento de la recolección afectaron la floración de la planta en Cáqueza, Cundinamarca, donde se hizo una expedición en búsqueda del material vegetal, pues es un lugar donde comúnmente florece; por otro lado se intentó la búsqueda en una plaza de mercado donde se conoce como orégano de monte, sin embargo tampoco fue posible debido a la misma razón del clima; por último, después de conseguir la planta en un cultivo de la Universidad Nacional, se tuvo en refrigeración durante un tiempo de 2 días, en el cual probablemente se pudieron perder algunos componentes. 56 Adicionalmente, el uso de aceites esenciales en el sector alimenticio es a menudo limitado debido a que las dosis antimicrobianas eficaces pueden exceder niveles aceptables (Kalemba y Kunicka, 2004). Se ha reportado en literatura que los compuestos químicos encontrados en el aceite esencial de esta planta tales como los fenoles isoméricos como el carvacrol y el timol pueden tener características antimicrobianas similares, el bajo pH de estas moléculas es mas disociado e hidrofóbico posiblemente conduciendo a una mejor unión a las áreas hidrofóbicas de las proteínas (Michiels et al, 2007) y la bicapa lipídica de la membrana citoplasmática que causan la pérdida de integridad y la salida del material celular tal como iones, ATP y ácidos nucleicos (Nostro et al, 2007), Por otra parte el mentol es un es un agente antifúngico y antimicrobiano y ha sido encontrado para interactuar a nivel célular con el Ca 2+ citosólico, probablemente por una liberación de calcio almacenado intracelularmente y bloqueando el canal de calcio (Mucciarelli et al, 2001). De los compuestos encontrados se reporta que la mentona es un inhibidor del crecimiento mientras que la pulegona es metabolizada por una monooxigenasa microsomal hepática para una serie de hepatotoxinas que causan cáncer en el hígado y esta involucrado en muchos casos reportados de intoxicación en humanos y animales. Además la pulegona es considerado uno de los más poderosos aleloquímicos y ha sido demostrado que puede ser dos veces mas tóxico que el cianuro de hidrógeno (HCN). (Mucciarelli et al, 2001). Los efectos de los compuestos alelopáticos en la respiración mitocrondrial pueden ser importantes en el mecanismo de acción por el cual se controla el crecimiento de maleza. (Mucciarelli et al, 2001). Por último, si bien los extractos obtenidos a partir de M. mollis han resultado eficientes frente a fitopatógenos, en este caso no tienen una actividad 57 antimicrobiana que ameriten seguir con su investigación para uso en industria de alimentos. 7. RECOMENDACIONES • En el caso de B. cereus se debe trabajar con esporas y no con formas vegetativas, para obtener datos más homogéneos. • Al trabajar con el aceite esencial de M. mollis, es necesario que todas las plantas se encuentren en el mismo estadio del ciclo de vida para asegurar resultados mas confiables en los compuestos obtenidos; igualmente se recomienda no dejar pasar más de un día después de la recolección del material vegetal para hacer la extracción del aceite. 58 8. CONCLUSIONES o De acuerdo con los datos obtenidos en las curvas de crecimiento, se observó que L. monocytogenes alcanzó la fase estacionaria en un tiempo de 12 horas y B. cereus en un tiempo de 18 horas. o No hubo diferencias en cuanto a la reducción logarítmica de células de L.monocytogenes en las temperaturas de 52, 55 y 57 ° C, pero si se presentaron valores D mayores en caldo que en salsa. o B. cereus mostró valores D mayores en salsa que en caldo, pero no se obtuvieron diferencias considerables en cuanto a la reducción logarítmica en las temperaturas de 55, 60 y 70 ° C . o M. mollis no presentó inhibición sobre las cepas de L.monocytogenes y de alimentos. o Estadísticamente no se encontró diferencia entre las temperaturas utilizadas para inactivar a B. cereus en la salsa, posiblemente por condiciones de pH y estructura de la espora. 59 9. REFERENCIAS • ACERO CORAL, G. Y M.D. RIVE. 1989. Medicina indígena, CachaChimborazo. Ediciones Abya Yala. • ADAMS M.R, MOSS. 1997. 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No pico Compuestos Tr (min) IK DB-1 Cantidad relativa (%) 1 ρ-cimoneno 15.42 1015 0.6 2 γ-terpineno 16.58 1052 0.3 3 Linalool 17.61 1085 0.8 4 Acetato de octan-3-ilo 18.31 1108 0.3 5 Mentona 19.20 1138 12.2 6 Isomentona 19.46 1147 0.5 7 Mentol 19.69 1154 1.7 8 Pulegona 21.61 1219 15.9 9 trans-pulegol 21.91 1230 0.7 10 Acetato de mentilo 22.86 1264 1.2 11 Timol 22.97 1268 1.4 12 Carvacrol 23.26 1278 16.2 13 Trans-acetato de piperitilo* 24.51 1323 0.9 14 Acetato de timilo 24.62 1327 1.4 15 Óxido de piperitenona 24.86 1336 0.6 16 δ-elemeno 24.95 1340 0.3 17 Acetato de carvacrilo 25.16 1348 30.6 18 Acetato de geranilo 25.48 1360 1.0 19 trans-β-cariofileno 27.24 1427 7.6 20 α-humuleno 28.06 1460 1.3 21 Biciclosesquifelandreno 28.69 1485 1.5 22 Biciclogermacreno 29.06 1500 2.4 Fuente: Chica, et al 2006. 73 ANEXO 2 Composición del aceite esencial de M. mollis determinada por Alkire et al, 1993. Componente Porcentaje (%) α-pineno 0.41± 0.08 Sabineno 0.19 ± 0.04 Limoneno 0.88 ± 0.28 (E)-β-ocimeno 1.20 ± 0.81 Isomentona 4.11 ± 0.84 Acetato de isomentil 1.95 ± 0.58 Neomentol 29.34 ± 3.94 Mentol 20.55 ± 3.33 Pulegona 0.80 ± 0.30 Piperitona 8.96 ± 1.65 β -pineno 0.50 ± 0.07 Mirceno 0.06 ± 0 (Z)-β-ocimeno 0.71 ± 0.11 Mentona 24.00 ± 5.23 Acetato de neomentil 2.72 ± 0.41 Acetato de mentil 0.09 ± 0.02 β-carofileno 2.55 ± 0.99 α-humuleno 0.37 ± 0.23 Siginificado ± S.D (N 3-4) Fuente: Alkire, et al 1993. 74 ANEXO 3 Formulación de las diferentes salsas obtenidas. Salsa número 1 Ingrediente Tomate Cebolla Ajo Color Agua Aceite Salsa de tomate Sal Cantidad 50 g 6.3 g 0.8 g 0.3 g 100 mL 2 mL 3.5 g 0.3g Ingrediente Tomate Cebolla Ajo Color Agua Aceite Salsa de tomate Sal Cantidad 100.9 g 5.3 g 0.8 g 0.3 g 50 mL 2 mL 6.7 g 0.3 g Ingrediente Tomate Cebolla Ajo Agua Aceite Salsa de tomate Sal Cantidad 100.5 g 5.1 g 0.5 g 30 mL 2 mL 5.1 g 0.3g Salsa número 2 Salsa número 3 75 Salsa número 4 Ingrediente Tomate Cebolla Ajo Agua Aceite Sal Cantidad 112.3 g 5.1 g 0.5 g 30 mL 2 mL 0.3g Ingrediente Tomate Azúcar Cebolla Ajo Color Agua Aceite Salsa de tomate Sal Cantidad 100.8 g 3g 3g 0.5 g 0.1 g 30 mL 2 mL 6.9 g 0.3g Ingrediente Tomate Azúcar Cebolla Ajo Color Agua Aceite Salsa de tomate Sal Cantidad 100 g 4g 3.2 g 0.5 g 0.1 g 30 mL 2 mL 7.3 g 0.3g Ingrediente Tomate Azúcar Cebolla Ajo Color Cantidad 70 g 3g 2g 0.2 g 0.1 g Salsa número 5 Salsa número 6 Salsa número 7 76 Agua Aceite Salsa de tomate Sal 30 mL 2 mL 10 g 0.3g Ingrediente Tomate Azúcar Cebolla Ajo Color Agua Aceite Salsa de tomate Sal Cantidad 150 g 4g 2.5 g 0.2 g 0.1 g 30 mL 2 mL 7g 0.3g Ingrediente Tomate Azúcar Cebolla Ajo Color Agua Aceite Salsa de tomate Sal Cantidad 100 g 1g 3g 0.4 g 0.1 g 20 mL 2 mL 9g 0.3 g Salsa número 8 Salsa número 9 Salsa número 11 Ingrediente Tomate Cebolla Ajo Agua Aceite Sal Cantidad 150 g 5g 0.5 g 10 mL 2 mL 0.3 g 77 ANEXO 10 COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN CALDO BHI PARA B.cereus ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 126 ---------------------------------------------------------------------------------------Obs TEM TIM REP LOG ---------------------------------------------------------------------------------------1 55 0 1 8.87 2 55 1 1 7.00 3 55 2 1 7.00 4 55 5 1 5.30 5 55 10 1 5.00 6 55 15 1 4.00 7 55 20 1 4.00 8 55 30 1 3.47 9 55 60 1 2.00 10 55 0 2 8.87 11 55 1 2 7.00 12 55 2 2 7.00 13 55 5 2 5.30 14 55 10 2 5.00 15 55 15 2 4.00 16 55 20 2 4.00 17 55 30 2 3.47 18 55 60 2 2.00 19 55 0 3 8.87 20 55 1 3 7.30 21 55 2 3 7.00 22 55 5 3 6.47 23 55 10 3 6.17 24 55 15 3 5.69 25 55 20 3 5.36 26 55 30 3 3.60 27 55 60 3 2.00 28 60 0 1 6.95 29 60 1 1 7.00 30 60 2 1 4.47 31 60 5 1 2.00 32 60 10 1 2.47 33 60 15 1 2.30 34 60 20 1 2.76 35 60 30 1 2.00 36 60 60 1 2.30 37 60 0 2 6.95 38 60 1 2 5.20 39 60 2 2 4.00 40 60 5 2 3.66 41 60 10 2 3.27 42 60 15 2 2.90 43 60 20 2 2.47 44 60 30 2 2.72 45 60 60 2 2.17 46 60 0 3 6.95 47 60 1 3 6.49 48 60 2 3 4.60 49 60 5 3 3.23 50 60 10 3 2.84 51 60 15 3 2.17 52 60 20 3 2.00 ---------------------------------------------------------------------------------------- 78 ---------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 127 ---------------------------------------------------------------------------------------Obs TEM TIM REP LOG 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 60 60 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 30 60 0 1 2 5 10 15 20 30 60 0 1 2 5 10 15 20 30 60 0 1 2 5 10 15 20 30 60 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.95 2.00 6.23 5.90 4.30 3.69 3.39 2.30 2.07 1.90 1.47 6.23 5.00 4.60 3.77 3.14 3.00 2.83 2.82 2.00 6.23 5.30 4.30 3.00 3.30 3.00 3.00 1.00 1.00 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 128 ---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure Class Level Information Class Levels TEM TIM 3 9 Values 55 60 70 0 1 2 5 10 15 20 30 60 Number of observations 81 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 129 ---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure Dependent Variable: LOG Source DF Sum of Squares Mean Square Model 2 59.4546889 29.7273444 F Value Pr > F 9.18 0.0003 79 Error 78 252.5620667 3.2379752 Corrected Total 80 312.0167556 ---------------------------------------------------------------------------------------- Source R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean 0.190550 42.95360 1.799437 4.189259 DF Type I SS Mean Square F Value 2 59.45468889 29.72734444 9.18 DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F TEM 0.0003 Source Pr > F TEM 2 59.45468889 29.72734444 9.18 0.0003 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 130 ---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure t Tests (LSD) for LOG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 80 ANEXO 11 COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN SALSA PARA B.cereus ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October ---------------------------------------------------------------------------------------13, 2007 131 Obs TEM TIM REP LOG ---------------------------------------------------------------------------------------1 55 0 1 6.39 2 55 1 1 5.00 3 55 2 1 4.07 4 55 5 1 3.60 5 55 10 1 3.20 6 55 15 1 2.47 7 55 20 1 2.30 8 55 30 1 1.00 9 55 60 1 0.00 10 55 0 2 6.39 11 55 1 2 5.00 12 55 2 2 4.32 13 55 5 2 3.60 14 55 10 2 3.20 15 55 15 2 2.60 16 55 20 2 2.47 17 55 30 2 1.00 18 55 60 2 0.00 19 55 0 3 6.39 20 55 1 3 5.30 21 55 2 3 5.07 22 55 5 3 4.04 23 55 10 3 3.23 24 55 15 3 2.95 25 55 20 3 2.47 26 55 30 3 1.00 27 55 60 3 0.00 28 60 0 1 6.77 29 60 1 1 5.77 30 60 2 1 5.49 31 60 5 1 3.90 32 60 10 1 3.60 33 60 15 1 2.11 34 60 20 1 1.69 35 60 30 1 1.30 36 60 60 1 0.00 37 60 0 2 6.77 38 60 1 2 5.30 39 60 2 2 4.95 40 60 5 2 3.77 41 60 10 2 3.60 42 60 15 2 3.30 43 60 20 2 1.60 44 60 30 2 1.47 45 60 60 2 0.00 46 60 0 3 6.77 47 60 1 3 4.60 48 60 2 3 3.90 49 60 5 3 3.60 50 60 10 3 3.60 51 60 15 3 2.14 52 60 20 3 1.77 ---------------------------------------------------------------------------------------- 81 ---------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 132 ---------------------------------------------------------------------------------------Obs TEM TIM REP LOG 53 60 30 3 1.60 54 60 60 3 0.00 55 70 0 1 6.23 56 70 1 1 6.07 57 70 2 1 5.30 58 70 5 1 4.69 59 70 10 1 4.39 60 70 15 1 3.78 61 70 20 1 3.60 62 70 30 1 2.07 63 70 60 1 2.00 64 70 0 2 6.23 65 70 1 2 5.00 66 70 2 2 4.60 67 70 5 2 3.77 68 70 10 2 3.47 69 70 15 2 3.00 70 70 20 2 2.83 71 70 30 2 1.30 72 70 60 2 1.00 73 70 0 3 6.23 74 70 1 3 5.30 75 70 2 3 4.30 76 70 5 3 3.95 77 70 10 3 3.85 78 70 15 3 3.60 79 70 20 3 2.77 80 70 30 3 2.34 81 70 60 3 1.00 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 133 ---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values TEM 3 55 60 70 TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60 Number of observations 81 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 134 ---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure Dependent Variable: LOG Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 2 5.2580025 2.6290012 Error 78 270.2211852 3.4643742 Corrected Total 80 275.4791877 0.76 0.4716 82 R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean 0.019087 54.01789 1.861283 3.445679 --------------------------------------------------------------------------------------Source DF Type I SS Mean Square F Value 2 5.25800247 2.62900123 0.76 DF Type III SS Mean Square F Value 2 5.25800247 2.62900123 0.76 Pr > F TEM 0.4716 Source Pr > F TEM 0.4716 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 135 The GLM Procedure t Tests (LSD) for LOG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 83 ANEXO 12 COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN BHI PARA L.monocytogenes ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 07:11 Thursday, October 14, 2007 1 ---------------------------------------------------------------------------------------Obs TEM TIM REP LOG 1 52 0 1 8.47 2 52 1 1 8.30 3 52 2 1 8.00 4 52 5 1 7.47 5 52 10 1 8.00 6 52 15 1 7.47 7 52 20 1 7.00 8 52 30 1 6.77 9 52 60 1 0.00 10 52 0 2 8.47 11 52 1 2 8.36 12 52 2 2 8.30 13 52 5 2 8.60 14 52 10 2 8.00 15 52 15 2 7.60 16 52 20 2 7.04 17 52 30 2 6.00 18 52 60 2 0.00 19 52 0 3 8.47 20 52 1 3 8.36 21 52 2 3 8.00 22 52 5 3 8.50 23 52 10 3 8.00 24 52 15 3 7.47 25 52 20 3 7.00 26 52 30 3 6.77 27 52 60 3 5.47 28 55 0 1 9.10 29 55 1 1 9.39 30 55 2 1 8.72 31 55 5 1 7.47 32 55 10 1 6.00 33 55 15 1 0.00 34 55 20 1 0.00 35 55 30 1 0.00 36 55 60 1 0.00 37 55 0 2 9.10 38 55 1 2 9.30 39 55 2 2 8.90 40 55 5 2 7.60 41 55 10 2 6.69 42 55 15 2 5.60 43 55 20 2 5.00 44 55 30 2 0.00 45 55 60 2 0.00 46 55 0 3 9.10 47 55 1 3 9.00 48 55 2 3 8.47 49 55 5 3 8.32 50 55 10 3 7.69 51 55 15 3 7.60 52 55 20 3 7.38 ---------------------------------------------------------------------------------------- 84 ---------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 07:11 Thursday, October 14, 2007 2 ---------------------------------------------------------------------------------------Obs TEM TIM REP LOG ---------------------------------------------------------------------------------------53 55 30 3 6.00 54 55 60 3 0.00 55 57 0 1 9.84 56 57 1 1 9.00 57 57 2 1 9.00 58 57 5 1 8.69 59 57 10 1 8.00 60 57 15 1 8.32 61 57 20 1 7.49 62 57 30 1 6.00 63 57 60 1 6.00 64 57 0 2 9.84 65 57 1 2 9.69 66 57 2 2 9.69 67 57 5 2 9.47 68 57 10 2 8.77 69 57 15 2 8.60 70 57 20 2 7.20 71 57 30 2 6.00 72 57 60 2 6.00 73 57 0 3 9.84 74 57 1 3 9.30 75 57 2 3 8.95 76 57 5 3 8.60 77 57 10 3 8.30 78 57 15 3 8.23 79 57 20 3 6.77 80 57 30 3 6.00 81 57 60 3 0.00 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 07:11 Thursday, October 14, 2007 3 ---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values TEM 3 52 55 57 TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60 Number of observations 81 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 07:11 Thursday, October 14, 2007 4 ---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure Dependent Variable: LOG Source DF Sum of Squares Mean Square Model 2 61.6736691 30.8368346 Error 78 588.4203778 7.5438510 F Value Pr > F 4.09 0.0205 85 Corrected Total 80 650.0940469 ---------------------------------------------------------------------------------------- Source R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean 0.094869 39.59267 2.746607 6.937160 DF Type I SS Mean Square F Value 2 61.67366914 30.83683457 4.09 DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F TEM 0.0205 Source Pr > F TEM 2 61.67366914 30.83683457 4.09 0.0205 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 14, 2007 07:11 Thursday, October 5 The GLM Procedure t Tests (LSD) for LOG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 86 ANEXO 13 COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN SALSA PARA L.monocytogenes ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 131 ---------------------------------------------------------------------------------------Obs TEM TIM REP LOG ---------------------------------------------------------------------------------------1 55 0 1 6.39 2 55 1 1 5.00 3 55 2 1 4.07 4 55 5 1 3.60 5 55 10 1 3.20 6 55 15 1 2.47 7 55 20 1 2.30 8 55 30 1 1.00 9 55 60 1 0.00 10 55 0 2 6.39 11 55 1 2 5.00 12 55 2 2 4.32 13 55 5 2 3.60 14 55 10 2 3.20 15 55 15 2 2.60 16 55 20 2 2.47 17 55 30 2 1.00 18 55 60 2 0.00 19 55 0 3 6.39 20 55 1 3 5.30 21 55 2 3 5.07 22 55 5 3 4.04 23 55 10 3 3.23 24 55 15 3 2.95 25 55 20 3 2.47 26 55 30 3 1.00 27 55 60 3 0.00 28 60 0 1 6.77 29 60 1 1 5.77 30 60 2 1 5.49 31 60 5 1 3.90 32 60 10 1 3.60 33 60 15 1 2.11 34 60 20 1 1.69 35 60 30 1 1.30 36 60 60 1 0.00 37 60 0 2 6.77 38 60 1 2 5.30 39 60 2 2 4.95 40 60 5 2 3.77 41 60 10 2 3.60 42 60 15 2 3.30 43 60 20 2 1.60 44 60 30 2 1.47 45 60 60 2 0.00 46 60 0 3 6.77 47 60 1 3 4.60 48 60 2 3 3.90 49 60 5 3 3.60 50 60 10 3 3.60 51 60 15 3 2.14 52 60 20 3 1.77 ---------------------------------------------------------------------------------------- 87 ---------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 132 ---------------------------------------------------------------------------------------Obs TEM TIM REP LOG ---------------------------------------------------------------------------------------53 60 30 3 1.60 54 60 60 3 0.00 55 70 0 1 6.23 56 70 1 1 6.07 57 70 2 1 5.30 58 70 5 1 4.69 59 70 10 1 4.39 60 70 15 1 3.78 61 70 20 1 3.60 62 70 30 1 2.07 63 70 60 1 2.00 64 70 0 2 6.23 65 70 1 2 5.00 66 70 2 2 4.60 67 70 5 2 3.77 68 70 10 2 3.47 69 70 15 2 3.00 70 70 20 2 2.83 71 70 30 2 1.30 72 70 60 2 1.00 73 70 0 3 6.23 74 70 1 3 5.30 75 70 2 3 4.30 76 70 5 3 3.95 77 70 10 3 3.85 78 70 15 3 3.60 79 70 20 3 2.77 80 70 30 3 2.34 81 70 60 3 1.00 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 133 ---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure Class Level Information Class Levels Values TEM 3 55 60 70 TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60 Number of observations 81 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 134 ---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure Dependent Variable: LOG DF Sum of Squares Mean Square F Value Model 2 5.2580025 2.6290012 0.76 Error 78 270.2211852 3.4643742 Corrected Total 80 275.4791877 Source Pr > F 0.4716 88 ---------------------------------------------------------------------------------------R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean 0.019087 Source 54.01789 1.861283 3.445679 DF Type I SS Mean Square F Value 2 5.25800247 2.62900123 0.76 DF Type III SS Mean Square F Value 2 5.25800247 2.62900123 0.76 Pr > F TEM 0.4716 Source Pr > F TEM 0.4716 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System 22:14 Wednesday, October 13, 2007 135 The GLM Procedure t Tests (LSD) for LOG ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. 89 ANEXO 8 MEDIOS DE CULTIVO Composición del Agar Oxford Polipeptona Extracto de levadura Almidón Cloruro sódico Citrato férrico amoniacal Esculina Cloruro de litio Agar bacteriológico 20.0 3.0 1.0 5.0 0.5 1.0 15 13 Composición caldo BHI Extracto de cerebro 12.5 Extracto de corazón 5.0 Proteosa peptona 10 Cloruro sódico 5.0 Fosfato disódico 2.5 D (+) Glucosa 2.0 90