Minthostachys mollis - Pontificia Universidad Javeriana

ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIÓN TÉRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
DIANA DEL PILAR GÛIZA PÉREZ
LINA MARÍA RINCÓN PRIETO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÌA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
Octubre de 2007
ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIÓN TÉRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
DIANA DEL PILAR GÜIZA PÉREZ
LINA MARÍA RINCÓN PRIETO
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el título de:
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
ANA KARINA CARRASCAL. Directora
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÌA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
Octubre de 2007
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia”.
ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIÓN TÉRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
DIANA DEL PILAR GÛIZA PÉREZ
LINA MARÍA RINCÓN PRIETO
APROBADO
_______________________________
ANA KARINA CARRASCAL CAMACHO. MSc
Directora
_________________
__________________
NADENKA MELO
ADRIANA PÁEZ
Jurado
Jurado
ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIÓN TÉRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.
DIANA DEL PILAR GÜIZA PÉREZ
LINA MARÍA RINCÓN PRIETO
APROBADO
______________________
____________________
ANGELA UMAÑA MUÑOZ
JANETH ARIAS PALACIOS
BIOLOGA PhD
Decana Acadêmica
MICROBIÓLOGA MSc.
Director de Carrera
AGRADECIMIENTOS
• A la Dra. Ana Karina Carrascal por su dirección, apoyo y oportunidades
que nos brindó para complementar los conocimientos en la realización
de este trabajo.
• A Luz Marina Melgarejo por su oportuna colaboración.
• A Nathalia Chica por su paciencia, optimismo y gran ayuda.
• A Fabián Torres por su valiosa asesoría.
• A Aura Marina Pedroza por su contribución en el análisis estadístico.
• A Inesita y al personal de lavado y esterilización por su paciencia y
colaboración.
A Dios, por iluminarme y acompañarme en todos mis proyectos
A mi mamá, por ser mi amiga, por tanto amor y por estar siempre ahí
A mi papá por sus consejos y apoyo
A Yiya, por compartir tantas cosas
A mis tíos y primos por su ayuda y apoyo incondicional
A Luz Amanda por ser tan especial
A Diana, por su amistad y por vivir conmigo la gran experiencia de iniciar
y culminar este trabajo.
Lina María.
A Dios, por darme la sabiduría, fuerza y paciencia en la
culminación de este trabajo y de esta etapa de mi vida.
A mi mamá y mi papá por esa confianza que depositaron en
mí, por ser mis amigos y por darme todo su apoyo y amor.
A mi hermano por desearme lo mejor.
A Luis Gabriel Rivera Mora por ese amor y compañía
incondicionales.
A mis familiares y amigos por su interés.
A Lina, por su amistad, por su comprensión y por hacer
posible la finalización de este trabajo.
Diana del Pilar.
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 3
2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 5
2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos ................................................ 5
2.1.1 Métodos de prevención de enfermedades transmitidas por alimentos . 8
2.2 Tratamiento térmico .................................................................................. 8
2.2.1 Esterilización comercial ......................................................................... 9
2.2.2 Pasteurización ..................................................................................... 10
2.2.3 Causas de la muerte térmica y mecanismo de termorresistencia ........ 11
2.2.4 Valores D y Z ....................................................................................... 12
2.2.5 Factores que influyen sobre la determinación de la termorresistencia. 13
2.2.6 Las conservas y el tratamiento térmico................................................ 13
2.2.7 Transmisión del calor en el alimento envasado ................................... 14
2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos ............................ 15
2.3.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas ........... 16
2.3.2 Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites esenciales
...................................................................................................................... 18
2.3.2.1 Método de difusión en agar .............................................................. 19
2.3.2.2 Método de dilución ............................................................................ 19
2.4 Minthostachys mollis ............................................................................... 20
2.5 Listeria monocytogenes .......................................................................... 23
2.5.1 Generalidades ..................................................................................... 23
2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes .............................................. 24
2.6 Bacillus cereus ........................................................................................ 25
2.6.1 Generalidades ..................................................................................... 25
2.6.2 Termoresistencia de Bacillus cereus ................................................... 25
3. JUSTIFICACIÓN .......................................................................................... 28
4. OBJETIVOS ................................................................................................. 29
4.1 Objetivo general ...................................................................................... 29
4.2 Objetivos específicos .............................................................................. 29
5. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 30
1
5.1. Obtención de cepas ............................................................................... 30
5.2 Elaboración del banco de células primario (BCP) ................................... 30
5.3 Curvas de crecimiento ............................................................................ 30
5.4 Evaluación de la termorresistencia ......................................................... 32
5.4.1 Elaboración de curvas de inactivación térmica .................................... 32
5.4.2 Elaboración de la salsa y evaluación de termorresistencia en salsa. .. 32
5.5 Obtención de la planta ............................................................................ 33
5.5.1 Obtención del aceite esencial de Minthostachys mollis ....................... 33
5.6 Evaluación de la actividad antimicrobiana. ............................................. 33
5.6.1 Método difusión en agar con disco para bacterias ............................... 33
5.6.1.1. Preparación del inóculo ................................................................... 33
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................... 35
6.1 Prueba de pureza y viabilidad de los bancos de células......................... 35
6.2 Cinética de crecimiento de Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. .. 37
6.3 Elaboración de la conserva..................................................................... 41
6.4 Evaluación de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus (en
caldo BHI y sobre alimento) .......................................................................... 43
6.4.1 Inactivación térmica de L. monocytogenes .......................................... 43
6.4.2 Inactivación térmica de Bacillus cereus ............................................... 46
6.5 Extracción del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluación de la
actividad antimicrobiana ...................................................................................
...................................................................................................................... 51
7. RECOMENDACIONES ................................................................................ 59
8. CONCLUSIONES ......................................................................................... 59
9. REFERENCIAS ............................................................................................ 60
Recursos electrónicos .................................................................................. 71
2
1. INTRODUCCIÓN
La mayoría de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), son de
origen microbiano, siendo uno de los problemas con mayor impacto en el
mundo. Debido a que estas enfermedades se adquieren por el consumo de
alimentos y/o agua contaminados, representan un gran riesgo para la población
en general.
De acuerdo con lo anterior, es importante considerar la existencia de
microorganismos de carácter patógeno que son los principales responsables de
dichas enfermedades y la aparición de graves intoxicaciones alimentarias.
Algunos de los microorganismos que se han asociado a las ETA son Listeria
monocytogenes y Bacillus cereus, ya que han tenido gran impacto en salud
pública. L. monocytogenes, tiene mayor trascendencia ya que el consumo de
este microorganismo, puede generar tasas de mortalidad altas (30 %).
(Vázquez et al, 2001). Por otra parte, B. cereus tiene un efecto mayor en
cuanto a la cantidad de personas que afecta, porque no tiene grupos blanco
específicos, generando tasas de morbilidad altas (ICMSF, 2000).
Por lo anterior, la presencia de estos microorganismos en los alimentos
conduce a buscar alternativas de inhibición y eliminación con una mayor
posibilidad de aplicación como pueden ser las sustancias naturales, y al mismo
tiempo fusionarlas con métodos convencionales como el tratamiento térmico
con altas temperaturas.
El estudio de la inactivación térmica es importante pues es uno de los métodos
más aplicables, con una efectividad comprobada en el control y prevención de
la transmisión de estas enfermedades, al mismo tiempo puede reemplazar
otros métodos más complejos como la irradiación, almacenamiento a bajas
temperaturas, conservantes químicos, entre otros. No obstante el tratamiento a
temperaturas altas modifica el valor nutricional de los alimentos, lo que explica
3
la tendencia actual a utilizar sustancias antimicrobianas debido a su conocido
efecto microbicida.
De acuerdo con esto, es importante resaltar que el estudio de sustancias de
origen natural tales como extractos y aceites vegetales se ha llevado a cabo
para evaluar su efecto antimicrobiano, fungicida, insecticida y plaguicida.
Algunas especies vegetales tales como Minthostachys mollis se han reportado
como
poseedoras
de
características
antimicrobianas,
antifúngicas
y
fitoterapéuticas, las cuales la hacen una especie promisoria para su uso en
actividades farmacéuticas, control de plagas en el sector agrícola y la
preservación de los alimentos para evitar la proliferación de microorganismos
causantes de enfermedades.
Esto conlleva a la realización de una
investigación con el propósito de evaluar la actividad bactericida del aceite
esencial extraído de M. mollis sobre dos microorganismos causantes de
enfermedades transmitidas por alimentos como L. monocytogenes y B. cereus.
Lo anterior debido a que M. mollis ha sido utilizada en Colombia como
condimento para alimentos, por lo que podría utilizarse como antimicrobiano en
la industria de alimentos.
Por lo descrito anteriormente, se pretende llevar a cabo la obtención del aceite
esencial de M. mollis por medio de una técnica de hidrodestilación, para su
posterior evaluación mediante un protocolo donde se evaluará el aceite en una
prueba in Vitro determinando la actividad antimicrobiana frente a los
microorganismos mencionados anteriormente; luego probarlo en un producto
inoculado y al mismo tiempo alternar este protocolo con un método más
convencional como el tratamiento térmico.
4
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos
La enfermedad transmitida por alimentos (ETA) ha sido definida por la
Organización Mundial de la Salud (OMS) como “una enfermedad de carácter
infeccioso o tóxico causada por, o que se cree que es causada por, el consumo
de alimentos o de agua” (Adams, 1997).
Las ETA pueden manifestarse a
través de:
•
Infecciones transmitidas por alimentos: son enfermedades que resultan
de
la
ingestión
de
alimentos
que
contienen
microorganismos
perjudiciales vivos. Por ejemplo: salmonelosis, hepatitis viral tipo A y
toxoplasmosis (www.panalimentos.org).
•
Intoxicaciones causadas por alimentos: ocurren cuando las toxinas o
venenos de bacterias u hongos están presentes en el alimento ingerido.
Estas toxinas generalmente no poseen olor o sabor y son capaces de
causar enfermedades después que el microorganismo es eliminado.
Algunas toxinas pueden estar presentes de manera natural en el
alimento, como en el caso de ciertos hongos y animales como el pez
globo. Ejemplos: botulismo, intoxicación estafilocócica o por toxinas
producidas por hongos (www.panalimentos.org).
•
Toxi-infección causada por alimentos: es una enfermedad que resulta de
la ingestión de alimentos con una cierta cantidad de microorganismos
causantes de enfermedades, los cuales son capaces de producir o
liberar
toxinas
una
vez
que
son
ingeridos.
Ejemplos:
cólera
(www.panalimentos.org)
5
Las enfermedades causadas por el consumo de alimentos contaminados tienen
un amplio impacto en la salud pública y en la economía en todo el mundo
(Gandhi y Chikindas. 2007). Entre los factores asociados a estos cambios
globales se pueden señalar el crecimiento de la población, la pobreza, la
urbanización en los países subdesarrollados, el comercio internacional de
alimentos para humanos y animales así como también la aparición de nuevos
agentes productores de ETA o nuevas mutantes con una mayor patogenicidad.
Otros factores importantes en cuanto a la manipulación incorrecta de los
alimentos que contribuyen a los brotes producidos por estos se muestran a
continuación en la figura 1 (McCabe-Sellers y Beattie. 2004). La temperatura
inadecuada es el principal factor reportado que contribuye a la transmisión de
enfermedades producidas por alimentos (Olsen, et al, 2000).
Figura 1. Factores que contribuyen a los brotes producidos por los alimentos a
partir de 1993 - 1997
Fuente: McCabe-Sellers y Beattie. 2004
6
Por esta y otras razones en países latinoamericanos, donde estos problemas
se intensifican desde 1989, la Organización Panamericana de la Salud (OPS)
ha estado trabajando con sus Estados Miembros para formar la capacidad
nacional de vigilancia de ETA. Las debilidades todavía persisten en muchos
países en la vigilancia epidemiológica: notificación de enfermedades, detección
e investigación de los brotes y el análisis de datos para la toma de decisiones
en
las
políticas
y
programas.
Es
por
consiguiente
difícil
evaluar
adecuadamente la situación de las ETA en la región latinoamericana
(www.aam.org.ar). En el caso particular de Colombia y de la capital del país,
las enfermedades transmitidas por alimentos constituyen un grave problema de
salud pública (www.comunidadandina.org), pues se ha demostrado un
incremento en los últimos años. Entre 1991 y 1998 se han reportado 21443
casos individuales de ETA. En cuanto al reporte de brotes de las ETA, ha
mostrado un leve incremento desde 1998 hasta el año 2000. Para 1998 fueron
reportados por el Sistema Alerta Acción un total de 28 brotes de ETA, y para
los siguientes dos años un total de 35 y 37 brotes, con rangos de variación de
dos a cuatrocientas personas afectadas (http://www.saludcapital.gov.co). Para
el 2007 se notificaron al sistema nacional de vigilancia 1594 casos de
enfermedades transmitidas por alimentos, lo que representa una disminución
del 22.65 % con respecto al mismo periodo del año anterior en el cual se
notificaron 2061 casos. Hasta el tercer periodo epidemiológico del 2007, se
presentó el mayor número de casos, debido a la ocurrencia de cuatro brotes,
uno en el Municipio de Soledad (Atlántico) que aportó 199 casos, otro en el
municipio de Tena (Cundinamarca) que aportó 69 casos, otro en Maicao (La
Guajira) que aportó 53 casos y otro en el municipio de Chinchiná (Caldas) que
aportó 48 casos de los 469 notificados en esa semana.
De las 36 Unidades Notificadoras Departamentales y Distritales, el 80.55%
notificó casos de ETA´s al SIVIGILA: La Secretaría de Salud de Atlántico
notificó el 14.49 %, siendo el mayor notificador, seguida de Bogotá D.C con el
8.59 %, Cundinamarca con el 7.15 %, Sucre con el 6.34, Caldas con el 5.90 %,
Antioquia con 5.83 %, La Guajira con el 5.58 %, Córdoba con el 4.33 %, Bolívar
7
con el 4.27 %, Magdalena con el 4.20%, Boyacá con el 4.14 % y en menor
porcentaje: Santander, Quindío, Meta, Valle, Huila, Vichada, Arauca, Cesar,
Casanare, Nariño, Chocó, Cauca, Putumayo, Amazonas, Barranquilla,
Risaralda, Norte de Santander, Cartagena. No notificaron casos de ETA:
Caquetá, Guainía, Guaviare, San Andrés, Santa Marta, Tolima y Vaupés.
Por lo anterior es necesario que la comunidad en general tenga y maneje
algunos elementos mínimos que le permita prevenir estas enfermedades.
(ttp://www.ins.gov.co).
2.1.1
Métodos de prevención de enfermedades transmitidas por
alimentos
Se han utilizado diversos procesos que tienen como fin evitar la proliferación
microbiana en los alimentos, evitando así la aparición de ETA. Dentro de los
métodos de control más utilizados se encuentran el tratamiento térmico
(pasteurización, esterilización), irradiación (radiación UV), almacenamiento a
bajas
temperaturas
(congelación,
refrigeración),
conservantes
químicos
(nitritos), conservación por medio de sustancias naturales que poseen actividad
antimicrobiana, tales como los aceites esenciales derivados de plantas, entre
otros (Adams, 1997).
2.2 Tratamiento térmico
Desde hace varias décadas, el tratamiento de conservación por calor, ha sido
la tecnología más utilizada para la conservación de alimentos. A través de los
años, se ha conseguido la elaboración de alimentos microbiológicamente
seguros y con baja actividad enzimática (Torres, 2007).
El objetivo primordial de un tratamiento térmico consiste en la destrucción de
microorganismos capaces de multiplicarse en el producto a la temperatura
prevista de distribución o de poner en peligro la salud del consumidor. Para un
número cada vez mayor de productos, el tratamiento térmico representa
8
solamente una parte del proceso de conservación, y suele aplicarse en
combinación con otros procesos. Actualmente, el tratamiento térmico es uno
de los tratamientos que hacen posible la existencia de productos sanos de
larga vida comercial. El tratamiento térmico permite que las conservas se
puedan almacenar a temperatura ambiente garantizando su seguridad (Rees,
1994).
Las formas vegetativas de bacterias, levaduras y hongos se destruyen casi
instantáneamente a 100°C y normalmente no constituyen ningún problema en
el tratamiento térmico de las conservas, pero las esporas de ciertas especies
bacterianas son extraordinariamente resistentes al calor y para su destrucción
se necesita exponerlas, durante periodos prolongados de tiempo a altas
temperaturas. La velocidad de destrucción es función del tiempo y la
temperatura y varia con las diferentes especies; permaneciendo constantes los
demás factores, la destrucción es tanto mas rápida cuanto más alta sea la
temperatura. Por ello, las condiciones letales para un microorganismo no
pueden expresarse diciendo que muere a tal temperatura, si no que es preciso
señalar un tiempo de exposición a una temperatura determinada. (Herson,
1980).
Los dos métodos mas utilizados hoy en día para la conservación de alimentos
son la esterilización y la pasteurización (Torres, 2007).
2.2.1 Esterilización comercial
La esterilización comercial es un tratamiento de conservación por calor que
tiene como objetivo inactivar la totalidad de microorganismos patógenos y
alteradores, y de enzimas presentes en el alimento permitiendo prolongar la
vida útil del producto en condiciones microbiológicamente seguras a
temperatura ambiente. Por lo general este tratamiento se denomina también
HTST (high temperature-short time) o UHT (ultra high temperature) que supone
aplicar temperaturas de proceso entre 100-120 ºC durante un periodo corto de
tiempo (2-5 s) (Torres 2007).
9
La esterilización, como método de conservación se aplica con el fin de evitar la
entrada de microorganismos y de oxígeno. El objetivo de la conserva, cuyo
punto principal es la esterilización comercial, es destruir todos los
microorganismos patógenos que puedan existir en el producto y prevenir el
desarrollo de aquellos que puedan causar deterioro (Paltrinieri y Figuerola,
1993).
La esterilización evita que sobrevivan los organismos patógenos o productores
de enfermedades cuya existencia en el alimento y su multiplicación acelerada
durante el almacenamiento, produciría serios daños a la salud de los
consumidores. Los microorganismos se destruyen por el calor, pero la
temperatura necesaria para destruirlos varía. Muchas bacterias pueden existir
en dos formas, vegetativa o de menor resistencia a las temperaturas, y
esporulada, o de mayor resistencia. Los microorganismos esporulados son los
más difíciles de destruir mediante tratamientos térmicos, de manera que si el
tratamiento es eficiente con ellos lo será con mayor razón con aquellos
microorganismos más termosensibles (Paltrinieri y Figuerola, 1993).
2.2.2 Pasteurización
La pasteurización es una de las más antiguas técnicas sabidas para la
preservación de alimentos, basado en la degradación térmica parcial de
microorganismos y en la desnaturalización de enzimas que presentan un riesgo
potencial para los alimentos. Los procesos industriales de la pasteurización
tienen que asegurar la prolongación del curso de la vida del alimento, mientras
que por otra parte la calidad del producto debe ser preservada. La realización
de ambos propósitos depende de las condiciones del proceso que aseguran el
curso adecuado de la temperatura durante el proceso, donde está la
consideración del perfil de temperatura dentro del producto de gran importancia
(Plazl, 2006).
10
2.2.3 Causas de la muerte térmica y mecanismo de termorresistencia
Estudios realizados por algunos autores reportan diferentes aspectos de la
lesión térmica y recuperación de formas vegetativas. Estos autores concluyen
que los datos que relacionan la estabilidad térmica de los ribosomas con la
máxima temperatura de crecimiento indican que el RNA ribosómico juega un
papel clave. Estudios recientes han demostrado que las alteraciones del DNA
de las bacterias después de su choque térmico, son debidas posiblemente a la
acción de las nucleasas nativas que se liberan o activan con tratamientos
térmicos suaves. La lesión de la membrana citoplasmática que da lugar a una
salida de los componentes celulares también se ha señalado como una causa
que lleva a la incapacidad de recuperarse de la lesión térmica de las formas
vegetativas. (Herson y Hulland, 1980).
Durante el desarrollo de las esporas aumenta la termorresistencia de los
microorganismos.
Se han avanzado una serie de teorías en torno a la
diferencia entre las células vegetativas y las esporas. Una de esas teorías es
la deshidratación protoplasmática y la corteza contráctil y la otra teoría es la
que implica el papel del ácido dipicolínico (DPA).
Se ha descrito que la
termorresistencia esporular es debida a que una gran porción de su contenido
acuoso se encuentra en forma no disponible para participar en la coagulación
de la proteína celular.
La termorresistencia aumenta de forma gradual a
medida que la concentración de agua del entorno disminuye.
La gran
resistencia de ciertas esporas en medios acuosos exige que la cubierta
esporular tenga una permeabilidad acuosa muy baja, lo que es difícil por la
permeabilidad de los materiales orgánicos.
Por esta razón, otros autores
postularon la corteza contráctil, según la cual la corteza de la espora se
mantiene en un estado seco ejerciendo presión hidrostática a continuación de
la contracción. Murrel y Warth lo interpretaron como apoyo a que la contracción
de la corteza esporular estaba relacionada con la termorresistencia; sugirieron
que en el mecanismo de contracción podía estar implicada la significativa
relación entre cociente Mg/Ca y termorresistencia (Herson y Hulland, 1980).
11
Por otro lado Powell y Starng comprobaron que la sal cálcica del DPA
constituye hasta 15% del peso seco de la espora, pero no de las formas
vegetativas. Después de la germinación se libera esta sustancia con perdida
de termorresistencia. Otras teorías apoyan la explicación que se basa en la
deshidratación osmótica del protoplasma por la corteza que lo rodea, que es
expansible e impermeable a los cationes multivalentes. Las condiciones más
rigurosas exigidas para la destrucción de las esporas por calor seco son
probablemente necesarias para los efectos deshidratantes suplementarios y la
temperatura mayor que la necesaria puede lesionar el DNA de la espora.
(Herson y Hulland, 1980).
2.2.4 Valores D y Z
Para establecer la reducción en el número de microorganismos se requiere
conocer el número inicial de microorganismos presentes en el alimento y
someter los productos a diferentes métodos de eliminación. La gráfica que
representa el logaritmo del número de células que permanecen vivas, en una
suspensión bacteriana o esporular, en función del tiempo de exposición, a una
temperatura constante, se le conoce como curva de supervivencia térmica
(Herson y Hulland, 1980). En el caso de la inactivación térmica como es el
secado
(calor-seco)
y
cocción
(calor-húmedo),
la
mortalidad
de
los
microorganismos necesita ser determinada estimando el valor total de la
destrucción (valor F0). La destrucción de microorganismos por calor es uno de
los objetivos en el secado y la cocción.
Estimar los valores F0 en las
condiciones especificas de proceso, es importante para conocer los valores D y
Z. El valor D es el tiempo de reducción decimal (h), indica el tiempo requerido
para matar al 90% de población bacteriana a una temperatura específica.
Otros autores resaltan que es el tiempo requerido para una reducción unidad
log10 en el número de microorganismos a una temperatura del sistema (James,
2006). Valor Z, es la constante de resistencia térmica (ºC), es la medida del
incremento de temperatura requerida para causar una reducción del 90% en el
12
tiempo de reducción decimal, se puede calcular si la inactivación térmica de las
pruebas se realiza con diferentes temperaturas (James, 2006).
Estos dos
valores ofrecen la base para calcular el tiempo en los procesos del sector
alimenticio. (Rahmana, 2004).
2.2.5
Factores
que
influyen
sobre
la
determinación
de
la
termorresistencia.
Por otra parte, la disponibilidad del agua tiene también un gran impacto en la
transferencia del calor a los microorganismos. La influencia de la actividad de
agua en los microorganismos es compleja, combinando los factores intrínsecos
(el potencial nutritivo, el pH, y los compuestos antimicrobianos como el SO2,
nitratos, y nitritos) y factores extrínsecos (temperatura, oxígeno, tratamientos
químicos, e irradiación), que varían en función de las clases de alimentos y de
microorganismos. Los estudios han demostrado que la resistencia térmica de
microorganismos aumenta mientras que su contenido en agua disminuye y ese
nivel óptimo de la resistencia ocurre entre aw = 0.20 y 0.50, dependiendo del
microorganismo estudiado (Larochea et al, 2005).
Con independencia de las influencias evidentes del medio de suspensión, pH,
actividad de agua, concentraciones de sal, etc. El factor más importante a
tener en cuenta en un estudio de termorresistencia es la velocidad y el
mecanismo de transferencia de calor. La penetración de calor es más lenta en
alimentos más viscosos que en los tampones o en agua (Rees, 1994).
2.2.6 Las conservas y el tratamiento térmico
Las conservas son productos que se mantienen durante largo tiempo
contenidos en recipientes (de metal, vidrio o material flexible) herméticamente
cerrados. La capacidad de conservación se logra con preferencia mediante
tratamiento térmico, cuya acción consiste en reducir, destruir o frenar el notable
desarrollo de los microorganismos presentes en las materias primas
13
conservadas (Sielaff, 2000). Durante el proceso es necesario, conservar las
cualidades organolépticas y nutritivas (Hersom y Hulland, 1980).
Para alcanzar la deseada capacidad de conservación resultan determinantes la
temperatura utilizada y el tiempo de actuación de ésta.
Los métodos más
importantes de conservación son la pasteurización y la esterilización. En ellos,
la temperatura y el tiempo de actuación son distintos. En la pasteurización se
suelen aplicar temperaturas inferiores a 100ºC y no se logran destruir las
esporas de los géneros Bacillus y Clostridium, pero si se garantiza la muerte de
los microorganismos vegetativos. La esterilización se realiza con temperaturas
superiores a 100ºC, con lo cual se logra la eliminación de las esporas de los
géneros mencionados (Sielaff, 2000).
2.2.7 Transmisión del calor en el alimento envasado
La velocidad con que se difunde el calor en el producto, depende
decisivamente de la composición de éste.
Los principales factores de
influencia son la estructura, densidad, proporción entre componentes sólidos y
líquidos, viscosidad y tamaño de los trozos o partículas.
Atendiendo al mecanismo de transmisión del calor, los contenidos de las
conservas pueden clasificarse así:
1. Productos en los que el calor se transmite por convección sin
obstáculos. Entre ellos se cuentan por ejemplo, la leche condensada sin
azúcar y determinadas salsas y sopas.
2. Productos calentados por conducción, como el jamón cocido y
embutidos escaldados.
3. Productos calentados simultáneamente por conducción y convección.
En este grupo se incluyen la mayoría de los productos cárnicos y
preparados de pescado, fruta y verduras (Sielaff, 2000).
14
2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos
Las sustancias esenciales naturales, se han utilizado desde épocas antiguas,
como sustancias aromáticas y como preservantes.
Los aceites esenciales
cubren un amplio espectro de actividades tales como efectos farmacológicos,
antiinflamatorios, antioxidantes y anticancerígenos. Otros son biocidas contra
una amplia gama de organismos como bacterias, hongos, virus, protozoos,
insectos y plantas. También se ha estudiado la importancia de estos aceites
debido a su disponibilidad, a los pocos efectos secundarios o a la toxicidad que
puedan causar, así como la mejor biodegrabilidad comparado con antibióticos y
preservativos disponibles (Kalemba, 2003). Por todas estas propiedades, se
ha evaluado el control que pueden ejercer estos compuestos contra
microorganismos patógenos en alimentos, y por tanto, la posibilidad de ser
utilizados como un método de eliminación.
Muchas hierbas y especias han sido usadas durante siglos para proporcionar
sabores diferentes a los alimentos y éstas pueden presentar también actividad
antimicrobiana (Ultee et al, 2002).
Los compuestos responsables de esta
actividad son a menudo fracciones del aceite esencial, las cuales consisten
principalmente en compuestos fenólicos (Conner, 1993).
esenciales
de
plantas
y
sus
componentes
que
Los aceites
presentan
actividad
antimicrobiana (Akgul y Kivanc, 1988), tienen gran aplicación para el control del
crecimiento de patógenos de alimentos por lo que se utilizan como método de
preservación (Hao et al, 1998).
Se ha reportado que la actividad
antimicrobiana se deriva de terpenoides y compuestos fenólicos en los aceites
(Yamazaki et al, 2003).
Las plantas producen una gran cantidad de compuestos secundarios como
protección contra ataques microbianos e insectos. De hecho muchos de éstos
compuestos han sido usados en forma pura o extractos vegetales como
alimento o aplicaciones médicas en humanos (Wallace, 2004).
15
Los aceites esenciales comúnmente se concentran en una región particular
como hojas, corteza o frutos; y cuando esto ocurre en diferentes órganos en la
misma planta, frecuentemente su composición es diferente (Oussalah et al,
2005).
Aunque comúnmente se piensa que son derivados de hierbas y
especias, están presentes hasta cierto punto en muchas plantas con un papel
protector contra el ataque de bacterias, hongos o insectos. Éstos comprenden
principalmente monoterpenos, hidrocarburos cíclicos y su alcohol, aldehído o
derivados esteres.
Recientemente, por ejemplo, se han demostrado los efectos positivos contra
bacterias patógenas (Wallace, 2004). Se ha comprobado que los aceites de
Cinnamomum
osmophloeum
poseen
actividad
antimicrobiana
frente
a
Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Salmonella
spp y Vibrio parahemolyticus, donde el cinamaldehído es el principal
componente de la mezcla (Chang et al, 2001). E.coli O157:H7 es inhibido por
el aceite del orégano (Elgayyar et al, 2001), de la hierbabuena (Imai et al, 2001)
y aceites esenciales de otras plantas (Marino et al, 2001). Helicobacter pylori
es altamente sensible al aceite de la menta verde (Imai et al, 2001).
2.3.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas
Las plantas tienen una capacidad casi ilimitada para sintetizar
sustancias
aromáticas, siendo la mayoría fenoles o sus derivados oxígeno – sustituídos.
En general son metabolitos secundarios (es decir, que no tienen un papel
esencial en el metabolismo de las plantas) (Walton et al, 1999), de los cuales
por lo menos el 10% se han aislado.
En muchos casos, estas sustancias
sirven a la planta como mecanismos de defensa contra el ataque de
microorganismos, insectos y herbívoros.
Algunos como los terpenoides,
proporcionan a la planta sus olores, otros (quinonas y taninos) son
responsables del pigmento de la planta (Murphy, 1999).
16
Dentro de los compuestos presentes en los extractos vegetales que poseen
actividad antimicrobiana, se pueden mencionar el timol, el carvacrol, o el
eugenol; algunos autores como Conner en 1993, reportaron la alta actividad
antimicrobiana de éstos compuestos en forma pura.
Con respecto al carvacrol, se ha visto que se encuentra presente en aceites
esenciales de orégano (60% a 70% de carvacrol) y tomillo (45% de carvacrol).
La inhibición del crecimiento de muchos patógenos por el carvacrol, ha sido
reportada en varios artículos, sin embargo no se ha definido el mecanismo de
acción de éste. Usando B. cereus, un esporoformador patógeno en alimentos,
como organismo modelo, se ha demostrado que la exposición de las células
vegetativas a concentraciones de carvacrol mayores a 1 mM, conduce a una
extensión de la fase de latencia, una tasa baja de crecimiento máximo
específico y una densidad final de población baja. También se ha visto que a
concentraciones por encima de 1 mM, la viabilidad de B. cereus decrece
exponencialmente. Al mismo tiempo hay un incremento en la fluidez de la
membrana y salida de protones e iones potasio, conduciendo a una
disminución en el gradiente de pH a través de la membrana citoplasmática, un
colapso en el potencial de membrana e inhibición de la síntesis de ATP.
Finalmente estos eventos, son seguidos por la muerte celular (Ultee et al,
2002).
Por otra parte, el timol es un isómero del carvacrol que se ha visto implicado en
la desintegración de la membrana externa y en el incremento de la
permeabilidad de la membrana citoplasmática al ATP en células de Escherichia
coli y Salmonella thyphimurium. El timol y el cimol (precursor biosintético del
timol) son ejemplos de preservativos naturales que han sido reportados por
tener efectos inhibitorios sobre bacterias y hongos (Delgado et al, 2003).
Otros de los compuestos derivados de plantas que poseen actividad
antimicrobiana son los fenólicos y polifenoles dentro de los cuales se
encuentran: quinonas; flavonas, flavonoides y flavonoles; taninos; y cumarinas.
17
Otros son los terpenoides y aceites esenciales, los alcaloides, lecitinas y
polipéptidos, entre otros (Murphy, 1999).
2.3.2 Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites
esenciales
Para la evaluación antimicrobiana de aceites esenciales, se aplican
generalmente métodos convencionales probados con capacidades antibióticas.
Hay dos técnicas básicas usadas para la valoración de ambas actividades,
antibacteriales y antimicóticas de los aceites esenciales: 1. El método de
difusión en agar (pozo o disco de papel) y 2. El método de dilución (agar o
caldo líquido). Las pruebas y evaluación de la actividad antimicrobiana de los
aceites esenciales son difíciles debido a su volatilidad, insolubilidad en agua y
complejidad (Kalemba y Kunicka, 2003).
Los aceites esenciales son de naturaleza hidrofóbica y de gran viscosidad.
Estas características pueden reducir la capacidad de la dilución o pueden
causar distribución desigual del aceite a través del medio, aún si se usa un
agente correcto disgregante o solubilizante. Se tiene que comprobar si las
concentraciones aplicadas del emulsor o del solvente no afectan el crecimiento
y la diferenciación de los microorganismos de prueba (Kalemba y Kunicka,
2003).
Los cultivos de microorganismos se realizan en medios líquidos, bajo
condiciones
físicas
óptimas
para
las
especies
individuales.
Los
microorganismos tienen que alcanzar una fase apropiada del crecimiento, y un
número especificado de células tiene que ser utilizado para la prueba (Kalemba
y Kunicka, 2003).
18
2.3.2.1 Método de difusión en agar
El método permite estimar el grado de inhibición del crecimiento de los
microorganismos y sus cambios morfológicos de una manera simple. En las
cajas de Petri con agar se inocula el microorganismo de prueba; existen dos
métodos posibles para la incorporación del aceite esencial que son: en un disco
de papel (Omer et al, 1998.) o en un pozo hecho en medio del agar (LisBalchin et al, 1998).
El aceite esencial no se usa a menudo en forma pura, generalmente se utilizan
sus soluciones. Se preparan en cajas de Petri, soluciones del aceite esencial
en diferentes concentraciones y los discos de papel son sometidos a inmersión.
Las placas se almacenan durante algún tiempo para permitir que todos los
componentes del aceite esencial se difundan dentro del agar, después se
incuban. La eficacia del aceite esencial es demostrada por tamaño de la zona
de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor del disco
y se
expresa generalmente como el diámetro de esta zona (milímetros o
centímetros) (Kalemba, 2003).
2.3.2.2 Método de dilución
El método de dilución en serie en agar se utiliza para bacterias y hongos y su
modificación con caldo líquido se usa solo para hongos. Los cultivos de agar
se realizan en cajas de Petri o en tubos, mientras que los cultivos líquidos se
realizan en frascos cónicos con un volumen de 100 ml de medio. Para el caldo
líquido en frascos cónicos, el índice de crecimiento inhibitorio se calcula (% de
los cambios en la biomasa del hongo comparando con el cultivo control)
(Kalemba y Kunicka, 2003).
Los resultados se pueden presentar en dos maneras:
*El índice de inhibición de crecimiento definido como la proporción porcentual
para el cultivo de crecimiento de control sin aceite esencial.
19
* La concentración mínima inhibitoria (MIC) o la máxima dilución inhibitoria
(MID). La restricción en el crecimiento de los microorganismos (análisis de la
actividad bacteriostática y fungistática) o la concentración mínima letal (MLC)
(análisis de la actividad bactericida y fungicida) (Kalemba, 2003).
La actividad de aceites esenciales contra hongos puede ser también
investigada comprobando la inhibición de la esporulación (Akgül et al, 1988) y
productividad de la toxina. La concentración mínima inhibitoria se define como
la concentración más baja del aceite esencial en el caldo, dando por resultado
la carencia de los cambios visibles del crecimiento del microorganismo
(Kalemba, 2003).
Para estimar la actividad letal del aceite esencial, los microorganismos se
transfieren del caldo líquido o al agar donde no se observa crecimiento en un
nuevo medio.
La concentración más baja del aceite esencial que da por
resultado la inhibición total del crecimiento, se reconoce como la concentración
mortal mínima, MCB para las bacterias (concentración mínima bactericida) y
MCF para los hongos (mínima concentración fungicida).
A veces MCL
(concentración mínima letal) se define como la concentración resultante dando
por resultado una reducción del >99.9% del número de microorganismos en el
inóculo (Kalemba, 2003).
2.4 Minthostachys mollis
Una especie promisoria por sus aceites esenciales es Minthostachys mollis
(Lamiaceae), planta nativa de la cordillera de los Andes desde Venezuela hasta
Bolivia, con amplio rango altitudinal (1000-3400 m).
Es un subarbusto
aromático de hasta 50 cm de altura, leñoso hacia la base, con hojas ovadas y
pubescentes e inflorescencias axilares en cimas (Alkire et al, 1994) (Figura 2).
En Colombia ésta se encuentra en las tres cordilleras y la Sierra Nevada de
Santa Marta (Chica-Balaguera et al, 2006).
20
Figura 2. Fotografía de Minthostachys mollis
Fuente: Autores
M. mollis es conocida como muña en el Perú, peperina en Argentina y orégano
en Colombia, y es utilizada en medicina popular para tratar los cólicos
estomacales y ciertos trastornos gripales (White, 1985; Acero Coral y Rive,
1994; Beltrán y Cedillo, 1994).
El uso más conocido tiene que ver con la
preservación de la papa en condiciones de almacenamiento; se ha señalado
que los campesinos de la sierra peruana la han utilizado desde hace muchos
años con este fin, igualmente ha tenido uso como condimento y preservativo de
alimentos. En Colombia es utilizada en forma similar por los campesinos del
altiplano cundiboyacense. De otro lado, Raman y Booth (1987) encontraron que
posee propiedades repelentes que controlan la polilla de la papa (Phthorimaea
operculella); además según Aliaga y Feldeheim (1985) reduce el brotamiento y
daño de este tubérculo al ser almacenado en cámaras que contengan esta
planta. En algunos lugares de Colombia la emplean como repelente contra las
pulgas y podría igualmente utilizarse para el control del gorgojo del fríjol,
Acanthoscelide obtectus (Chica-Balaguera et al, 2006).
21
Diferentes estudios de la composición química del aceite esencial de
Minthostachys han reportado los compuestos carvacrol , pulegona, mentona,
isomentona, β-pineno y limoneno, mentol en cantidades relativas que varían
desde 9.3% hasta 65.8% (Figura 3)
Figura 3. Algunos de los componentes de Minthostachys mollis determinada
por Chica, et al 2006, con su respectiva estructura.
Fuente: (Kalemba y Kunicka, 2003)
22
2.5 Listeria monocytogenes
2.5.1 Generalidades
Listeria monocytogenes es un bacilo Gram positivo, aerobio, psicrótrofo, halo
tolerante, no móvil, no esporulado, este microorganismo se ha aislado de
muchos alimentos, tales como carnes y productos cárnicos, quesos blandos,
helados, verduras y hortalizas y alimentos de origen marino (ICMSF, 2000). L.
monocytogenes es un microorganismo que no era considerado como un
importante patógeno transmitido a través de los alimentos hasta hace
relativamente poco tiempo y, en consecuencia, no había recibido mucha
atención por parte de la industria alimentaria (Bell et al, 2000); sin embargo
actualmente L. monocytogenes es un microorganismo zoonótico emergente en
la industria de alimentos (Torres et al, 2004), es un contaminante ambiental
ampliamente distribuido cuyo medio primario para la transmisión al hombre es
a través de la contaminación de los alimentos en cualquier punto de la cadena
alimentaria, desde el origen hasta la cocina y ha sido reportada como la
causante de la listeriosis humana, por esta razón resulta de gran interés para
la salud pública (Bell et al, 2000). Es importante enfocarse en la enfermedad
producida
por
el
consumo
de
alimentos
contaminados
con
este
microorganismo, pues la listeriosis humana ha sido reportada y es considerada
de grave naturaleza desde la década de los 80, puesto que cursaba con altos
índices de mortalidad, en particular sobre los miembros mas vulnerables de la
población como son los niños neonatos, los ancianos y los inmunosuprimidos.
(Bell, et al, 2000).
Los individuos susceptibles tienden a ser muy jóvenes, mayores o mujeres
embarazadas quienes son particularmente susceptibles a la listeriosis.
23
2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes
L. monocytogenes ha causado una considerable preocupación en la industria
alimenticia, a funcionarios reguladores de la salud y consumidores (Selby et al,
2006), pues este microorganismo puede adaptarse para sobrevivir, crecer en
una gran variedad de condiciones ambientales y causar listeriosis (Mead et al.
1999), entre éstas condiciones se encuentra la capacidad de crecer sobre una
amplia gama de temperaturas (2-45°C), su supervivencia y crecimiento en las
temperaturas de refrigeración (2-4°C) (Gandhi y Chikindas, 2007) y la mayor
resistencia térmica concerniente a otros patógenos transmitidos por los
alimentos (Piyasena, 1998).
Se sabe que las células contienen varios blancos para la acción térmica, pero
ha sido propuesto por Miller, et al (2006) que la resistencia basal de calor de
estos microorganismos podría ser debida a la estabilidad intrínseca de
macromoléculas, o sea ribosomas, ácidos nucleicos, enzimas y proteínas
dentro de la célula y la membrana (Miller et al, 2006).
Los lípidos en las membranas de las células bacterianas son un fluido, su
condición cristalina y ésta condición física es importante para mantener la
fluidez y la función de la membrana. Los cambios en la temperatura conducen
a una alteración en la composición de los lípidos de la membrana para
mantener la fluidez ideal requerida para la actividad enzimática y el transporte
de solutos a través de la membrana. Una proporción alta de ácidos grasos iso
y anteiso con números impares de cadenas conectadas, caracterizan la
membrana de la célula de Listeria (Gandhi y Chikindas. 2007).
24
2.6 Bacillus cereus
2.6.1 Generalidades
B. cereus es un microorganismo esporoformador, aerobio facultativo, Gram
positivo, móvil que se puede aislar de una variedad de sitios diferentes.
(Kotiranta et al, 2000). Este microorganismo es capaz de causar enfermedad
transmitida por alimentos.
Dos síndromes pueden ser distinguidos, un
síndrome emético y un síndrome diarreico. El síndrome emético es causado
por la toxina cereulida, un péptido estable al calor y al pH.
El síndrome
diarreico es causado por enterotoxinas que son producidas durante el
crecimiento de B. cereus en el intestino delgado. Se presentan tres
enterotoxinas capaces de causar el síndrome diarreico y pueden ser descritas
como: hemolisina BL (HBL), enterotoxina no hemolítica (NHE) y citotoxina K.
HBL Y NHE tienen tres componentes proteicos, mientras que la cititoxina K es
una sola proteína. El mecanismo del síndrome se cree que es: el consumo de
comida contaminada con las esporas y/o las células vegetativas de B.cereus.
Las esporas pasan a través del estómago y alcanzan el intestino delgado,
germinan, crecen y de este modo se producen las enterotoxinas. Las células
vegetativas se cree que son muy susceptibles a las condiciones del estómago
por lo tanto es difícil el alcance al intestino delgado. (Wijnands et al, 2006).
La forma clásica de intoxicación alimentaria por B .cereus se conoce desde
comienzos del siglo, pero es a partir de 1950 cuando se han escrito numerosos
brotes atribuibles de forma definitiva a este microorganismo (ICMSF, 2000).
2.6.2 Termorresistencia de Bacillus cereus
Los microorganismos aeróbicos formadores de esporas como las especies de
Bacillus reciben especial atención en producción de alimentos, por su amplia
distribución en el ambiente.
Se ha demostrado la resistencia de sus
endosporas a condiciones adversas y a varias condiciones de estrés debido a
25
su aislamiento de muchos alimentos crudos y procesados alrededor del mundo
(Claus y Berkeley, 1986).
Debido a la capacidad de B. cereus para producir esporas que sobreviven a
altas temperaturas y crecer a bajas temperaturas (Gonzáles et al, 1995), este
microorganismo representa un riesgo asociado a enfermedad transmitida por
alimentos (Amodio et al, 1998). Se ha reportado que la resistencia al calor de
las esporas bacterianas depende de la actividad del agua del medio en el cual
éstas son suspendidas durante el calentamiento. La máxima termoestabilidad
para esporas de muchos microorganismos fue encontrada en una actividad de
agua de un rango entre 0.2 – 0.4 (Pfeiffer y Kessler, 1994); también se ha visto
que la resistencia al calor de las esporas microbianas incrementa cuando se
someten al calor en presencia de altas concentraciones de soluciones de sales
y azúcares ( Bell y De Lacy, 1984).
En general, las esporas son resistentes a los tratamientos de pasteurización, el
tratamiento térmico en productos procesados (90-95°C por 6-10 min)
usualmente no es suficiente para inactivar todas las esporas (Rozier y Carlier,
1997).
Es importante conocer y predecir la habilidad de las esporas para
sobrevivir al tratamiento térmico y el efecto de las condiciones ambientales en
su subsiguiente crecimiento en alimentos. La resistencia térmica y la duración
de la fase de germinación después del tratamiento térmico son dos parámetros
importantes para estimar la seguridad de los alimentos (Laurent et al, 1999).
Se ha reportado que las esporas Bacillus cereus son capaces de resistir una
temperatura de 95°C (Byrne et al, 2006; Anonymous, 2000). Además se ha
visto que las condiciones del medio como pH, naturaleza de los acidulantes y
temperatura, también se relacionan con la resistencia al calor de las esporas
(Laurent et al, 1999).
La termorresistencia de las esporas bacterianas se ve muy influenciada por
factores ambientales durante: (1) la esporulación; (2) el tratamiento térmico y
(3) la recuperación. Además, cuanto mayor sea el número inicial de esporas,
26
mayor será el tiempo necesario para llevar a cabo su destrucción (Hersom y
Hulland 1980).
27
3. JUSTIFICACIÓN
Los alimentos pueden ser un vehículo de transmisión de microorganismos
patógenos y por tanto tienen gran trascendencia en la salud de los
consumidores. La adquisición de enfermedades por el consumo de alimentos
contaminados con microorganismos como L. monocytogenes y B. cereus ha
hecho que cada vez más países reconozcan la necesidad de someter estos
productos a ciertas pruebas o estudios enfocados a evaluar su inocuidad y su
calidad. Actualmente se conocen muchas técnicas para el control e inhibición
de microorganismos con el fin de preservar los alimentos, una de éstas es la
adición de sustancias de origen natural que le provean al alimento calidad
microbiológica y al mismo tiempo permitan sustituir los aditivos químicos.
Igualmente el tratamiento térmico ha sido uno de los métodos más
comúnmente utilizados para la conservación de los alimentos, especialmente
en conservas.
Por lo anterior, en el presente estudio se quiso evaluar la
actividad antimicrobiana del extracto de Minthostachys mollis sobre L.
monocytogenes y B. cereus y determinar el tiempo y temperatura necesarios
para inactivar éstos microorganismos mediante curvas de inactivación tanto en
medio de cultivo como directamente en el alimento, en este caso una conserva.
28
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Evaluar el efecto de la inactivación térmica y el aceite esencial de M. mollis
sobre cepas de Bacillus cereus y Listeria monocytogenes.
4.2 Objetivos específicos
•
Determinar
el
tiempo
que
requieren
las
monocytogenes y Bacillus cereus para llegar a
cepas
de
Listeria
la fase estacionaria,
mediante curvas de crecimiento.
•
Evaluar la termorresistencia de las cepas, mediante la elaboración de
curvas de muerte térmica en caldo BHI y en conserva a base de tomate.
•
Obtener el aceite esencial de la planta, mediante una técnica de
hidrodestilación.
•
Establecer el efecto bacteriostático o bactericida
del aceite esencial
obtenido de Minthostachys mollis, sobre Listeria monocytogenes y
Bacillus cereus en conservas a base de tomate.
•
Combinar la inactivación térmica y el aceite esencial sobre las cepas a
evaluar para realizar la prueba en conservas.
29
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Obtención de cepas
Se trabajó con las cepas 146, 142, y 196 de Listeria monocytogenes aisladas
previamente de productos cárnicos y la cepa de Bacillus cereus que se obtuvo
de una colección del cepario de la Pontificia Universidad Javeriana (Correa,
2004).
5.2 Elaboración del banco de células primario (BCP)
Las cepas de L. monocytogenes se recuperaron en agar Oxford.
Para su
posterior criopreservación fue necesario tomar una parte de este cultivo,
inocularla en 36 mL de caldo BHI adicionado con 0.5% de glucosa y llevar a
incubación durante 24 horas a 37ºC, 130 rpm. Finalizado este tiempo, se le
adicionó al cultivo 4 mL de glicerol estéril y se distribuyó en tubos eppendorf
cada uno conteniendo un volumen de 1 mL (Molina et al, 2005). Los tubos
fueron almacenados a – 70ºC durante todo el estudio. Por otra parte la cepa
de B. cereus se recuperó en agar Bacillus cereus y se procedió de la misma
forma para su criopreservación sustituyendo la glucosa al 0.5% por almidón al
1% , para su posterior almacenamiento.
Durante los 6 meses del estudio se realizaron pruebas de pureza a las cepas
utilizadas; esto se hizo mediante tinciones de Gram.
5.3 Curvas de crecimiento
Se realizaron curvas de crecimiento para cada una de las 3 cepas de L.
monocytogenes por triplicado. Para esto se descongeló un vial de cada cepa y
se inoculó en 20 mL caldo BHI adicionado de 0.5% de glucosa (preinóculo),
después se incubó a 37°C con agitación de 130 rpm durante toda la noche.
Posteriormente se adicionaron los 20 mL de cultivo crecido en 200 mL del
30
mismo caldo para iniciar la curva de crecimiento, en el transcurso de este
tiempo se tomaron muestras del inóculo, las dos primeras horas cada 15
minutos y después de estas dos horas cada 30 minutos, este procedimiento
seguido de la medición por duplicado de la absorbancia del inóculo a 620 nm,
utilizando caldo BHI estéril con glucosa al 0.5% como blanco, al finalizar las 12
horas, se observó que el cultivo alcanzó la fase estacionaria (Román, 2004.,
Rojas, 2007).
Para B. cereus la cinética de crecimiento se obtuvo como se describe a
continuación: las curvas se llevaron a cabo durante 24 horas, bajo agitación
130 rpm y una temperatura de 30°C. Para esto fue necesario descongelar las
cepas, inocularlas en 20 ml de caldo BHI con almidón al 1% y dejar en
incubación durante toda la noche, posteriormente se transfirió el cultivo a 200
mL de caldo BHI con almidón al 1%, se tomaron muestras y se hizo lectura de
absorbancia y recuento en placa, (Delgado et al, 2003). Adicionalmente se
realizó un modelo matemático de la cinética de crecimiento de B. cereus en
“Combase
predictor”,
para
identificar
las
fases
de
crecimiento
del
microorganismo bajo condiciones estándar (caldo tripticasa de soya, pH 7,
temperatura de 30 °C, Aw de 0.997).
Durante la realización de las curvas de crecimiento se hicieron diluciones
seriadas en agua peptonada al 0.1 % y se sembraron en profundidad las
diluciones 10-7 y 10-8 en agar TSAYE y TS para L. monocytogenes y B. cereus
respectivamente, para luego hacer recuentos.
31
5.4 Evaluación de la termorresistencia
5.4.1 Elaboración de curvas de inactivación térmica
Para realizar las curvas de inactivación térmica de B. cereus fue necesario
descongelar los viales y colocarlos a crecer durante 18 horas en caldo BHI con
almidón al 1% para que el cultivo alcanzara la fase estacionaria (Román, 2004).
Posteriormente, se sirvieron tubos con 10 mL de cultivo para someterlos a las
temperaturas a evaluar (55ºC, 60ºC y 70ºC) durante 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 y
60 minutos. De cada tiempo se realizaron diluciones seriadas de 10-1 a 10-10
en agua peptonada al 0.1% para hacer recuentos en profundidad en agar TS
por duplicado. Cada curva se realizó por triplicado para cada temperatura.
(Molina et al, 2006)
Por otra parte, las curvas de L. monocytogenes se realizaron de la misma
forma pero evaluando temperaturas de 52, 55 y 57°C y, tiempos de 1, 2, 5, 10,
15, 20, 30 y 60 minutos. Los recuentos se realizaron de la misma manera que
con las curvas de B.cereus, reemplazando el agar TS por TSAYE.
5.4.2 Elaboración de la salsa y evaluación de termorresistencia en salsa.
Para la elaboración de la salsa sobre la cual se evaluó la termorresistencia se
pesaron diferentes cantidades de los ingredientes a utilizar (tomate, cebolla,
ajo, aceite, sal, salsa de tomate y azúcar) hasta obtener el sabor, color y
contextura deseada. Se obtuvieron 11 conservas con características distintas y
se realizó una selección de una de ellas con base en las características
organolépticas requeridas y al mismo tiempo teniendo en cuenta las opiniones
de las personas del laboratorio de microbiología de alimentos de la Universidad
Javeriana, acerca de sabor, color, etc. Después de seleccionar la salsa, se
llevó a esterilización y se sirvieron 200 mL en frascos de vidrio; para después
inocular 20 mL del cultivo crecido previamente durante 12 y 24 horas para
L.monocytogenes y B.cereus respectivamente. Luego, se procedió a evaluar
32
las mismas temperaturas usadas durante la elaboración de las curvas ya
mencionadas. Igualmente se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada
de cada tiempo y recuentos en agar TS para B. cereus y TSAYE para L.
monocytogenes. Para esto fue necesario pesar 10 g de salsa e inocularlos en
90 mL de agua peptonada para seguir haciendo las diluciones (Carrascal y col.
2003)
5.5 Obtención de la planta
Las plantas de M. mollis se recolectaron en el jardín botánico de la Universidad
Nacional, Bogotá, Colombia. Este procedimiento de recolección se realizó en
compañía de un asesor experto en la obtención de Minthostachys mollis.
5.5.1 Obtención del aceite esencial de Minthostachys mollis
De una misma población de individuos de M. mollis propagados bajo
condiciones controladas, se tomaron muestras frescas (500 g) de la parte
aérea de plantas en el mismo estado de desarrollo (vegetativo, floración o
fructificación), se sometieron a hidrodestilación por 2 horas. La fracción de
aceite esencial extraída se recolectó en un vial, para congelarlo a -10 °C y
centrifugarlo a 12000 rpm durante 10 min, con el fin de separar la fase acuosa
de la oleosa, y se almacenaron a 4 ºC para los análisis posteriores (ChicaBalaguera et al, 2006., Tepe et al, 2005).
5.6 Evaluación de la actividad antimicrobiana.
5.6.1 Método difusión en agar con disco para bacterias
5.6.1.1. Preparación del inóculo
Para la obtención del inóculo de L. monocytogenes se realizó un pool con las
cepas 146, 142 y 196, las cuales se adicionaron en 200 mL de caldo BHI con
33
glucosa al 0.5% y se llevaron a incubación durante 12 horas a 37ºC, 130 rpm.
En el caso de B. cereus, se inoculó en 200 mL de caldo BHI adicionado con
almidón al 1% y se llevó a incubación durante 18 horas a 30ºC, 130rpm.
Transcurrido el tiempo de incubación para cada microorganismo, se ajustó la
concentración del inóculo haciendo diluciones con caldo BHI adicionado de
0.5% de glucosa o 1% de almidón para L. monocytogenes y B. cereus
respectivamente, y se midió su absorbancia con el espectrofotómetro
GENESYS, hasta obtener un valor de 0.25 equivalente a concentración de 108
células/ mL (Molina et al, 2005). A partir de este inóculo se realizó una siembra
masiva en cajas de Petri; para L. monocytogenes se utilizó agar para antibiótico
adicionado de sangre al 5% y extracto de levadura al 0.5% (comunicación
personal Gallegos, 2006) y para B. cereus agar para antibiótico. Las placas de
Petri se utilizaron de la siguiente forma: se realizaron 5 réplicas donde una caja
contenía el disco impregnado con el aceite esencial puro, otra caja el disco con
el control positivo (ampicilina o vancomicina para Listeria monocytogenes y
Bacillus cereus respectivamente) y la última caja el control negativo que en
este caso se utilizó un disco estéril. Los discos utilizados se cortaron de papel
Whatman No 3 (6mm) y se esterilizaron previamente (Bauer-Kirby, 1966;
NCCLS, 2003).
5.7. Análisis estadístico
Se realizó una comparación de medias para establecer si existía diferencia
estadísticamente significativa entre las diferentes temperaturas utilizadas para
cada una de las cepas de inactivación térmica, usando el programa SAS-9 para
Windows.
34
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Prueba de pureza y viabilidad de los bancos de células.
Los resultados de pureza y viabilidad de las cepas evaluadas, se muestran en
las tablas 1 y 2 respectivamente.
Tabla 1. Pruebas de pureza
FECHA DE PRUEBA
14 de
Enero de
2007
20 de
Febrero
de 2007
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
positivo
esporulado
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
positivo
CEPA
L.
monocytogenes
código 146
L.
monocytogenes
código 142
L.
monocytogenes
código 196
Bacillus cereus
17 de
10 de
22 de
Marzo de
Abril de
Mayo de
2007
2007
2007
COLORACIÓN DE GRAM
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
positivo
esporulado
8 de
Junio de
2007
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
pequeño
positivo
Bacilo
positivo
esporulado
Tabla 2. Pruebas de viabilidad de los BCP.
CEPA
Fecha de prueba : 14 de Enero de
2007
Recuento (UFC/mL)
Listeria monocytogenes código 146
30x108
Listeria monocytogenes código 142
17x108
Listeria monocytogenes código 196
21x108
Bacillus cereus
12x109
35
Figura 4. Fotografía de coloración de Gram de L. monocytogenes.
Fuente: Autores
Figura 5. Fotografía de la coloración de Gram de B.cereus.
Fuente: Autores
En la tabla 1 se muestran los resultados de las pruebas de pureza realizadas
durante el estudio, en las cuales se obtuvieron las morfologías que se muestran
en la figura 4, coincidiendo con lo reportado por Bell et al, 2000 para Listeria
monocytogenes, que corresponden a bacilos Gram positivos en algunos casos
en forma de Y o V. En el caso de la morfología de B. cereus (figura 5), se
observaron bacilos Gram positivos esporulados, coincidiendo con lo reportado
por Delgado et al, 2004. Lo anterior demuestra que el método de preservación
36
utilizado en este caso, criopreservación con glicerol, fue favorable ya que es un
método que protege a las bacterias durante el almacenamiento en congelación
(Lynn, 2004). El glicerol actúa a nivel de membrana celular limitando el efecto
de la deshidratación celular, disminuyendo el punto de congelación de líquidos
biológicos intra y extracelulares y promoviendo la vitrificación en lugar de la
formación de cristales de hielo intracelulares (Rojas, 2007).
Con relación a L. monocytogenes, podría decirse también que su tolerancia al
frío se relaciona con la lipoproteína OppA, pues ésta media el transporte de
ologopéptidos dentro de la pared celular, involucrándose en la crioprotección
por medio de la acumulación de osmolitos como la glicina betaína (Borezee et
al, 2000). Se ha reportado que L. monocytogenes acumula glicina betaína para
adaptarse a bajas temperaturas (Molina et al, 2006).
Un banco de células es un cultivo microbiano puro, homogéneo; almacenado
bajo condiciones que aseguran su estabilidad genética (Meza, 2004), evita la
alteración
de
las
características
bioquímicas,
secuencia
nucleotídica,
estabilidad plasmática, reconocimiento inmunológico, actividad biológica,
características morfológicas, retarda la muerte de los microorganismos,
previene la contaminación y mantiene la viabilidad de los microorganismos
(Monroy et al, 2002). De acuerdo a lo anterior, se evidenció que las cepas de
L. monocytogenes y B. cereus conservaron sus características y mantuvieron
estabilidad, pues durante todo el estudio hubo poblaciones de 108 UFC/mL y
109 UFC/mL para L. monocytogenes y B. cereus respectivamente (tabla 2).
6.2 Cinética de crecimiento de L. monocytogenes y B. cereus.
Con la realización de las curvas de crecimiento de las 3 cepas de L.
monocytogenes en estudio, se evidenció que todas alcanzaron la fase
estacionaria en 12 horas (Fig. 6), lo cual corresponde con lo mencionado por
Aldana, 2000 y Robinson et al, 2001. En este estudio se pretendía conseguir la
fase estacionaria ya que se ha reportado que es el momento en el cual los
37
microorganismos adquieren mayor resistencia; además en esta fase se han
encontrado ciclos de división reductiva, incremento en la estabilidad del ARN y
en la resistencia a condiciones de estrés en bacterias patógenas (Arraíz et al,
2002).
Según Robinson et al, 2001, las células en fase exponencial son
generalmente más frágiles y susceptibles a la injuria que en la fase
estacionaria.
L. monocytogenes en fase estacionaria aumenta la expresión del gen prfA, el
cual proporciona un mecanismo por el que las células pueden responder a
condiciones adversas de crecimiento.
También se sabe que las células
contienen varios blancos para la acción térmica, pero ha sido propuesto por
Miller et al, 2006, que la resistencia basal de calor de estos microorganismos
podría ser debida a la estabilidad intrínseca de macromoléculas, o sea
ribosomas, ácidos nucleicos, enzimas y proteínas dentro de la célula y la
membrana (Rojas, 2007).
38
C u rva crecim ien to Listeria mon ocytogenes
C ep a 142 curva 2
Abs a 620 nm
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
12
13
12
13
Tie m po (hora s)
C u rv a c re c im ie n to L is te ria m o n o cy to ge n e s
C epa 196
Abs 620 nm
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
T ie m p o (h o ra s)
C urva crecimiento Listeria monocytogenes
C epa 146
Abs 620 nm
0,6
0,4
0,2
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Tie m po (hora s)
Figura 6. Curvas de crecimiento de Listeria monocytogenes
39
Por otra parte, B. cereus alcanzó su fase estacionaria en un tiempo de 18 horas
como se puede observar en la figura 7. Al comparar los datos obtenidos en el
programa “Combase predictor”, donde B. cereus en condiciones ideales
alcanza la fase estacionaria en 12 horas, los resultados obtenidos en esta
investigación difieren por la siguiente razón: el medio utilizado en el programa
es caldo tripticasa de soya, mientras que en este estudio se utilizó caldo BHI
suplementado con almidón, lo que podría explicar el alargamiento de la fase
logarítmica; B. cereus posee amilasas que son activadas en presencia de
almidón, y como sucedió en este estudio, la cepa inició una segunda fase (fase
de diauxia), una vez terminado el consumo de glucosa en el medio, pues en
este caso tenía dos sustratos alternativos (Fernández, 1999). Es posible que si
en esta investigación no se hubiera adicionado almidón al medio, la fase
estacionaria se hubiera obtenido en 12 horas. La razón por la que se adicionó
almidón, fue simular las condiciones de las conservas donde se usan
almidones modificados que mantienen la estabilidad reológica del producto,
pues este microorganismo causa deterioro en las conservas (Hersom y
Hulland, 1980) el cual se evidencia por la aparición de vetas blancas y acidez
en el producto (Rees y Bettison, 1994).
Cabe resaltar que en estudios para evaluar actividad antimicrobiana o
temperaturas altas, se trabaja con las cepas en fase estacionaria ya que éstas
corresponden a condiciones adversas y como ya se mencionó, los
microorganismos son más resistentes durante la fase estacionaria (Robinson et
al, 2001).
40
Curva de crecimiento Bacillus cereus
Abs 620 nm
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
Tiempo (horas)
Figura 7. Curva de crecimiento de B. cereus
6.3 Elaboración de la conserva
En la figura 8 se muestran los componentes, cantidades y apariencia de la
salsa escogida.
Como se mencionó en la metodología, se prepararon
conservas con diferentes cantidades de ingredientes y se seleccionó la que
cumpliera con las características requeridas como viscosidad, olor, sabor,
color, etc. para una conserva a base de tomate. La valoración de la calidad
sensorial puede servir para determinar los efectos del tratamiento térmico sobre
los alimentos, o sobre su aceptabilidad (gustan-no gustan). Por ejemplo, el
sabor se valora mediante el sentido del gusto (dulce, salado, amargo, ácido) y
del olfato (compuestos volátiles), y suele ser valorado en la boca a la
temperatura en que el alimento (o bebida) es consumido normalmente. La
textura puede ser valorada visualmente, por ejemplo la viscosidad mediante el
tacto (Rees y Bettison, 1994). Otros requerimientos para salsa de tomate por
ejemplo, son: su aspecto debe ser completamente homogéneo; su color rojo
uniforme, no deberá presentar partes decoloradas o ennegrecimiento, su olor y
41
sabor deben ser propios del producto (Quintero, 2003). Con base en esto, se
seleccionó la salsa número 10 y se descartaron las otras 10 obtenidas (anexo
3).
Ingrediente
Tomate
Azúcar
Cebolla
Ajo
Color
Agua
Aceite
Salsa de tomate
Sal
Cantidad
150 g
1g
5g
0.5 g
0.2 g
20 mL
2 mL
4g
0.1 g
Figura 8. Salsa seleccionada a base de tomate.
42
6.4 Evaluación de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus
(en caldo BHI y sobre alimento)
6.4.1 Inactivación térmica de L. monocytogenes
Al analizar los datos obtenidos en las curvas de inactivación térmica (figura 9)
se puede observar que durante la evaluación en las diferentes temperaturas, la
cepa mostró una mayor termorresistencia cuando se sometió a la temperatura
en caldo BHI adicionado de 0.5% de glucosa, que lo obtenido en la evaluación
directamente sobre el alimento (conserva a base de tomate). Aunque podría
esperarse una mayor termorresistencia en la conserva debido a su
composición,
viscosidad,
Aw
que
al
ser
menor
induce
una
mayor
termorresistencia (Hersom y Hulland, 1980); no fue así probablemente porque
esta resistencia por parte de la célula pudo verse afectada por el pH del medio,
pues el alimento evaluado poseía un pH ácido (5.0) y se ha demostrado que la
mayoría de microorganismos generalmente presentan su resistencia máxima a
pH neutro, disminuyendo su termorresistencia a medida que el pH aumenta o
disminuye (Hersom y Hulland, 1980); en este caso se pudo dar una mayor
destrucción de los microorganismos debido a la acidez del medio.
Se ha
demostrado que el comportamiento de L. monocytogenes en los alimentos,
depende de la interacción de los efectos de temperatura, pH, tipo de
acidulante, contenido de sal, Aw, así como tipos y concentraciones de aditivos
presentes (Ryser, 1999), y en este estudio se presentó la interacción de 3
factores: temperatura, pH y concentración de NaCl.
Es importante señalar, que en los 2 medios evaluados (medio de cultivo y
conserva) la transferencia de calor es igual, es decir, la viscosidad del fluido no
afecta la transferencia de calor porque en los 2 casos se da por convección;
con lo cual se puede afirmar que el pH del medio afectó en gran medida la
resistencia celular al calor.
43
Otros factores que probablemente pudieron afectar la termorresistencia en la
conserva, fueron las sustancias antimicrobianas presentes en algunos de los
componentes de la salsa como son la cebolla, el ajo y la sal, pues se ha
reportado que estas sustancias poseen un efecto antimicrobiano. Se sabe que
existen diversos productos de origen botánico los cuales poseen una actividad
antimicrobiana como el ajo, orégano, mostaza, canela, albahaca, tomillo,
pimienta, mejorana, chile, achiota, cebolla, cilantro, té, limón y naranja
(Barboza et al, 2004).
Por ejemplo el ajo es comúnmente utilizado como saborizante y condimento en
los alimentos. El ajo (Allium savitum), pertenece a la familia de las liláceas
junto con la cebolla, el puerro y el tulipán. Es probablemente el alimento con
potencial antimicrobiano mas consumido. Las propiedades medicinales del ajo
han sido estudiadas desde hace ya varios siglos. Sin embargo, es hasta los
años cuarentas, que aparecen evidencias científicas de sus propiedades
antimicrobianas; Cavallito y Bailey en 1944, fueron los primeros en aislar el
componente antimicrobiano del ajo a partir de bulbos frescos y lo identificaron
como alicina o ácido dialitiosulfónico, el cual es el responsable del olor
característico del ajo y la cebolla. Se ha estudiado que en concentraciones de
1:85,000, tiene actividad bactericida frente a microorganismos Gram positivos y
Gram negativos (Hernández, 2003). Adicionalmente, la presencia de sal en el
alimento también pudo haber afectado la resistencia de las células al calor;
pues estudios realizados por Lynn y col en 1991 en carne de cerdo,
demostraron que el aumento en las concentraciones de NaCl (1-3%), resultó en
una disminución en la inactivación térmica de L. monocytogenes a una
temperatura de 60ºC.
Otro factor que pudo verse implicado fue la tasa de calentamiento. Las tasas
de calentamiento rápidas o lentas, influyen en el grado de destrucción de L.
monocytogenes.
En estudios realizados sobre muestras de cerdo molido
inoculado, se observó que un calentamiento lento (1.3ºC/min) permitió que una
44
mayor concentración de L. monocytogenes sobreviviera, que en un
calentamiento rápido (Doyle, 2001).
Curvas de inactivación térmica a 52, 55 y 57 °C
en caldo BHI L. monocytogenes
10
Log UFC/mL
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
5
52°C
10
15
55° C
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
55
60
65
Tiempo ( minutos)
57°C
Curvas inactivación térmica a 52, 55 y 57 °C
en salsa L. monocytogenes
11
10
Log UFC /mL
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
52°C
5
55°C
10
15
57°C
20
25
30
35
40
45
50
Tiempo (minutos)
Figura 9. Curvas de inactivación térmica de L. monocytogenes a 52, 55 y 57 °
C en caldo BHI y salsa.
45
En cuanto a los valores D encontrados para L. monocytogenes en caldo BHI
(tabla 3) se observa que hubo una disminución de éstos a medida que la
temperatura aumentó, lo cual puede indicar que el proceso de inactivación tuvo
los resultados esperados ya que con una mayor temperatura de exposición
como lo es 57°C se observa un mayor efecto sobre la viabilidad de la cepa y
por lo tanto se verá inhibido su crecimiento en un menor tiempo, esto puede
compararse
con
el
análisis
estadístico
que
muestra
una
diferencia
estadísticamente significativa entre los valores de la temperaturas de 55 y 57
(tablas 4 y 5). De lo anterior, se podría concluir que el tratamiento con el que
más rápido se destruye un ciclo logarítmico en la población de L.
monocytogenes corresponde a 57°C durante 3.3 minutos.
Con respecto a los valores D obtenidos en la salsa también se observó una
disminución para 57°C, lo que indica que a mayor temperatura sea sometida la
conserva menos tiempo de exposición necesita, sin embargo se observó que el
tiempo de exposición necesario para inactivar un ciclo logarítmico a las
diferentes temperaturas no varía sustancialmente, lo que podría apoyarse con
el análisis estadístico, pues se observa que no hubo una diferencia
estadísticamente significativa en el tratamiento con las tres temperaturas
(tablas 6 y 7), por lo cual en una industria de alimentos es suficiente un
tratamiento térmico que trabaje con 52°C durante 60 minutos, para erradicar la
contaminación por L. monocytogenes.
Esto ratifica que la transferencia de calor se da por convección de calor en la
salsa y en el caldo sin obstáculos.
Tabla 3.
Valores D para L. monocytogenes en caldo BHI y conserva
D52 (minutos)
D55 (minutos)
D57 (minutos)
Cepa
CALDO
SALSA
CALDO
SALSA
CALDO
SALSA
L.monocytogenes
15
5
6.6
5
3.3
2
46
Tablas 4 y 5. Comparación de medias por temperaturas en caldo BHI (L.
monocytogenes).
Alfa
Grados de libertad
Error de la media
Valor critico de t
Mínima diferencia significativa
0.05
78
7.543851
1.99085
1.4882
Agrupación t
Media
N
Tem
7.9107
27
57
A
7.1070
27
52
AB
5.7937
27
55
B
Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
Tablas 6 y 7.
Comparación de medias por temperaturas en salsa (L.
monocytogenes).
Alfa
Grados de libertad
Error de la media
Valor critico de t
Mínima diferencia significativa
0.05
78
7.632015
1.99085
1.4969
Agrupación t
Media
N
Tem
7.2811
27
57
A
7.2374
27
52
A
7.1581
27
55
A
Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
6.4.2 Inactivación térmica de Bacillus cereus
De acuerdo con los resultados obtenidos en las curvas de inactivación térmica
(figura 10) y los valores D (tabla 8) de B. cereus, se observó que en las curvas
de inactivación en caldo BHI y en la conserva a base de tomate no hubo una
diferencia considerable en la reducción de las unidades logarítmicas, en cuanto
a los valores D presentados en caldo son iguales en las tres temperaturas
evaluadas (55, 60 y 70 ºC), lo mismo ocurrió en los valores D en la conserva;
claro esta que hay que tener en cuenta que al analizar los datos obtenidos
estadísticamente se encontró que hubo diferencia estadísticamente significativa
47
en el caldo BHI entre 55°C y las otras dos temperaturas (60 y 70°C), esta
diferencia se podría explicar porque los datos para los valores D son tomados
manualmente lo que podría tener un mayor porcentaje de error, por lo cual en
el presente estudio se tuvo en cuenta el resultado obtenido mediante el análisis
estadístico donde se confirma que es mejor un tratamiento a 60 o 70°C, para
una industria de alimentos es de mayor utilidad aplicar 60°C porque representa
menor costo.
Otro punto clave para discutir estos resultados es que el
tratamiento térmico para B. cereus según reportes, tiene una mayor efectividad
durante el desarrollo de las esporas porque aumenta la termorresistencia de los
microorganismos.
Se han avanzado una serie de teorías en torno a la
diferencia entre las células vegetativas y las esporas. Una de esas teorías es
la que implica el papel del ácido dipicolínico (DPA). Se ha descrito que la
termorresistencia de la espora se debe a que una gran porción de su contenido
acuoso se encuentra en forma no disponible para participar en la coagulación
de la proteína celular.
La termorresistencia aumenta de forma gradual a
medida que la concentración de agua del entorno disminuye (deshidratación
del protoplasto de la espora). La gran resistencia de ciertas esporas en medios
acuosos exige que la cubierta esporular tenga una permeabilidad acuosa muy
baja, lo que es difícil por la permeabilidad de los materiales orgánicos, se ha
demostrado que existen diferencias en termorresistencia asociados al tamaño
de la molécula que ejerce el pH ácido (Martínez, 2007). (Herson y Hulland,
1980). Además existen factores en el medio que afectan la resistencia térmica
de las esporas, como el pH, la naturaleza de los acidulantes, la temperatura y
la concentración de NaCI (Laurent et al, 1999).
En contraste, se ha encontrado que la resistencia al calor por las esporas de
muchas especies incrementa cuando son sometidas al calentamiento en
presencia de soluciones con altas concentraciones de azúcar y sal (Mazas, et
al, 1999).
Si bien se observó una mayor termorresistencia por parte de B. cereus en la
conserva, esto pudo ser por la exposición a factores diferentes al calor, como a
48
etanol o ácido, lo que puede resultar en un incremento de la termotolerancia.
Igualmente, se ha reportado que en una gran variedad de bacterias, la
respuesta al choque térmico incluye el aumento de una serie de proteínas del
choque térmico (HSPs).
Estudios realizados por Derré et al, 1999 con B.
subtilis, concluyeron que los genes inducidos por calor son divididos en cuatro
clases diferentes según sus mecanismos regulatorios; los genes de la clase II
son inducidos por estrés térmico y otras condiciones como sal o etanol.
También se ha visto que la repuesta al choque térmico de las células de B.
subtilis preexpuestas a calor suave, producen esporas más estables al calor
(Periago et al, 2002), esta preexposición al calor puede corresponder a la
temperatura de incubación utilizada en el presente estudio antes de la
exposición a las diferentes temperaturas de evaluación. Durante el desarrollo
de las esporas aumenta la termorresistencia de los microorganismos y por lo
tanto puede ser mas difícil su destrucción, por esta razón se puede decir que B.
cereus tuvo valores D constantes en las diferentes temperaturas evaluadas 55,
60 y 70 ºC, pues estas temperaturas no son suficientes para la destrucción de
las esporas, se ha reportado que la temperatura óptima para inactivar las
esporas es aproximadamente 90, 95 y 100 ºC, (Byrne et al, 2006) y que el
tratamiento térmico mínimo para productos procesados (90 -95 º C por 6 – 10
minutos) usualmente no es suficiente para inactivar a todas las esporas
(Fernández et al, 2002). En el caso de este estudio no se utilizaron estas
temperaturas tan altas, porque se pensaba combinar el efecto de la
temperatura con el agente antimicrobiano (aceite de M. mollis) y además las
temperaturas altas hacen que se pierdan más fácil los componentes por
volatilización. Asimismo se observa en la figura 7 que las concentraciones de
células iniciales vegetativas son altas, por lo cual se ve un decrecimiento más
rápido del minuto 1 al 5, lo que explica los bajos valores D en estos primeros
minutos. Por otra parte, después del minuto 5 se observa una tendencia más
constante lo que puede hacer pensar que la cepa empieza a esporular en este
momento. Además, debido a la naturaleza logarítmica de la curva de muerte
térmica, cuanto mayor sea el número de esporas mayor será el tiempo
necesario para llevar a cabo su destrucción (Hersom y Hulland, 1980) por esta
49
razón se evaluaron tiempos largos.
Por todo lo anterior era recomendable la
evaluación de la termorresistencia de B. cereus directamente sobre las esporas
sin la presencia de células vegetativas para dar una aproximación mas cercana
a la temperatura óptima de inactivación.
Curvas de inactivación térmica a 55, 60 y 70 °C
en caldo BHI B.cereus
10
Log UFC/mL
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
5
55 ° C
10
60 °C
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tiempo (minutos)
70 °C
Curvas de inactivación térmica a 55, 60 y 70 °C
en SALSA B.cereus
8
Log UFC/mL
7
6
5
4
3
2
1
0
0
5
55°C
10
60°C
15
20
70°C
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Tiempo (minutos)
Figura 10. Curvas de inactivación térmica de B. cereus a 55, 60 y 70 ° C en
caldo BHI y salsa.
50
Tabla 8.
Valores D para B. cereus en caldo BHI y conserva
D55 (minutos)
D60 (minutos)
D70 (minutos)
Cepa
CALDO
SALSA
CALDO
SALSA
CALDO
SALSA
B. cereus
0.98
1
0.98
1
0.98
1
Tablas 9 y 10. Comparación de medias por temperaturas en caldo BHI (B.
cereus).
Alfa
Grados de libertad
Error de la media
Valor critico de t
Mínima diferencia significativa
0.05
78
3.464374
1.99085
0.975
Agrupación t
Media
N
Tem
5.3978
27
55
A
3.6600
27
60
B
3.5100
27
70
B
Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
Tablas 11 y 12. Comparación de medias por temperaturas en la conserva (B.
cereus).
Alfa
Grados de libertad
Error de la media
Valor critico de t
Mínima diferencia significativa
0.05
78
3.464374
1.99085
1.0085
Agrupación t
Media
N
Tem
3.8026
27
55
A
3.3100
27
60
A
3.2244
27
70
A
Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
51
6.6 Extracción del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluación
de la actividad antimicrobiana.
En la tabla 13 se muestra la cantidad de aceite esencial obtenido a partir de las
plantas de M. mollis recolectadas.
Tabla 13. Volumen de aceite esencial obtenido
Cantidad de planta sometida a
Cantidad de aceite esencial obtenida
hidrodestilación
500 g
0.5 mL
Los aceites esenciales son tradicionalmente obtenidos por destilación con
vapor o por hidrodestilación. Estos procesos son realizados a temperaturas
muy altas y pueden conducir a la degradación de los compuestos termolábiles,
resultando la formación de compuestos indeseables y desagradables. Además
que pueden tener una composición heterogénea. Aceites de superior calidad,
libres de productos degradados por hidrólisis y degradación térmica; pueden
ser aislados usando dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2) como solvente
(Bocevska y Sovová, 2007).
Debido a que la extracción con dióxido de
carbono supercrítico puede ser llevado a cabo a bajas temperaturas (cerca de
313 K), se preservan las propiedades y composición original del aceite (Zizovic
et al, 2005). La extracción del aceite esencial de M. mollis en el presente
estudio, se realizó por medio de hidrodestilación y se obtuvo una baja cantidad
a partir de la planta (Tabla 13), posiblemente porque como se mencionó
anteriormente, esta técnica se hace a temperaturas muy altas y la volatilización
de los componentes del aceite se hace mucho más fácil. Lo anterior hizo que
la evaluación de la actividad antimicrobiana fuera limitada y dependiera de la
cantidad de aceite obtenida.
En las tablas 14 y 15
se muestran los datos obtenidos de la actividad
antimicrobiana del aceite esencial
52
Tabla 14. Actividad antimicrobiana del aceite esencial (zona inhibición en mm)
Microorganismo
Listeria
monocytogenes
Bacillus cereus
Aceite
esencial puro
Control
positivo
(ampicilina)
Control
negativo
(disco estéril)
Aceite
esencial puro
Control
positivo
(vancomicina)
Control
negativo
(disco estéril)
Réplica
1
0
Tamaño del halo (mm)
Réplica
Réplica
Réplica
2
3
4
0
0
0
Réplica
5
0
15
18
14
16.3
15
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
36
36
28
32
31
0
0
0
0
0
Tamaño del halo: Diámetro halo + disco – diámetro disco (0.6mm)
Tabla 15. Susceptibilidad de las cepas evaluadas con el aceite esencial de M.
mollis
Disco
Aceite esencial puro
Control positivo
Control negativo
Listeria monocytogenes
R
S
R
Bacillus cereus
R
S
R
S: Cuando la CMI del antimicrobiano para una bacteria se puede conseguir in vivo a dosis terapéuticas.
R: Cuando el microorganismo no es inhibido por las concentraciones que normalmente se pueden obtener
en el sito de infección.
I: Cuando las bacterias no se inhiben a concentraciones normales, pero pueden inhibirse a
concentraciones mas altas sin resultar tóxicas.
Para evidenciar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de M. mollis, fue
necesario utilizar un método de difusión en agar con el aceite esencial de la
53
planta, el cual se mostró inactivo y no tuvo inhibición como se demuestra (tabla
14) pues no hubo presencia de halos en ninguna de las cepas analizadas,
mostrando la resistencia de estos microorganismos al aceite con la
concentración utilizada para L. monocytogenes y B. cereus (tabla 15).
El presente estudio no tenía como objetivo determinar la composición del aceite
esencial de M. mollis, por tanto se tomaron como base datos obtenidos en
estudios anteriores acerca de los principales componentes presentes. Alkire et
al, 1993, reportaron que el aceite contiene principalmente mentona, pulegona,
β-pineno, entre otros (anexo 2).
Otros estudios acerca de la composición
química, encontraron que el aceite contiene carvona, pulegona, mentona,
isomentona, β-pineno and limoneno, en cantidades relativas que varían de
9.3% a 65% (Chica et al, 2006). Sin embargo Chica et al, 2006, encontró 3
compuestos adicionales en proporciones significativas: carvacrol, acetato de
carvacril y trans-β-cariofileno. De éstos, el carvacrol ha sido muy estudiado por
su potencial actividad antimicrobiana y antifúngica frente a distintos
microorganismos. La inhibición del crecimiento de muchos patógenos por el
carvacrol, ha sido reportada en varios artículos, sin embargo no se ha definido
el mecanismo de acción de éste.
Usando B. cereus, un esporoformador
patógeno en alimentos, como organismo modelo, se ha demostrado que la
exposición de las células vegetativas a concentraciones de carvacrol mayores
a 1 mM, conduce a una extensión de la fase de latencia, una tasa baja de
crecimiento máximo específico y una densidad final de población baja.
También se ha visto que a concentraciones por encima de 1 mM, la viabilidad
de B. cereus decrece exponencialmente. Al mismo tiempo hay un incremento
en la fluidez de la membrana y salida de protones e iones potasio, conduciendo
a una disminución en el gradiente de pH a través de la membrana
citoplasmática, un colapso en el potencial de membrana e inhibición de la
síntesis de ATP. Finalmente estos eventos, son seguidos por la muerte celular
(Ultee et al, 2002).
Por otra parte, también se ha reportado la actividad del carvacrol frente a L.
monocytogenes. Gill y Holley, 2006 encontraron que es capaz de inhibir la
54
actividad ATPasa en la membrana celular. También se ha encontrado que este
tipo de agentes pueden inhibir la generación de adenosina trifosfato de
dextrosa y afectar la membrana y que concentraciones de carvacrol de 5 a 10
mM tienen actividad bactericida frente a L. monocytogenes (Gill y Holley, 2006).
Por lo anterior, posiblemente la ausencia de actividad antimicrobiana pudo ser
porque en el aceite esencial obtenido en el presente estudio, no contenía
carvacrol dentro de sus componentes, siendo este el componente con mayor
actividad antimicrobiana reportado. Es probable que lo anterior se haya dado
porque la composición química del aceite obtenido de la planta puede variar
según las condiciones de crecimiento, geográficas, geológicas, climáticas y
estaciónales de la planta, por lo tanto sus características o propiedades
antimicrobianas pueden también variar (Chica et al, 2006). Posiblemente la
composición del aceite obtenido por Chica et al 2006 fue diferente al obtenido
en el presente estudio, pues la recolección de la planta se llevó a cabo en
diferentes lugares.
Se ha reportado que las bacterias Gram negativas son menos resistentes a la
acción de los aceites que las Gram positivas como resultado de las cadenas
alifáticas como sustituyentes en los anillos fenólicos de los componentes del
aceite (Chica et al, 2006).
Además se ha reportado que L. monocytogenes es la menos sensible entre un
número de bacterias evaluadas (Kalemba y Kunicka 2003). La variabilidad de
la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales hacia diferentes
microorganismos se puede atribuir a las diferencias cualitativas y cuantitativas
en componentes de aceites individuales, mientras que algunos aceites
esenciales estimulan el crecimiento de algunos microorganismos, otros son
capaces de inhibirlos (Demo et al, 2005). Las características letales también
dependen de los componentes del aceite esencial, y puede depender del
número de las células del inóculo. Algunos productos químicos, como por
ejemplo la pulegona, han expresado una mayor inhibición en el crecimiento de
55
Erwinia amylovora en concentraciones
más bajas (103 UFC/ml), otros
compuestos como la β-pinona en 107 UFC/ml. y para otros componentes no
se ha encontrado. (Kalemba y Kunicka, 2004).
Otra de las posibles razones por las que no se obtuvo un efecto antimicrobiano
del aceite esencial, fue porque el método utilizado para evaluar la actividad no
fue el mejor; pues se ha reportado que el método de difusión en agar es
inadecuado para aceites esenciales, sus componentes volátiles se pueden
evaporar con el solvente de dispersión durante el tiempo de incubación,
mientras que sus componentes mas solubles no se difunden bien en el agar.
No obstante, es la técnica más común para evaluar actividad antibacteriana y
antifúngica de aceites esenciales porque es mas fácil llevarla a cabo y requiere
solo pequeñas cantidades del aceite esencial (Kalemba and Kunicka 2003).
Debido a la difícil tarea que es la recolección de la planta, pues es una especie
que únicamente florece en verano (Ojeda, 2004), el aceite esencial no se
consideró rentable para su posible uso en preservación de alimentos, ya que
Colombia es un país donde no se presentan estaciones y por lo tanto no hay
periodos largos de luz para favorecer la constante floración de la planta. Por
esta razón se dificultó una segunda recolección de ésta para evaluar
nuevamente la actividad antimicrobiana, debido a las siguientes razones: los
cambios climáticos que se presentaron en el momento de la recolección
afectaron la floración de la planta en Cáqueza, Cundinamarca, donde se hizo
una expedición en búsqueda del material vegetal, pues es un lugar donde
comúnmente florece; por otro lado se intentó la búsqueda en una plaza de
mercado donde se conoce como orégano de monte, sin embargo tampoco fue
posible debido a la misma razón del clima; por último, después de conseguir la
planta en un cultivo de la Universidad Nacional, se tuvo en refrigeración
durante un tiempo de 2 días, en el cual probablemente se pudieron perder
algunos componentes.
56
Adicionalmente, el uso de aceites esenciales en el sector alimenticio es a
menudo limitado debido a que las dosis antimicrobianas eficaces pueden
exceder niveles aceptables (Kalemba y Kunicka, 2004).
Se ha reportado en literatura que los compuestos químicos encontrados en el
aceite esencial de esta planta tales como los fenoles isoméricos
como el
carvacrol y el timol pueden tener características antimicrobianas similares, el
bajo pH de estas moléculas es mas disociado e hidrofóbico posiblemente
conduciendo a una mejor unión a las áreas hidrofóbicas de las proteínas
(Michiels et al, 2007) y la bicapa lipídica de la membrana citoplasmática que
causan la pérdida de integridad y la salida del material celular tal como iones,
ATP y ácidos nucleicos (Nostro et al, 2007),
Por otra parte el mentol es un es un agente antifúngico y antimicrobiano y ha
sido encontrado para interactuar a nivel célular con el Ca
2+
citosólico,
probablemente por una liberación de calcio almacenado intracelularmente y
bloqueando el canal de calcio (Mucciarelli et al, 2001).
De los compuestos encontrados se reporta que la mentona es un inhibidor del
crecimiento mientras que la pulegona es metabolizada por una monooxigenasa microsomal hepática para una serie de hepatotoxinas que causan
cáncer en el hígado y esta involucrado en muchos casos reportados de
intoxicación en humanos y animales. Además la pulegona es considerado uno
de los más poderosos aleloquímicos y ha sido demostrado que puede ser dos
veces mas tóxico que el cianuro de hidrógeno (HCN). (Mucciarelli et al, 2001).
Los efectos de los compuestos alelopáticos en la respiración mitocrondrial
pueden ser importantes en el mecanismo de acción por el cual se controla el
crecimiento de maleza. (Mucciarelli et al, 2001).
Por último, si bien los extractos obtenidos a partir de M. mollis han resultado
eficientes frente a fitopatógenos, en este caso no tienen una actividad
57
antimicrobiana que ameriten seguir con su investigación para uso en industria
de alimentos.
7. RECOMENDACIONES
•
En el caso de B. cereus se debe trabajar con esporas y no con formas
vegetativas, para obtener datos más homogéneos.
• Al trabajar con el aceite esencial de M. mollis, es necesario que todas las
plantas se encuentren en el mismo estadio del ciclo de vida para
asegurar resultados mas confiables en los compuestos obtenidos;
igualmente se recomienda no dejar pasar más de un día después de la
recolección del material vegetal para hacer la extracción del aceite.
58
8. CONCLUSIONES
o De acuerdo con los datos obtenidos en las curvas de crecimiento, se
observó que L. monocytogenes alcanzó la fase estacionaria en un
tiempo de 12 horas y B. cereus en un tiempo de 18 horas.
o No hubo diferencias en cuanto a la reducción logarítmica de células de
L.monocytogenes en las temperaturas de 52, 55 y 57 ° C, pero si se
presentaron valores D mayores en caldo que en salsa.
o B. cereus mostró valores D mayores en salsa que en caldo, pero no se
obtuvieron diferencias considerables en
cuanto
a la reducción
logarítmica en las temperaturas de 55, 60 y 70 ° C .
o M. mollis no presentó inhibición sobre las cepas de L.monocytogenes y
de alimentos.
o Estadísticamente no se encontró diferencia entre las temperaturas
utilizadas para inactivar a B. cereus en la salsa, posiblemente por
condiciones de pH y estructura de la espora.
59
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72
ANEXO 1
Composición del aceite esencial de M. mollis determinada por Chica, et al
2006.
No pico
Compuestos
Tr (min)
IK DB-1
Cantidad
relativa (%)
1
ρ-cimoneno
15.42
1015
0.6
2
γ-terpineno
16.58
1052
0.3
3
Linalool
17.61
1085
0.8
4
Acetato de octan-3-ilo
18.31
1108
0.3
5
Mentona
19.20
1138
12.2
6
Isomentona
19.46
1147
0.5
7
Mentol
19.69
1154
1.7
8
Pulegona
21.61
1219
15.9
9
trans-pulegol
21.91
1230
0.7
10
Acetato de mentilo
22.86
1264
1.2
11
Timol
22.97
1268
1.4
12
Carvacrol
23.26
1278
16.2
13
Trans-acetato de piperitilo*
24.51
1323
0.9
14
Acetato de timilo
24.62
1327
1.4
15
Óxido de piperitenona
24.86
1336
0.6
16
δ-elemeno
24.95
1340
0.3
17
Acetato de carvacrilo
25.16
1348
30.6
18
Acetato de geranilo
25.48
1360
1.0
19
trans-β-cariofileno
27.24
1427
7.6
20
α-humuleno
28.06
1460
1.3
21
Biciclosesquifelandreno
28.69
1485
1.5
22
Biciclogermacreno
29.06
1500
2.4
Fuente: Chica, et al 2006.
73
ANEXO 2
Composición del aceite esencial de M. mollis determinada por Alkire et al,
1993.
Componente
Porcentaje (%)
α-pineno
0.41± 0.08
Sabineno
0.19 ± 0.04
Limoneno
0.88 ± 0.28
(E)-β-ocimeno
1.20 ± 0.81
Isomentona
4.11 ± 0.84
Acetato de isomentil
1.95 ± 0.58
Neomentol
29.34 ± 3.94
Mentol
20.55 ± 3.33
Pulegona
0.80 ± 0.30
Piperitona
8.96 ± 1.65
β -pineno
0.50 ± 0.07
Mirceno
0.06 ± 0
(Z)-β-ocimeno
0.71 ± 0.11
Mentona
24.00 ± 5.23
Acetato de neomentil
2.72 ± 0.41
Acetato de mentil
0.09 ± 0.02
β-carofileno
2.55 ± 0.99
α-humuleno
0.37 ± 0.23
Siginificado ± S.D (N 3-4)
Fuente: Alkire, et al 1993.
74
ANEXO 3
Formulación de las diferentes salsas obtenidas.
Salsa número 1
Ingrediente
Tomate
Cebolla
Ajo
Color
Agua
Aceite
Salsa de tomate
Sal
Cantidad
50 g
6.3 g
0.8 g
0.3 g
100 mL
2 mL
3.5 g
0.3g
Ingrediente
Tomate
Cebolla
Ajo
Color
Agua
Aceite
Salsa de tomate
Sal
Cantidad
100.9 g
5.3 g
0.8 g
0.3 g
50 mL
2 mL
6.7 g
0.3 g
Ingrediente
Tomate
Cebolla
Ajo
Agua
Aceite
Salsa de tomate
Sal
Cantidad
100.5 g
5.1 g
0.5 g
30 mL
2 mL
5.1 g
0.3g
Salsa número 2
Salsa número 3
75
Salsa número 4
Ingrediente
Tomate
Cebolla
Ajo
Agua
Aceite
Sal
Cantidad
112.3 g
5.1 g
0.5 g
30 mL
2 mL
0.3g
Ingrediente
Tomate
Azúcar
Cebolla
Ajo
Color
Agua
Aceite
Salsa de tomate
Sal
Cantidad
100.8 g
3g
3g
0.5 g
0.1 g
30 mL
2 mL
6.9 g
0.3g
Ingrediente
Tomate
Azúcar
Cebolla
Ajo
Color
Agua
Aceite
Salsa de tomate
Sal
Cantidad
100 g
4g
3.2 g
0.5 g
0.1 g
30 mL
2 mL
7.3 g
0.3g
Ingrediente
Tomate
Azúcar
Cebolla
Ajo
Color
Cantidad
70 g
3g
2g
0.2 g
0.1 g
Salsa número 5
Salsa número 6
Salsa número 7
76
Agua
Aceite
Salsa de tomate
Sal
30 mL
2 mL
10 g
0.3g
Ingrediente
Tomate
Azúcar
Cebolla
Ajo
Color
Agua
Aceite
Salsa de tomate
Sal
Cantidad
150 g
4g
2.5 g
0.2 g
0.1 g
30 mL
2 mL
7g
0.3g
Ingrediente
Tomate
Azúcar
Cebolla
Ajo
Color
Agua
Aceite
Salsa de tomate
Sal
Cantidad
100 g
1g
3g
0.4 g
0.1 g
20 mL
2 mL
9g
0.3 g
Salsa número 8
Salsa número 9
Salsa número 11
Ingrediente
Tomate
Cebolla
Ajo
Agua
Aceite
Sal
Cantidad
150 g
5g
0.5 g
10 mL
2 mL
0.3 g
77
ANEXO 10
COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN CALDO BHI PARA
B.cereus
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 126
---------------------------------------------------------------------------------------Obs
TEM
TIM
REP
LOG
---------------------------------------------------------------------------------------1
55
0
1
8.87
2
55
1
1
7.00
3
55
2
1
7.00
4
55
5
1
5.30
5
55
10
1
5.00
6
55
15
1
4.00
7
55
20
1
4.00
8
55
30
1
3.47
9
55
60
1
2.00
10
55
0
2
8.87
11
55
1
2
7.00
12
55
2
2
7.00
13
55
5
2
5.30
14
55
10
2
5.00
15
55
15
2
4.00
16
55
20
2
4.00
17
55
30
2
3.47
18
55
60
2
2.00
19
55
0
3
8.87
20
55
1
3
7.30
21
55
2
3
7.00
22
55
5
3
6.47
23
55
10
3
6.17
24
55
15
3
5.69
25
55
20
3
5.36
26
55
30
3
3.60
27
55
60
3
2.00
28
60
0
1
6.95
29
60
1
1
7.00
30
60
2
1
4.47
31
60
5
1
2.00
32
60
10
1
2.47
33
60
15
1
2.30
34
60
20
1
2.76
35
60
30
1
2.00
36
60
60
1
2.30
37
60
0
2
6.95
38
60
1
2
5.20
39
60
2
2
4.00
40
60
5
2
3.66
41
60
10
2
3.27
42
60
15
2
2.90
43
60
20
2
2.47
44
60
30
2
2.72
45
60
60
2
2.17
46
60
0
3
6.95
47
60
1
3
6.49
48
60
2
3
4.60
49
60
5
3
3.23
50
60
10
3
2.84
51
60
15
3
2.17
52
60
20
3
2.00
----------------------------------------------------------------------------------------
78
---------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 127
---------------------------------------------------------------------------------------Obs
TEM
TIM
REP
LOG
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
60
60
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
70
30
60
0
1
2
5
10
15
20
30
60
0
1
2
5
10
15
20
30
60
0
1
2
5
10
15
20
30
60
3
3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2.95
2.00
6.23
5.90
4.30
3.69
3.39
2.30
2.07
1.90
1.47
6.23
5.00
4.60
3.77
3.14
3.00
2.83
2.82
2.00
6.23
5.30
4.30
3.00
3.30
3.00
3.00
1.00
1.00
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 128
---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure
Class Level Information
Class
Levels
TEM
TIM
3
9
Values
55 60 70
0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations
81
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 129
---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure
Dependent Variable: LOG
Source
DF
Sum of
Squares
Mean Square
Model
2
59.4546889
29.7273444
F Value
Pr
> F
9.18
0.0003
79
Error
78
252.5620667
3.2379752
Corrected Total
80
312.0167556
----------------------------------------------------------------------------------------
Source
R-Square
Coeff Var
Root MSE
LOG Mean
0.190550
42.95360
1.799437
4.189259
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
2
59.45468889
29.72734444
9.18
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr
> F
TEM
0.0003
Source
Pr
> F
TEM
2
59.45468889
29.72734444
9.18
0.0003
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 130
---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure
t Tests (LSD) for LOG
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
80
ANEXO 11
COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN SALSA PARA
B.cereus
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
---------------------------------------------------------------------------------------13, 2007 131
Obs
TEM
TIM
REP
LOG
---------------------------------------------------------------------------------------1
55
0
1
6.39
2
55
1
1
5.00
3
55
2
1
4.07
4
55
5
1
3.60
5
55
10
1
3.20
6
55
15
1
2.47
7
55
20
1
2.30
8
55
30
1
1.00
9
55
60
1
0.00
10
55
0
2
6.39
11
55
1
2
5.00
12
55
2
2
4.32
13
55
5
2
3.60
14
55
10
2
3.20
15
55
15
2
2.60
16
55
20
2
2.47
17
55
30
2
1.00
18
55
60
2
0.00
19
55
0
3
6.39
20
55
1
3
5.30
21
55
2
3
5.07
22
55
5
3
4.04
23
55
10
3
3.23
24
55
15
3
2.95
25
55
20
3
2.47
26
55
30
3
1.00
27
55
60
3
0.00
28
60
0
1
6.77
29
60
1
1
5.77
30
60
2
1
5.49
31
60
5
1
3.90
32
60
10
1
3.60
33
60
15
1
2.11
34
60
20
1
1.69
35
60
30
1
1.30
36
60
60
1
0.00
37
60
0
2
6.77
38
60
1
2
5.30
39
60
2
2
4.95
40
60
5
2
3.77
41
60
10
2
3.60
42
60
15
2
3.30
43
60
20
2
1.60
44
60
30
2
1.47
45
60
60
2
0.00
46
60
0
3
6.77
47
60
1
3
4.60
48
60
2
3
3.90
49
60
5
3
3.60
50
60
10
3
3.60
51
60
15
3
2.14
52
60
20
3
1.77
----------------------------------------------------------------------------------------
81
---------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 132
---------------------------------------------------------------------------------------Obs
TEM
TIM
REP
LOG
53
60
30
3
1.60
54
60
60
3
0.00
55
70
0
1
6.23
56
70
1
1
6.07
57
70
2
1
5.30
58
70
5
1
4.69
59
70
10
1
4.39
60
70
15
1
3.78
61
70
20
1
3.60
62
70
30
1
2.07
63
70
60
1
2.00
64
70
0
2
6.23
65
70
1
2
5.00
66
70
2
2
4.60
67
70
5
2
3.77
68
70
10
2
3.47
69
70
15
2
3.00
70
70
20
2
2.83
71
70
30
2
1.30
72
70
60
2
1.00
73
70
0
3
6.23
74
70
1
3
5.30
75
70
2
3
4.30
76
70
5
3
3.95
77
70
10
3
3.85
78
70
15
3
3.60
79
70
20
3
2.77
80
70
30
3
2.34
81
70
60
3
1.00
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 133
---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure
Class Level Information
Class
Levels
Values
TEM
3
55 60 70
TIM
9
0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations
81
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 134
---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure
Dependent Variable: LOG
Source
DF
Sum of
Squares
Mean Square
F Value
Pr
> F
Model
2
5.2580025
2.6290012
Error
78
270.2211852
3.4643742
Corrected Total
80
275.4791877
0.76
0.4716
82
R-Square
Coeff Var
Root MSE
LOG Mean
0.019087
54.01789
1.861283
3.445679
--------------------------------------------------------------------------------------Source
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
2
5.25800247
2.62900123
0.76
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
2
5.25800247
2.62900123
0.76
Pr
> F
TEM
0.4716
Source
Pr
> F
TEM
0.4716
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 135
The GLM Procedure
t Tests (LSD) for LOG
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
83
ANEXO 12
COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN BHI PARA
L.monocytogenes
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
07:11 Thursday, October
14, 2007
1
---------------------------------------------------------------------------------------Obs
TEM
TIM
REP
LOG
1
52
0
1
8.47
2
52
1
1
8.30
3
52
2
1
8.00
4
52
5
1
7.47
5
52
10
1
8.00
6
52
15
1
7.47
7
52
20
1
7.00
8
52
30
1
6.77
9
52
60
1
0.00
10
52
0
2
8.47
11
52
1
2
8.36
12
52
2
2
8.30
13
52
5
2
8.60
14
52
10
2
8.00
15
52
15
2
7.60
16
52
20
2
7.04
17
52
30
2
6.00
18
52
60
2
0.00
19
52
0
3
8.47
20
52
1
3
8.36
21
52
2
3
8.00
22
52
5
3
8.50
23
52
10
3
8.00
24
52
15
3
7.47
25
52
20
3
7.00
26
52
30
3
6.77
27
52
60
3
5.47
28
55
0
1
9.10
29
55
1
1
9.39
30
55
2
1
8.72
31
55
5
1
7.47
32
55
10
1
6.00
33
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15
1
0.00
34
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20
1
0.00
35
55
30
1
0.00
36
55
60
1
0.00
37
55
0
2
9.10
38
55
1
2
9.30
39
55
2
2
8.90
40
55
5
2
7.60
41
55
10
2
6.69
42
55
15
2
5.60
43
55
20
2
5.00
44
55
30
2
0.00
45
55
60
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0.00
46
55
0
3
9.10
47
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1
3
9.00
48
55
2
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8.47
49
55
5
3
8.32
50
55
10
3
7.69
51
55
15
3
7.60
52
55
20
3
7.38
----------------------------------------------------------------------------------------
84
---------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
07:11 Thursday, October
14, 2007
2
---------------------------------------------------------------------------------------Obs
TEM
TIM
REP
LOG
---------------------------------------------------------------------------------------53
55
30
3
6.00
54
55
60
3
0.00
55
57
0
1
9.84
56
57
1
1
9.00
57
57
2
1
9.00
58
57
5
1
8.69
59
57
10
1
8.00
60
57
15
1
8.32
61
57
20
1
7.49
62
57
30
1
6.00
63
57
60
1
6.00
64
57
0
2
9.84
65
57
1
2
9.69
66
57
2
2
9.69
67
57
5
2
9.47
68
57
10
2
8.77
69
57
15
2
8.60
70
57
20
2
7.20
71
57
30
2
6.00
72
57
60
2
6.00
73
57
0
3
9.84
74
57
1
3
9.30
75
57
2
3
8.95
76
57
5
3
8.60
77
57
10
3
8.30
78
57
15
3
8.23
79
57
20
3
6.77
80
57
30
3
6.00
81
57
60
3
0.00
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
07:11 Thursday, October
14, 2007
3
---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure
Class Level Information
Class
Levels
Values
TEM
3
52 55 57
TIM
9
0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations
81
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
07:11 Thursday, October
14, 2007
4
---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure
Dependent Variable: LOG
Source
DF
Sum of
Squares
Mean Square
Model
2
61.6736691
30.8368346
Error
78
588.4203778
7.5438510
F Value
Pr
> F
4.09
0.0205
85
Corrected Total
80
650.0940469
----------------------------------------------------------------------------------------
Source
R-Square
Coeff Var
Root MSE
LOG Mean
0.094869
39.59267
2.746607
6.937160
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
2
61.67366914
30.83683457
4.09
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
Pr
> F
TEM
0.0205
Source
Pr
> F
TEM
2
61.67366914
30.83683457
4.09
0.0205
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
14, 2007
07:11 Thursday, October
5
The GLM Procedure
t Tests (LSD) for LOG
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
86
ANEXO 13
COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN SALSA PARA
L.monocytogenes
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 131
---------------------------------------------------------------------------------------Obs
TEM
TIM
REP
LOG
---------------------------------------------------------------------------------------1
55
0
1
6.39
2
55
1
1
5.00
3
55
2
1
4.07
4
55
5
1
3.60
5
55
10
1
3.20
6
55
15
1
2.47
7
55
20
1
2.30
8
55
30
1
1.00
9
55
60
1
0.00
10
55
0
2
6.39
11
55
1
2
5.00
12
55
2
2
4.32
13
55
5
2
3.60
14
55
10
2
3.20
15
55
15
2
2.60
16
55
20
2
2.47
17
55
30
2
1.00
18
55
60
2
0.00
19
55
0
3
6.39
20
55
1
3
5.30
21
55
2
3
5.07
22
55
5
3
4.04
23
55
10
3
3.23
24
55
15
3
2.95
25
55
20
3
2.47
26
55
30
3
1.00
27
55
60
3
0.00
28
60
0
1
6.77
29
60
1
1
5.77
30
60
2
1
5.49
31
60
5
1
3.90
32
60
10
1
3.60
33
60
15
1
2.11
34
60
20
1
1.69
35
60
30
1
1.30
36
60
60
1
0.00
37
60
0
2
6.77
38
60
1
2
5.30
39
60
2
2
4.95
40
60
5
2
3.77
41
60
10
2
3.60
42
60
15
2
3.30
43
60
20
2
1.60
44
60
30
2
1.47
45
60
60
2
0.00
46
60
0
3
6.77
47
60
1
3
4.60
48
60
2
3
3.90
49
60
5
3
3.60
50
60
10
3
3.60
51
60
15
3
2.14
52
60
20
3
1.77
----------------------------------------------------------------------------------------
87
---------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 132
---------------------------------------------------------------------------------------Obs
TEM
TIM
REP
LOG
---------------------------------------------------------------------------------------53
60
30
3
1.60
54
60
60
3
0.00
55
70
0
1
6.23
56
70
1
1
6.07
57
70
2
1
5.30
58
70
5
1
4.69
59
70
10
1
4.39
60
70
15
1
3.78
61
70
20
1
3.60
62
70
30
1
2.07
63
70
60
1
2.00
64
70
0
2
6.23
65
70
1
2
5.00
66
70
2
2
4.60
67
70
5
2
3.77
68
70
10
2
3.47
69
70
15
2
3.00
70
70
20
2
2.83
71
70
30
2
1.30
72
70
60
2
1.00
73
70
0
3
6.23
74
70
1
3
5.30
75
70
2
3
4.30
76
70
5
3
3.95
77
70
10
3
3.85
78
70
15
3
3.60
79
70
20
3
2.77
80
70
30
3
2.34
81
70
60
3
1.00
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 133
---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure
Class Level Information
Class
Levels
Values
TEM
3
55 60 70
TIM
9
0 1 2 5 10 15 20 30 60
Number of observations
81
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 134
---------------------------------------------------------------------------------------The GLM Procedure
Dependent Variable: LOG
DF
Sum of
Squares
Mean Square
F Value
Model
2
5.2580025
2.6290012
0.76
Error
78
270.2211852
3.4643742
Corrected Total
80
275.4791877
Source
Pr
> F
0.4716
88
---------------------------------------------------------------------------------------R-Square
Coeff Var
Root MSE
LOG Mean
0.019087
Source
54.01789
1.861283
3.445679
DF
Type I SS
Mean Square
F Value
2
5.25800247
2.62900123
0.76
DF
Type III SS
Mean Square
F Value
2
5.25800247
2.62900123
0.76
Pr
> F
TEM
0.4716
Source
Pr
> F
TEM
0.4716
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------The SAS System
22:14 Wednesday, October
13, 2007 135
The GLM Procedure
t Tests (LSD) for LOG
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.
89
ANEXO 8
MEDIOS DE CULTIVO
Composición del Agar Oxford
Polipeptona
Extracto de levadura
Almidón
Cloruro sódico
Citrato férrico amoniacal
Esculina
Cloruro de litio
Agar bacteriológico
20.0
3.0
1.0
5.0
0.5
1.0
15
13
Composición caldo BHI
Extracto de cerebro
12.5
Extracto de corazón
5.0
Proteosa peptona
10
Cloruro sódico
5.0
Fosfato disódico
2.5
D (+) Glucosa
2.0
90