201 El alcohol afecta el desarrollo del sistema nervioso en pez cebra

XXVI CONGRESO DE INVESTIGACIÓN CUAM-ACMor
El alcohol afecta el desarrollo del sistema nervioso en pez cebra
Mariana Zurita León, Fernando Oscar Bejarano Mendoza, y Celia Machorro Berna
Profesor: José Antonio Alonso Pavón Asesora: Dra. Denhi Schnabel
Colegio Marymount Cuernavaca
Area C. Ciencias Biológicas, Químicas y de la Salud- Proyecto con apoyo externo
Introducción
Actualmente el consumo de alcohol por el ser humano representa un problema de salud importante. (OMS,
2009). En los años 70’s se reconoció el Síndrome de Alcoholismo Fetal (FAS, por sus siglas en ingles) como
un problema global de la salud (OMS, 2011). Este síndrome, causado por la ingesta de etanol (C2H6OH)
durante el embarazo, crea una serie de trastornos en el desarrollo del feto los cuales tienen implicaciones
importantes en la salud del bebé. Los síntomas más comunes producidos por el FAS se encuentran en el
sistema nervioso central (Wood, 2002). Los efectos causantes de estos problemas han sido motivo de estudio
desde el reconocimiento del FAS. Estudios médicos sobre el síndrome han sido realizados por medio del
seguimiento de los pacientes; sin embargo, para entender las causas bioquímicas es necesario usar modelos
alternativos. El pez cebra (Danio reiro) representa un modelo comúnmente usado, debido a su fácil
manipulación. Gracias a que el desarrollo del pez ocurre fuera de la madre y de un cascarón, así como que
los huevecillos son transparentes, es fácil observar mal formaciones durante el desarrollo (Gilbert, 2014). Esto
lo hace un buen modelo para observar síndromes que, como el FAS, tienen su origen durante el desarrollo del
feto.
Antecedentes
Los efectos del alcohol en el desarrollo de pez cebra no son un enfoque nuevo. Blader et al. (1998),
reportaron que el desarrollo de pez cebra se ve afectado en presencia de etanol de manera parecida a los
efectos en el desarrollo humano. La presencia de alcohol (2.4%) en etapas tempranas del desarrollo del pez
cebra no solo causa daños fisiológicos, tales como la ciclopia (presencia de un solo ojo), sino que también
afecta la expresión de diferentes genes (Blader et al. 1998). Dosis más bajas de etanol, al igual que un menor
tiempo de exposición a esta sustancia, no causan daños morfológicos notables en el embrión; pero afectan
negativamente el aprendizaje en peces cebra adultos (Fernández et al. 2014). Es decir, que aun cuando no
haya un efecto fisiológico, hay un daño en la expresión de genes del sistema nervioso por lo que sería de
interés poder conocer alguno de los genes cuya expresión sea alterada. El gen Krox20 se expresa en el
desarrollo temprano del pez, apareciendo desde la segmentación1 del embrión. Krox20 marca particularmente
a los rombómeros 3 y 5. Los rombómeros son paquetes de células que se diferencian en neuronas. En
humanos n los rombómeros forman los nervios craneales. Krox20 es un marcador de esta porción del sistema
nervioso, y cualquier alteración en su patrón de expresión indicaría daños en el desarrollo en esta zona. Aun
cuando existen estudios del efecto de etanol en la expresión de marcadores del sistema nervioso durante el
desarrollo temprano, no se sabe si la expresión de Krox20 se modifica en la presencia de etanol; por lo que
este análisis resulta de interés.
Hipótesis
La presencia de alcohol durante el desarrollo temprano del pez cebra provoca daños moleculares que afectan
la expresión de genes tempranos del sistema nervioso tales como Krox20, aun en concentraciones que no
causen un efecto morfológico aparente.
Objetivos
Analizar las alteraciones morfológicas del embrión causadas por la presencia de etanol, y su efecto en la
expresión del gen Krox20 durante el desarrollo temprano del pez cebra.
Metodología
Etapa del desarrollo que ocurre desde las 10 horas y termina a las 24 horas. En ella se forman las somitas,
estas dan lugar a vertebras, costillas, músculos y piel pertenecientes al dorso del pez (Monterde & Gil, 2012).
1
Los experimentos para realizar esta investigación se realizarán en el laboratorio de la doctora Hilda Lomelí en
el Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular del Instituto de Biotecnología de la UNAM,
al igual que el bioterio del mismo Instituto. Todo el material usado será proporcionado por el IBT.
1) Obtención de embriones de pez cebra
Para la obtención de los embriones que serán nuestro objeto de estudio se realizará una cruza de pez cebra
en el bioterio. Una noche anterior los machos y hembras se pondrán en la misma pecera, pero evitando el
contacto directo para inducir la secreción de hormonas que provocará la puesta de huevos. Al día siguiente se
juntarán a los peces dentro de una red para provocar la reproducción. Se obtendrán los embriones y estos
serán transportados al laboratorio. Bajo el microscopio los embriones serán observados y se separarán en
diferentes estadios, al mismo tiempo que se removerán aquellos que no fueron fertilizados.
2) Tratamientos con etanol
Se prepararán las soluciones donde serán incubados los embriones conteniendo 0.75%, 1.5%, 3% y 6% de
etanol en agua de mar Instant Ocean®, como disolvente. Se colocarán diez embriones en cada una de las
soluciones de etanol, así como diez embriones en solución de mar Instant Ocean como control, por
cuadruplicado en una placa de 20 pozos. Esta placa se incubará a 32oC, ya que esta es la temperatura
adecuada para el desarrollo del pez cebra. Debido a que a 32oC el etanol presente se puede evaporar, y así
contaminar los controles, se dejará un duplicado de cada condición, incluyendo el control sin etanol, a
temperatura ambiente (28°). Finalmente, también se dejará un último control, a 28º, en cajas separadas las
cuales tendrán 10 embriones cada una en la solución de Instant Ocean®.
3) Análisis del fenotipo en presencia de etanol
Después de una hora de tratamiento, se observará a todos los embriones para compararlos con los grupos
control. Se realizará un conteo del estado de desarrollo en el que se encuentran los embriones. Esto será
repetido después de 13 horas de tratamiento, junto una toma de fotos de los embriones representativos. El
objetivo de esto es analizar los cambios fisiológicos.
4) Análisis del patrón de expresión del gen Krox20
Para analizar el patrón de expresión de Krox20, los embriones serán fijados en una solución de
paraformaldehido al 4% con una solución tampón durante toda la noche. Posteriormente el formaldehído será
removido y los embriones serán lavados tres veces cada cinco minutos con una solución amortiguadora salina
de fosfato y tween – un detergente- al 0.1% (PBST). Se descoroniaran los embriones, es decir que se quitará
la membrana protectora, bajo el microscopio. Se remueve el PBST y se sustituye por metanol con lavados
graduales al 25%, 50% y 75% cada cinco minutos y tres lavados al 100% cada tres minutos. Posteriormente
los embriones se guardan a -20ºC en dónde pueden permanecer por varias semanas.
Para poder detectar el patrón de expresión de Krox20 se utilizará una sonda que contiene un fragmento de la
secuencia complementaria del gen. Esta sonda se sintetiza y se marca con digoxigenina , y en nuestro caso
será proporcionada por la Dra. Schabel. Este proceso es llamado hibridación in situ.
Antes de empezar la hibridación se rehidratarán los embriones con PBST. Para que la sonda pueda entrar a
las células del embrión es necesario hacer primero un tratamiento con la enzima proteasa K. Esta proteasa
degrada proteínas de la membrana celular y hace pequeños hoyos lo cual permite la entrada de la sonda a
las células del embrión. Después del tratamiento, la proteasa K se levara con PSBT. Los embriones se
pondrán a prehibridar a 70ºC durante 6hrs en solución de hibridación. Finalmente la sonda se pondrá en
contacto con los embriones y se incubará a 70ºC durante la noche para permitir que la sonda encuentre a la
secuencia complementaria presente únicamente en Krox20. Al día siguiente se realizaran lavados de la sonda
con una solución amortiguadora salina de citrato de sodio (SSC) y PBST. Los embriones serán tratados con
un tampón de bloqueo de 3 a 5hrs. Posteriormente se agrega el anticuerpo anti-DIG, el cual reconocerá la
digoxigenina de la sonda y el cual contiene una enzima (peroxidasa) que formara un producto colorido con el
sustrato. Se dejará a 4ºC durante toda la noche. Al día siguiente se realizarán seis lavados con PBST de
30min cada uno. Se pasaran a la solución AP en la cual se añadirá el sustrato NBT/BCIP que reaccionará con
la peroxidasa causando una tinción azul. Para detener la tinción se agregará PBS con un quelante de calcio
(EDTA) y se pasaran los embriones a glicerol para tomar fotos.
Resultados
En proceso.
Conclusiones
En proceso.
Bibliografía:
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syndrome. Neurotoxicology and Teratol, 26, 737-43. Retrieved February 8, 2015, from PubMed.
Blader, P., & Strähle, U. (1998). Ethanol Impairs Migration of the Prechordal Plate in the Zebrafish
Embryo. Developmental Biology, 201, 185–201-185–201. Retrieved February 8, 2015, from http://ac.elscdn.com/S0012160698989953/1-s2.0-S0012160698989953-main.pdf?_tid=88d99c52-abc7-11e4-83e2Gilbert, S. (2014). Amphibians and Fish. In Developmental Biology (10th ed., pp. 271-272). Sunderland, MA:
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Fernández et al., Y. (2014). Embryonic alcohol exposure impairs associative learning performance in adult
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Monterde, & Gil. (2012). Neurulación II. In Embriología para estudiantes de veterinaria. Editorial Intermedica.
OMS, Salud (2011, Junio 6). Síndrome de Alcoholismo fetal: esperanzas frustradas, vidas dañadas. Retrieved
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Wood, D. (2012, Septiembre). Síndrome del alcoholismo fetal. Retrieved from NYU Langone:
http://med.nyu.edu/content?ChunkIID=103703