Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con
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Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico Andrés Felipe Duque Rodríguez UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA MAESTRÍA EN NEUROCIENCIAS Bogotá D.C. 2013 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico Andrés Felipe Duque Rodríguez Código: 05598578 Trabajo presentado como requisito parcial para optar al título de: Magister en Neurociencias Director: Gonzalo Humberto Arboleda Bustos. MD, MSc, PhD. Línea de investigación: Neurodegeneración Grupo de Investigación Grupo de Neurociencias Universidad Nacional de Colombia UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA MAESTRÍA EN NEUROCIENCIAS Bogotá D.C. 2013 Agradecimientos Dentro del proceso que ha sido la realización del presente trabajo me he encontrado con algunas dificultades que no hubiesen podido subsanarse de no haber contado con el apoyo de un grupo invalorable de personas que me han mostrado lo valioso de la vida. A mi padre, quien me ha enseñado que en la educación está la capacidad de realizar grandes cosas, modelando mi carácter y corrigiendo en los momentos en los que siento que el camino se aleja de mis rumbos. Esa persona paciente y de gran corazón que ahora ve el fruto de sus esfuerzos reflejados en mí. A mi madre, quien con amor y compasión me ha mostrado que la dedicación es fundamental para el desarrollo de los mejores aspectos de la vida, quien me demostró que lo fundamental de uno persiste y debe ser parte en la vida. Tu conocimiento no es científico, pero me enseñas todos los días cosas que el conocimiento científico no es capaz de comprender, sobretodo, que los sueños se construyen día a día y con paso firme. A mi hermano, entrañable compañero de aventuras y ejemplo durante mi formación, cómplice de mis travesuras de infancia y guerrero de las mil batallas. A mi hermana, quien ha apoyado mis momentos de dificultad y ha sabido aportar con su alegría. A mi Adri, mujer hermosa que te has robado mi corazón, tu apoyo, comprensión, ternura y amor fueron fundamentales para mantenerme animado y lograr mis objetivos, me has enseñado que el amor es una fuerza motriz enorme, que te permite dar lo mejor de ti. Fuiste luz en momentos de oscuridad y nunca me dejaste retroceder. A la Universidad Nacional de Colombia, mi alma mater, lugar donde creció mi amor por la medicina y que fue fuente constante de conocimiento. En sus rincones aprendí aser curioso y me formó en mi naciente carrera como investigador. A mis profesores Gonzalo, Humberto y Juan José, a quienes les debo el conocimiento que tengo en Neurociencias; mis mentores en el campo de la investigación y quienes me dieron la oportunidad de nacer y crecer en la investigación. VI Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico A mis amigos del Grupo de Neurociencias, personas con las que he compartido muchas experiencias, quienes han compartido conmigo momentos de alegrías y tristezas, de quienes aprendí y a quienes recuerdo con cariño. Al Dr. Mark Cookson y la Dra. Melissa McCoy, del instituto nacional de salud de los Estados Unidos, por su amable donación de los plásmidos para la realización de los experimentos de esta tesis. Resumen y Abstract VII Resumen La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más frecuente, después de la enfermedad de Alzheimer (EA). Su incidencia ha venido en aumento y se espera que siga esta tendencia, por lo cual, la EP ha adquirido importancia a nivel global. Su etiología no es bien conocida, y aún cuando se ha avanzado en el conocimiento de algunos factores implicados en el desarrollo de la enfermedad, no se ha descrito cuál es la etiología de la EP, especialmente de aquella esporádica. Si bien, se han encontrado algunos casos de origen genético con agregación familiar, en la mayoría de los casos no se encuentra una causa de la muerte neuronal; pero el estudio de los casos familiares puede dar luz a la incógnita sobre la etiología. Para la EP se han descrito algunas mutaciones en proteínas que regulan la fusión y fisión de las mitocondrias. Parkin es una de esas proteínas, y se sabe que su ausencia o disfunción lleva a la muerte celular dopaminérgica selectiva, por alteración de la homeostasis energética y activación de vías de muerte celular dependientes de la mitocondria. Se ha demostrado que la sobreexpresión de Parkin genera un efecto neuroprotector, y modifica la dinámica de la regulación mitocondrial, pero no se ha descrito bien el mecanismo molecular por medio del cual se ejerce esta protección. Este trabajo surgió de la necesidad de investigar los mecanismos moleculares implicados en la sobreexpresión de la proteína del gen parkin y su efecto sobre la susceptibilidad de neuronas mesencefálicas frente a Ceramida, Rotenona y 6-OH Dopamina, evaluando la contribución de la vía de supervivencia neuronal mediada por PI3K/AKT. Células dopaminérgicas de origen murino en cultivo fueron sometidas a Ceramida, 6-OH Dopamina y Rotenona, bajo la sobreexpresión transitoria de Parkin en su versión silvestre y dos mutantes, evaluando la viabilidad de las células por MTT y analizando los niveles de AKT fosforilado por western blot como evidencia de activación de la vía de superviviencia PI3K/AKT. La sobreexpresión de Parkin en su versión silvestre protege contra la muerte neuronal inducida por Ceramida y 6-Hidroxidopamina, pero no contra Rotenona, Dicho efecto se pierde con la sobreexpresión de las versiones mutantes de Parkin. La protección se logró relacionar con aumento de la fosforilación de AKT. Las células que sobreexpresaban Parkin en sus versiones mutantes no lograban la activación con la misma intensidad de dicha vía de señalización, demostrando la importancia de la activación de AKT para la supervivencia neuronal. Palabras Clave: Enfermedad de Parkinson, Vía PI3K/AKT, Parkin, Neurodegeneración. VIII Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico Abstract Parkinson’s Disease (PD) is the second most frequent neurodegenerative disorder, after Alzheimer’s disease (AD). It’s incidence has being raising and it is expected that this trend continue, because of this, PD has acquired importance globally. It’s etiology is not well known, and nevertheless there is progress in the knowledge of some factors involved in the development of the disease, it hasn’t been described which is the etiology of PD, specially the sporadic variant. It has been found some patients with genetic origin and familial aggregation, in the greater part of the cases it is not found a cause for neuronal death, but the study of familial cases can bring light to the mystery about its etiology. It has been described some mutations in proteins that regulates mitochondrial fusion and fission. Parkin is one of those proteins, and it is known that its absence or dysfunction leads to selective dopaminergic cell death, by altering energetic homeostasis and activation of cell death pathways that depend on mitochondria. It has been demonstrated that the overexpression of Parkin generates a neuroprotector effect and modifies the dynamics of mitochondrial regulation, but it is not clearly described the molecular mechanism by which this protect is carried out. This work raised from the needs of investigating the molecular mechanisms involved in the overespression of the protein from Parkin gene and its effect on the susceptibility of mesencephalic neurons exposed to Ceramide, Rotenona and 6-OH Dopamine, evaluating the contribution of the PI3K/AKT cell survival pathway. Murine derived cultured dopaminergic cells were subjected to Ceramide, 6-OH Dopamine and Rotenona, with the background of the transient overexpression of the wild type and mutant versions of Parkin, evaluating the viability of the cells with MTT and analyzing the levels of phosphorilated AKT by western blot as an evidence of the activation of the PI3K/AKT survival pathway. Parkin overexpression in its wild type version protects against neuronal cell death induced by Ceramide and 6-OH Dopamine, but not against Rotenona. Such effect is lost with the overexpression of mutated versions of Parkin. Protection was related with the raise of AKT’s phosphorilation. Cells that overexpreseed mutant versions of Parkin did not achieve the activation with the same intensity of that cell survival pathway, demonstrating the importance of the activation of AKT for neuronal survival. Keywords: Parkinson’s Disease, PI3K/AKT Pathway, Parkin, Neurodegeneration. Contenido IX Contenido Resumen y Abstract Lista de Figuras Lista de Abreviaciones 1.Marco Teórico y Estado del Arte 1.1.-sinucleína (PARK 1) 1.2. LRRK2 Dardarin (PARK 8) 1.3. PINK1 (PARK 6) 1.4. DJ-1 (PARK 7) 1.5. Parkin (PARK 2) 1.6. Las alteraciones mitocondriales como vía final común de eurodegeneración en EP17 1.7.Muerte Celular en la EP 1.8.Supervivencia Neuronal: PI3K/AKT 1.9. Regulación del metabolismo Celular 1.10. La vía PI3K/AKT en EP 1.11.Ceramidas 1.12.Rotenona 1.13. 6 Hidroxidopamina. 1.14.Linea Celular CAD 2. Objetivos 2.1. General 2..2. Específicos 3. Materiales y Métodos 3.1.Cultivos Celulares 3.2. Conteo Celular 3.3. Ensayos de viabilidad 3.4.Extracción y cuantificación de la concentración de proteínas 3.5. SDS-PAGE de las muestras de proteína 3.6. Detección de proteínas por Western blotting 3.7. Análisis de vía PI3K/AKT Pág. VII XI XII 1 2 2 2 3 3 6 7 8 9 10 10 11 12 13 15 15 15 17 17 17 17 18 18 18 18 Contenido 4. Resultados X 19 4.1. Los niveles de p-AKT y Parkin aumentan con la diferenciación y son disminuidos por 6-OHDA y Ceramida mas no por Rotenona 19 4.2.Los niveles de p-AKT aumentan con la diferenciación y son disminuidos por 6-OHDA y Ceramida 19 4.3. Los niveles de Parkin aumentan con la diferenciación y el tratamiento con Rotenona; pero son disminuidos por 6-OHDA y Ceramida 20 4.4. La Sobreprotección de Parkin no altera los niveles de p-AKT 21 4.5. La Ceramida y la 6-OHDA disminuyen los niveles de p-AKT en células CAD sin transfectar 22 4.6.La Transfección con el vector vacío no recupera los niveles de p-AKT 25 4.7.La transfección con Parkin WT recupera los niveles de p-AKT 26 4.8Parkin R42P falla en recuperar los niveles de p-AKT 26 4.9.Parkin R275W recupera los niveles de p-AKT 28 4.10. Las Toxinas Disminuyen la Viabilidad Celular en condiciones basales 29 4.11. La Transfección con el Vector Vacio no recupera la viabilidad 30 4.12.Parkin WT Evita la muerte Inducida Por las neurotoxinas 31 4.13. Parkin R275W pierde levemente el efecto neuroprotector 32 4.14. Parkin R42P pierde completamente el efecto neuroprotector 33 5. Discusión y Perspectivas 35 5.1 Discusión 35 5.2 Perspectivas 42 6. Análisis Estadístico 45 Anexo A. Cultivo de células CAD 47 Anexo B. Viabilidad Celular 51 Anexo C. Tratamientos con las Neurotoxinas 53 Anexo D. Transformación de Bacterias E. Coli JM109 y Purificación de los plásmidos recombinantes 56 Anexo E. Transfección de las Células CAD 61 Anexo F. Western Blot 62 Anexo G. Consideraciones Éticas 69 Anexo H. Propiedad Intelectual 70 Bibliografía 71 Contenido XI Lista de figuras Figura 1 Esquema de la proteína Parkin Figura 2 Esquema de la función de Parkin dentro del Sistema Ubiquitina Proteasoma Figura 3 Efecto de la diferenciación sobre los niveles de p-AKT Figura 4 Efecto de la diferenciación sobre los niveles de Parkin Figura 5 Efecto de la transfección de Parkin WT sobre los niveles de p-AKT en células CAD Figura 6 Efecto de las Toxinas sobre los niveles de p-AKT en células CAD Figura 7 Efecto de las Toxinas sobre los niveles de p-AKT en células CAD transfectadas con el Vector Vacío Figura 8 Efecto de las Toxinas sobre los niveles de p-AKT en células CAD transfectadas con Parkin WT Figura 9 Efecto de las Toxinas sobre los niveles de p-AKT en células CAD transfectadas con Parkin R42P Figura 10 Efecto de las Toxinas sobre los niveles de p-AKT en células CAD transfectadas con Parkin R275W Figura 11 Efecto de las Toxinas sobre la viabilidad en células CAD Figura 12 Efecto de las Toxinas sobre la viabilidad en células CAD Transfectadas con el Vector Vacío Figura 13 Efecto de las Toxinas sobre la viabilidad en células CAD Transfectadas con Parkin WT Figura 14 Efecto de las Toxinas sobre la viabilidad en células CAD Transfectadas con Parkin R275W. Figura 15 Efecto de las Toxinas sobre la viabilidad en células CAD Transfectadas con Parkin R42P Figura 16 Vía de Señalización PI3K/AKT Figura 17 Hipótesis Fisiopatológica Pág. 4 5 20 21 23 24 25 27 28 29 30 31 32 33 34 38 41 Contenido Lista abreviaciones °C: Grados centígrados AB: Antibiótico AD: Alzheimer’s Disease ADN: Ácido desoxirribonucleico AKT/PKB: Proteín Cinasa B APS: Persulfato de amonio ATP: Adenosina Tri-fosfato BCA: Ácido bicinconínico CAD: Células CATH.a diferenciadas CAT: Ciclo de los ácidos tricarboxílicos C3G: Guanine nucleotide-releasing factor 2 Cer.: C2-Ceramida (N-Acetyl-D-sphingosine) COMP. V: Complejo V de la cadena respiratoria. CREB: cAMP response element binding protein CRLK: CRK-like protein C. RESP: Cadena respiratoria d: Días DA: Dopamina DAB1: Disabled Homolog 1 DE: Desviación estándar D-MEM/F12: Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 DMSO: Dimetil sulfóxido EA: Enfermedad de Alzheimer Ej.: Ejemplo EP: Enfermedad de Parkinson ERO: Especies reactivas de oxígeno Figura A.: Figura Anexa g: Gramos GAP-43: Proteína asociada al crecimiento 43 GFAP: Proteína ácida fibrilar glial GSK3β: Glycogen synthase kinase 3β h: Horas H2O: Agua H2O d: Agua destilada H2O dd: Agua destilada y desionizada XII Contenido XIII H2O2: Peróxido de hidrógeno HK: Hexocinasa IBR: Dominio entre los Anillos (del inglés: In Between RING) kDa: Kilodaltons L: Litro LDH: Lactato deshidrogenasa LTP: Potenciación a largo plazo (del inglés: Long-term potentiation) L-DOPA: L-dihidroxifenilalanina, levodopa MAPKs: Cinasas activadas por mitógenos (del inglés: mitogen activated protein kinase) mA: Miliamperios mg: Miligramo min: Minutos mL: Mililitro mm: Milímetro mM: Milimolar mARN: Ácido ribonucleico mensajero MPP+: 1-methyl-4-phenylpyridinium MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ng: Nanogramo nM: Nanomolar NMDA: N-metil-D-aspartato NPxY: Asparragina-Prolina-X-Tirosina NT-3: Neurotrofina-3 OH.: Radicales hidroxilo p-AKT: AKT fosforilada PBS: Tampón fosfato salino PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PD: Parkinson’s Disease PINK1: Cinasa putative inducida por PTEN ( del inglés:PTEN induced putative kinase 1) PI3K: Fosfatidil Inositol 3 Cinasa PLD: Poli-D-Lisina PSD-95: Postsynaptic Density – 95 PTEN: Fosfatasa y homóloga de tensina (Phosphatase and tensin homolog) PTPm: Poro de transición de permeabilidad mitocondrial RAP1: Ras proximate 1 RING1: Dominio Tipo Anillo 1 RING2:Dominio Tipo Anillo 2 Rot.: Rotenona rpm: Revoluciones por minuto SDS: Dodecil sulfato de sodio sem: Semanas SFB: Suero fetal bovino XIV Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico SNAP-25: Proteína asociada al sinaptosoma 25 SNC: Sistema nervioso central SNP: Sistema nervioso periférico SUP: Sistema Ubiquitina Proteasoma TAU: Microtubule-associated protein tau t-AKT: AKT total TBS: TRIS Buffer Salino TH: Tirosina hidroxilasa TrkC: Receptores tirosina- quinasa Tipo C UBL: Dominio similar a la Ubiquitina (del inglés: Ubiquitin Like) UV: Ultravioleta WB: Western blot μg: Microgramo μm: Micrómetro μM: Micromolar 1. Marco teórico y estado del arte La EP fue descrita como una entidad clínicamente distinguible desde 1817, pero solo recientemente y gracias a los adelantos metodológicos y tecnológicos, se ha logrado avanzar considerablemente en diversos aspectos de la EP (1). El diagnóstico clínico de la EP, requiere la presencia de algunos signos y síntomas motores: el temblor de reposo, la rigidez en “rueda dentada”, la bradiquinesia o aquinesia y la inestabilidad postural (2).Neuropatológicamente se caracteriza por degeneración neuronal, gliosis reactiva, muerte selectiva y la presencia de los cuerpos de Lewy (CL) y las neuritas de Lewy en neuronas dopaminérgicas de la pars compacta de la sustancia nigra (SN) y el locus ceruleus (3). Los CL son inclusiones neuronales, esféricas e intracitoplasmáticas, formados por agregados de neurofilamentos, α-sinucleina, ubiquitina, UCH-L1, tirosin hidroxilasa, calbindina, y tau entre otras (4). En la dinámica causal compleja que caracteriza a la EP, la genética y el componente medio ambiental no son eventos mutuamente excluyentes sino que podrían ser complementarios en el proceso que subyace esta enfermedad. Algunas toxinas exógenas como el MPTP (5), rotenona(6), 6-OH-dopamina (7), y endógenas como la ceramida (8) y procesos como el estrés oxidativo (9), alteraciones mitocondriales (10), alteraciones del sistema ubiquitina-proteosoma (SUP) (11), y el envejecimiento (12), se han considerado como potenciales contribuyentes al desarrollo de la enfermedad. Uno de los grandes avances en la investigación biomédica básica en enfermedades neurodegenerativas ha sido el reconocimiento, mapeo y descripción de varios genes en algunas formas heredadas monogénicamente. Hasta ahora se han establecido varios locus para la EP y se han denominado en secuencia cronológica: (PARK 1-PARK 10) (13). De estos loci se han identificado 6 genes hasta la fecha, dos para EP autosomica dominante Sinucleina y LRRK2, y tres para EP autosomica recesiva. Con esta evidencia se ha sµgerido un modelo patogénico de función celular de estas proteinas en el cual la ganancia de función toxica de las proteínas Sinucleina y lrrk2 favorecen la disfunción celular promoviendo la agregación de proteínas y la subsiguiente muerte neuronal, y las proteínas Parkin, DJ-1 y PINK1 actúan como elementos neuroprotectores en vías de supervivencia neuronal que se pierden en la EP (14) este modelo es parcialmente apoyado por los estudios en modelos celulares y animales de las diferentes proteínas (15;16) 2 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico 1.1 -sinucleína (PARK 1) Es el primer gen en el que se describió una mutación en la EP, a la fecha se han identificado tres mutaciones especificas: A53T, A30P, E46K y recientemente se han descrito la duplicación y triplicación de su región genómica (17-19)Aunque estas mutaciones constituyen una causa infrecuente de la enfermedad, su descripción ha proporcionado claves significativas para el avance en la patobiología de la EP (20). Actualmente en el modelo de patogénesis mediado por sinucleina ha pasado de un modelo cualitativo (mutaciones puntuales infrecuentes) a un modelo cuantitativo por efecto de dosis génica (triplicación-duplicación), en el cual los factores (genéticos, medioambientales) que aumentan la expresión de la proteína favorecen su papel patogénico, este modelo se aplica aun en las formas esporádicas de la EP e incluso se correlaciona inversamente con la edad de inicio de la EP (21;22) 1.2 LRRK2 (LEUCINE-RICH REPEAT KINASE 2)-Dardarin (PARK 8) Es el gen mas reciente descrito en EP, inicialmente encontrado en pacientes con EP autosómico dominante (23;24) y con evidencia creciente de su papel en EP esporádico (25;26) Desde su descripción inicial se encontró asociado con una gran espectro neuropatólogico abarcando grandes áreas de neurodegeneración asociada a la formación de numerosos y diversos cuerpos de inclusión (24;27). Su expresión no esta limitada al SNC y presenta sus mayores niveles en el putamen y en la SN (24), tiene una distribución citoplasmática principalmente asociado a la membrana externa de la mitocondria, aunque su relación con esta ultima no esta aclarada (28;29). Por sus múltiples dominios de unión a proteínas y por la pleiotropía neuropatologica reportada se ha sµgerido a LRRK2 como un primer de neurodegeneración que conlleva a la disfunción neuronal favoreciendo la formación de cuerpos de inclusión neuronal por sinucleína, tau y/o otras proteínas amiloidogenicas (21;22). 1.3 PINK1 (Kinasa inducida por PTEN 1)(PARK 6) Es una proteína que pertenece a la familia de las Serin/treonin kinasas, tiene una distribución amplia en diferentes tejidos y es regulada por un supresor tumoral PTEN (30). Inicialmente se describieron mutaciones en pacientes con EP recesiva (31-33) y recientemente en EP esporádica (34). PINK1 tiene una localización preferentemente mitocondrial (31), con una fracción citoplasmática (35). En algunos modelos celulares (SH-SY5Y, N2a) se le ha encontrado un función neuroprotectora, tanto en condiciones básales como frente a retos neurotóxicos (MG132, Estaurosporina, MPTP, Rotenona), principalmente evitando la disfunción mitocondrial (manteniendo el Ψm) y la subsecuente apoptosis celular dependiente de mitocondria (31;31;36;37), esta función protectora es abolida por las mutaciones asociadas a la EP (31;35;38), y aunque no esta claro el mecanismo se ha sµgerido que lo puede hacer fosforilando proteínas mitocondriales o regulando vías corriente arriba de la mitocondria (31).Para aclarar el Marco teórico y estado del arte 3 papel de la función Kinasa de PINK1 en la supervivencia neuronal se necesitan más estudios complementarios, principalmente para definir los blancos, el estado de fosforilación de los mismos y su interrelación con las vías corriente arriba de la mitocondria (39). En este sentido se ha sµgerido a PINK1 como un elemento de retroalimentación negativa para la acción pro-apototica de PTEN (36) el cual promueve la apoptosis inhibiendo la vía de supervivencia celular PI3K/AKT (40;41). 1.4 DJ-1 (PARK 7) DJ-1 fue inicialmente caracterizado como un oncogen inducido por mitogenos, codifica una proteína nuclear y citoplasmática que es ubicuamente expresada en varios tejidos (42) y en SNC es expresado mayormente neuronas y astrocitos de los núcleos basales y la SN. (43) Recientemente se han descrito varias mutaciones en pacientes con EP autosomica resecivo (44;45). Se ha descrito la participación de DJ-1 en varios procesos biologicos: control del ciclo celular y oncogenesis (42) control de la trascripción génica (46) regulación de la estabilidad del RNAm, y en la respuesta al estrés celular, siendo este ultimo el más consistente en los modelos neuronales evaluados (47) . En los modelos celulares (Neuro2a, SH-SY5Y, N27, neuronas dopaminérgicas primarias) y animales (Drossophila Melanogaster, ratones) evaluados ha mostrado un papel neuroprotector frente a varios estímulos apoptoticos (H2O2, OH-Dopamina, MPTP)(48;49), esta protección es abolida por sus respectivas mutaciones (50) y su mecanismo no esta determinado aun. Se ha encontrado que puede ser regulando mecanismos anti-estrés celular y mitocondrial específicamente (48;50), aunque como posibles mecanismos alternos recientemente se ha mostrado que DJ-1 inhibe la vía de muerte celular mediada por Daxx/ASK1 (51) y sorprendentemente se ha reportado la asociación funcional del DJ-1 con PTEN, mostrando una correlación negativa entre ambos y una potenciación y regulación proporcional a la activación de la vía PI3K/AKT promoviendo la supervivencia celular (52;53) . Son necesarios más estudios para aclarar los eventos moleculares que conectan estas dos vías de neuroprotección. De los genes involucrados en formas monogenicas de la EP, Parkin, PINK1 y DJ-1 han mostrado efectos neuroprotectores consistentes, su mecanismo no esta bien definido aun, aunque evidencia creciente sµgiere su convergencia sobre la mitocondria o las vías corriente arriba. Varias líneas de evidencia recientes soportan su interrelación con la vía de supervivencia celular mediada por PI3K/AKT (36;53). Estos hechos son de gran importancia porque han resaltado la importancia de evaluar en mayor profundidad esta interrelación en un contexto celular dopaminergico y explorarlo como un posible mecanismo patogénico de la EP con buenas oportunidades de intervención terapéutica (53). 1.5 Parkin (PARK 2) El gen con el mayor numero de mutaciones descritas es el gen parkin, en el cual se han encontrado gran variedad de mutaciones en diversas poblaciones (13).En Europa se estima que el 50% de las familias con parkinsonismo autosómico recesivo y que el 18% 4 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico de pacientes con parkinsonismo aislado y con inicio temprano tienen mutaciones en este gen (54). El gen parkin consta de 12 exónes y codifica una proteína de 465aa con un peso molecular de 51kDa y con dominios tipo UBL y RING-IBR-RING (55)(Figura 1). Su nivel de expresión en el SNC presenta una distribución amplia y diferencial, presentándose en la corteza, hipocampo, ganglios basales y cerebelo, aunque con un alto nivel de expresión en neuronas dopaminérgicas de la SN (56). Figura 1. Esquema de la proteína Parkin. Se muestra el esquema del gen Parkin con sus dominios y las mutaciones más importantes descritas en cada uno de ellos. Ub-Like: Ubiquitin like domain (Dominio similar a la Ubiquitina, RING1: Dominio tipo anillo 1, IBR: In Between Ring (Dominio entre los anillos), RING2: Dominio tipo anillo 2.Tomado de: Parkin and the Molecular Pathways of Parkinson’s Disease, en Neuron, Vol. 31, 885–888, September 27, 2001. La proteína parkin se localiza predominantemente en el citoplasma aunque hay reportes de su hallazgo nuclear. Se ha descrito que parkin funciona como un complejo E3 ligasa de ubiquitina haciendo parte del SUP (57) (Figura 2) y a la fecha, se han identificado varios sustratos: una proteína neuronal desconocida de 30kDa, una forma O-glicosilada de -sinucleína, PAEL, CDCRel-1, Sinfilina-1, ciclina E, CHIP, SEPT5_v2, sinaptotagmina, tubulina y PACRG (glup) (58) que participan en varios procesos celulares desde el ciclo celular hasta la supervivencia celular, lo que ha llevado a la sµgerencia que la regulación del los niveles de estas proteínas por parte de parkin modula indirectamente estos procesos. Recientemente, se ha descrito como parkin puede traslocarse al núcleo cuando hay daño del DNA (59) y cómo puede regular la reparación del DNA al cual se le ha producido un daño (60), procesos que podrían explicar la protección que se ve con la sobreexpresión de parkin. Marco teórico y estado del arte 5 Figura 2 .Esquema de la función de Parkin dentro del Sistema Ubiquitina Proteasoma.Parkin funciona como una E3 ligasa de Ubiquitina dentro del Sistema Ubiquitina Proteasoma. De este modo marca proteínas con ubiquitina para ser degradadas. Tomado de: Parkin and the Molecular Pathways of Parkinson’s Disease, en Neuron, Vol. 31, 885–888, September 27, 2001. En varios modelos celulares (SH-SY5Y, HEK293) se ha encontrado que la sobreexpresión de parkin aumenta la actividad proteosomal, disminuye los niveles de carbonilos y 3-nitrotirosina en proteínas, protege de la muerte neuronal especifica inducida por ceramidas, pero no frente a sustancias como el H 2O2, el 4-hidroxinonenal, el rotenona, la 6-OHDA, y la estaurosporina (61). Su protección frente a la tunicamicina y el 2-mercaptoetanol es controvertida. Esta protección es abolida por las formas mutantes y por inhibidores del proteosoma. Las mutantes se asociaron a elevados niveles de proteínas y lípidos oxidados sin afectar el sistema de enzimas antioxidantes, y se plantea que estas mutantes pueden aumentar el estrés oxidativo sensibilizando a las neuronas a la muerte celular inducida por otros insultos (62). El papel neuroprotector de parkin proviene de estudios in vitro donde su forma “silvestre” suprime la apoptosis inducida por el estrés de proteínas desplegadas en el retículo endoplásmico (UPR) (63) como parte del sistema de degradación de proteínas asociadas al retículo (ERAD) (64). Además contrarresta los efectos neurotóxicos de la disfunción del proteosoma, de la sobreexpresión de α-sinucleína (65), de la excitotoxicidad inducida por kainato (66)y la muerte celular mediada por ceramidas (61). Mediante su unión con la HSP70 facilita además la eliminación de los agregados de poliglutaminas a través de la ubiquitinacion y regulando la actividad de la caspasa 12 como una forma de control de la apoptosis inducida por el UPR (67). También se ha descrito como las alteraciones sinápticas son las principales manifestaciones de los modelos animales para el gen parkin principalmente debido a alteraciones en la fisiología mitocondrial (68). 6 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico En los últimos dos años se ha avanzado en el conocimiento de la relación de parkin con el proceso de autofagia, por medio del cual se eliminan las mitocondrias para la regulación de la supervivencia celular (69-71). Se ha documentado la relación de parkin con otros genes como PINK1 y DJ1, en la regulación de la actividad mitocondrial por la modulación de procesos como la fusión y fisión mitocondriales (72), por medio de la unión a proteínas como mitofusina (73), VDAC y p 62 (74). 1.6 Las alteraciones mitocondriales como una vía final común de neurodegeneración en EP La mitocondria es uno de los organelos más importantes para la célula por ser la fuente de la energía celular, pero también constituye un reservorio de proteínas que hacen parte de la fase efectora de la apoptosis. Uno de los parámetros que está más delicadamente regulado es el potencial transmembrana de la mitocondria (Ψm), el cual mantiene una estrecha regulación bidireccional con el PTP (poro transición de permeabilidad), una estructura que atraviesa las dos membranas mitocondriales y cuya apertura y/o cierre se constituye en un hecho que define el destino celular. De tal forma que los procesos que favorecen su apertura se consideran proapoptoticos y aquellos que favorecen su cierre se consideran antiapoptoticos (75;76). Se ha demostrado que la ceramida mediante la formación directa de canales (77) e indirectamente mediante la inhibición del complejo I y III de la cadena respiratoria (78;79), modula la función mitocondrial, induciendo la liberación de citocromo c, generando radicales libres, alterando la homeostasis de calcio, depletando el ATP, colapsando el m (80)y llevando la célula a apoptosis. Por otro lado, algunas vías implicadas en la supervivencia celular como Akt y la hexoquinasa interfieren con la capacidad de Bax de alterar el Ψm, abrir el PTP y liberar el citocromo c e inducir muerte celular (81-83). Una de las principales hipótesis para explicar la muerte celular selectiva en la EP, ha sido el estrés oxidativo derivado del metabolismo dopaminérgico. Esta hipótesis postula que el aumento en la producción de radicales libres y/o los déficit del metabolismo oxidativo y/o alteraciones inherentes o inducidas en el complejo I de la cadena transportadora de electrones (9), conlleva a alteraciones en el Ψm favoreciendo la apertura del PTP y la subsiguiente inducción de muerte celular (84). Este postulado ha sido la base para el desarrollo de modelos de EP in vitro e in vivo de EP (85). Adicionalmente, el estudio de los efectos de algunas neurotoxinas como el MPTP, 6hidroxidopamina y rotenona, han mostrado que su acción sobre la viabilidad celular esta mediada por cambios en el Ψm (86;87), y de manera interesante estos modelos pueden ser evitados y/o revertidos modulando las vías corriente arriba de la mitocondria (88). Esto sµgiere que las proteínas pro-apoptóticas de la familia Bcl-2 interaccionan específicamente con proteínas o con vías de supervivencia celular distintas, y que regulándolas diferencialmente se podría determinar su papel como un modulador positivo o negativo en la muerte celular (89). Evidencia creciente ha mostrado que la sobre-expresión in vitro e in vivo de -sinucleina altera la cadena respiratoria, aumenta la sensibilidad al estrés mitocondrial y disminuye la Marco teórico y estado del arte 7 sensibilidad frente al MPTP, aportando evidencia a favor de la disfunción mitocondrial como un mecanismo común en la patogénesis de la EP (90-92). Los análisis proteómicos, genéticos y fisiológicos revelan un papel esencial para parkin en la regulación de la homeostasis mitocondrial y proporciona evidencia directa de la disfunción mitocondrial y del daño oxidativo en un modelo genético de EP (93).Además, parkin se localiza en la membrana externa mitocondrial y evita la muerte celular mediada por mitocondria(61).Recientemente se describió una mutación en el gen DJ-1 asociada a EP (94). La función de este gen es desconocida pero se ha correlacionado con la respuesta al estrés oxidativo (49).Se ha descrito que su relocalización a la mitocondria protege frente a la toxina MPTP y al estrés oxidativo, protección que se pierde por las mutaciones reportadas en EP (95). Por otro lado, se ha encontrado mutaciones en pacientes con EP en la quinasa inducida por PTEN o PINK-1 (31). Esta quinasa parece ser parte de un elemento de respuesta al estrés mitocondrial, que actúa mediante la fosforilación de proteínas mitocondriales evitando su alteración (34). Los blancos proteicos de PINK1 siguen siendo desconocidos, pero se ha determinado que la sobreexpresión PINK1 protege contra algunos retos proapoptóticos que actuan sobre la mitocondria evitando la liberación de citocromo C; mientras que mutaciones en PINK1 asociadas a la EP inhiben su efecto neuroprotector (37;96). Esos resultados sµgieren que los genes involucrados en la EP estarían involucrados en la regulación de la cascada de señalización corriente arriba de la mitocondria, pero se requieren mas estudios para aclarar la interrelación entre estas proteínas el estrés oxidativo, la disfuncion mitocondrial y la degradación de proteínas en la patogénesis de la EP (97). La evidencia aportada por los modelos genéticos y bioquímicos converge en que los pacientes con EP presentan alteraciones mitocondriales. Por lo tanto, el análisis in vitro de los efectos reguladores de la homeostasis mitocondrial corriente arriba y abajo, y el papel de los genes asociados a la EP son fundamentales para ampliar y tratar de establecer sus efectos sobre aspectos de la fisiología neuronal dopaminergica aun no explorados (98). 1.7 Muerte celular en la EP Mientras que la causa de la muerte celular en la EP es aun desconocida, varios mecanismos están actualmente en discusión: la necrosis, la apoptosis y la autofagia (99). Por la escasez de cambios necróticos en la SN, el patrón topográfico y temporalmente específico de la perdida celular, la apoptosis emerge como el principal mecanismo de muerte neuronal en EP. Algunos reportes indican que el 12% de neuronas dopaminérgicas expresan proteínas proapototicas, y la activación de caspasas precede la muerte celular (100). Otros reportes resaltan los elevados niveles de proteínas antiapoptoticas en los ganglios basales y la SN de pacientes con EP (101),aunque la evidencia es aun controversial. Una correlación positiva entre la perdida celular, el porcentaje de células de la SN positivas para caspasa 3 y una disminución del 76% en EP, sµgiere que esta enzima es el principal efector de la apoptosis en EP y contribuye a la vulnerabilidad regional observada (76). La apoptosis es una forma de muerte celular programada morfológica y bioquímicamente bien caracterizada. Es un proceso activo, es decir requiere de ATP, y se manifiesta con retracción celular, fragmentación nuclear, preservación de los organelos intracelulares, 8 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico cambios en la asimetría de los fosfolipidos de membrana, y es llevado a cabo por una maquinaria intrínseca y especifica de “suicidio celular” (102). Algunos de los eventos que subyacen la cascada molecular en la apoptosis se subdividen en: la vía extrínseca (disparada por los receptores de la superfamilia de CD95L) y la vía intrínseca (103). La vía mitocondrial como vía final común ha sido la más extensamente estudiada en eventos de muerte y de supervivencia neuronal (104).En los procesos corriente arriba de la activación mitocondrial participan una multitud de proteínas proapoptoticas (Bax, Bad, Bid, Bak, Bcl-xs) y antiapoptoticas (Bcl-2,Bcl-xl) (103), algunas de las cuales están localizadas en la superficie citosólica de la membrana externa mitocondrial y se encargan de regular la homeostasis mitocondrial por diversos mecanismos como: inserción y formación directa de un poro transmembranal, interacción y regulación del canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC) y del transportador de nucleótidos de adenosina (ANT), convergiendo en ultimas en la alteración del PTP, con la consecuente liberación del citocromo c, formación del apoptosoma y la activación de caspasas efectoras (103). Las alteraciones mitocondriales surgen del delicado balance entre los niveles de las proteínas pro y antiapoptoticas, lo cual a su vez depende de la naturaleza e intensidad del estimulo desencadenante, del estado y del tipo celular, de algunas condiciones del microambiente celular externo(105)y de manera “autónoma” de procesos de regulación que modifican las formas activas y/o inactivas de las distintas vías corriente arriba, pej. la fosforilación de Bad por AKT(106) lleva a su secuestro en el citosol, mientras que la defosforilacion inducida por ceramidas lo lleva a interactuar con Bcl-xl y con Bcl-2 disparando la apoptosis(107). De igual forma, la ubiquitinación y subsecuente proteólisis de Bax por el SUP regula el proceso apoptotico (108), y por esto es importante determinar como estos procesos de modificación postraslacional están implicados en la regulación de la supervivencia neuronal y su potencial implicación en neurodegeneración (109). 1.8 Supervivencia neuronal: la vía PI3K/AKT La vía PI3K/AKT puede participar en la supervivencia celular y neuroprotección mediante el bloqueo de la apoptosis, al promover la proliferación celular, y regulando vías adicionales de señalización celular. En neuronas la fosfatidil-inositol-3-quinasa (PI3K) y su mediador corriente abajo proteína kinasa B o Akt (PKB/AKT) median señales de supervivencia, diferenciación y proliferación neuronal (110;111). Estas vías activadas por diversos factores de crecimiento (FC) son un punto crucial en el cuál convergen diversas señales de supervivencia celular (112;113). La unión de FC a los receptores tirosina quinasa causa autofosforilación de sus residuos tirosina, recluta proteínas adaptadoras como Shc, acoplandose corriente abajo y activando las vías PI3K/AKT y Raf/MEK/ERK (114-117). PI3K consiste de una subunidad reguladora (85kDa) y una catalítica (100kDa) encargada de la fosforilación de lípidos de inositol para generar 3-fosfoinositoles (PI: PI(3)P, PI(3,4)P2 y PI(3,4,5)P3). Estos se unen a un dominio homologo a plekstrina presente en una variedad de moléculas de señalización, alterando su actividad y localización subcelular (107) . La función de supervivencia de PI3K en particular esta mediada por la activación de AKT (118-120). Recientemente, se ha demostrado que la activación de Marco teórico y estado del arte 9 AKT requiere su translocación a la membrana plasmática y la fosforilación en treonina 308 (Thr308) y serina 473 (Ser473) (121;122). Los blancos corriente abajo de AKT son diversos, y se asocian a repuestas metabólicas y de supervivencia celular (123;124). En neuronas, AKT se ha demostrado que regula la supervivencia pero no el crecimiento y la diferenciación (113). Los sustratos de AKT incluyen la inactivación por fosforilación de mediadores proapoptóticos (Bad, Bax, caspasa-9, factor de transcripción Forkhead, GSK-3, p53), y activación de proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL, IAP y mTOR) (106;118;125-128). Probablemente AKT media la supervivencia neuronal a diferentes niveles dependiendo del tipo celular, de la disponibilidad de blancos y del requerimiento de eventos transcripcionales o post-transcripcionales (129). El desarrollo de terapias dirigidas contra componentes específicos de la vía PI3K/AKT y sus blancos corriente abajo, pueden constituir una de las principales opciones para la regulación de la muerte celular y un blanco terapéutico para favorecer la supervivencia neuronal de las poblaciones más susceptibles. 1.9 Regulación del metabolismo celular mediado por PI3K/AKT Adicional a su función en supresión de la muerte celular, los FC vía PI3K/AKT también regulan el metabolismo celular modulando la captación de glucosa (130-133). Poco se conoce acerca de la función de la vía PI3K/AKT en la regulación del metabolismo de la glucosa (glucólisis) y cómo esta contribuye a las decisiones de supervivencia/muerte celular (134;135). A diferencia de las proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2, que mantienen la homeostasis mitocondrial en respuesta a remoción de FC al promover el transporte continuo de metabolitos a través de la membrana mitocondrial externa aún en presencia de metabolismo celular disminuido (136;137), la supervivencia mediada por PI3K/AKT requiere de un suplemento continuo de substratos metabólicos y por ende depende del metabolismo celular (131). En modelos de ausencia de FC y de glucosa, la disminución en la glucólisis se ha asociado de forma consistente con estadios iniciales de apoptosis (depleción de ATP, translocación mitocondrial de Bax, activación de JNK, disminución ΔΨm, y liberación de citocromo c al citoplasma). Estos cambios se generan debido a la ausencia de substratos metabólicos derivados de la glucosa, ya que la sobreexpresión de Glut1 (transportador de glucosa) previene tales alteraciones (131;138;139). La sobreexpresión de AKT previene también las alteraciones asociadas a ausencia de FC y mantiene la supervivencia celular al estabilizar la bioenergética celular vía incremento en el transporte y metabolismo de glucosa (140). Se ha demostrado que AKT incrementa la actividad hexoquinasa, de tal forma que la hexoquinasa permanece asociada a la mitocondria y disminuye la muerte celular (141). Estos estudios sµgieren que el acoplamiento entre glucólisis y la función mitocondrial es un pre-requisito para que los FC y en particular AKT medien sus efectos en supervivencia. Además la actividad hexoquinasa es suficiente para que AKT inhiba la apoptosis (141). La forma como la vía PI3K/AKT regula la función hexoquinasa, su asociación/desplazamiento de VDAC y la función mitocondrial, y cómo la actividad hexoquinasa contribuye a la supervivencia celular mediada por los FC, requieren mayor análisis. Así, la inhibición de la vía glucolítica a través de inhibición de la 10 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico vía PI3K/AKT puede determinar eventos que dirigen las neuronas a muerte celular, y constituyen un blanco terapéutico poco explorado en EP. 1.10 La vía PI3K/AKT en EP En la EP, algunos estudios han evaluado el papel de la vía AKT y su relación directa con algunas proteínas implicadas en la EP. Se ha reportado que las sinucleínas estabilizan AKT y favorecen su acción promoviendo la supervivencia celular (142). Además su relación con algunas de las toxinas implicadas en la etiopatogenesis de la EP (MPTP, rotenona, 6OH-Dopamina) parecen regular corriente abajo y negativamente la actividad AKT, favoreciendo así el proceso apoptótico de manera selectiva (143-145).Por otro lado proteínas implicadas en fenómenos de neuroprotección, neurodegeneración como son la HSP o chaperonas moleculares (146-148), se han visto que regulan y estabilizan AKT evitando su defosforilacion y por ende evitan la apoptosis y promueven la supervivencia celular (149;150).Seplantea quede esta manera median su papel neuroprotector. Además algunos agonistas de los receptores dopaminérgicos que han mostrado evidencia en modelos experimentales de neuroprotección, también ejercen su efecto a través de la vía PI3K/AKT (151-153). La relación de genes recientemente asociados a la EP como PINK y DJ-1 con la vía de señalización PI3K/AKT se han empezado a explorar en los últimos años, encontrando relación de la proteína DJ-1 con AKT, en donde el efecto neurotóxico la interferencia de DJ-1 se puede revertir por medio de la estimulación de la vía PI3K/AKT (154). En un estudio genético se encontró que un haplotipo de AKT reduce el riesgo de enfermedad de Parkinson con una p de 0.0002 (155), demostrando una vez más la relación de esta vía de señalización con la enfermedad de Parkinson. Mas recientemente se ha demostrado cómo la estimulación de células en cultivo con IGF-1 es capaz de suprimir la agregación de alfa sinucleína y rescatar la toxicidad inducida por la misma a través de la activación de la vía PI3K/AKT (156). 1.11 Ceramidas Las ceramidas pertenecen a un grupo de segundos mensajeros lipídicos basados en esfingomielina, involucrados en diversas respuestas celulares a estímulos exógenos (157-159). El ciclo de la esfingomielina describe el mecanismo por el cual señales de estrés como citokinas (TNF, FasL, IL-1), agentes citotóxicos (agentes quimioterapeuticos), estreses ambientales, trauma e infecciones incrementan el nivel de ceramida (159). Debido a que muchos de estos estímulos han sido considerados como mediadores de la muerte neuronal (160),la activación inapropiada del ciclo de la esfingomielina puede contribuir a la neurodegeneración observada en EP (8). Ceramida ha sido involucrada en detención del ciclo celular, proliferación, diferenciación y apoptosis (157;161) . La Ceramida induce apoptosis en diversos modelos celulares, incluyendo neuronas (162-164). dicho proceso se caracteriza por activación de caspasas, fragmentación de DNA, liberación de citocromo c, activación de Rb, inactivación de PKC , adicional a los cambios morfológicos asociados con apoptosis (165). Marco teórico y estado del arte 11 Los blancos corriente abajo de ceramida son bastantes y variados. Hasta el momento se conoce que ceramida regula de forma directa o indirecta la actividad de un número variado de diferentes componentes de señalización, incluyendo kinasas MAP, kinasas activadas por ceramida (CAPK), fosfatasas activadas por ceramida (CAPP), fosfolipasas (cPLA, PLD, PLA2), kinasas activadas por stress (SAPK/JNK), ciclo-oxigenase, c-Myc, proteína Rb, factores de transcripción como NF-B, activación de Bax, y caspasas (161;166;167). Adicionalmente a su rol en la activación de mediadores de apoptosis, de forma importante ceramida también inhibe la vía de supervivencia celular mediada por la vía PI3K/AKT, que contribuye potencialmente a apoptosis (110). Dada la complejidad de la acción pro-apoptótica de la ceramida, las estrategias encaminadas para surtir un efecto anti-apotótico contra esta toxina son limitadas y los resultados son específicos de las células analizadas. Se ha demostrado que la utilización de inhibidores de caspasas solos o en asocia con factores neurotróficos, confieren una protección anti-apoptótica limitada y a corto plazo en modelo de neuronas mesencefálicas, pero de forma importante las células neuroprotegidas retienen su integridad metabólica (168). El análisis de potenciales metodologías que incrementen la viabilidad celular en respuesta a exposición a ceramida, son importantes dada la importancia de la ceramida como toxina endógena asociada a diversos paradigmas proapoptóticos. Adicionalmente uno de los co-investigadores ha demostrado que las ceramidas inhiben tempranamente la vía PI3K/AKT y esta inhibición se asocia temporalmente al compromiso del metabolismo celular particularmente alteraciones de la glucólisis por medio de modulación de la actividad hexoquinasa, y estos cambios parecen dirigir las alteraciones mitocondriales corriente abajo y la progresión hacia muerte neuronal (169). 1.12 Rotenona La rotenona es un compuesto natural de estructura isoflavonoide derivado de las raíces de plantas de los géneros Derris y Lonchorcarpus. Es un compuesto activo utilizado como pesticida e insecticida. Se ha reportado su uso también para erradicación de poblaciones de peces. Este compuesto es extremadamente hidrofóbico, por esto es capaz de cruzar fácilmente las membranas biológicas(170-172). La OMS (organización mundial de la salud) lo ha clasificado como un pesticida Clase II (moderadamente peligroso). Existen algunos reportes que indican que la exposición a rotenona puede causar toxicidad en mamíferos, mientras que en animales de sangre fría, como los insectos y peces, es altamente tóxica(173-176). La rotenona es usualmente empleada en la agricultura a bajas concentraciones, es rápidamente absorbida por el suelo y el agua y se descompone por la exposición a la luz solar; por lo tanto es buena para el ambiente y segura para los agricultores y otros usuarios.Estudios epidemiológicos han sugerido que la exposición a pesticidas está asociada con un aumento en el riesgo de desarrollar esta enfermedad(177;178). La exposición crónica, continua y sistémica de ratas a rotenona produce la inhibición sistémica del complejo I mitocondrial, lo que causa degeneración dopaminérgica nigroestriatal altamente selectiva, asociada con rigidez e hipoquinesia(179;180). Además, las 12 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico neuronas dopaminérgicas de la SN de ratas tratadas con rotenona presentan inclusiones citoplasmáticas que contienen poli-ubiquitina y α-sinucleína(181). En neuronas, la rotenona es específicamente un inhibidor del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial, desencadenando reducción del oxígeno molecular a especies superóxido por bloqueo de la transferencia de electrones del clúster Fe-S N-2 a quinona oxidada (179;182) y por varios años se ha usado con el propósito de entender el mecanismo de neurodegeneración dopaminérgica tanto en modelos in vitro e in vivo. La rotenona in vivo puede modelar algunas de las características anatómicas, neuroquímicas, neuropatológicas y comportamentales de EP, con alta reproducibilidad. Algunas de las limitaciones de este modelo son la variabilidad en el porcentaje de animales que desarrollan la lesión, la magnitud de la lesión y la localización y distribución de la lesión en el estriado(175;178). Sin embargo, los mecanismos precisos de neurodegeneración inducida por rotenona en células mesencefálicas dopaminérgicas aún no son claros. Se ha reportado que la inhibición del complejo I mitocondrial resulta en la apertura del PTPm incrementando masivamente las especies reactivas de oxígeno (ERO), originando así daño oxidativo en lípidos, DNA y proteínas de la célula. Este daño oxidativo es un defecto bioenergético y sólo se puede observar en modelos de rotenona in vivo(183;184). En modelos in vitro se ha demostrado que la rotenona tiene un efecto dosis tiempo dependiente y que induce apoptosis selectiva de neuronas dopaminérgicas. Se han realizado varios estudios en modelos neuronales y se ha establecido que causa muerte neuronal en dosis bajas y crónicas. 1.13 6-Hidroxidopamina La 6-hidroxidopamina (6-OHDA) es un análogo hidroxilado del neurotransmisor DA. En la actualidad, la 6-OHDA es una de las neurotoxinas más comunes en la experimentación en modelos de la EP. Es usada tanto in vitro como in vivo, y se ha sugerido que ésta induce lesiones en neuronas dopaminérgicas por la generación de peróxido de hidrógeno, ERO y la inhibición de los complejos I (NADH deshidrogenasa) y IV (citocromo c oxidasa) mitocondriales, siendo el complejo I más sensible a la inhibición por parte de la 6-OHDA(175;176;178). Bajo condiciones fisiológicas e independientes de enzimas, la 6-OHDA es rápidamente oxidada por el oxígeno molecular (O2) para formar peróxido de hidrógeno (H 2O2) y paraquinona(185). Por otra parte, la alta especificidad dada por la 6-OHDA en modelos degenerativos de neuronas catecolaminérgicas se da porque esta neurotoxina es un análogo sintético noradrenérgico, es decir que tiene una estructura similar a la DA y a la norepinefrina, exhibiendo una alta afinidad por los transportadores catecolaminérgicos de la membrana plasmática, como el TDA y transportadores de norepinefrina. Consecuentemente, la 6-OHDA puede entrar a cualquiera de los dos tipos neuronales tanto dopaminérgico como noradrenérgicos y causa daño en las vías catecolaminérgicas periféricas del SNC. La 6-OHDA destruye estructuras catecolaminérgicas por combinación de efectos de las ERO y quinonas(186;187). Marco teórico y estado del arte 13 La capacidad neurotóxica de la 6-OHDA se atribuye principalmente a la inhibición de los complejos I y IV mitocondriales, ya que después de su entrada a la célula a través del TDA se acumula en la mitocondria, teniendo como efecto disminución en el ATP intracelular y como consecuencia final la muerte celular(188). Este mecanismo tardío de muerte es similar al producido por el MPTP, otra neurotoxina dopaminérgica comúnmente usada para la creación de modelos animales de la EP(187;189). Sin embargo, a diferencia del MPTP, la 6-OHDA es un compuesto incapaz de atravesar la barrera hematoencefálica, por lo tanto, los modelos animales (ratas, ratones y primates pequeños) de EP generados por 6-OHDA se basan en la inyección directa intracerebral en el estriado y en la SN, lo que causa muerte selectiva de neuronas dopaminérgicas de la SN y disminución del neurotransmisor DA en el estriado, alteraciones biológicas que reproducen una fisiopatología similar a la de la EP(173-175;178). Se ha descrito que la 6OHDA en neuronas dopaminérgicas genera muerte celular con fenotipo apoptótico, tanto in vivo como in vitro, caracterizada por encogimiento y condensación de la cromatina, invaginación de la membrana y fragmentación del DNA, y activación de caspasa 3(185;190). Aunque existen estudios que mencionan que la muerte inducida por 6-OHDA es independiente de caspasas. Adicionalmente, existe evidencia que permite considerar a la 6-OHDA como una neurotoxina endógena porque se ha descrito su presencia en cerebros de ratas y humanos. Las neuronas dopaminérgicas de la SN contienen altos niveles de DA, de H 2O2 y de hierro libre, lo cual sugiere que una reacción no enzimática entre estos elementos puede conducir a la formación de 6-OHDA(186;187). La oxidación de la DA endógena ocurre a bajas concentraciones, aproximadamente de 50 μM, produciendo además de 6-OHDA, quinonas relacionadas con 6-OHDA y neurotóxicos alcaloides (7-dihydroxy 1,2,3,4 tetrahydroisoquinoline)(186). La generación in situ de 6-OHDA se puede favorecer por factores como la presencia de la neuromelanina (incrementando los niveles de hierro libre), iones de nitrito, H 2O2, manganeso, entre otros. Aunque, no se tiene claro el mecanismo molecular de citotoxicidad de la 6-OHDA, éste puede estar ligado directamente a la producción de ERO y quinonas. La auto-oxidación de 6-OHDA puede generar H2O2, el cual puede ser fácilmente reducido por la presencia del ión ferroso (Fe2+), por la reacción Fenton, produciendo radicales hidroxilo (HO.), que se consideran los radicales libres más dañinos para la células(186;188;191). En el caso de las neuronas dopaminérgicas que acumulan neuromelanina y por ende presentan altas concentraciones de hierro, se puede establecer una relación neurotóxica más acentuada entre el Fe2+ y la 6-OHDA en comparación con otros tipos celulares. De tal forma que las estrategias anti-oxidativas se constituyen en un mecanismo de neuroprotección, por ejemplo el ácido ascórbico, la glutatión y la catalasa(186). 1.14 Línea celular CAD Las células CAD se desarrollaron a partir de una línea celular aislada de un tumor mesencefálico de ratón. Las CAD expresan marcadores neuronales específicos, vesículas sinápticas, tiroxinhidroxilasa, corrientes de voltaje para sodio, potasio y calcio, feniletanolamina N-metiltransferasa, neuropéptido Y, transportador monoaminovesicular subtipo 2, sinaptofisina, proteína de las vesículas sinápticas 2, y la proteína asociada al crecimiento 43 (GAP-43) (192-195). 14 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico De tal forma que las CAD representan un modelo de SNC apropiado para el estudio de las funciones normales y patológicas de las neuronas catecolaminérgicas que se pierden de forma específica en EP. 2. Objetivos 2.1 Objetivo General Investigar los mecanismos moleculares implicados en la sobreexpresión de la proteína del gen parkin y su efecto sobre la susceptibilidad de neuronas mesencefálicas frente a exposición a C2-Ceramida, Rotenona y 6-OH Dopamina y evaluar la contribución de la vía de supervivencia neuronal mediada por PI3K/AKT. 2.2 Objetivos Específicos Caracterizar los efectos de la sobreexpresión del gen Parkin humano (silvestre y mutado) sobre la viabilidad de células CAD. Analizar el efecto en la viabilidad en las células CAD de la sobreexpresión del gen Parkin bajo la exposición a C2-Ceramida, 6-OH Dopamina y Rotenona. Analizar la contribución de la vía de supervivencia neuronal PI3K/AKT en la función mediada por parkin. 3. Materiales y Métodos 3.1 Cultivos Celulares Las Células CAD y SH-SY5Y fueron cultivadas en medio DMEM/F12 suplementado con 10% de suero bovino fetal, penicilina 100 U/mL y estreptomicina 100 µg/mL en platos de cultivo estándar, en una incubadora con medio humidificado y una concentración de CO2 al 5% y temperatura de 37 ºC. Las Células se sometieron a pases cada 3-4 días o cuando alcanzaron una confluencia del 70-80% y transferidas a medio fresco. Para inducir la diferenciación, las Células CAD fueron sembradas en medio DMEM/F12 sin adición de suero; suplementado con Selenita de Sodio 50 ng/mL y antibiótico. 3.2 Conteo Celular Las células se despegan y re-suspenden usando Tripsina al 0.25% p/v en una solución de PBS y EDTA 0.1% p/v, se toma una muestra de la suspensión y se diluye en una solución de azul de Tripán al 0.4% en una proporción de 1:1. Se colocan 10 μl en un hemocitómetro y se realiza el conteo en cuatro de los cuadrantes del hemocitómetro y se realiza el cálculo del número de células. Las células viables no toman la coloración azul, a diferencia de las células no viables. 3.3 Ensayos de viabilidad La viabilidad de las células fue evaluada mediante dos técnicas descritas brevemente a continuación: Ensayo MTT. Las células CAD fueron sembradas a una confluencia de 7000 células por pozo, mientras que las células SH-SY5Y fueron sembradas a 21000 células por pozo en placas de 96 pozos. Se cultivaron durante cuatro días en medio de diferenciación. Posterior a la exposición de las células a las proteínas recombinantes y/o a las toxinas, se agregaron 20 uL de solución MTT a cada pozo y se incubó durante 2 horas. Entonces, los cristales de formazán formados gracias al metabolismo mitocondrial fueron solubilizados con 100 uL Solución de Lisis MTT (ver protocolo anexo) y se cuantifico la absorbencia por espectrofotometría a 590 nm. Los valores de absorbencia de los tratamientos se compararon con los valores de absorbencia de los controles. Ensayo LDH. Para este ensayo se utilizó el kit “CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay” (Promega® Cat. No. G1781) el cual permite cuantificar de manera relativa la cantidad de enzima lactato deshidrogenasa liberada al medio de cultivo. Para el uso de este producto se siguieron las instrucciones emitidas por el fabricante. 3.4 Extracción y cuantificación de la concentración de proteínas Las células fueron cultivadas en placas de 6 pozos. Se lisan en frio usando buffer de lisis RIPA 30 suplementado con inhibidores de proteasas (Complete Mini, EDTA Free. Roche) y fosfatasas (PhosphoStop. Roche). Los lisados se centrifµgan a 7200g por 10min a 4°C, y el sobrenadante se alícuota y se almacena a -20°C. La concentración de proteína de 18 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico cada muestra se determina usando el ensayo de Ácido Bicinconínico (BCA Protein Assay, Pierce) de acuerdo a las instrucciones del productor. Se construyen curvas estándar para proteína mediante dilución de BSA (2mg/ml) en PBS a una concentración final de 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5 y 32.25 µg/mL. Se hace una mezcla de reactivos del kit y muestra en una proporción 20:1, se incuba a 37 °C durante 30 minutos, y la absorbencia se mide mediante espectrofotometría en placas de 96 pozos o en fibra óptica (NanoDrop, NanoVue) a una longitud de onda 570 nm. 3.5 SDS-PAGE de las muestras de proteína Se utiliza una cámara de electroforesis BIORAD mini PROTEAN III para la separación de proteínas de acuerdo a su tamaño en geles SDS-poliacrilamida en gradiente de 6-20%. El gel se coloca entre dos placas de vidrio separadas por espaciadores de 0.75mm en un soporte vertical. Luego de la polimerización del gel, este se coloca en tanques de electroforesis y se cubre con buffer de corrido. Las muestras de proteína (20 µg en total por línea) diluidas en buffer Laemmli y marcadores de proteína pre-marcados se colocan en los pozos y se lleva a cabo la electroforesis a 50V hasta el límite entre gel de concentración y gel de separación, y en adelante a 100V hasta alcanzar la migración requerida. 3.6 Detección de proteínas por Western blotting Luego de la electroforesis, las proteínas se transfieren a membranas de nitrocelulosa usando una cámara de transferencia BIORAD Mini Trans-Blot. El gel se cubre con la membrana de nitrocelulosa que se coloca entre papel Whatmann y dos esponjas de filtración. El ensamblaje se colocará en un cassette de soporte, se insertan en el tanque lleno de buffer de transferencia, con la membrana de nitrocelulosa mirando hacia el ánodo. La transferencia se lleva a cabo por 1h a 100V o a lo largo de la noche a 15V. Luego de la transferencia, la membrana se remueve del ensamblaje y se incuba en buffer de bloqueo (5% leche descremada en TBS con 0.1% (v/v) Tween-20 (TBS-T)) por 1h o a lo largo de la noche a 4°C hasta que se utilice posteriormente. La membrana de nitrocelulosa se incuba con 5ml de la solución apropiada de anticuerpos primarios en buffer de bloqueo por 2h o a lo largo de la noche a 4ºC, se lava 3 veces en TBS-T (5min/lavado). Los anticuerpos primarios Anti-Parkin (PRK8) fue comprado a SantaCruz Biotechnology, y p-AKT (ser 472) fue comprado a Cell Signaling. El anticuerpo unido se visualiza mediante incubación de la membrana con el anticuerpo secundario específico por 1h a temperatura ambiente y se lava luego 3 veces con TBS-T (10min/lavado). El anticuerpo secundario unido se detecta usando quimioluminiscencia (ECL). La membrana se incuba con una mezcla 40:1 de los reactivos A y B de ECL por 1min, y se expone a una película sensible a la luz para visualizar los productos de quimioluminiscencia. Las bandas en la placa se escanean utilizando un analizador de imágenes y se cuantifica su densidad relativa con respecto a un control interno. 3.7 Análisis de vía PI3K/AKT El kit Phospho-Akt Pathway Sampler se adquirió de Cell Signaling Tecnology Labs (Cat. No. 9916) el cual contiene varios anticuerpos capaces de reconocer proteínas activadas mediante fosforilación pertenecientes a esta vía. La detección de estas proteínas se realizará mediante Western Blot. La activación de la vía fue analizada como la relación entre la densidad óptica de las bandas de AKT fosforilado sobre AKT total. 4. Resultados 4.1 Los niveles de p-AKT y Parkin aumentan con la diferenciación y son disminuidos por 6-OHDA y Ceramida mas no por Rotenona Para establecer las condiciones basales del cultivo y poder realizar las comparaciones entre los niveles basales y los niveles a evaluar con los tratamientos en los experimentos posteriores, se hizo necesario analizar los niveles de las proteínas. Se sembraron 250.000 células por pozo en placas de seis pozos estándar. Las cajas fueron pre-tratadas con Poli-D-Lisina (ver protocolo anexo) para mejorar la adherencia de las células. El medio de cultivo de crecimiento fue reemplazado por medio de cultivo de diferenciación y se permitió a las células adquirir el fenotipo neuronal durante uno a cuatro días. Se evaluó la expresión de las proteínas p-AKT y Parkin. Las células fueron lisadas a los cero (control), uno, dos tres y cuatro días de diferenciación. También fueron realizados los tratamientos con las tres neurotoxinas, para poder comparar la afección de los niveles basales de las proteínas en presencia del tratamiento con cada toxina. El protocolo es idéntico al inmediatamente descrito para el sembrado de las células y la inducción de la diferenciación celular, con la salvedad que las células se dejaban diferenciar hasta el día dos, cuando se realizaban los tratamientos con ceramida (Cer:10 µM), 6-OHDA (50 µM) oRotenona (Rot: 5 µM); y 24 horas después, en el tercer día de diferenciación, se realizaba la extracción de las proteínas. La razón para utilizar esta secuencia temporal en los experimentos se debe a que con la transfección y el uso de las neurotoxinas se obtienen los mejores resultados de los experimentos realizados. 4.2 Los niveles de p-AKT aumentan con la diferenciación y son disminuidos por 6-OHDA y Ceramida En la figura 3 se observa el nivel de p-AKT en los días de diferenciación, evidenciando el aumento progresivo de la expresión de p-AKT con la diferenciación (carriles 1 a 4), teniendo un máximo al tercer día y disminuyendo hacía el cuarto día. Por otra parte, se evidencia que los niveles de p-AKT disminuyen notoriamente con el tratamiento con 6-OHDA, mostrando una diferencia altamente significativa con respecto al control (p< 0.001). El efecto de disminución de los niveles de p-AKT se presenta también con el tratamiento con Cer, en menor proporción que con la 6-OHDA, pero logrando una significancia estadística alta(p< 0,01). El tratamiento con Rot no modifica los niveles de p-AKT (figura 3). 20 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico 4.3 Los niveles de Parkin aumentan con la diferenciación y el tratamiento con Rotenona; pero son disminuidos por 6-OHDA y Ceramida Similar a lo observado con los niveles de p-AKT, los niveles de Parkin aumentan con la diferenciación celular, llegando a un máximo al tercer día, y disminuyendo ligeramente hacía el cuarto. En cuanto al tratamiento con las neurotoxinas, es clara la disminución de los niveles de Parkin con el tratamiento con 6-OHDA y Cer con respecto al control (p< 0.001). En tanto que el tratamiento con Rot demostró un aumento en los niveles de Parkin, en comparación con el control (p< 0.001; figura 4). B ** *** Figura 3. Efecto de la diferenciación sobre los niveles de p-AKT. Se muestran los niveles de p-AKT en la diferenciación y con los tratamientos con toxinas (evaluados en el tercer día de diferenciación).A. Western Blot contra p-AKT. B. Densitometria para cuantificar lo Observado en A. Resultados 21 B *** *** *** Figura 4 .Efecto de la diferenciación sobre los niveles de Parkin. Se muestran los niveles de Parkin en diferenciación y con los tratamientos con toxinas (evaluados en el tercer día de diferenciación). A. Western Blot contra Parkin. B. Densitometria para cuantificar lo Observado en A. 4.4 La Sobreexpresión de Parkin no Altera los Niveles de p-AKT Continuando con el establecimiento de las condiciones de las células CAD previas a la experimentación, se realizó la transfección para sobreexpresar la proteína Parkin tanto en su versión silvestre como en sus versiones mutantes, y se estableció el efecto de dicha transfección sobre los niveles de p-AKT, debido a que esta vía se evaluaría posteriormente para evidenciar la respuesta celular ante las neurotoxinas. En placas de 6 pozos, previamente tratadas con Poli-D-Lisina,se sembraron 200.000 células CAD por pozo, en medio D-MEM/F12, sin antibiótico, con 50 ng/mL de selenito de sodio, suplementado con 2% de SFB. Se procedió a transfectar las células con el 22 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico plásmido de Parkin en su versión no mutada (Parkin WT) y con el vector vacío (V.V.) y al tercer día se realizó la extracción de proteína. El resultado obtenido se muestra en la figura 5, en la que se puede apreciar que con la transfección de Parkin se logran unos niveles de expresión de Parkin WT significativamente superiores a los que se observan con el Vector Vacío (V. V.) o sin transfección (Sin Trans) (Figura 5 A y B), garantizando el efecto de aumento de los niveles de Parkin, con un promedio de 10 veces la expresión del control sin transfectar o del V.V., resultado que se desea con el procedimiento de la transfección. En cuanto a los niveles de p-AKT, en la figura 5 se demuestra que los niveles no varían cuando se realiza la transfección, manteniendo niveles muy similares entre las células Sin Trans, aquellas transfectadas con Parkin WT y las transfectadas con el V.V. garantizando homogeneidad en los niveles de p-AKT previo a los tratamientos a las células con las neurotoxinas. Nótese que se muestran los niveles de p-AKT en diferenciación, para poder realizar la comparación contra las células en tercer día de diferenciación, sin presentar cambios significativos de los niveles (Figura 5 A y C). 4.5 La Ceramida y la 6-OHDA disminuyen los niveles de p-AKT en células CAD sin transfectar Para esta serie de experimentos se realizó el procedimiento de transfección de las células, con la excepción que no se utilizó plásmido alguno. Al segundo día de diferenciación se procedió a la exposición de las células a las toxinas Ceramida, 6-OHDA y Rotenona; se utilizó la dosis letal 50 a las 24 horas, en tratamientos con Cer (10 µM), 6OHDA (50 µM) o Rot (5 µM). Al tercer día se realizó la extracción de proteína siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente. Una vez conocido el efecto de la transfección en las CAD, evaluó la exposición de las células a las toxinas, para ver los efectos de las mismas en los niveles de fosforilación de AKT, encontrando que tanto la ceramida como la 6-OHDA disminuyen los niveles de fosforilación de AKT, en un efecto que es dosis dependiente. En la figura 6 se muestra el efecto de la exposición con la dosis letal 50 de cada una de las toxinas produce una disminución de los niveles de p-AKT en las células tratadas con Cer (p< 0.001), siendo mayor el efecto que aquel que se logra con la 6-OHDA la cual produce una disminución significativa de los niveles de p-AKT cuando se compara contra el control sin transfectar y sin toxinas (Sin Trans Sin Tox) o contra el control absoluto del experimento (p< 0.01). Resultados 23 B C ** * * * Figura 5. Efecto de la transfección de Parkin WT sobre los niveles de p-AKT en células CAD. La transfección logra niveles 10 veces superiores a las células sin transfectar y a las células con el vector vacío. Se ponen demanifiesto los niveles en la diferenciación celular, para realizar la comparación de los niveles con la transfección (evaluados en el tercer día de diferenciación).A. Western Blot contra Parkin y p-AKT B. Cuantificación de los niveles de Parkin en relación con la carga evaluada por β-Actina. C. Cuantificación de los niveles de p-AKT en relación con la carga evaluada por β-Actina. En contraste, el tratamiento con Rot no demuestra diferencias significativas con el control sin transfectar o con el control absoluto del experimento, demostrando que el Rot no actúa disminuyendo los niveles de fosforilación de AKT; mientras que 6-OHDA y Cer sí producen una disminución significativa de los niveles de p-AKT, como puede apreciarse en la figura 6. 24 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico B *** ** Figura 6.Efecto de las Toxinas sobre los niveles de p-AKT en células CAD. En la gráfica se muestra el efecto logrado con cada una de las toxinas sobre los niveles de p-AKT, demostrando que la Ceramida y la 6OHDA disminuyen los niveles de forma significativa, mientras que el Rotenona parece no tener un efecto directo sobre los niveles de fosforilación de AKT. A. Western Blot contra p-AKT B. Cuantificación de los niveles de p-AKT en relación con la carga evaluada por β-Actina Resultados 25 4.6 La Transfección con el Vector Vacío no recupera los niveles de p-AKT A continuación, se evaluó el efecto que tenían las toxinas sobre las células cuando se transfectaban con el vector vacío, encontrando, similar a lo observado en el experimento de las células sin transfectar, que la transfección con el vector vacío no recupera los niveles de fosforilación de AKT. Es de notar que cuando se realiza la transfección con el vector vacío disminuye la fosforilación de AKT cuando se somete a las células a las toxinas 6-OHDA y Cer, mostrando una gran disminución de los niveles de p-AKT con 6OHDA (60 %) y una disminución un poco menor con Cer (35 %). De nuevo, Rot no mostró variaciones significativas en los niveles de p-AKT (figura 7). B ** *** Figura 7.Efecto de las Toxinas sobre los niveles de p-AKT en células CAD transfectadas con el Vector Vacío. Cer y 6-OHDA disminuyen los niveles de p-AKT, mientras Rot no tiene efecto significativo. A. Western Blot contra p-AKT B. Cuantificación de los niveles de p-AKT en relación con la carga evaluada por β-Actina. 26 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico 4.7 La transfección con Parkin WT recupera los niveles de p-AKT En el orden lógico de la experientación se continuó con la evaluación del efecto que tiene la transfección con Parkin WT sobre os niveles de p-AKT en células que se sometían a las toxinas. Se continuo con la transfección con el plásmido parkin WT. Al segundo día de diferenciación se procedió a la exposición de las células a las toxinas Cer, 6-OHDA y Rot. Al tercer día se realizó la extracción de proteína. El resultado obtenido fue que las células transfectadas con Parkin WT y sometidas a las toxinas, mostraron recuperación de los niveles de p-AKT tanto en las células tratadas con Ceramida, como en las células tratadas con 6-OHDA, revirtiendo el efecto observado con las toxinas en las células sin transfectar y las células transfectadas con el vector vacío (Figura 8). Además se comprobó que el incremento de los niveles de Parkin aumentaba los niveles de p-AKT hasta devolverlos a los niveles observados en las células que no fueron sometidas al tratamiento con las toxinas y similar al control (Figura 8 A y B). 4.8 Parkin R42P falla en recuperar los niveles de p-AKT Se realizó la transfección con una versión mutante de Parkin: Parkin R42P, cuyo efecto es alteración del dominio UBL, que sirve para realizar la unión a mitocondria, modificando la capacidad de traslocación de dicha proteína.Se siguieron los protocolos descritos previamente y se sometieron las células a los tratamientos con las toxinas con las dosis antes mencionadas finalizando con la extracción de proteínas. Se evidenció que los niveles de p-AKT estaban disminuidos en las células tratadas con 6OHDA y con Cer, mientras que los niveles no se afectaban de manera significativa con el tratamiento con Rot (Figura 9);siendo un resultado similar al obtenido con las células transfectadas con el V.V. o sin transfección, pero opuesto a lo demostrado con la sobreexpresión de Parkin WT. Este resultado pone de manifiesto que Parkin R42P falla en recuperar los niveles de pAKT que se habían recuperado en las células con la sobreexpresión de Parkin WT, manteniéndose un nivel bajo de p-AKT cuando se tratan las células con 6-OHDA y con Cer (Figura 9). Este resultado demuestra que la mutación R42P de Parkin es deletérea para su función y que afecta a la célula alterando la señalización a través de la vía PI3K/AKT. Resultados 27 B Figura 8. Efecto de las Toxinas sobre los niveles de p-AKT en células CAD transfectadas con Parkin WT. La sobreexpresión de Parkin revierte el efecto de Ceramida y la 6-OHDA sobre la fosforilación de AKT. A. Western Blot contra p-AKT B. Cuantificación de los niveles de p-AKT en relación con la carga evaluada por β-Actina. 28 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico B * *** Figura 9. Efecto de las Toxinas sobre los niveles de p-AKT en células CAD transfectadas con Parkin R42P. Se demuestra que la sobreexpresión de Parkin R42P no recupera los niveles de p-AKT disminuidos por la exposición a Cer y 6-OHDA. A. Western Blot contra p-AKT B. Cuantificación de los niveles de p-AKT en relación con la carga evaluada por β-Actina. 4.9 Parkin R275W recupera los niveles de p-AKT Se evaluó el efecto de la transfección con otra versión mutante de Parkin: Parkin R275W, que afecta el dominio RING1 de Parkin, modificando la capacidad de Parkin para reconocer sustratos. Los protocolos se realizaron idénticos que lo relatado para las otras transfecciones, se expuso a las toxinas al segundo día y se realizo la extracción de proteínas al tercer día. En contraste con lo evidenciado para Parkin R42P en donde el rescate de los niveles de p-AKT se perdía por efecto de la mutación, para Parkin R275W se observó que hay recuperación de los niveles de p-AKT cuando las células son sometidas a Cer y 6-OHDA. Si bien,dichos niveles ligeramente más bajos de p-AKT con los tratamientos con Cer y 6- Resultados 29 OHDA en el contexto de una transfección con Parkin R275W se presentan, estas disminuciones no alcanzan la significancia estadística (Figura 10). B Figura 10. Efecto de las Toxinas sobre los niveles de p-AKT en células CAD transfectadas con Parkin R275W. La sobreexpresión de Parkin R275W recupera los niveles de p-AKT disminuidos por la exposición a Cer y 6-OHDA.A. Western Blot contra p-AKT B. Cuantificación de los niveles de p-AKT en relación con la carga evaluada por β-Actina. 30 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico 4.10 Las Toxinas Disminuyen la Viabilidad Celular en Condiciones Basales Para establecer el efecto sobre la viabilidad celular de los tratamientos con las neurotoxinas, se realizó la siembra de 7000 células CAD por pozo en cajas de 96 pozos y se dejaron con medio de diferenciación hasta completar dos días de diferenciación, momento en el cual se realizaban los tratamientos con las neutoxinas con las dosis letales 50 previamente establecidas, que para Cer era 10 µM, para 6-OHDA era 50 µM y para Rot era 5 µM; pasadas 24 horas del tratamiento se realizaba la cuantificación del porcentaje de viabilidad celular mediante MTT o por liberación de LDH al medio (Ver protocolo Anexo). Los resultados obtenidos en condiciones basales muestran que las tres toxinas disminuyen la viabilidad de las células CAD con las dosis descritas, logrando el efecto de muerte celular que se busca con los tratamientos realizados (Figura 11 A y B). Si bien, se evidencia que con la viabilidad por MTT tanto Cer como 6-OHDA logran una disminución dentro de lo esperable de la viabilidad, este efecto no se evidenció tan notoriamente con Rot (Figura 11 A), por lo cual se procedió a realizar la medición por LDH (Figura 11 B), obteniendoque con las dosis descritas los porcentajes de muerte eran los deseables para las tres toxinas. A B ** ** ** * ** * ** * Figura 11. Efecto de las Toxinas sobre la viabilidad en células CAD. Valoración en condiciones basales de la viabilidad.A. MTT de los tratamientos mostrando disminuciones significativas de la viabilidad con 6OHDA y Cer B. Liberación de LDH, que comprueba que la muerte celular se presenta con las tres toxinas. Resultados 31 4.11 La Transfección con el Vector Vacío no Recupera la Viabilidad Se realizó la transfección con el plásmido V.V.. Al segundo día de diferenciación se procedió a la exposición de las células con Cer (10 µM), 6-OHDA (50 µM) o Rot (5 µM). Al tercer día se realizó la valoración de la viabilidad celular por MTT. Cuando se transfectaron las células con el V.V. se demostró que las toxinas seguían ejerciendo el efecto de muerte celular evidenciado en condiciones basales, mostrando que no se modificaba la viabilidad cuando se transfectaba con el V.V. (Figura 12), siendo siempre significativa la diferencia comprobada entre todas las toxinas y el control interno del experimento (Carril 5, Figura 12). * ** *** Figura 12. Efecto de las Toxinas sobre la viabilidad en células CAD Transfectadas con el Vector Vacío. Se evidencia disminución de la viabilidad con los tratamientos con las toxinas, siendo altamente significativo para la Cer (p<0,001), seguido por 6-OHDA (p<0,01) y Rot (p<0,05). Carril 1, Control: Células sin transfectar, control absoluto de viabilidad; Carriles 2-4, Rot, 6-OHDA, Cer: Células transfectadas con el Vector Vacío que se sometieron a los tratamientos con las toxinas; Carril 5, Sin Tox: Células transfectadas con el Vector Vacío que no se sometieron al tratamiento con las toxinas, control relativo de viabilidad. 4.12 Parkin WT evita la muerte inducida por los neurotoxinas Para sobreexpresar Parkin WT y evaluar sus efectos sobre la viabilidad celular se procedió de idéntica forma como se describió para el V.V., con la salvedad que se realizaba la transfección con el plásmido con la secuencia de Parkin sin mutaciones, se expuso a las toxinas y se cuantificó la viabilidad celular por MTT al tercer día. El efecto de Parkin sobre la viabilidad de las células es notorio al evitar la muerte celular inducida por las toxinas, logrando mantener porcentajes de viabilidad comparables con el control sin toxina, lo cual demuestra que Parkin WT mantiene la viabilidad celular aún cuando se induce la muerte con las toxinas. Por lo demás,se demostró que los 32 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico porcentajes de viabilidad son muy similares para las tres toxinas, sin que haya diferencia significativa entre ellas (Figura 13). Figura 13. Efecto de las Toxinas sobre la viabilidad en células CAD Transfectadas con Parkin WT. La viabilidad,que se veía disminuida con la exposición a las toxinas, se recupera y adquiere niveles comparables con el control que no se expuso a las toxinas.Carril 1, Control: Células sin transfectar, control absoluto de viabilidad; Carriles 2 – 4, Rot, 6-OHDA, Cer: Células transfectadas con Parkin WT que se sometieron a los tratamientos con las toxinas; Carril 5, Sin Tox: Células transfectadas con Parkin WT que no se sometieron al tratamiento con las toxinas, control relativo de viabilidad. 4.13 Parkin R275W neuroprotector pierde levemente el efecto Con la sobreexpresión de una de las versiones mutantes de Parkin, la R275W, siguiendo los mismos procedimientos descritos previamente se demostró que la protección conferida por Parkin se disminuye con la versión mutante, mostrando diferencias significativas cuando se compara la viabilidad de las células tratadas con Rot y con 6OHDA (p<0,05, para las dos), siendo la viabilidad entre 5 – 10 % menor; mientras que no se demostró diferencia significativa con Cer (figura 14). No obstante, aún se evidencia el efecto neuroportector de Parkin conesta versión mutante, siendo notorio cuando se compara contra el resultado obtenido con el vector vacío (Figura 12), lo cual demuestra una pérdida parcial de la actividad protectora de Parkin cuando se presenta la mutación R275W. Resultados 33 * * Figura 14. Efecto de las Toxinas sobre la viabilidad en células CAD Transfectadas con Parkin R275W. La viabilidad disminuye levemente en comparación con la versión no mutada de Parkin cuando se exponen a las toxinas, mostrando diferencias significativas con Rot y con 6-OHDA. Carril 1, Control: Células sin transfectar, control absoluto de viabilidad; Carriles 2 – 4, Rot, 6-OHDA, Cer: Células transfectadas con Parkin R275W que se sometieron a los tratamientos con las toxinas; Carril 5, Sin Tox: Células transfectadas con Parkin R275W que no se sometieron al tratamiento con las toxinas, control relativo de viabilidad. 4.14 Parkin R42P pierde completamente el efecto neuroprotector Con la transfección de la segunda versión mutante de Parkin, la R42P, y exponer las células a las toxinas se demostró que con Parkin R42P se pierde por completo el efecto protector demostrado con Parkin WT, ya que las células expuestas tanto a Cer, como a 6-OHDA y Rot mostraban diferencias significativas con respecto al control interno del experimento, las células transfectadas sin exposición a las toxinas. Es de notar, que las células transfectadas con Parkin R42P y sometidas al tratamiento con Cer revelan una disminución de la viabilidad, siendo ésta menos de la mitad de lo observado en las células transfectadas con Parkin R42P que no fueron sometidas a las toxinas (Figura 15, Carril 4), siendo esta diferencia altamente significativa (p< 0,001). Por otra parte, las células tratadas con 6-OHDA, que fueron previamente transfectadas con Parkin R42P, también demuestran disminución de cerca del 50% de la viabilidad, alcanzando alta significancia estadística (p< 0,01); mientras que las células tratadas con Rot tienen una disminución de la viabilidad mucho más sutil, cercana al 10%, siendo también significativa (p< 0,05). 34 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico * ** *** Figura 15. Efecto de las Toxinas sobre la viabilidad en células CAD Transfectadas con Parkin R42P. La viabilidad disminuye claramente en comparación con la versión no mutada de Parkin cuando se exponen a las toxinas, mostrando diferencias altamente significativas con Cer (p< 0,001) y 6-OHDA (p< 0,01), y una diferencia menor con Rot, no obstante, es significativa (p< 0,05). Carril 1, Control: Células sin transfectar, control absoluto de viabilidad; Carriles 2 – 4, Rot, 6-OHDA, Cer: Células transfectadas con Parkin R42P que se sometieron a los tratamientos con las toxinas; Carril 5, Sin Tox: Células transfectadas con Parkin R42P que no se sometieron al tratamiento con las toxinas, control relativo de viabilidad. 35 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico 5. Discusión y perspectivas 5.1 Discusión En la explicación de las hipótesis que conducen a la muerte celular en la enfermedad de Parkinson se han descrito muchos posibles caminos, y se han desarrollado múltiples modelos tanto celulares como animales que cumplen con la característica de inducción de la muerte de las neuronas dopaminérgicas. Dentro de los avances que se han logrado están aquellos relacionados con la genética de la enfermedad, en donde la descripción de unos genes asociados a la aparición de la EP ha permitido vislumbrar los posibles eventos fisiopatológicos que llevarían a un grupo tan selecto de células a la muerte. Y aún cuando se ha trabajado mucho en el desarrollo de las técnicas y en el establecimiento de los factores causales, todavía no es completamente claro cómo se produce dicha muerte celular. Para el presente trabajo se estableció un modelo de neurotoxicidad con tres neurotoxinas: Rotenona, C2-Ceramida y 6-Hidroxidopamina, aplicadas sobre las células CAD, que son neuronas derivadas de un tumor mesencefálico de ratón; teniendo como ventaja que son neuronas de origen central y por ende permitirían hacer extrapolaciones de los resultados obtenidos. Debido a que las células CAD son un modelo relativamente inexplorado, la primera labor fue establecer las condiciones basales, para evaluar los niveles de las proteínas de interés durante la diferenciación de las células. De este modo, se logró identificar que en el proceso de diferenciación las dos proteínas de interés, tanto p-AKT como Parkin tienen su máximo de expresión al tercer día de diferenciación. Así, se decidió que el mejor momento para evaluar el efecto que tenían las toxinas era hacía el tercer día de diferenciación, ya que se presentaba el máximo de expresión proteica. Al valorar el efecto de las toxinas, se encontró que la 6-OHDA casi que suprimía la fosforilación de AKT, mientras que la Cer disminuía notoriamente los niveles para la misma proteína. Estos resultados ya habían sido reportados previamente en trabajos realizados al interior del grupo de investigación en neurociencias de la Universidad Nacional de Colombia(196;197). Al evaluar los niveles de Parkin en células CAD en diferenciación, se encontró que el comportamiento era similar a lo reportado para p-AKT, es decir, que se evidenció aumento progresivo de los niveles de expresión proteica desde el primer día, hasta llegar 36 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico a un máximo al tercer día, con una leve disminución hacia el cuarto día. Este resultado no había sido publicado para este modelo, siendo parte del nuevo conocimiento del modelo utilizado. Por esta razón se pudo establecer que el momento óptimo para evaluar a las células era el tercer día. Una posible explicación para este fenómeno es que con el aumento en los niveles de fosforilación de AKT, se produce activación de las proteínas corriente abajo, con la subsecuente activación de la Hexocinasa (HK)(198), cuya acción es convertir la Glucosa en Glucosa 6-fosfato, acelerando la glucolisis, cuyo paso final es la producción de Piruvato (Figura 16), a partir del cual se sintetiza Acetil CoA, que a su vez participa como inductor del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) cuya función es suplir de Hidrogeniones y equivalentes reductores a la cadena respiratoria (C. RESP), para hacer el transporte de los electrones dados por los hidrogeniones para producir un aumento en el diferencial del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), que proporciona la energía suficiente para que la ATP sintasa adhiera al fosfato al ADP por medio de un enlace de alta energía. En este proceso, se producen gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ERO), que de forma normal en las células tiene que controlarse. Uno de los mecanismos descritos para limitar el efecto nocivo de las ERO está dado por la eliminación de las mitocondrias cuyos niveles se hacen peligrosamente tóxicos y que pueden inducir señalización para iniciar los procesos de muerte celular; dicho proceso se puede dar inicialmente por fusión o fisión mitocondriales (199;200), haciendo que aquellas mitocondrias en situaciones más desfavorables se fusionen con mitocondrias en mejor estado, mejorando los niveles, o dividiendo las mitocondrias para eliminar los fragmentos más peligrosos por vía de la mitofagia. Parkin es una de las proteínas que se han implicado en el proceso de mitofagia, ya que reconoce algunos de los sustratos mitocondriales, como VDAC, y los marca con ubiquitinas para llevar a las mitocondrias a la eliminación. Así, se logra mitigar el efecto de las ERO en las células prolongando su viabilidad. Por ésto es esperable que los niveles de Parkin aumenten con la diferenciación celular, coincidiendo con el aumento de la fosforilación de AKT que lleva a un metabolismo celular mayor, e incremento en las ERO, siendo necesario mejorar el control sobre las mitocondrias para limitar la muerte celular. Al someter a las células a los tratamientos con las neurotoxinas se encontró que dos de ellas (6-OHDA y Cer) tenían un impacto grande en los niveles de fosforilación de AKT y en los niveles de Parkin, notándose una disminución en las dos proteínas que se correlaciona con disminución en la viabilidad celular. Este resultado puede explicarse debido a que el efecto que tienen dichas neurotoxinas se ha relacionado con un aumento en las ERO, derivado de sus mecanismos de acción particulares, que para la Cer es por desacople de la C. RESP y pérdida del ΔΨm, mientras que para la 6-OHDA es por la inhibición de los complejos I y IV de la C. RESP; dando como resultado en los dos casos la disminución de la producción de ATP y la muerte celular por inducción mitocondrial (201). Discusión y perspectivas Además, se ha descrito que las neuronas impiden la traslocación de Parkin después de una rápida despolarización de la membrana mitocondrial (202), confirmando que la función de Parkin, aún cuando no se encuentra mutada, depende también del tiempo que se le otorgue a la célula para hacer el manejo de las ERO. Así, la disminución de los niveles de p-AKT y de Parkin pueden relacionarse con la muerte celular inducida por Cer y 6-OHDA, como se ha demostrado para otros modelos como el MPP+ (203); debido a que la pérdida del ΔΨm que lleva a la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (PTPm) con la liberación de inductores de muerte desde la matriz mitocondrial, pero con depleción previa de la energía por déficit en la producción de ATP, siendo necesaria la energía en forma de ATP para la síntesis proteica (201). 38 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico Figura 16. Vía de Señalización PI3K/AKT. Se muestran los principales mediadores de la vía de señalización PI3K/AKT, mostrando los mecanismos de control de la síntesis proteica, la regulación metabólica y la inhibición de la apoptosis. Discusión y perspectivas 39 En cuanto al efecto que se presenta en los niveles de p-AKT cuando se sobreexpresa Parkin WT, se evidenció que evita la disminución de los niveles de p-AKT que se presentaban con los tratamientos con las toxinas, siendo este un hallazgo que, si bien ya se había descrito para otros genes causantes de la EP en modelos diferentes a las células CAD(204), dicho efecto no se conocía para Parkin, y para nuestro conocimiento este es el primer reporte de la activación de la vía PI3K/AKT estableciendo una forma de regulación de la fosforilación de AKT a partir de la función de Parkin. Debido a que la situación primordial de Parkin es clásicamente descrita como una E2 ligasa dentro del sistema ubiquitina proteasoma (SUP)(205), se propone que la función se cumpla de manera indirecta, bien sea actuando sobre PTEN uno de los reguladores de AKT, o sobre proteínas que la regulen a ella, quitando la inhibición que PTEN representa dentro de la vía de señalización de PI3K/AKT, permitiendo que AKT permanezca fosforilada y por ende cumpla con la función de señalizar para la supervivencia celular. El aumento de los niveles de Parkin WT se correlacionó con una disminución de la mortalidad de las células CAD, logrando mitigar el efecto de las neurotoxinas; y sí se tiene en cuenta que los niveles de p-AKT se recuperan al tiempo, es posible intuir que la recuperación de la viabilidad celular se deba a una activación de la vía PI3K/AKT. Ya se ha descrito que la activación de esta vía de señalización promueve la supervivencia neuronal aún cuando se someten las células a toxinas, siendo nueva la conexión descrita entre Parkin y la vía PI3K/AKT. Es llamativo que la vía PI3K/AKT no ha sido directamente ligada con Parkin, sin embargo, ya se ha logrado establecer en trabajos realizados por el grupo de Neurociencias de la Universidad Nacional de Colombia que la sobreexpresión de genes como DJ1 y PINK1 protegen contra la muerte celular inducida por neurotoxinas(196). Por su parte las versiones mutantes de Parkin disminuyen la viabilidad celular, siendo menor el efecto evidenciado para la variante Parkin R275W que el demostrado para Parkin R42P. La razón para este hallazgo podría residir en el dominio que se afecta con cada una de estas mutaciones, que en el caso de Parkin R42P es el dominio UBL (Ubiquitin Like) y en el caso de Parkin R275W es en el dominio RING1. La afección del dominio RING1 por parte de la mutación R275W de Parkin disminuye su afinidad por los sustratos que van a ser llevados a degradación por vía del proteasoma, pero también afecta su afinidad para el reconocimiento de las proteínas para activar procesos de mitofagia(205). Esta alteración supondría que la actividad de Parkin se disminuye y que aquellos sustratos que deban degradarse, incluyendo las mitocondrias que dejan de ser viables se acumulan y se desencadena la muerte celular. Además se ha demostrado que las mutantes del dominio RING1 de Parkin tienen una localización anómala de la proteína (206). Pero es pertinente aclarar que las mutaciones en el dominio RING1 y en particular la R275W tienen una pérdida parcial de la afinidad, lo que resulta en parte de la función que se conserva.Es por esta última razón que podría verse una ligera disminución de la viabilidad con discreta disminución de la fosforilación de AKT. Si bien ya se había descrito que Drosophilas que sobreexpresan Parkin R275W tienen una viabilidad neuronal dopaminérgica disminuida y que presentan mitocondrias anormales (207), no se ha descrito bien cuál es el mecanismo que lleva a la célula a dicha pérdida tan selectiva de la viabilidad ni a la modificación morfológica. 40 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico Para este modelo se propone que Parkin regula de cierta forma la fosforilación de AKT y por este medio puede contribuir a la supervivencia celular, siempre y cuando los daños ejercidos a la célula no se produzcan tan rápidamente ni con dosis tan elevadas que impidan tener una respuesta adecuada en la activación de las vías de supervivencia. Por su parte, la alteración del dominio UBL en la mutación R42P de Parkin impide la función de ligar las ubiquitinas al sustrato, evento que es fundamental para el marcaje de las proteínas a degradar(208). Además se ha descrito que el dominio UBL está implicado en la traslocación de Parkin hacia la mitocondria, logrando realizar reconocimiento mitocondrial. Con la pérdida de esta función el comportamiento se puede esperar más agresivo ya que el dominio alterado posee una importancia funcional enorme en el control de la homeostasis mitocondrial(209); generando mayor susceptibilidad de las células ante estímulos neurotóxicos. De esta forma se establece que las versiones mutantes de Parkin tienen un comportamiento diferencial, siendo de peor comportamiento la versión Parkin R42P que la versión Parkin R275W, presentando ambas disminución de los niveles de p-AKT en comparación con Parkin WT. Alrededor de la función de Parkin en el contexto de la EP se han vislumbrado algunos mecanismos que podrían explicar la actividad de Parkin en relación con la autofagia mitocondrial(199). Teniendo en cuenta que las versiones mutantes de Parkin alteran la morfología y función mitocondrial (210)se toma este organelo como el punto clave para establecer la hipótesis fisiopatológica derivada de los hallazgos en la presente investigación. Parkin es capaz de controlar la degradación mitocondrial marcando las mitocondrias disfuncionales y llevándolas a degradación por diferentes medios para controlar los posibles efectos deletéreos de la liberación del contenido intramitocondrial. Ya es bien conocido el rol de Parkin en la inducción de la mitofagia, así como la modulación de la actividad de la subunidad 26S del proteasoma (211). En este sentido, si fallase la función de Parkin, el resultado esperable es que se presente disfunción mitocondrial y agregación proteica, como se ha descrito previamente(212), lo cual a su vez se traduciría en activación de la señalización para la muerte celular. En este punto interviene Parkin, cuando se produce el daño de las mitocondrias y éstas empiezan a acumular ERO Parkin las guía a su proceso de degradación por mitofagia. Este evento mitiga la caída del potencial de membrana mitocondrial y se sostiene la producción de ATP que será utilizado para las fosforilaciones mediadas por p-AKT (Figura 17). Los intermediarios que le permiten a Parkin aumentar los niveles de fosforilación de AKT son desconocidos aún, pero no se descarta que tengan algún papel las cinasas mitocondriales (200;213). Otra posibilidad, es que Parkin tenga influencia directa o indirecta de la disminución de la función de PTEN, cuyo efecto sería disminuir la inhibición de la vía de señalización, permitiendo a AKT permanecer fosforilado (Figura 17). Aún cuando falta mucho por entender de los mecanismos fisiopatológicos de la EP, los aportes que se logran al trabajar con versiones mutantes de las proteínas descritas alteradas en los casos familiares pueden orientar sobre los daños fisiopatológicos que conllevan al desarrollo de la enfermedad. Discusión y perspectivas 41 Figura 17.Hipótesis Fisiopatológica.Se esquematiza el efecto que tienen las toxinas sobre la cadena respiratoria, y los potenciales efectos deletéreos de las mutaciones de Parkin en el control de ERO, que desencadenarían la muerte celular. Nótese que las versiones mutantes de Parkin fallan en controlar las ERO y por ende se altera la cadena respiratoria, disminuyendo la disponibilidad de ATP. Se propone que Parkin WT actúe sobre PTEN o sobre otro sustrato que sea inhibidor de AKT para permitir el aumento de los niveles de p-AKT. Dicho efecto se pierde con las versiones mutantes de Parkin. 42 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico 5.2 Perspectivas Como en todos los trabajos de investigación, al final son más las incógnitas que las respuestas que se obtienen. En esta investigación se buscaba encontrar una conexión entre Parkin y AKT, hecho que sucedió de manera afortunada para nosotros, demostrando que hay un nexo entre estas dos proteínas que empieza a ser develado. Dentro del estudio de la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson mucho se ha descrito sobre cada uno de los genes involucrados en los cuadros familiares de la enfermedad, pero los detalles del funcionamiento en situaciones patológicas aún continúa siendo un misterio. El desarrollo en el conocimiento de esta nueva vía abre la posibilidad a una gama de conexiones y de posibles redes que pueden dar más pistas sobre la susceptibilidad tan selectiva de las neuronas dopaminérgicas ante estos eventos que desencadenan la muerte celular. En este sentido se hace necesario analizar cuáles son los posibles sustratos de Parkin que pueden intervenir de forma directa o indirecta sobre la vía de señalización PI3K/AKT, y si existen otras vías de supervivencia neuronal relacionadas. Para esto se hace necesario establecer un plan de intervención de las vías de señalización con el propósito de descartar o corroborar el compromiso de cada una de ellas, y establecer posibles nodos de activación simultánea de las vías de supervivencia neuronal. Probablemente este proceso sea más complejo e involucre redes de proteínas que interaccionan para llevar a cabo las funciones, y es ese sentido es también necesario ampliar el estudio a otros genes. Y si bien, en el grupo de neurociencias de la Universidad Nacional se han hecho avances en el estudio de algunos de ellos como DJ1 y PINK1 deberá hacerse énfasis en el estudio de la regulación de la homeóstasis de los organelos, en especial de las mitocondrias. Probablemente este proceso sea más complejo e involucre redes de proteínas que interaccionan para llevar a cabo las funciones, y es ese sentido es también necesario ampliar el estudio a otros genes. Y si bien, en el grupo de neurociencias de la Universidad Nacional se han hecho avances en el estudio de algunos de ellos como DJ1 y PINK1 deberá hacerse énfasis en el estudio de la regulación de la homeóstasis de los organelos, en especial de las mitocondrias. Así se puede pasar de análisis descriptivos a análisis funcionales, ya que hoy en día se cuenta en las instalaciones de la universidad con un microscopio confocal y un citómetro de flujo, y se podrá evidenciar en tiempo real la modificación de los patrones de fisión y fusión mitocondrial con cada una de las versiones mutantes de Parkin, cuyos plásmidos se encuentran en el instituto de genética, bajo el contexto del uso de estas neurotoxinas. Debido a que este resultado fue obtenido en un cultivo celular también se hace importante establecer en un modelo animal, posiblemente murino, sí aquellos animales que no tengan la expresión de la proteína Parkin también tienen niveles más bajos de expresión de p-AKT, y en ese orden de ideas, establecer una posible hipótesis causal con el ánimo de obtener nuevas opciones terapéuticas para la EP, analizando la respuesta ante posibles agentes que intervengan en estas vías de señalización. Discusión y perspectivas 43 Si bien es cierto que se realizaron los experimentos con neurotoxinas, dos de las cuales pueden ser sintetizadas en el interior de las células, aún queda por describir cómo sucede el proceso en el paciente, a quien no se la suministra este tipo de toxinas, sino en quien la muerte neuronal adviene como consecuencia de un proceso de neurodegeneración. Se hace indispensable entonces la participación de estudiantes de pregrado, maestría y doctorado que se vinculen a esta emergente línea de investigación del grupo de Neurociencias y del grupo de Muerte Celular de la facultad de medicina de la Universidad Nacional de Colombia. 6. Análisis Estadístico Todos los experimentos cuantitativos fueron sometidos a pruebas de hipótesis estadística para evaluar su significancia. En primera instancia, los valores obtenidos por grupo experimental fueron sometidos a pruebas de normalidad estadística. Se utilizaron dos test de normalidad: Test de Kolmogorov-Smirnoff y Test de Shapiro-Wilk. Ambos test asumen la hipótesis nula de la similitud entre una distribución normal o de Gauss y la distribución de los datos obtenidos, de tal manera que la obtención de un p-value por encima de 0,05 significa que los datos no difieren de manera significativa de la distribución normal. Por el contrario, un p-value inferior a 0,05 nos dice que los datos no poseen un comportamiento normal. Posteriormente, para evaluar si las diferencias entre grupos experimentales era significativa se realizaron comparaciones de medias por dos métodos según lo obtenido en las pruebas de normalidad. Si las pruebas de normalidad indicaban p-value > 0,05, es decir que los datos se comportan de manera normal, se realizó un test de análisis de varianza (ANOVA) para corroborar las diferencias en el total de los grupos. Si el test ANOVA resultó positivo, o sea p-value <0,05, se realizó un post-test de Tukey-Kramer de comparación múltiple, para averiguar si existen diferencias significativas entre grupos y en cuál de los grupos radica la diferencia. Los p-values obtenidos en el test de Tukey-Kramer son expresados en las gráficas de la siguiente manera: “*” si p-value es inferior a 0,05 “**” si p-value es inferior a 0,01 “***” si p-value es inferior a 0,001 Si las pruebas de normalidad indicaban p-value <0,05, es decir que los datos no se comportan de manera normal, se recurrió a la estadística no paramétrica. En este caso realizó un test de Kruskal-Wallis para corroborar las diferencias en el total de los grupos. Si el test de Kruskal-Wallis resultó positivo, o sea p-value <0,05, se realizó un post-test de Dunn con columnas seleccionadas para comparación múltiple, para averiguar si existen diferencias significativas entre grupos y en cuál de los grupos radica la diferencia. 46 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico Los p-values obtenidos en el test de Dunn son expresados en las gráficas de la siguiente manera: “*” si p-value es inferior a 0,05 “**” si p-value es inferior a 0,01 “***” si p-value es inferior a 0,001 Anexos: ANEXO A. CULTIVO DE CÉLULAS CAD El sostenimiento de cultivosde líneas celulares precisa de especial atención en los posibles eventos de contaminación (bacterias, hongos y/o levaduras) o cambios espontáneos en el fenotipo de los cultivos. Para garantizar que dichos procesos no se presenten, las actividades de cultivo celular se realizan siempre en cabina de flujo laminar vertical tipo IIA, y previo a cada sesión de trabajo, la superficie debe ser desinfectada con alcohol etílico al 70% y expuesta por 1530 min a luz ultravioleta (UV), además, se debe encender la cabina de flujo al menos durante 15 min antes de iniciar el trabajo, de tal manera que el aire presente haya circulado y se filtre, eliminando los posibles patógenos ambientales. Es también importante el uso de vestimenta adecuada, con elementos de bioseguridadcomo guantes, tapabocas, gorro y bata; las prácticas de lavado de manos son indispensables. La desinfección de las manos con alcohol etílico al 70% se debe hacer antes de introducir las manos en la cabina de flujo laminar, o en el caso de haber hecho contacto con un elemento no estéril. Todo material fungible estéril se debe mantener en su empaque original, y una vez abierto, este se debe re-sellar mediante cinta adhesiva. Los empaques solo se deben abrir y cerrar al interior de la cabina y solo deben salir del cuarto de cultivo cuando sea estrictamente necesario. Existen algunas sustancias usadas en cultivo (medio de cultivo, suero fetal bovino) que deben permanecer refrigeradas. Se prefiere tener una nevera/congelador exclusivo para los materiales de cultivo, y se debe verificar a qué temperatura debe conservarse cada una de las sustancias. Todo material plástico o de vidrio que vaya entrar en contacto con medio de cultivo, debe ser esterilizado mediante el método adecuado. Se debe garantizar que las condiciones de incubación sean: temperatura de 37 °C, 90% de humedad relativa y 5% de CO2. Preparación de soluciones para cultivo celular Medio de cultivo Las células CAD se cultivan en el medio D-MEM/F12 (GIBCO® Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12), el cual se adquirió en polvo para reconstituir. 48 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico La reconstitución debe hacerse en agua Tipo I, se adicionan 1,2 g de bicarbonato de sodio y de 300 mg de glutamina por cada litro de medio a preparar. El pH es ajustado a 7,4 mediante la adición de ácido/base fuerte. La esterilización se realiza mediante ultrafiltración a través de membranas de nitrocelulosa con porosidad igual o menor a 0,22 um. Previa prueba de 24 horas en incubación para detección de contaminación, el medio es suplementado con 100 U/mL de Penicilina y 100 µg/mL de Estreptomicina. A partir de este medio base se prepara el medio de crecimientoadicionándole 10% v/v de Suero Fetal Bovino; o medio de diferenciación, adicionando Selenito de Sodio hasta una concentración de 50 ng/mL.Además, se debe preparar medio sin antibiótico y sin SFB, mas 50 ng/mL de selenito de sodio para el procedimiento de transfección de las células CAD. Tampón fosfato salino (PBS) Esta solución se usa para el lavado de las monocapas celulares, la preparación de tripsina-EDTA y la solución de MTT. Cloruro de sodio (NaCl): 0,8 gr/100 mL; cloruro de potasio (KCl): 0,02gr/100 mL; fosfato diácido de potasio (KH2PO4): 0,02 gr/100 mL; fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4). Se ajusta el pH a 7,4 y se esteriliza con calor húmedo en autoclave. Solución de tripsina 0,25% La tripsina en solución es usada para disgregar las células que crecen en monocapa y cosecharlas, ya sea para hacer sembrado de experimentos, para la criopreservación, o para realizar un pasaje de células a una nueva caja. Esta solución contiene 0,25% de tripsina; 0,1% EDTA y 0,2% de antibiótico penicilina/estreptomicina disueltos en PBS. Se debe ajustar el pH a 7,4 y posteriormente se esteriliza por ultrafiltración. Esta solución debe ser conservada a -20°C. Solución stock de Selenito de Sodio La solución stock de selenito desodiousada tiene una concentración de 250 μg/mL disuelta en medio DMEM-F12 estéril. Es posible usar PBS estéril como reemplazo. Esta solución debe ser conservada a -20°C Cubierta con Poli-D-Lisina (PLD) Este procedimiento debe realizarse bajo condiciones de esterilidad y en cabina de flujo laminar siguiendo el procedimiento descrito a continuación: Se prepara la solución stock de PDL 0,1 mg/mL. usando ddH2O, se hacen alícuotas de 5 mL en tubos cónicos de 50 mL estériles y se almacenan a -20°C. Posteriormente, a una de las alícuotas de 5 mL de PLD stock se le adicionan 45 mL de ddH2O para obtener una concentración de 0,01 mg/mL. Esta solución de trabajo se aplica sobre los pozos o cajas permitiendo un cubrimiento uniforme de la superficie y se debe dejar actuar por al menos 1 hora. Luego se retira el exceso (no se desecha, ya que la PLD es reutilizable) y se realizan al menos tres lavados con ddH2O durante 5 min. La esterilidad debe asegurarse mediante irradiación directa con luz UV durante al menos 20 min tanto sobre los pozos como sobre la tapa de la placa. Anexos 49 Mantenimiento de las células CAD La línea celular CAD fue donada por la Dra. Chikaraishi del departamento de Neurobiología del Duke University Medical Center, Durham, North Carolina al Dr. Gonzalo Arboleda Bustos del grupo de Neurociencias de la Universidad Nacional de Colombia y se mantiene el cultivo de manera estable en el laboratorio 1 del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia desde el año 2007. Criopreservación de células CAD En cabina, se retira el medio de cultivo y se realiza un lavado con PBS estéril. Las células se desprenden usando tripsina en solución, se envasan en un tubo cónico de 15 mL y se centrifµgan por 5 min a 1.200 rpm. Acto seguido, y en cabina de flujo laminar, se descarta el medio, el pellet de células se resuspende en medio fresco para proceder a realizar conteo. La cantidad ideal de células para congelar es de 1x10 6células por mL de medio de congelación. Para un adecuado congelamiento, las células deben ser resuspendidas en la mitad del volumen final usando medio de cultivo. En tubo aparte, se prepara una solución de DMSO al 20% en Suero Fetal Bovino. Esta segunda solución debe agregarse a la suspensión de células de manera lenta hasta alcanzar el volumen final requerido, quedando como concentraciones finales 50% de DMEM-F12; 40% SFB; 10% DMSO. Esta última suspensión se alicuota en viales de criopreservación sin llenar nunca la capacidad máxima del vial. Se colocan sobre una cámara de criopreservación con base en isopropanol y se llevan directamente a -70°C. Tres días después, los viales pueden ser transferidos a nitrógeno líquido. Descongelación Bajo condiciones de esterilidad y en cabina de flujo laminar, se alista un tubo cónico de 15 mL con 5 mL de medio de crecimiento a 37 °C. Luego, se identifica el vial a descongelar, se retira del tanque de nitrógeno líquido y rápidamente se transfiere a un baño serológico a 37 °C, hasta que se descongele únicamente la parte externa del bloque de medio de congelación, es importante que no se descongele totalmente. Inmediatamente, el bloque de hielo se debe colocar en el tubo con medio de crecimiento y se resuspende mediante pipeteo; posteriormente, se centrifµga por 5 min a 1.200 rpm. Se descarta el sobrenadante y el pellet celular se resuspende para realizar conteo celular. Según el número de células, se debe completar con medio de crecimiento y colocar sobre cajas de 25 cm 2hasta el día siguiente, cuando se reemplazará el medio de cultivo con medio fresco. Desprendimiento celular Para desprender las células adheridas a la superficie de la caja de cultivo se usa la solución de tripsina al 0,25%. Cuando las cajas alcanzan un 70-90% de confluencia, se debe hacer uso de esas células, ya sea para hacer subcultivos o para desarrollar un experimento. En cabina, se retira el medio de cultivo y se realiza un lavado con PBS estéril. Se agrega 1 mL de Solución de Tripsina para cajas de 25 cm 2y 2 mL para las cajas de 75 cm 2y se incuba a 37 °C por un tiempo no mayor a 5 minutos para evitar el daño celular. Es necesario monitorear el desprendimiento de las células para no exponerlas a un mayor tiempo de manera innecesaria. Una vez desprendidas las células, la tripsina es inactivada por competencia, agregando medio de cultivo con SFB. Se 50 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico transfiere la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL y se centrifµga a 1200 rpm por 5 minutos. Se realiza el conteo celular usando azul tripán y se procede a sembrar las células en nuevas cajas para hacer subcultivos, o a sembrar sobre placas para la realización de experimentos. Sembrado de células para experimentos en placas de 6, 24 y 96 pozos. Las células deben ser sembradas en pozos con un volumen más pequeño para asegurar la replicación de los experimentos y para minimizar costos en reactivos. Los ensayos de MTT deben ser realizados en placas de 96 pozos para lograr réplicas intra-experimento. Los tratamientos que son destinados para transfección, lisis celular y WB deben ser realizados en placas de 6 pozos para asegurar una cantidad apropiada de proteína total. La cantidad de células que se siembran por cada pozo debe ser la suficiente para lograr una confluencia aproximada de 70%. Para este procedimiento, las células, justo después de ser desprendidas, deben ser resuspendidas en medio de diferenciación según corresponda. Posteriormente, se reparte la suspensión de células en los pozos de las placas que previamente fueron tratadas con Poli-D-Lisina. La cantidad de células CAD y volumen final de cada pozo para cada tipo de placa, se expresa a continuación: Caja de 96 Pozos Caja de 24 Pozos Caja de 6 Pozos Volumen por pozo 200 uL 500 uL 2 mL Células por pozo 7,000 62,500 250,000 Conteo y viabilidad celular por exclusión de azul tripán El azul tripán es una coloración que permite evaluar de manera rápida la integridad de las membranas celulares. Aquellas células que tengan la membrana íntegra no serán permeables al colorante, por lo cual permanecen traslúcidas, mientras que aquellas que tengan la membrana perforada, tomarán una coloración azul. Además, usando una hemocitómetro o cámara de Neubauer es posible realizar una estimación de la cantidad de células presentes por unidad de volumen de medio. Para realizar este procedimiento se requiere tener una suspensión de células, para lo cual se debe haber realizado previamente un desprendimiento celular adecuado. Se debe realizar una mezcla de 20 uL de la suspensión celular con 20 uL de azul tripán. 10 uL de esta mezcla deben ser colocados en cada uno de los lados de la cámara de Neubauer y se procede a contar bajo microscopio. Se cuentan 4 u 8 cuadrantes de la cámara y se obtiene un promedio. Cada uno de los cuadrantes de la cámara equivale a 1/10.000 mL, por lo que el cálculo de células se debe realizar siguiendo la siguiente fórmula: Células por mL = Promedio de Células por Cuadrante x 10.000 x 2 (factor de dilución). Anexos 51 ANEXO B. VIABILIDAD CELULAR Ensayo MTT El ensayo de MTT permite evaluar la viabilidad celular mediante la valoración de la actividad mitocondrial por transformación de un sustrato colorimétrico. Esta transformación es realizada por deshidrogenasas mitocondriales, en especial la Succinato Deshidrogenasa. La viabilidad celular o la actividad mitocondrial se puede medir aprovechando que la Succinato Deshidrogenasa genera la ruptura del anillo de tetrazolio del bromuro de 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5 difenil tetrazolio, (reactivo MTT), generando una sal de Formazán, la cual absorbe la luz a una longitud de onda diferente con respecto al sustrato original. Esta sal no es soluble en agua, pero lo es en solventes orgánicos. La cantidad de absorbencia obtenida será directamente proporcional a la viabilidad celular o a la actividad mitocondrial. Dependiendo del solvente orgánico que se use, la longitud de onda de máxima absorbencia cambia. Los ensayos realizados en este trabajo se hicieron usando Buffer de Lisis MTT (Ver Anexo) con el cual se logra un pico de absorción cuando se lee a 590 nm. Para este ensayo se recomienda usar placas de 96 pozos y un lector de placas para medir la absorbencia. Una vez realizados los tratamientos sobre las placas, se debe agregar la solución de MTT (Ver Anexo). El volumen a agregar debe ser un 10% del volumen de medio inicial en el pozo, en este caso, 20 uL. Posteriormente, la placa debe ser incubada a 37 °C en ambiente humidificado con 5% de CO 2 durante 1 a 2 horas para permitir que las células metabolicen el MTT hacia formazán. Entonces, el medio de cultivo mezclado con la solución MTT debe ser retirado cuidadosamente para evitar el desprendimiento de las células. Para el caso especial de la 6-OHDA, en este punto se realiza un lavado muy suave con PBS estéril debido a la interferencia de los cristales de esta toxina que modifican las lecturas con dicha longitud de onda; para los otras toxinas no es necesario realizar este lavado. Posteriormente, se agregan 100 uL de Buffer de Lisis a cada pozo, preferiblemente a temperatura elevada para facilitar la solubilización del formazán. La absorción de cada pozo es medida en un lector de placas a 590 nm. Para calcular la viabilidad o la actividad mitocondrial de cada uno de los tratamientos se debe comparar el promedio de estas mediciones con el promedio de la absorbencia de los controles, cuya absorbencia es normalizada a 100%. Solución MTT La sal de tetrazolio se debe disolver en PBS estéril para alcanzar una concentración de 5mg/mL. Antes de usar, la solución se debe esterilizar mediante ultrafiltración en cabina. Esta solución se debe conservar a 4 °C si es usada en el transcurso de una semana. Para periodos prolongados de almacenamiento, la solución debe ser conservada a -20 °C, protegida de la luz, ya que ésta facilita su oxidación espontanea. Buffer de lisis/solubilización MTT Se mezclan 200 mL de dimetilformamida con 150 mL de ddH2O. El pH es ajustado a 4,7 con ácido acético glacial. Se adicionan 40 g de SDS. Llevar a un volumen final de 400 mL. La temperatura de congelación del buffer es superior a 4 °C por lo que es común que 52 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico se encuentre congelado en el refrigerador. Se debe descongelar en baño serológico antes de su uso. Medición de LDH La Enzima Lactato Deshidrogenasa se ubica normalmente en el citoplasma celular y no es liberada al exterior, excepto en casos de ruptura de membrana y/o muerte celular. La cantidad relativa de esta enzima libre en el medio es mesurable usando kits comerciales con base en un pseudosustrato y un reactivo cromógeno. En este caso se utilizó CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega® Cat. No. G1781). Permite evaluar la integridad de las células en cultivo, que se relaciona inversamente con la muerte celular. Dicho kit se usó según lo especificado en las instrucciones emitidas por el fabricante, las cuales se resumen a continuación. Procedimiento de medición de LDH 1. Transferir 50 μL del medio de cada uno de los tratamientos, controles del experimento y los controles positivos (incluidos en el kit) para LDH a una caja nueva de 96 pozos. 2. Reconstituir la mezcla de sustrato (Substrate mix) con el buffer (Assay buffer), 12 mL de buffer por frasco de mezcla de sustrato, seguir las indicaciones del proveedor. Después de reconstituido el sustrato almacenar a -20 °C. Se debe procurar mantener frio y protegido de la luz durante la aplicación y no es necesario descongelarlo totalmente en el próximo uso. 3. Adicionar 50 μL del sustrato reconstituido a cada pozo (tratamientos y controles), proteger la caja de la luz con papel aluminio para proteger de la luz e incubar a temperatura ambiente por exactamente 30 min. 4. Transcurridos los 30 min, inmediatamente, adicionar 50 μL a cada pozo de la solución de parada (Stop solution). 5. Leer la placa de 96 pozos a 490 nm y registrar los datos. El análisis de los datos se realiza teniendo en cuenta los controles. El kit incluye una solución de lisis (Lysis Buffer) que se usa para generar el punto máximo de liberación de LDH Esta solución es vendida a una concentración de 10X. En este caso se debe agregar 20 uL de solución de lisis a cada pozo de control LDH 30 min antes de la culminación de los experimentos. El promedio de absorbencia en estos pozos se normaliza a 100%, valor que se usará como base para calcular el porcentaje de liberación de LDH en pozos con tratamiento y en controles. Anexos 53 ANEXO C. TRATAMIENTOS CON LAS NEUROTOXINAS Rotenona Descripción: Formula molecular: Otros nombres: Peso molecular: Solubilidad: Densidad: Temp. de Melting: Pureza: Referencia: Almacenamiento: Toxina mitocondrial, inhibidor competitivo y reversible del complejo I (NADH CoQ Reductasa) C23H22O6 Rotenona, Tubatoxin, Paraderil 394,41g Cloroformo: 50 mg/mL; DMSO: 50 mg/mL; Etanol: 5 mg/mL; poco soluble en agua 15 mg/L a 100°C y 0,02 mg/L a 20°C. 1,27 g/cm3a 20°C 165-166°C >=98% por TLC SIGMA R8875 Temperatura ambiente (20°C), protegido de la luz, después de reconstituir este producto se puede almacenar hasta por tres años a-70°C. Los desechos con rotenona deben ir a la bolsa roja. Stock 10 mM Rotenona en DMSO Pesar 5 mg de rotenona y se disolver en 1,268 mL de DMSO,se ayuda a la disolución por medio de vortex, garantizando que no queden precipitados; se debe proteger de la luz. La concentración de esta solución es de 10 mM, en 100 % de DMSO. Este stock en 100% de DMSO se puede alicuotar y guardar a -70°C hasta por tres años. Stock de trabajo 1 mM Rotenona A 100 μL del stock 10 mM de rotenona se le adicionan 900 μL de agua destilada estéril. Se debe aplicar vortex y sonicar por 5 min con el propósito de evitar la formación de precipitados, se debe proteger de la luz. Aplicación de tratamientos de Rotenona Con el propósito de garantizar la dosis letal 50 del Rotenona en células CAD diferenciadas, se realizaron los tratamientos conla dosis de 5 µM a 24 horas, dosis previamente estandarizada en estudios realizados dentrodel Grupo de Neurociencias de la Universidad Nacional de Colombia. Concentración 5 µM Stock 1 mM 96 pozos, 200 μL 1 µL 6 pozos, 2 mL 10 µL Para proceder con los tratamientos, se debe retirar la cantidad de medio según corresponda y agregar la cantidad de la neurotoxina dependiendo del tamaño del pozo para garantizar la concentración de 5 µM, así, para un volumen final de 200μL se debe adicionar 1 μL del stock de trabajo, mientras que para un volumen final de 2 mL se debe adicionar 10 μL del stock de trabajo. 54 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico 6-Hidroxidopamina Descripción: Neurotoxina que destruye terminaciones catecolaminérgicas Formula molecular: (HO)3CH2 CH2 NH2 HBr Otros nombres: 2,4,5-Trihydroxyphenethylamine hydrochloride, 2,5Dihydroxytyramine hydrochloride, 2-(2,4,5-Trihydroxyphenyl) ethylamine hydrochloride, 6-OHDA Peso molecular: 250,09 g Solubilidad: 50 mg/mL (5%) H2O Pureza: >=95% Referencia: SIGMA H116 Almacenamiento: Temperatura ambiente (20°C), protegido de la luz, después de reconstituir este producto se oxida muy rápido, se debe almacenar a-70°C y puede permanecer hasta por un mes. Stock 10 mM 6-OHDA Pesar 2,5 mg de 6-OHDA y disolverlos en 1 mL de H 2Odd; libre de oxígeno, esta solución toma un color rosado translúcido, debe realizarse muy rápido, en frío y protegido de la luz, porque la 6-OHDA se oxida muy rápido. Este stock se puede alicuotar y guardar a -70°C hasta por un mes, protegido de la luz. Stock de trabajo 1 mM 6-OHDA Tomar 100 μL del stock 10 mM de 6-OHDA y adicionar 900 μL de H2Odd. Se debe realizar muy rápido, protegido de la luz y en frío. Aplicación de tratamientos de 6-OHDA Previamente se estableció que la dosis letal 50 de la 6-OHDA para las células CAD es de 50 µM a 24 horas, por esta razón se utilizó esta dosis para la realización de los experimentos con esta neurotoxina, realizando los cálculos así: Concentración 50 µM Stock 1 mM 96 pozos, 200 μL 10 µL 6 pozos, 2 mL 100 µL Se debe retirar la cantidad de medio y agregar la cantidad de la neurotoxina dependiendo del tamaño del pozo para garantizar la concentración de 5 µM, así, para un volumen final de 200μL se debe adicionar 1 μL del stock de trabajo, mientras que para un volumen final de 2 mL se debe adicionar 10 μL del stock de trabajo. C2-ceramida Descripción: Inductor apoptótico de la familia de las esfingomielinas que activa las protein fosfatasas Serina/Treonina citosólicas a través de la vía de señalización por diferentes vías de señalización como la JNK y la PI3K/AKT. Formula molecular: C20H39NO3 Anexos Otros nombres: Peso molecular: Solubilidad: Pureza: Referencia: Almacenamiento: 55 (2S,3R,4E)-2-(Acetylamino)-4-octadecene-1,3-diol, N-Acetoyl-Derythro-sphingosine, Acetyl ceramide, C2 Ceramide (d18:1/2:0), NAcetyl-D-sphingosine. 341.53 g 20 mM en DMSO y 20 mg/mL en Cloroformo >98% SIGMA A7191 Sin solubilizar se puede almacenar a -20°C hasta por un año, una vez se ha disuelto, se almacena a esta temperatura hasta por 3 meses. Preparación de C2-ceramida para tratamientos Realizar un stock en DMSO de C2-ceramida 50 mM, alicuotar en tubos estériles 10 μL por tubo y almacenar a -20°C protegidos de la luz Preparar el stock de trabajo 1 mM. A 10 μL de C2-cermida 50 mM se le adicionan 490 μL de D-MEM/F12 estéril. Dar vortex hasta que la solución se observe homogénea. Agregar el volumen necesario a las células según se indica a continuación. Concentración 10 μM Stock 1 mM 96 pozos, 200 μL 2 μL 6 pozos, 2 mL 20 μL La C2-ceramida se debe adicionar a las células, inmediatamente, después de dar vortex, porque ésta es un lípido y se precipita muy rápido en la solución 1 mM. 56 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico ANEXO D. TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS Escherichia coli JM109 Y PURIFICACIÓN DE LOS PLÁSMIDOS RECOMBINANTES Se transformaron bacterias Escherichia coli JM109, con los plásmidos pcDNA3.1 V5/HIS y pcDNA3.1 V5/HIS Parkin WT, pcDNA3.1 V5/HIS Parkin R42P, pcDNA3.1 V5/HIS Parkin R275W, donados por el Dr. Mark Cookson del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos para luego llevar a cabo la purificación de los plásmidos, los productos de esta purificación fueron cuantificados y usados para la transfección de las células CAD con el fin de sobreexpresar la proteína Parkin humana silvestre y dos versiones mutantes en células CAD. Transformación de bacterias E. coli JM109 con plásmidos recombinantes Medio LB líquido La preparación del medio LB se realiza por componentes según las siguientes especificaciones: Para 1 L de medio líquido se pesan: 10 g de Bacto® triptona 5 g de Bacto ® extracto de levadura 5 g de cloruro de sodio (NaCl) Disolver todos los componentes en 800 mL de H 2O dd, cuando la solución esté homogénea se completa a 1 L con H 2O dd. Ajustar a pH 7.0 con NaOH. Finalmente, se esteriliza con calor húmedo. Medio LB sólido Se procede de idéntica forma que el protocolo para el medio LB líquido, con la diferencia que al LB sólido se le deben adicionar 15 g de Bacto® agar. Así, se disuelven los componentes en 800 mL de H2O dd, se completa el volumen hasta 1 L y se esteriliza con calor húmedo. Después de esterilizar se deja enfriar hasta 50°C y bajo condiciones de esterilidad y con mechero se sirve en cajas de Petri estériles, aproximadamente 30 mL para cajas de 85 mm, luego de gelificado el medio las cajas se tapan, se marcan y se guardan a 4°C hasta el momento de su uso, las cajas pueden permanecer almacenadas a 4°C hasta por un mes y a temperatura ambiente una semana. Medio LB líquido y sólido con ampicilina 100 μg/Ml El medio LB con antibiótico (ampicilina 100 μg/mL) se usa para seleccionar las bacterias transformadas con los plásmidos, los cuales le confieren a las células E. coli resistencia a la ampicilina. Para preparar 1 L de medio LB con ampicilina 100 μg/mL, bajo condiciones de esterilidad y con mechero a un 1 L de medio LB líquido estéril y a temperatura ambiente, se le adicionan 2 mL de la solución de ampicilina 50 mg/mL . Anexos 57 Para preparar medio sólido con ampicilina 100 μg/mL, bajo condiciones de esterilidad y con mechero, a 500 mL de medio LB sólido estéril y 50°C de temperatura se le adiciona 1 mL de la solución de ampicilina 50 mg/mL, se resuspende y se sirve en cajas de Petri estériles, aproximadamente 30 mL para cajas de 85 mm, luego de gelificado el medio las cajas se tapan, se marcan y se guardan a 4°C hasta el momento de su uso, las cajas pueden permanecer almacenadas a 4°C hasta por un mes y a temperatura ambiente una semana. Solución de ampicilina 50 mg/mL Se pesan 250 mg de ampicilina y en cabina disolver esta cantidad en 5 mL de agua destilada estéril en un tubo cónico estéril de 15 mL, alicuotar en tubos de 1,5 mL estériles y almacenar en el congelador a -20°C hasta el momento de su uso, la solución se debe almacenar máximo hasta por un mes. Medio SOC Para preparar 100 mL de medio SOC se requiere: 2 g de Bacto® triptona 0,5 g de Bacto® extracto de levadura 1 mL de 1M de NaCl 0,25 mL de 1M de KCl 1 mL de 2M glucosa, esterilizada por filtración 1 mL de 2M Mg2+stock, esterilizada por filtración 2M Mg2+stock: 20,33 g MgCl2 6H2O 24,65 g MgSO4 7H2O Adicionar H2O dd hasta 100 mL y esterilizar por filtración Adicionar la triptona, el extracto de levadura, el cloruro de sodio (NaCl) y el cloruro de potasio (KCl) a 97 mL de H2O dd, agitar hasta disolver, esterilizar con calor húmedo y enfriar hasta temperatura ambiente. En cabina, adicionar la solución stock de 2M Mg2+ y la solución de2M glucosa. Almacenar a 4°C hasta el momento de su uso. Medio de congelación para bacterias El medio de congelación de bacterias es medio LB líquido estéril con 30 % de glicerol estéril. Para preparar 10 mL de medio de congelación, bajo condiciones de esterilidad y con mechero, en un tubo cónico de 15 mL estéril se colocan 7 mL de medio LB estéril y se le adicionan 3 mL de glicerol estéril, se resuspende esta solución y se guarda a 4°C hasta el momento de su uso. Procedimiento de transformación de bacterias E. coli JM109 con plásmidos recombinantes El proceso de transformación se realiza bajo condiciones de esterilidad y con mechero, dentro de cabina de flujo laminar, y todo el material usado en este proceso debe estar estéril. Para la transformación se utilizan las bacteriasE. coli JM109, que deben preservarse a 70°C, cada tubo trae 200 μL y se requieren 50 μL por plásmido, adicionalmente se usan 58 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico 50 μL para el control positivo y 50 μL para el control negativo, el tubo o los tubos con las bacterias se colocan en un recipiente con hielo, aproximadamente por 5 min o hasta que se descongelen, se pueden resuspender con pipeta y se debe evitar que las células estén a una temperatura superior de 4°C.Después de descongelar las bacterias, mezclarlas suavemente por inversión, y transferir 50 μL a cada tubo de 1,5 mL estéril, previamente marcados (Control Positivo, Control negativo y los plásmidos). Adicionar 1-50 ng de DNA plasmídico (en un volumen no superior a 10 μL). A los dos tubos controles no se les adiciona nada pero se les realiza todo el procedimiento. Resuspender con la pipeta. Inmediatamente, poner los tubos en hielo por 10 min. Posteriormente se realiza un choque térmico; se transfieren todos los tubos al termicicladora 42°C por 1min. Inmediatamente, colocar todos los tubos en hielo por 2 min.Cuando ya se hayan cumplido los 2 min de incubación, Llevar el volumen a 1 mL con medio SOC a 4°C e incubar en baño serológico por 60 min a 37°C con agitación constante. Terminado este periodo, se centrifµga por 30 seg a 5.000 rpm. Se deben retirar 800 μL del sobrenadante con cuidado de no alterar el pellet bacteriano y se resuspende en los 200 μL de medio restantes y se procede a sembrar en cajas de Petri (medio LB sólido con antibiótico o sin antibiótico). La siembra se debe realizar con asa de vidrio triangular. Incubar a 37°C hasta por 16 h. Las colonias transformadas con el plásmido (colonias que crecen en medio LB sólido con ampicilina 100 μg/mL) se deben repicar antes de las 16 h posterior al procedimiento de siembra e incubación de las cajas. Para repicar las colonias, se toma una colonia con el asa metálica y se siembra por aislamiento en caja de Petri con medio LB sólido con ampicilina 100 μg/mL. Incubar a 37°C por 12-14 h. También se deben repicar los controles para probar el estado de los medios, las bacterias E. coli JM109 sin transformar no deben crecer en medio LB con ampicilina 100 μg/mL. En este punto, se debe tomar una colonia para comprobar la inserción del plásmido por medio de toothpick. Una vez realizada la comprobación de la transformación, se ponen a crecer las bacterias control en Erlenmeyers de 250 mL control en 200 mL de medio con y sin antibiótico y las bacterias transformadas en 200 mL de medio líquido con ampicilina 100 μg/mL, en agitación constante a 37°C, durante 16 – 21 h (crecer toda la noche), hasta una DO600 = 2-4. Al finalizar esta incubación, se centrifµgan las bacterias transformadas 6-7 min a 4.600 rpm y se resuspende el pellet en medio de congelación. El pellet obtenido en 200 mL de medio se resuspende en 2 mL de medio de congelación. Luego se hacen alícuotas de 200 μL en criotubos estériles y se almacenan a -70°C, con el propósito de mantener un stock de células transformadas. Toothpick El toothpick es un método que permite comprobar de manera rápida la inserción del plásmido después del procedimiento de transformación. Además permite estimar el tamaño del plásmido insertado realizando una electroforesis en gel de agarosa. Se toma con un asa metálica recta estéril una de las colonias bacterianas que haya crecido en medio LB sólido con ampicilina 100 µg/mL y se transfiere a un tubo estéril de 200 µL que contenga 50 μL de una solución estéril 10 mM EDTA, pH 8.0. Se debe usar un tubo por cada colonia transferida. También se debe transferir una colonia de E. coli JM109 sin transformar como control. Anexos 59 A cada tubo con la respectiva colonia adicionar 50 μL de la solución NSS fresca. Se tapa el tubo y se mezcla con vortex por 30 seg. Acto seguido, se transfieren los tubos a un baño serológico a 70°C y se incuban por 5 min y luego se enfrian a temperatura ambiente. Una vez enfriados, a cada tubo se le adicionan 1,5 μL de una solución 4 M de KCl y se mezcla con vortex por 30 seg.Se procede a enfriar los tubos por 5 min en hielo y luego centrifµgar a máxima velocidad por 3 min a 4°C.El sobrenandante contiene el DNA genómico y plasmídico de las bacterias E. coli JM109, la comprobación se realiza en un gel de agarosa al 0,7 %, teñido con bromuro de etidio u otra sustancia intercalante del DNA, se observa en un transiluminador UV y se realiza el registro fotográfico. EDTA (10 mM, pH 8.0) Para preparar 500 mL de EDTA 10 mM se pesan 1,86 g de EDTA y se disuelven en 400 mL de H2O dd completando a un volumen final de 500 mL, se ajusta el pH a 8,0 con HCl y/o NaOH y se esteriliza con calor húmedo. Solución NSS Esta solución debe usarse siempre fresca y se debe mantener a temperatura ambiente hasta el momento de su uso, se debe descartar la solución NSS no usada. Esta solución consta de: 0,2 N de NaOH 0,5 % de SDS 20 % de sucrosa KCl (4M) Para preparar 10 mL de KCl (4M), pesar 2,98 g de KCl y disolverlos en H2O dd completando a un volumen final de 10 mL. Purificación de plásmidos recombinantes La purificación de los plásmidos se llevó a cabo con el kit de purificación PureYield TM Plasmid Midiprep System (Promega®, A2495), siguiendo las recomendaciones del fabricante, cuyo protocolo es: Lisis celular 1. Crecer en Erlenmeyers estériles de 250 mL con 200 mL de medio LB líquido con ampicilina 100 µg/mL bacterias E. coli JM109 transformadas con el plásmido recombinante. Se debe incubar a 37°C en agitación constante durante toda la noche (16 h) hasta una O.D.600=2-4. 2. Centrifµgar la suspensión celular a 5.000 rpm por 15 min en tubos cónicos de 50 mL estériles y descartar el sobrenadante. Finalmente, el pellet de los 200 mL de cultivo se resuspende en un solo tubo cónico de 50 mL con 6 mL de la solución de resuspensión celular (Cell Resuspension Solution ®). 3. Adicionar 6 mL de la solución de lisis celular (Cell Lysis Solution ®), mezclar suavemente por inversión el tubo, 3 a 5 veces, e incubar 3 min a temperatura ambiente. Nota: Si se evidencia la formación de precipitados, la solución se debe 60 4. 5. 6. 7. Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico incubar en un baño serológico a 37°C con agitación suave hasta que la solución tenga una apariencia homogénea. Adicionar 10 mL de la solución de neutralización (Neutralization Solution ®) a las células lisadas y mezclar por inversión el tubo, 5 a 10 veces. Centrifµgar el lisado a 5.000 rpm por 30 min. Realizar el montaje de la bomba de vacío, el manifold y las columnas. Las columnas de limpieza son azules y las columnas de unión al DNA plasmídico son de color blanco. La columna azul se inserta sobre la columna blanca y la columna blanca se acopla a una de las entradas del manifold y éste a su vez va conectado a la bomba de vacío. El vacío debe ser suave para evitar que la membrana se separe de la columna. El sobrenadante obtenido se filtrapor medio de la columna azul. Aplicar vacío y esperar que todo el líquido pase a través de las dos columnas. El DNA se une a la membrana de la columna blanca. Cuando haya pasado toda la solución se cierra la llave. Lavado 1. Retirar la columna azul y adicionar 5 mL de la solución de remoción de endotoxinas (Endotoxin Removal Wash) a la columna que contiene la membrana, aplicar vacío hasta que pase toda la solución a través de la columna. 2. Adicionar 20 mL de la solución de lavado (Column Wash), aplicar vacío hasta que pase toda la solución. 3. Dejar secar la membrana aplicando vacío por 30 seg a 1 min. La membrana debe estar seca y no tener olor a etanol. 4. Remover la columna blanca del manifold e insertarla en un tubo cónico estéril de 50 mL. Elución 1. En cabina, adicionar 600 μL de agua estéril, libre de nucleasas, sobre la membrana. 2. Centrifµgar a 3.000 rpm por 5 min a 4°C, en una centrifµga de rotor móvil. El tubo no se debe tapar. 3. En cabina, colectar el filtrado del tubo cónico de 50 mL y transferirlo a un tubo de 1,5 mL estéril. 4. Si se desea se puede realizar una segunda elución adicionando nuevamente 600 uL de agua libre de nucleasas sobre la membrana, centrifµgando y colectando el filtrado, como se indica en los pasos 2 y 3. 5. El DNA plasmídico purificado se almacena a en tubos estériles de 1,5 mL a -20°C. Cuantificación del DNA plasmídico La cuantificación del DNA plasmídico se llevo a cabo en el espetrofotómetro NanoDrop (Thermo®) según las especificaciones del equipo. La lectura de cada muestra se realiza a 260 nm y 280 nm, se obtiene la relación 260 nm/280 nm, la cual debe estar en el rango de 1,8 – 2. Además, para comprobar el tamaño del plásmido se realizan geles de agarosa al 0,7%. Anexos 61 ANEXO E. TRANSFECCIÓN DE LAS CÉLULAS CAD Las condiciones de transfección de las células CAD con Lipofectamine® se estandarizaron tras varios ensayos, el protocolo que se presenta se estableció como el óptimo porque con éste se presenta el menor número de células desprendidas y la mayor sobreexpresión de la proteína Parkin, según el análisis por WB. Protocolo de transfección de células CAD Dentro de los experimentos a realizar para el desarrollo de la tesis, era necesario sobreexpresar tanto la versión silvestre como las versiones mutantes de la proteína Parkin. Esto se logró por medio de la transfección, cuyo protocolo para cajas de 6 pozos se describe a continuación. Primero se realiza la siembra de 200.000 células CAD por pozo, en medio D-MEM/F12, sin antibiótico, con 50 ng/mL de selenito de sodio, suplementado con 2% de SFB. Con el propósito de permitir que las células estén bien adheridas en el momento de la transfección la siembra se debe realizar el día anterior, preferiblemente en horas de la tarde, para que al día siguiente las células se encuentren bien adheridas y la confluencia se mantenga en un 80 %, aproximadamente. Al día siguiente de la siembra, se realiza el proceso de transfección, que para cajas de 6 pozos, se estableció bajoel siguiente protocolo: 1. Retirar 1 mL de medio de cada pozo 2. Adicionar 500 μL de medio de diferenciación sin antibiótico 3. La solución de transfección se realizó de la siguiente forma:2 µg de plásmido, y 2 µL de Plus Reagent® se diluyen en OptiMem ® con un volumen final de 500 µL. Agitar suavemente por inversión e incubar por 5 min a temperatura ambiente. 4. Agregar a la solución anterior 5 µL de Lipofectamine LX® y agitar vigorosamente e incubar por 20 min a temperatura ambiente, agitar suavemente cada 5 min. 5. Agregar a cada pozo 500 µL de la solución anterior. A las células sin transfectar se les adiciona 500 µL de OptiMem ®, con el propósito que todos los tratamientos se realicen con un volumen final de 2 mL. En los ensayos de viabilidad se realizó ese mismo procedimiento para cajas de 96 pozos, cambiando los cálculos proporcionalmente de la siguiente manera: se retiran 100 μL de medio del pozo y se adicionan 50 μL de medio de diferenciación. Para cada pozo se hace el cálculo de 0,2 μg de plásmido y 0,2 μL de Plus Reagent ® y se diluyen en OptiMem® para un volumen final de 50 μL. Finalmente a la solución se le adicionan 0,5 μL de Lipofectamine LX®, y se adicionan 50 μL en cada pozo. Con los controles se procede a adicionarles los 50 μL de OptiMem ®, para un volumen final de 200 μL. 62 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico ANEXO F. WESTERN BLOT El Western Blot es una técnica para determinar la cantidad de una proteína específica, e inclusive es tan sensible que permite reconocer una proteína activada por unamodificación covalente como la fosforilación. El WB se basa en la reacción específica entre antígeno-anticuerpo, que es aprovechada para visualizar proteínas en una membrana de nitrocelulosa, usando anticuerpos conjµgados con peroxidasa de rábano y una solución quimioluminiscente. La luz producida se usa para exponer una película fotosensible. Tras el revelado de dicha película, queda impresa en ella la banda correspondiente a la proteína detectada por el anticuerpo específico. El WB es una técnica semicuantitativa, que me permite calcular la cantidad relativa de proteína en comparación con un control experimental usando como patrón, la densidad óptica de la banda resultante en la placa fotosensible. Esta densidad óptica se midió usando el software ImageJ. Soluciones usadas en Western Blot Las soluciones para WB son modificadas con cada protocolo y según las necesidades de cada laboratorio y procedimiento, a continuación se listarán algunas de las soluciones usadas durante este trabajo. Buffer de lisis celular Para este estudio se adquirió Buffer de lisis RIPA (Pierce ® Cat. No. 89900), el cual contiene 25 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% Deoxicolato de Sodio y 0,1% SDS. Cocktail de inhibición enzimático El coktail de inhibición enzimático se usa para impedir la digestión enzimática de las proteínas celulares y/o las modificaciones covalentes una vez ocurrida la lisis. Se requiere entonces usar inhibidores de proteasas y fosfatasas para mantener las proteínas intactas para su estudio. En este caso se adquirieron dos reactivos comerciales: PhosphoStop (Roche®. Cat. No. 04906845001) y cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail (Roche® Cat. No. 04693159001) que inhiben las fosfatasas y proteasas celulares respectivamente. Los cocktails fueron preparados según las especificaciones del fabricante y el protocolo se resume a continuación. Phosphostop: Disolver una tableta en 1mL de ddH20 mediante vortex. Esta solución stock tendrá una concentración de 10X. Conservar a -20 °C. cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail: Disolver una tableta en 1,5 mL de ddH2o. Esta solución tendrá una concentración de 7X. Conservar a -20 °C. Los inhibidores de fosfatasas y proteasas deben ser llevados a una concentración de 1X con Buffer RIPA al momento de realizar la lisis celular. Anexos 63 Buffer de carga El buffer de carga se utiliza con dos objetivos, el primero es desnaturalizar las proteínas para facilitar su migración a través de los geles de poliacrilamida y el segundo es otorgar una clave visual de la migración electroforética usando colorantes como el Azul de Bromofenol, el cual migra en el mismo sentido de las proteínas. Para este estudio se adquirió el Laemmli Sample Buffer (BioRad ®, Cat. No. 161-0737), el cual requiere únicamente que se le agregue 50 uL de 2-Mercaptoetanol por cada 950 uL de Buffer. Las proteínas, previa cuantificacióny normalización, se mezclan con el Buffer Laemmli completo en tubos de 0,2 mL hasta completar 20 uL. La mezcla se calienta a 95 °C por 5 min y posteriormente se enfría en hielo antes de ser sembrada en gel de poliacrilamida. Electroforesis en geles de poliacrilamida Las proteínas desnaturalizadas deben ser separadas según peso molecular. Para esto se recurre a la electroforesis en geles de poliacrilamida, donde las proteínas son sometidas a una corriente eléctrica constante que permitirá separar las proteínas por peso en una matriz de poliacrilamida. Gel de Separación Los geles de separación fueron preparados en un gradiente de poliacrilamida de 6% a 12% haciendo uso del equipo “Model 485 Gradient Former and Mini-PROTEAN 3 MultiCasting Chamber #165-4122” de BIORAD®. Para este se deben preparar dos soluciones que cada una constituirá la mitad del total del volumen de acrilamida necesario para llenar el número de vidrios seleccionado. La solución Light tiene la concentración mínima del gel de gradiente a preparar, en este caso 6%; la solución Heavy tiene la concentración máxima del gel de gradiente a preparar, en este caso 12%. Las soluciones se llevan a los dos compartimentos del Gradient Former, se agrega un magneto al compartimiento Light y se pone sobre una plataforma de agitación. Se ensamblan el número de vidrios requeridos en el Casting Chamber y se conecta al Gradient Former. Se abren las dos llaves del Gradient Former y se verifica la mezcla de ambas soluciones mientras se permite el llenado de la Casting Chamber. Al final se debe agregar 1 mL de Isopropanol a la parte superior de cada uno de los geles para nivelar y se permite la polimerización durante una hora. Gel de concentración A continuación se describe la mezcla a realizar para concentración: Gel de concentración Mezcla 30% acrilamida:bisacrilamida 0,5 M TRIS-HCl/0,4 % SDS pH 6.8 (*) Solución SDS al 10 % p/v (**) H2O dd Solución de APS (persulfato de amonio) al 10% p/v (***) TEMED preparar dos geles de Volumen 830 μL 630 μL 50 μL 3,4 mL 50 μL 10 μL El APS y el TEMED se deben agregar de últimos a la solución ya que son los catalizadores de la reacción de polimerización. Se mezcla con mucha suavidad para 64 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico evitar la re-oxigenación de la acrilamida, se sirven con pipeta sobre el gel de separación ya preparado y se coloca la peinilla antes de la polimerización del gel. Después de la polimerización la cual toma aproximadamente 20-30 minutos, se retira la peinilla y se lavan los pozos con agua corriente para retirar cualquier residuo de acrilamida. (*) Para 100 mL de la solución 0,5 M TRIS-HCl/0,4% SDS pH 6,8: Se pesan 6,05 g de TRIS base, 0,4 g de SDS, se disuelven en 70 mL de dd H2O, se ajusta a pH 6,8 con HCl concentrado y se completa con H2O dd hasta 100 mL y se mantiene a 4°C hasta el momento de su uso. (**) Para 50 mL de SDS al 10% p/v se pesan 5 g de SDS y se diluyen en H2O dd hasta completar 50 mL de disolución. (***) Para 500 μL de solución de APS al 10% p/v se pesan 50 mg de APS en un vial de 1,5 mL y se le adicionan 500 μL de dd H2O (esta solución debe prepararse en el momento de su uso y se debe sellar bien dado que es higroscópica y con el paso del tiempo se altera su concentración). Buffer de corrido 10X Para preparar 1 L de este buffer se pesan y disuelven en 800 mL de H2O dd los siguientes compuestos: Buffer de corrido TRIS base 22,7 g Glicina 141,13 g SDS 10 g Concentración final 10X (188 mM) (188 mM) (0,1 % p/v) Luego se lleva a volumen final 1.000 mL con ddH2O en un balón aforado y se conserva refrigerado a 4°C. Buffer de corrido 1X Al momento del uso, la solución 10X se diluye hasta llegar a una concentración de 1X. La cámara MiniProtean II requiere aproximadamente 500 mL de Buffer de Corrido 1X. Buffer de transferencia 10X Para prepara 1 L de este buffer se pesan y disuelven en 800 mL de H2O dd los siguientes compuestos: Buffer de Transferencia Tris Base 30,4 g Glicina 140,4 g Concentración final 10X (250 mM) (1,87 M) Luego se lleva a volumen final 1.000 mL con ddH2O en un balón aforado y se conserva refrigerado a 4oC. Anexos 65 Buffer de transferencia 1X Para preparar el buffer de transferencia 1X se requiere una probeta de 1.000 mL en la cual se adicionan 100 mL del buffer de transferencia 10X y se le agrega 200 mL de metanol y 700 mL de ddH2O. Buffer de lavado: TRIS Buffer Salino (TBS) 10X Para preparar 1 L de este buffer se pesan y disuelven en 800 mL de ddH2O los siguientes compuestos: TRIS Buffer Salino TRIS base 24,23 g NaCl 80,10 g Concentración final 10X (200 mM) (1370 mM) Luego se lleva a volumen final 1.000 mL en un balón aforado, se ajusta el pH a 7,6 con HCl concentrado y se conserva refrigerado a 4oC. Buffer de lavado: TRIS Buffer Salino-Tween (TBS-T) 1X Para preparar 1 L se toman 100 mL de TBS 10X, se le adiciona 1 mL de Tween-20 (para una concentración final de 0,1% v/v) y se completa a un volumen de 1.000 mL con dd H2O en un balón aforado o en una probeta. Buffer de bloqueo Al momento del uso se preparan 250 mL de esta solución, para lo cual se pesan 12,5 g de leche descremada (para una concentración final de 5% p/v) y se disuelven en 200 mL de TBS-T 1X, se agita fuertemente para la disolución total y se completa con TBS-T 1X hasta 250 mL. Anticuerpo primario Los anticuerpos primarios son los encargados de reconocer el epítope en estudio. Para este estudio se usaron anticuerpos comerciales y anticuerpos que fueron donados por sus creadores. Las membranas de nitrocelulosa cargadas con las proteínas totales serán expuestas a estos anticuerpos diluidos en buffer de bloqueo durante toda la noche a 4°C o durante 2 horas a temperatura ambiente. Las diluciones de los anticuerpos se deben determinar experimentalmente y a continuación se resumen las diluciones realizadas con cada anticuerpo en un total de 3 mL de buffer de bloqueo. Anticuerpo Anti-Parkin PRK8 (Monoclonal, Ratón, Santa Cruz 32282) Anti-AKT-p Ser472 (Monoclonal, Conejo, Cell signaling 4060) Anti-β-actina (Monoclonal, conjµgado con HRPMillipore 1501) Dilución 1:500 1:1000 1:10.000 66 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico Anticuerpo secundario Los anticuerpos secundarios son los que van a reconocer la fracción Fc de los anticuerpos primarios que ya se encuentran unidos al epítope en estudio. Estos anticuerpos también son diluidos en buffer de bloqueo y generalmente se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora, aunque la incubación durante toda la noche a 4°C también genera buenos resultados. Anticuerpo Anti-rabbit IgG HRP-linked (Cell signaling, 7074) Anti-mouse IgG HRP-linked (Cell signaling, 7076) Dilución 1:2.000 1:2.000 Extracción de proteína Para la extracción total de proteína se utilizan tres elementos mencionados anteriormente en este texto: Buffer RIPA, Inhibidores de Proteasas e Inhibidores de Fosfatasas; los dos últimos tienen que ser preparados previamente según las indicaciones del proveedor. (Ver protocolo anexo). Para obtener una cantidad considerable de proteína se recomienda sembrar las células en placas de 6 pozos. Una vez finalizados los tratamientos, se retira el medio de cultivo por aspiración excepto en el caso de tener un experimento en el cual se genere muerte celular, donde el sobrenadante debe ser recuperado y centrifµgado para obtener la células desprendidas. Posteriormente se realiza el cálculo del total de Buffer de Lisis suplementado que se va a requerir en la totalidad de las cajas a lisar de la siguiente manera: Se requieren 60 uL de buffer de lisis suplementado por cada pozo a lisar. Entonces se multiplica el número de pozos totales por 60 uL y se suma un 10% del volumen por posible error al volumen total de buffer de lisis suplementado. Este volumen total contiene Cocktail Inhibidor de Fosfatasas, cuya concentración stock es a 10X; Cocktail inhibidor de proteasas, cuya concentración es 7X; Buffer RIPA como solvente. Entonces los cálculos para preparar el buffer suplementado serían: 10% Cocktail inhibidor de Proteasas 14,3% Cocktail Inhibidor de Fosfatasas 75,7% Buffer RIPA Una vez preparado el total de buffer de lisis suplementado a usar, se añade 60 uL a cada pozo y se procede a hacer lisar las células frotando un “cell scrapper” contra el piso y las paredes del pozo en presencia del buffer de lisis suplementado. Una vez se han lisado la totalidad de células, esta solución es transferida a un tubo de centrífµga de 1,5 mL. El lisado debe ser sometido a vortex por periodos de 5 minutos durante 20 minutos, interrumpidos por colocación en hielo para evitar el calentamiento de la muestra. Si se tiene acceso a un procesador ultrasónico, se debe sonicar la muestra haciendo tres pulsos de 5 segundos con la muestra sobre hielo. Las muestras de proteína deben ser conservadas a -20 °C si se van a usar pronto, o a -70 °C si se van a almacenar por periodos prolongados. Determinación de la concentración de proteína Para asegurar la normalización de los valores en el WB se requiere la cuantificación de la proteína total de cada muestra de los lisados celulares. En este estudio se realizó por el método del ácido bicinconínico (BCA), método bastante sensible y con pocas interferencias debidas a detergentes. El ácido bicinconínico es un compuesto capaz de Anexos 67 formar un complejo de color púrpura que resulta de la quelación de dos moléculas de BCA con un ión cuproso. Los iones cuprosos provienen de la reducción de iones cúpricos por las proteínas en un medio con pH elevado. La intensidad del color purpura es proporcional a la cantidad de proteína total en la muestra, de tal manera que se puede cuantificar en un espectrofotómetro y compararse con muestras patrón para posteriormente extrapolar los valores de absorbencia mediante una regresión lineal. Paraeste ensayo se empleó la relación reactivo: muestra (20:1). El kit BCA de PIERCE ® (Cat. No. 23227) contiene dos soluciones: A y B que deben ser mezcladas en una relación 50:1|. Se realizó una curva de calibración con 6 soluciones patrón de trabajo de distinta concentración de albúmina sérica bovina (BSA), desde 0,20 mg/mL hasta 10 mg/mL Una vez realizada la mezcla de reactivos de BCA, se sirven 40 μL de la mezcla y 2 μL de cada muestra o de los patrones, esto se realiza en tubos para PCR, luego los tubos se incuban a 37°C en una incubadora o termociclador durante 30 minutos, al cabo de los cuales se realiza la medición de absorbencia, en este caso se usó el espectrofotómetro de fibra óptica NanoDrop (Thermo ®). Los valores de las muestras son comparados con la línea obtenida de los valores obtenidos de la curva estándar y la concentración de las muestras es obtenida mediante extrapolación hacia el eje X mediante regresión lineal. Transferencia a membranas de nitrocelulosa Luego de la electroforesis, se desmonta la cámara y se retira el gel de concentración. Los geles de separación junto con los materiales usados en la transferencia (papel de nitrocelulosa, esponjas y papel filtro) se equilibran en buffer de transferencia 1X durante 30 min.La transferencia se realiza a 100 voltios, 300 mA durante 90 min. Dentro de la cámara se coloca un bloque de hielo y un agitador magnético para mantener frío el sistema y asegurar la recirculación del buffer de transferencia 1X. Detección de proteínas Luego de la transferencia, las membranas se saturan en buffer de bloqueo 10 % durante 45 min y se incuban con el anticuerpo primario durante toda la noche a 4 oC en un rotador de tubos. Al cabo de este tiempo se realizan 3 lavados de 15 min cada uno, en buffer de lavado TBS 1X y se realiza incubación con el anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Luego las membranas se lavan nuevamente 3 veces con buffer de lavado TBS 1X, y se procede a detectar las proteínas de interés usando el kit de quimioluminiscencia ECL Amersham® siguiendo las instrucciones del fabricante, para ser expuestas en oscuridad a la película de revelado durante 15 min en el caso de Parkin, 10 min para el p-Akt y laβ-Actina. Una vez cumplido el tiempo de exposición se revelan en el equipoKonica® Medical Film Processor. El análisis de las bandas se hace digitalizando la imagen de la película de revelado y realizando el análisis densitométrico con ImageJ. Limpieza de membranas luego de western blot para re-análisis Para realizar un re-análisis de las membranas se debe lavar la membrana dos veces en PBS-Tween 0.2 % o en TBS Tween 2 % antes de la limpieza de los anticuerpos. Posterior a los lavados, colocar las membranas en 50 mL de buffer de limpieza en un contenedor sellado.Se sumerge parcialmente el contenedor en baño serológico a 50 °C por 15 min, agitando ocasionalmente.Luego de la limpieza, volver a lavar las membranas 68 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico 3 o 4 veces con PBS-Tween 0.2 % o en TBS Tween 2 %. Acto seguido, se bloquea en buffer de bloqueo 5 % y se continua con el WB normalmente. En lo posible, utilizar un anticuerpo secundario diferente la segunda vez que se pruebe. Buffer de limpieza El buffer de limpieza se prepara con la siguiente fórmula: Componente SDS 10% TRIS 1 M, pH 6,8 β-mercaptoetanol H2O dd Volumen final Volumen 10mL 3,125 mL 0,353 mL 36,5 mL 50 mL Concentración Final 2% SDS 62,5 mM TRIS, pH 6,8 100 mM β-mercaptoetanol Anexos 69 ANEXO G. CONSIDERACIONES ÉTICAS En el desarrollo del presente proyecto no se usóningún animalni se ejecutó experimentación en humanos. El trabajo se realizó enteramente sobre líneas celulares desarrolladas en laboratorio, sin mediar otros tipos de modelo. Por otra parte, todos los elementos que se usaron en el desarrollo del proyecto, fueron manejados de manera apropiada según las disposiciones legales del país, teniendo en cuenta su posible inactivación y clasificación a la hora de desecharlos. Asimismo, los investigadores cumplieron con todas las normas de bioseguridad para trabajo con material biológico, como el uso de guantes, tapabocas y bata entre otros. No hay ningún tipo de conflicto de interés en la realización del presente proyecto, ya que no contempla el uso de ningún producto farmacéutico para uso humano; no hubo financiación externa, y la totalidad de los recursos para la investigación fueron otorgados por la División de Investigaciones de la sede de Bogotá de Universidad Nacional de Colombia. 70 Análisis del efecto neuroprotector del gen Parkin y su relación con la vía PI3K/AKT en un contexto neurotóxico ANEXO H. PROPIEDAD INTELECTUAL Durante el curso del proyecto es posible que el trabajo escrito en forma de artículos, reportes, tesis de pre y post grado puedan contener material original que podrían representar potencialmente nuevos descubrimientos. Es la responsabilidad de la Universidad Nacional de Colombia, cuando lo considere apropiado, proteger los derechos que surgen de los resultados del proyecto. Los derechos de explotación del proyecto son propiedad del Universidad Nacional de Colombia, a menos que exista un acuerdo específico de forma contraria. Sin embargo, la Universidad Nacional de Colombia reconoce la posición de los investigadores, co-investigadores y estudiantes cuyo trabajo genere beneficios económicos, y normalmente llega a un acuerdo con las personas que participan en tal beneficio, en reconocimiento a su contribución. Bibliografía (1) Barzilai A, Melamed E. Molecular mechanisms of selective dopaminergic neuronal death in Parkinson's disease. Trends Mol Med 2003 Mar;9(3):126-32. (2) Gelb DJ, Oliver E, Gilman S. Diagnostic criteria for Parkinson disease. Arch Neurol 1999 Jan;56(1):33-9. (3) Pollanen MS, Dickson DW, Bergeron C. Pathology and biology of the Lewy body. J Neuropathol Exp Neurol 1993 May;52(3):183-91. (4) Forno LS. Neuropathology of Parkinson's disease. J Neuropathol Exp Neurol 1996 Mar;55(3):259-72. (5) Langston JW. 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