IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE Rhizoctonia spp. AISLADAS

IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE Rhizoctonia spp. AISLADAS CON TRAMPAS DE
PLÁNTULAS DE SOJA
M. Ferri1, D. Ruberti1, F. Biffis3, M. Scandiani*1,2
1Laboratorio Agrícola Río Paraná. 2 CEREMIC. 3 Syngenta Agro S.A
Ruíz Moreno 225, San Pedro, 2930, Buenos Aires, Argentina, Teléfono 54-3329-423511
[email protected]
Palabras claves: soja, enfermedades radiculares, patógeno de suelo, emergencia, planta
adulta
Introducción
Entre los patógenos que causan damping-off y podredumbre de raíces en plantas de soja en
Argentina, uno de los más frecuentemente citados es Rhizoctonia.
R. solani es un hongo habitante del suelo, capaz de infectar diferentes hospedantes, entre
ellos soja (Yang 1999), otras Fabáceas como alfalfa, arveja, garbanzo, lenteja, poroto, y
Poáeceas como trigo, cebada y maíz (Sumner 1999, Wiese 1991).
Para diferenciar las especies dentro del género Rhizoctonia, se toma en cuenta la
morfología de las hifas, estructura septada que constituye el micelio del hongo. En base a
esta característica, se encuentran las que presentan hifas multinucleadas, Rhizoctonia sp.
(teleomorfo Thanatephorus sp., Waitea sp., y las binucleadas, Rhizoctonia sp. (teleomorfo
Ceratobasium sp., Tullasnella sp.). Los aislamientos de Rhizoctonia solani se clasifican en
“grupos de anastomosis” (GA), en base a la fusión de las hifas. Algunos grupos luego se
diferencian en subgrupos. Estos grupos también pueden ser identificados en base a
diferencias genéticas por RFLP del ADN ribosomal (Yang 2004), rsARN (Burns 2009), etc.
En soja, a nivel mundial, se ha citado como causante de podredumbre de raíces,
principalmente R. solani AG-4, sin embargo, los grupos AG-2-2, AG-5, AG-7, AG-1 y AG-3,
también han sido mencionados, todos correspondientes al teleomorfo Thanatephorus sp. R.
solani AG-1 es causante del tizón foliar (Yang 1999). En trigo se han reportado R. solani AG8 como causante de podredumbre de raíces en manchones, y R. cerealis (teleomorfo
Ceratobasium sp.), causante de la mancha ocular. De raíces de trigo también se han aislado
otros GA como AG2, 2-2, 4, 5, 9 y 10 y R. oryzae (teleomorfo Waitea sp.) (Paulitz 2010). En
maíz, R. solani AG-2 tipo 2 III B causaría podredumbres de raíces (Sumner 1999).
Las plantas de soja son susceptibles a las podredumbres radiculares causadas por
patógenos de suelo durante todas las etapas de su desarrollo. Su presencia predomina en
dos momentos: emergencia hasta V2 y planta adulta, principalmente después de floración.
Las fallas en la implantación del cultivo ocurren por damping-off de preemergencia causado
por la podredumbre de la semilla y por la muerte de plántulas en postemergencia, con una
distribución de plantas aisladas o en grupos de 4 a 5, causando mayores pérdidas
económicas cuanto más elevado es la reducción del stand (Mitidieri et al 1987). Cuando las
plántulas sobreviven a los ataques queda la infección latente que será la fuente de inóculo
para la infección de las plantas adultas (Ploper et al 2009).
Los primeros síntomas de R. solani se manifiestan por lesiones corticales color castaño
rojizo sobre el hipocótilo (cancros), la raíz principal y las raíces secundarias. En la zona basal
se pueden observar hifas gruesas marrones y pequeños esclerocios amorfos color marrón
adheridos a las partículas de suelo. En plantas adultas causa marchitamiento en rodales. Las
condiciones ambientales que predisponen un ataque de R. solani son suelos con
fluctuaciones en la humedad y temperatura cálida. Generalmente, su ataque se encuentra
asociado a otros patógenos, como Fusarium sp. y Macrophomina phaseolina, entre otros.
-1Producción Vegetal: Enfermedades
En Argentina, se ha citado al patógeno indistintamente como Rhizoctonia sp. y R. solani,
en soja, trigo, maíz, poroto, garbanzo, pero poco se sabe sobre la identificación correcta del
mismo. Stegman et al (1989) reportó la presencia de aislamientos obtenidos de plantas de
soja dentro del GA AG4. El conocimiento de la identidad del patógeno permite realizar
estudios sobre su distribución, rango de hospedantes, control químico y biológico mediante
tratamientos de semillas, comportamiento genético de los genotipos de soja, y establecer
estrategias de manejo adecuadas.
En el presente trabajo se informa el aislamiento e identificación de cultivos de Rhizoctonia
obtenidos de muestras de suelo de lotes con historia de soja.
Materiales y Métodos
Obtención de los aislamientos
Se realizaron aislamientos de muestras de suelo de lotes del centro-oeste de Buenos Aires,
Santa Fe y Entre Ríos, con historia de soja y trigo. Las muestras se tomaron en las
localidades ubicadas en la provincia de Buenos Aires: Bragado, Balcarce, Tandil, General
Pinto, General Villegas, Junín, Lincoln, 9 de Julio, Rojas, Pergamino, de la Pcia. de Santa Fe:
Firmat, Maciel, Cavanagh, y de Paraná, Entre Ríos. Se realizaron aislamientos de plantas de
soja con damping-off de postemergencia empleadas como cultivo trampa, por la metodología
fitopatológica clásica.
Identificación
Se seleccionaron 20 aislamientos, que fueron cultivados durante 10 días en placas de Petri
conteniendo agar papa glucosa más el agregado de estreptomicina, a 25ºC y oscuridad. Los
cultivos puros obtenidos y ya crecidos fueron derivados al INDEAR (www.indear.com) para la
extracción del ADN. Los ADN se extrajeron con el protocolo CTAB, se purificó con
fenol/cloroformo, isopropanol, etanol 70% y se resuspendió con H2O mq. La concentración de
ADN se midió por duplicado con el quan-it-picogreen (INVITROGEN) con fluorómetro de alta
precisión. Los ADN, contenidos en tubos eppendorf, fueron enviados congelados a EpiLogic
GMBH (www.epigene.de), para la identificación mediante secuenciación del rADN-ITS1,
empleando pirosecuenciación.
Pruebas de patogenicidad
El ensayo se realizó en invernáculo, utilizando soja de 95% de poder germinativo. Como
inóculo se utilizó la cepa de Rhizoctonia sp. nº 16, aislada de plántulas de soja con síntomas
de damping-off. El inóculo fue cultivado en una mezcla de Czapek Dox - vermiculita - salvado
de trigo, que fue inoculado al 0,8% en sustrato para viveros Grow Mix. Se sembraron 4
repeticiones por tratamiento, con patógeno y sin patógeno, con 1 maceta con 20 semillas por
repetición, distribuidas en un DCBA. La incubación se realizó a 25ºC, 12 hs. de fotoperíodo,
sin restricción hídrica, durante 21días.
Se registró el porcentaje de emergencia de plántulas en dos momentos y el porcentaje de
plántulas de mayor vigor. Al momento de cosecha se evaluó la incidencia de plántulas
infectadas con presencia de cancros, y el peso seco por planta. Los registros obtenidos para
cada una de las variables fueron analizados con ANOVA y las medias de tratamientos se
compararon con la prueba DMS al 5%.
Resultados y Conclusiones
Se obtuvieron 20 aislamientos y sólo en ese número, se determinó una amplia diversidad,
no solamente en GA, sino también en el número de núcleos. Se identificaron 14 aislamientos
de Rhizoctonia multinucleadas, correspondientes a los AG 8, AG 3-TB, AG 9, AG 4-HGI, y
-2Producción Vegetal: Enfermedades
AG 6-GV2. Dos aislamientos de Rhizoctonia binucleadas se identificaron como
correspondientes a AG-Fb y AG-A. Cuatro cepas no pudieron ser identificadas, por escaso
material, deficiencias en el patrón de secuencias o baja homología.
Se han reportado trabajos sobre pruebas de patogenicidad y control químico de R. solani
AG4 mediante el tratamiento químico de la semilla de soja con fungicidas (Scandiani &
Mitidieri 1989, Scandiani & Ruberti 1999), y sin especificarse el GA (Baigorri 1989).
En este trabajo se informa por primera vez la presencia y patogenicidad sobre plantas de
soja de Rhizoctonia sp. GA-Fb, correspondiente a los teleomorfos Ceratobasidium sp. y
Tulasnella sp. (Tabla 2).
Estos resultados indican de la necesidad de realizar estudios sobre Rhizoctonia sp.
mediante el relevamiento y desarrollo de métodos de identificación confiables.
Tabla 1. Aislamientos, origen geográfico, concentración de ADN obtenida, e identificación en grupos de
anastomosis de Rhizoctonia sp.
Aislamiento
Origen
Concentración
(ng/µl-picogreen)
Masa total
(µg/190 µl água
1
Balcarce
6,153
1,16907
2
Tandil
18,740
3,5606
3
Tandil
14,575
2,76925
5
Firmat
13,48
2,5612
7
Cavanagh
7,985
1,51715
8
Azul
4,971
0,94449
9
Azul
41,05
7,7995
10
Azul
27,19
5,1661
11
Azul
30,05
5,7095
12
Azul
12,45
2,3655
13
Pergamino
9,395
1,78505
14
Paraná
34,065
6,47235
15
Paraná
15,94
3,0286
16
Pergamino
13,91
2,6429
17
Rojas
17,8
3,382
13,775
2,611725
18
19
Maciel
20,17
3,8323
20
Maciel
5,875
1,11625
21
Maciel
19,705
3,74395
GA
MNR/BNR
MNR AG8
*
MNR AG
3-TB
MNR AG
9
MNR AG
8
MNR AG
3-TB
MNR AG
3-TB
MNR AG
6GV2 *
MNR AG
4-HGI
MNR AG
6GV2 *
MNR AG
8
MNR AG
8
BNR AGFb
BNR AGA
MNR AG
4-HGI
MNR AG
4-HGI
MNR AG
4-HGI
Identificación
Bases
%
57/70
81
73/77
95
75/79
05
71/79
90
75/75
100
75/78
96
60/71
85
60/65
92
27/34
79
74/77
96
73/74
99
66/69
96
65/66
98
48/51
94
57/58
98
57/60
95
MNR: multinucleadas; BNR, binucleadas. (-) falta de material, deficiencias en el patrón de secuencias o baja
homología.
-3Producción Vegetal: Enfermedades
Tabla 2. Porcentaje de plántulas emergidas, plántulas más vigoras y plántulas con cancros, y el peso de
plántulas en soja, en terrinas infestadas con Rhizoctonia sp.
Peso seco/planta
(g)
Plántulas (%)
Tratamientos
A los 10 d
1- Con patógeno
2- Sin patógeno
CV (%)
53,09 b
88,74 a
5,40
A los 21 d
55,67 b
87,48 a
4,24
De mayor
vigor
46,16 b
84,96 a
5,80
Con
cancros
basales
60,39 a
0,00 b
19,52
Parte
aérea
Raíz
0,49 b
0,56 a
10,92
0,14 a
0,13 a
12,27
Letras iguales en cada columna indican diferencias no significativas según DMS al 5%.
Agradecimientos
A todos los técnicos de Syngenta que participaron del muestreo. Este trabajo se realizó con
el apoyo económico de Syngenta Agro S.A.
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-4Producción Vegetal: Enfermedades