Módulos de Unión a Carbohidratos como Plataformas de Evolución.

Módulos de Unión a Carbohidratos como Plataformas de Evolución.
Armenta-Jaime Silvia, y Rodríguez-Sanoja Romina*.
Departamento de Biología Molecular y Biotecnología. Instituto de Investigaciones
Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México. México D.F. 04510. Email: [email protected]
RESUMEN
Los módulos de unión a carbohidratos (CBM, Carbohydrate-Binding Module) son
proteínas especializadas en el reconocimiento de azúcares, estos módulos pueden estar
asociados a enzimas multimodulares como las glucósido-hidrolasas u otras enzimas
relacionadas con el metabolismo, reconocimiento y transporte de carbohidratos. Con base en
su
secuencia
y
similitudes
(http://www.cazy.com).
en
el
plegamiento,
se
clasifican
en
68
familias
En todas estas proteínas la interacción CBM-carbohidrato está
mediada por interacciones hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, donde los aminoácidos
aromáticos participan de forma relevante en el reconocimiento. Sin embargo, esta información
no explica la especificidad y selectividad de estos dominios hacia los diferentes sustratos. Una
opción para generar información relevante acerca de las bases moleculares que rigen el
reconocimiento es la generación de diversidad en los dominios de unión a través de la
ingeniería de proteínas. En este trabajo se revisa la principal estrategia utilizada en la
diversificación de estos módulos para entender y optimizar su especificidad y afinidad,
potenciando sus aplicaciones para la industria y la investigación.
Palabras clave: Módulos de unión a carbohidratos, ingeniería de proteínas, interacción
proteína-carbohidrato.
ABSTRACT
The carbohydrate-binding modules (CBM) are specialized proteins in the
recognition of sugars, these modules can be associated with multimodular enzymes
such as glycoside hydrolases and other enzymes related to metabolism, transport and
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
12
recognition of carbohydrate molecules. Based on sequence and folding similarities,
they are classified into 68 families. In all these proteins CBM-carbohydrate interaction
is mediated by hydrophobic interactions and hydrogen bonds, where the aromatic
amino acids play the most relevant role in recognition. However, this information does
not explain how these domains recognize and bond specific carbohydrates. One
alternative to generate relevant information about the molecular basis of recognition is
the generation of diversity in the binding domains by protein engineering. In this paper,
we review the strategy used to diversify these modules to understand and optimize
their specificity and affinity to carbohydrates, enhancing their applications for industry
and research.
Key words: Carbohydrate binding module, protein engineering, CBM-carbohydrate
interaction.
INTRODUCCIÓN
La
interacción
proteína-carbohidrato
como las glucósido-hidrolasas u otras
regula muchos procesos biológicos; como
enzimas relacionadas con el metabolismo
el reconocimiento celular, el metabolismo
de carbohidratos. Funcionalmente estos
primario de carbono, la respuesta del
dominios permiten la interacción entre los
sistema
de
sustratos, generalmente poco accesibles o
procesos
insolubles, con el sitio activo del dominio
inmune,
señalización
los
celular
mecanismos
y
los
patológicos. Tal diversidad de funciones
catalítico
de
las
enzimas
sugiere que el reconocimiento ocurre por
Sanoja et al., 2005).
(Rodríguez-
diversos mecanismos que justifican la
Los CBMs están agrupados en 68
selectividad de carbohidratos dentro de
familias (http://www.cazy.org), que incluyen
matrices tan complejas como son el
dominios
glucocálix o la pared celular de plantas,
prácticamente
hongos y bacterias.
existentes
de
en
reconocimiento
todos
la
los
para
carbohidratos
naturaleza;
desde
Existen proteínas especializadas en el
polisacáridos estructurales y de reserva,
reconocimiento de carbohidratos, como los
hasta factores de virulencia (Guillén et al.,
módulos de unión a carbohidratos (CBM,
2010). Muchas de estas familias tiene la
Carbohydrate-Binding Module) que pueden
capacidad de reconocer inequívocamente
estar asociados a enzimas multimodulares
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
13
un ligando específico; por ejemplo, las
las condiciones más parecidas a las
familias CBM1, CBM3a, CBM5 y CBM10
naturales.
sólo reconocen celulosa (Boraston et al.,
Una opción es conocer el efecto que
2004), mientras que las familias CBM4,
pueden tener mutaciones en residuos
CBM6, CBM15, CBM22, CBM35 y CBM36
específicos,
reconocen principalmente xilano (cadenas
importancia por estudios estructurales en
de D-xylose unidas por enlaces b-1,4) pero
presencia de sustratos solubles (Czjzek et
también se unen a b-1,4-glucano, b-1,3-
al., 2001; Boraston et al., 2006; van Bueren
glucano,
et al., 2007; Gregg et al., 2008; Cid et al.,
manano,
sustituidos,
como
y
el
xiloligosacáridos
xiloglucano
y
arabinoglucano (McCartney et al., 2006).
unión
de
estos
dominios
y
han
demostrado
su
2010). Extender esta idea sería llevarla a la
mutagenesis simultánea y al azar de varios
Es difícil explicar la diversa capacidad
de
que
residuos de aminoácidos simulando el
su
proceso de evolución. Por lo que en este
promiscuidad, puesto que la interacción
trabajo se muestra como los dominios de
entre el glucósido y el sitio de unión de la
unión
proteína ocurre a través de un mecanismo
utilizados como una base o plataforma
en común, el cual depende principialmente
evolutiva para entender la especificidad y
de la complementariedad, orientación y
selectividad de estos dominios por sus
conformación de aminoácidos aromáticos,
sustratos.
a
carbohidratos
pueden
ser
mismos que interaccionan por fuerza de
van der Waals con los carbohidratos.
CONSTRUCCIÓN
Además, la interacción es estabilizada por
COMBINATORIAS
puentes
de
hidrógeno
entre
DE
BIBLIOTECAS
algunos
En general, la generación de variantes
residuos polares con los grupo hidroxilo
de proteínas puede ser de forma racional o
(-OH) del mismo sustrato (Quiocho, 1989;
combinatoria; en ambas es necesario tener
Bewley et al., 2013).
conocimiento
El estudio de la interacción de los
tridimensional
de
y
de
la
estructura
las
propiedades
dominios de unión a carbohidratos con sus
fisicoquímicas de la proteína de interés. En
sutratos insolubles no es realizable a
la
través de técnicas clásicas de bioquímica
aminoácidos mediante mutagénesis dirigida,
estructural como la cristalografía o el RMN,
lo cual limita el número de variantes que se
por lo que deben buscarse alternativas que
pueden obtener. Por otro lado, en la
permitan aproximarse a estos sistemas en
estrategia combinatoria, la secuencia y
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
primera
se
modifican
algunos
14
estructura
sometida
a
diversidad en una proteína (Gunnarsson et
generándose
un
al., 2004; Binz et al., 2005). La figura 1
amplio repertorio de variantes que, a través
ejemplifica el proceso a seguir para la
de un riguroso proceso de selección,
construcción
permite obtener proteínas con propiedades
combinatorial de CBMs. El primer paso
bioquímicas novedosas, por lo tanto es la
para construir una biblioteca combinatoria
mutaciones
estrategia
proteica
al
más
es
azar,
usada
para
de
una
biblioteca
generar
Fig. 1. Estrategia experimental para la obtención de variantes de los dominios de fijación al
almidón con características bioquímicas mejoradas.
es elegir el procedimiento metodológico
forma inespecífica dentro del gen que
para mutagenizar (Figura 2). Es posible
codifica para el
introducir
usando condiciones que disminuyan la
mutaciones
aleatorias
en
posiciones de aminoácidos específicos a
fidelidad
través del diseño de oligonucleótidos
polimerasa durante el PCR, técnica
degenerados (Zoller et al., 1987) o bien,
conocida
llevar a cabo mutaciones al azar de
(Caldwell et al., 1992). También es
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de
dominio de interés,
la
como
enzima
TaqDNA
error-prone
PCR
15
posible crear diversidad por recombina-
fácil en comparación con el diseño de
ción de dos o más genes, mediante el
una adecuada estrategia de selección y
método de DNA shuffling (Stemmer,
el
1994). De esta manera, se llegan a
encontrar variantes con características
obtener bibliotecas de miles de millones
optimizadas en función del sistema de
de variantes, lo cual es relativamente
interés.
Oligonucleó9dos$
degenerados$
posterior
Error/prone$PCR$
análisis
requerido
para
DNA$shuffling$
!
Fig. 2. Métodos comúnmente utilizados para generar diversidad durante la construcción de
bibliotecas combinatorias (Stahl et al., 2013).
MÉTODOS PARA LA ELECCIÓN DE
la transformación de la biblioteca de ADN
VARIANTES
en un huésped, por ejemplo: en la
A
PARTIR
DE
UNA
BIBLIOTECA COMBINATORIA
La
selección
modificado
un
fenotipo,
bacteriana (Fuchs et al., 1991; Francisco
relacionada con el sistema de expresión
et al., 1993) o en levaduras (Boder et al.,
de
de
1997) y (2) los sistemas que implican la
despliegue de bibliotecas se pueden
traducción in vitro de proteínas, como en
dividir en dos: (1) sistemas que requieren
el despliegue en
biblioteca.
ingeniería,
McCafferty et al., 1990), en la superficie
está
la
por
de
presentación en fagos (Smith, 1985;
Los
sistemas
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
polisomas/ribosomas
16
(Mattheakis et al., 1994; Hanes et al.,
de
fagos
se
expone
al
ligando
1997) o en mRNA (Nemoto et al., 1997;
inmovilizado sobre un soporte sólido; que
Roberts et al., 1997).
pueden ser columnas para cromatografía
De los anteriores, el despliegue en
(McCafferty et al., 1990), superficies de
fagos o “phage display” fue el primer
polipropileno de placas de 96 pozos
sistema
(Barbas
desarrollado
y
es
el
más
et
al,
1992),
o
partículas
utilizado hasta el momento, en este
paramagnéticas (Hawkins et al., 1992).
sistema las proteínas recombinantes se
Después de un tiempo de incubación
expresan en la superficie de bacterió-
adecuado y sucesivas etapas de lavado
fagos filamentosos como el M13 (Smith,
para eliminar los fagos no unidos; los
1985). La superficie del fago M13 está
fagos que se unen selectivamente son
constituida por cinco proteínas (pIII, pVI,
eluidos. La elución puede llevarse a cabo
pVII, pVIII y pIX) de once codificadas a
por
partir de su genoma. Las proteínas pIII
incubación a pH bajo (Charles-Niño et
(con cinco copias) y pVIII (con aproxima-
al.,
damente 2700 copias) han sido las más
(Gunnarsson et al., 2006). Los fagos
utilizadas para el despliegue de proteínas
eluidos se utilizan para infectar cepas de
recombinantes. El tener menor número
E.
de copias representa encontrar variantes
amplifican para su uso en sucesivos
con mayor afinidad hacia un ligando
ciclos de selección o con fines de
específico, ya que el fenómeno de avidez
identificación y de caracterización.
se
reduce.
Sin
embargo,
una
diversos
2011)
coli
o
con
medios,
la
incluyendo
elución
fenotipo
F’
la
competitiva
donde
se
alta
afiniddad podría no ser siempre el
IDENTIFICACÓN
principal objetivo de la selección, debido
CIÓN DE VARIANTES SELECCIONA-
a
DAS A PARTIR DE BIBLIOTECAS
que
un
despliegue
multivalente
favorece la identificación de variantes
El
El proceso de selección permite aislar,
bajo
proceso
de
bioselección
o
CARACTERIZA-
COMBINATORIAS
raras y/o de baja afinidad (Qi et al.,
2012).
Y
ciertas
condiciones,
diversas
variantes de proteínas con la capacidad
“biopanning”, se basa en la selección por
de
reconocer
ligandos,
afinidad hacia un sustrato o ligando
carbohidratos; sin embargo, es necesario
específico, por ejemplo: polisacáridos u
caracterizarlas
para
conocer
como
sus
oligosacáridos. Típicamente, la biblioteca
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
17
propiedades bioquímicas. Los ensayos
de
ELISA
Linked
sujetas a procesos de evolución in vitro
Immunosorbent Assay) son una forma
como “protein scaffolds”. Algunas de las
rápida
obtener
características indispensables para que
información acerca de la especificidad y
una proteína pueda ser utilizada como
afinidad de las variantes seleccionada
una
(McCafferty et al., 1990; Mattheakis et
presentar una estructura estable con
al., 1994). En esta metodología los
regiones o loops expuestos al solvente
sobrenadantes de fagos recombinantes
relacionados con la funcionalidad de la
seleccionados interaccionan con ligandos
proteína; (2) tener una estructura o core
inmovilizados en la superficie de placas,
bien definido y altamente conservado
donde la detección se realiza a través de
entre los diferentes miembros de una
anticuerpos
familia de proteínas; así como, (3) tener
y
enzimas
(Enzyme
No todas las proteínas pueden ser
específica
de
específicos
como
acoplados
la
a
peroxidasa,
produciendo compuestos que se pueden
monitorear
(McCafferty
midiendo
et
al.,
la
absorbancia
1990),
plataforma
estabilidad
evolutiva
son:
conformacional
(1)
intrínsica
(Skerra, 2000a).
Hasta el momento se conoce la
usando
estructura de más de 90 000 proteínas
ligandos biotinilados (Malabarba et al.,
(http://www.rcsb.org), de las cuales sólo
2001) o fluorescencia (Starwalt et al.,
se han utilizado, aproximadamente, 50
2003).
como plataformas evolutivas (Binz et al.,
2005;
Gebauer
et
al.,
2009).
Las
PROTEÍNAS COMO PLATAFORMAS
proteínas que han sido utilizadas son
DE EVOLUCIÓN
diversas en tamaño, topología, modo de
El término de plataforma evolutiva o
acción y funcionalidad. Algunos ejemplos
protein scaffold se refiere a utilizar una
notables de proteínas que han funciona-
estructura proteíca como una base o
do como scaffold son la fibronectina tipo
cimiento a la cual se pueden introducir
III (glicoproteínas presentes en la matriz
mutaciones al azar sin comprometer la
extracelular de tejidos animales; Koide et
estabilidad de la proteína, pero sí dando
al., 1998) y las lipocalinas (proteínas
como
las
involucradas en el transporte y almace-
funcionales
namiento de moléculas hidrofóbicas), de
resultado
cambios
propiedades bioquímicas y
en
(Skerra, 2000a).
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
las cuales se ha modificado su afinidad
18
para reconocer una amplia variedad de
altamente conservada, en la cual el sitio
ligandos (Skerra, 2000b).
de unión se localiza, hacia el lado
concavo de una de las hojas beta,
CBM COMO SCAFFOLDS
aunque, también puede ser localizado
Los dominios de unión a carbohidratos
(CBMs)
adoptan
principalmente
una
estructura tridimensional de -sandwich
hacia alguno de los extremos de la
estructura (Figura 3) (Boraston et al.,
2004).
Fig. 3. A) Esquema que muestra la ubicación de los sitios de unión a carbohidrato de un CBM
típico (estructura en β-sandwich). Boraston et al., (2004) realizaron la superposición de los
carbonos α de diferentes CBM en complejo con el ligando para corroborar que en la mayoría de los
casos el sitio de unión se localiza hacia la hoja β cóncava, y en menos casos hacia el extremo de la
estructura. B) Se muestra la forma de ranura o hendidura característica de un sitio de unión que
reconoce como sustrato al xilano.
La forma o conformación espacial del
sitio de unión es el reflejo de los sustra-
sitio de unión es clave la presencia de
aminoácidos aromáticos.
tos que son capaces de reconocer;
Hay varios reportes donde se desta-
además, es importante señalar que en el
ca la participación de estos residuos
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
19
hidrofóbicos durante el reconocimiento de
3 residuos aromáticos; las tirosinas 18, 20
los sustratos.
y el triptófano 32, siendo el residuo de
Por ejemplo, Abbott y Boraston (2011),
aminoácido W32 indispensable para la
proponen que el residuo de aminoácido
función, ya que su sola mutación provoca
W935 del dominio CBM32 presente en la
la pérdida total del reconocimiento del
endo-β-1,4-N-acetylglucosamidasa
de
ligando.
Streptococcus
es
residuos aromáticos están conservados en
de
ambos dominios, la orientación espacial de
carbohidratos; este residuo se localiza en
cada residuo se predice diferente (Figura
un loop extendido y expuesto al solvente
4) (Rodríguez-Sanoja et al., 2009).
indispensable
pneumoniae,
para
la
fijación
donde interacciona directamente con el
sustrato.
Así
Sin
La
contribución
aminoácidos
mismo,
en
la
embargo,
vecinos
aunque
de
a
estos
residuos
aquellos
de
que
estructura
participan en el reconocimiento también ha
cristalográfica del dominio CBM26 de la α-
sido analizada. En el dominio CBM2b de la
amilasa de Bacillus halodurans C-125, se
xilanasa 11A de Cellulomonas fimi se
muestra que tres aminoácidos aromáticos
evaluó el efecto que producía la mutación
(W36, Y23 y Y25) son importantes para el
R262G en la orientación espacial del
reconocimiento de maltooligosacáridos. La
triptófano
unión se da básicamente a través de
directamente
interacciones tipo van der Waals entre el
observaron que la mutación mencionada
triptófano 36 y la tirosina 25 con los anillos
modificó la orientación de triptófano 90º
de piranosa de una molécula de maltosa, y
con respecto a su posición original en el
mediante puentes de hidrógeno formados
sitio de unión. Tal mutación provocó que
por la tirosina 23 y otros residuos como la
no se reconociera mas al xilano como
glutamina 71, la glicina 76 y el glutamato
ligando, modificándose la especificidad
77 (Boraston et al., 2006). Por otro lado,
hacia celohexosa (Simpson et al., 2000).
mediante estudios de mutagénesis dirigida
Estos datos confirman la importancia de la
realizados con un dominio CBM26 de la α-
posición estructural y la orientación de los
amilasa de Lactobacillus amylovorus, se
aminoácidos involucrados en el sitio de
confirmó que la principal contribución para
unión
que ocurra el reconocimiento está dada por
carbohidrato.
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
259;
el
con
durante
cual
xilano.
la
interacciona
Los
interacción
autores
CBM-
20
Fig. 4. Gel de electroforesis no desnaturalizante en ausencia (A) o presencia (B) de almidón. Los
carriles muestran las proteínas correspondientes a un CBM26 de la α-amilasa de L. amylovorus y sus
mutantes derivadas: 1) Y85L, 2) Y20L, 3) Y18L, 4) Y16L 5) W11-32L, 6) W32L, 7) W11L, 8) CBM26
silvestre y 9) Albúmina. Lo anterior muestra como la mutación W32L abate por completo el
reconocimiento del dominio hacia almidón. (C) La imagen muestra la superposición de los residuos de
unión del dominio CBM26 de la amilasa de B. halodurans C-125 (AP 2C3G; en rojo) y los residuos del
modelo de Rosetta de un módulo CBM26 de la amilasa de L. amylovorus (en negro), lo que indica
como aminoácidos conservados en ambos dominios presentan diferente conformación y orientación, lo
cual es determinante en el mecanismo de reconocimiento del ligando (Modificado de Rodríguez-Sanoja
et al., 2009).
Existen pocos reportes donde se
utilizan a los módulos de unión a
colaboradores en el 2000.
carbohidratos
de
trabajo se utilizó un dominio de unión a
sus
celulosa de la celobiohidrolasa Cel7A de
como
evolución.
Sin
plataformas
embargo,
características
estructurales
(una
Trichoderma
reesei
como
En este
plataforma
estructura conservada, estable, funcional
para la búsqueda de nuevas propiedades
y
funcionales.
con
sitios
de
unión
al
sustrato
La
modificación
de
11
accesibles al solvente) los hace un
residuos de aminoácidos, provocaron un
sistema con potencial para llevar a cabo
cambio de especificidad tan dramático,
estudios de evolución in vitro.
que
Uno
de
los
primeros
y
más
el
interaccionar
dominio
con
mutado
una
pudo
proteína,
sorprendentes trabajos donde utilizan a
específicamente una amilasa. Debido a
los
de
que dicha interacción ocurre con el sitio
y
activo de la amilasa; la unión del CBM
CBMs
evolución”
como
lo
“plataforma
reportan
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
Lehtiö
21
impide que el sustrato entre al sitio
con aumentar la actividad enzimática, de
activo.
realizada
hecho una de las principales funciones
mediante evolución in vitro cambió por
de los dominios de unión a carbohidratos
completo la funcionalidad del CBM1, al
es
pasar de unir polímeros de celulosa a
sustrato en el sitio catalítico. Con base
inhibir
en lo anterior, Shiraga et al., (2004)
La
la
modificación
actividad
de
una
enzima
amilolítica.
aumentar
la
diversificaron
el
concnetración
CBM20
de
del
la
Por otro lado, Gunnarsson et al.
glucoamilasa de Rizhopus oryzae, para
(2004) utilizaron el dominio CBM4-2 de la
determinar el efecto de la adsorción al
xilanasa
marinus
almidón sobre la actividad de la enzima.
(proteína termófila, capaz de reconocer
Al respecto, los autores concluyen que el
sustratos como: xilano, b-glucanos y
obtener variantes con mayor capacidad
celulosa no cristalina) como scaffold para
de adsorberse al sustrato incrementa la
modificar la especificidad y afinidad del
disponibilidad del mismo en el sitio
dominio hacia diferentes polisacáridos. A
catalítico
y
partir de una biblioteca de un millón 600
capacidad
de
mil variantes del dominio CBM4-2, se
insoluble.
de
lograron
Rhodothermus
aislar
variantes
con
otras
capaces
específicamente
de
consecuencia,
hidrólisis
del
la
almidón
mayor
afinidad por xilano (Gunnarsson et al.,
2007);
por
CONCLUSIONES
reconocer
A pesar de que existe un importante
xiloglucano
número de estructuras resueltas, aún no
(Gunnarsson et al., 2006) e incluso de
enorme
distinguir entre xiloglucano fucosilado del
presentes en la naturaleza. Se sabe que
que no presenta unidades de fucosa en
la
su estructura, característica importante
encuentra conservada en la mayoría de
en
de
los dominios descritos y que en todos
tejidos en semillas, por lo que esta
estos, las interacciones hidrofóbicas de
variante funciona como marcador en el
los aminoácidos aromáticos juegan un
estudio de polisacáridos estructurales en
papel primordial en la unión, siendo tan
plantas (Schantz et al., 2009; Filanova et
solo
al., 2007).
espaciales
el
reconocimiento
diferencial
Mejorar la especificidad y capacidad
cantidad
estructura
las
de
de
beta-sandwich
pequeñas
de
carbohidratos
los
se
modificaciones
residuos
que
interaccionan con el sustrato, lo que les
de adsorción, también está relacionado
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
22
da la capacidad de reconocer y unir
específicamente su carbohidrato blanco.
Los reportes existentes muestran
que
utilizando
diversificación
una
estrategia
“artificial”
es
de
Abbott
WD
&
Boraston
A
Structural analysis of a
(2011)
putative
family
32
carbohydrate-bindig
module
from
the
Streptococcus
posible
pneumoniae enzyme Endo D. Acta
mejorar la selectividad y/o especificidad
Crystallogr., Sect. C: Cryst. Struct.
de estos módulos, lo que crea una
Commun. F67: 429- 433.
plataforma novedosa para estudiar la
Barbas CF, Bain JD, Hoekstra DM &
interacción proteína-carbohidrato y para
Lerner
imaginar
combinatorial antibody libraries: a
diversas
aplicaciones
biomédicas y biotecnológicas.
RA
(1992)
Semisynthetic
chemical solution to the diversity
problem. Proc. Natl. Acad. Sci. 89:
AGRADECIMIENTOS
4457- 4461.
La MC Silvia Armenta agradece a la
Bewley C & Shahzad-Ul-Hussan (2013)
comisión de premios 2012-2014 de la
Characterizing
Sociedad Mexicana de Biotecnología y
interactions
Bioingeniería y a Applikon Biotechnology
resonance spectroscopy. Biopolym.
por el premio “Sergio Sánchez Esquivel”,
99: 796-806.
otorgado como mejor Protocolo de Tesis
de
Doctorado.
Manoutcharian
A
los
Dres.
Airapetian
y
carbohydrate-protein
by
nuclear
magnetic
Binz HK, Amstutz P & Plückthum A
Karen
(2005) Engineering novel binding
Amelia
proteins from nonimmunoglobulin
Farrés González Sarabia por la discusión
domains. Nat. Biotechnol. 23: 1257-
crítica en el diseño de la metodología. A
1268.
Conacyt por la beca para estudios de
Boder ET & Wittrup KD (1997) Yeast
doctorado. Este trabajo forma parte del
surface
trabajo
combinatorial polypeptide libraries.
de
Tesis del Doctorado
en
Ciencias Bioquímicas, UNAM de Silvia
Armenta. Este trabajo es realizado con el
display
for
screening
Nat. Biotechnol. 15: 552-557.
Boraston A, Bolam D, Gilbert H & Davies
apoyo de DGAPA-UNAM IN222113 y
G
(2004)
Carbohydrate-binding
Conacyt 131149.
modules: fine-tuning polyssacharide
recognition. Biochem. J. 382:769-
REFERENCIAS
BioTecnología, Año 2014, Vol. 18 No. 1
781.
23
Boraston A, Hesaley M, Klassen, Ficko-
Binding Module that have evolved
Blean E, Lammerts van Bueren A &
from
Law V (2006) A Structural and
conserved.
Funcional
48580-48587.
Analysis
of
a-glucan
recognition by family 25 and 26
Carbohydrate-binding
Modules
common
J.
sequence
Biol.
is
not
Chem.
276:
Filanova L, Gunnarsson LC, Daniel G &
Ohlin
M
(2007)
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xilan-
reveals a conserved mode of starch
binding modules for mapping of pulp
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fibers and wood section. BMC Plant
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