EPSTEIN BARR VIRUS _VCA_ IFA IgM_ES_10.09

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EPSTEIN-BARR VIRUS (VCA) IFA
IgM
PVCAM10: Kit de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para la
determinación de anticuerpos IgM frente a virus de Epstein-Barr en suero
humano.
INTRODUCCIÓN:
Los anticuerpos a antígenos de la cápside viral (VCA) del virus de EpsteinBarr (VEB) aparecen los primeros al producirse la infección. La técnica
más utilizada por su sencillez, precocidad y ausencia de reacciones
cruzadas es la inmunofluorescencia indirecta. La mononucleosis infecciosa
es la enfermedad más común provocada por VEB y puede producir fiebre,
adenopatías, esplenomegalia y faringitis. Algunos de estos casos pueden
ser provocados por citomegalovirus, Toxoplasma gondii, adenovirus, etc.
VEB produce además síndromes proliferativos en inmunodeprimidos y la
infección se asocia a la patogénesis del linfoma de Burkitt y del carcinoma
de nasofaringe.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO:
El método de inmunofluorescencia indirecta está basado en la reacción de
los anticuerpos de la muestra con el antígeno unido a la superficie del
portaobjetos. Los anticuerpos específicos presentes en la muestra
reaccionan con el antígeno, y las inmunoglobulinas no unidas por reacción
con el antígeno son eliminadas en el proceso de lavado. En un paso
posterior el complejo antígeno-anticuerpo es revelado mediante globulina
antihumana marcada con fluoresceína, resultando visualizable mediante
microscopio de fluorescencia.
fluoresceína en tampón fosfatos con estabilizante de proteínas, azul de
Evans y azida sódica.
6 VIRCELL MOUNTING MEDIUM: 3 ml de medio de montaje: glicerol
tamponado (contiene azida sódica).
7 VIRCELL ANTI HUMAN IgG GLOBULIN (SORBENT): 2 viales de
1,5 ml de sorbente (suero de cabra anti-IgG humana, contiene azida
sódica).
Conservar entre 2 y 8ºC y comprobar la fecha de caducidad.
Material necesario no contenido en el kit:
Pipetas de precisión adecuadas.
Incubador termostatizado.
Agua destilada.
Cubreobjetos de 24x60 mm.
Microscopio de fluorescencia y filtros apropiados según recomendaciones
del fabricante.
Cámara húmeda.
CONSERVACIÓN:
Conservar entre 2 y 8ºC. No utilizar los componentes del kit después de la
fecha de caducidad. Los kits son estables hasta el final del mes indicado en
la fecha de caducidad, siempre que los componentes se mantengan
cerrados y conservados entre 2 y 8ºC.
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS COMPONENTES
UNA VEZ ABIERTOS:
COMPONENTE
PBS reconstituido
Resto de componentes
ESTABILIDAD
4 meses a 2-8ºC, siempre dentro de su fecha de
caducidad
Fecha indicada en envase a 2-8ºC
ESTABILIDAD Y USO DE LOS REACTIVOS:
Luz visible
FITC
Usar todos los reactivos en condiciones asépticas para evitar
contaminaciones microbianas. Utilizar sólo la cantidad de sorbente,
controles, PBS y conjugado necesaria para la realización de la prueba. No
devolver a los viales el exceso sobrante. Una vez preparado el PBS debe
ser conservado a 2-8ºC y no debe emplearse si presenta turbidez.
Globulina anti-IgM humana
Luz UV
VIRCELL, S.L. no se responsabiliza de la inadecuada utilización de los
reactivos contenidos en el kit.
IgM humana anti-virus de Epstein-Barr
Antígeno de virus de Epstein-Barr
RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES:
1.
CARACTERÍSTICAS:
2.
Todos los reactivos a excepción del PBS vienen listos para su uso. Los
componentes del equipo se presentan numerados para facilitar su
identificación inequívoca. En el Procedimiento del Ensayo se indican los
números de los reactivos que han de utilizarse en cada etapa.
3.
CONTENIDO DEL KIT:
1 VIRCELL EPSTEIN BARR VIRUS (VCA) SLIDE: 10 portaobjetos de
10 pocillos con células P3HR1 (ATCC HTB-62), tratadas con
formaldehido y fijadas con acetona, de las que aproximadamente sólo un
10-20% expresan los antígenos VCA.
2 VIRCELL PBS: 1 vial para preparar 1 l de PBS pH 7,2.
3 VIRCELL EBV IgM POSITIVE CONTROL: 200 µl de suero control
positivo (contiene azida sódica).
4 VIRCELL EBV NEGATIVE CONTROL: 200 µl de suero control
negativo (contiene azida sódica).
5M VIRCELL ANTI-HUMAN IgM FITC CONJUGATE: 2 viales de 1,1
ml de una solución de globulina anti-IgM humana marcada con
4.
5.
6.
Este producto es sólo para diagnóstico in vitro y está destinado al uso
por personal sanitario cualificado.
Usar sólo componentes del kit. No mezclar los componentes de
diferentes kits o fabricantes. Sólo el PBS, el sorbente, los
portaobjetos y el medio de montaje son compatibles con los
equivalentes en otras referencias y lotes de IFA VIRCELL. El resto
de los componentes son compatibles entre distintos equipos cuando
coincida el lote.
Utilizar puntas de pipeta diferentes y limpias para cada fase del
ensayo. Utilizar sólo material limpio y preferentemente desechable.
No utilizar en caso de deterioro del envase.
No pipetear con la boca.
El sorbente, conjugado y controles de este equipo contienen material
de origen animal. Los controles contienen además material de origen
humano. Aunque los sueros control del equipo son sometidos a
controles de ausencia de HBsAg, anticuerpos frente a VIH y
Hepatitis C, es necesario manejar los controles y muestras del
paciente como potencialmente patógenos. Los pocillos contienen
antígeno de virus de Epstein-Barr inactivado, no obstante, deben
manejarse con precaución. Ningún método actual puede asegurar por
completo la ausencia de estos u otros agentes infecciosos. Todo el
material debe ser manipulado y desechado como potencialmente
infeccioso. Observe la regulación local en materia de residuos
clínicos.
PRODUCTO PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712
http://www.vircell.com
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Por contener azida sódica (concentración <0,1%), debe evitarse el
contacto del conjugado, sorbente, medio de montaje y controles con
ácidos y metales pesados.
Por contener glicerol, debe evitarse el contacto del medio de montaje
con ácidos. No exponer a temperaturas elevadas.
El azul de Evans (concentración <0,1%), es cancerígeno. Evite el
contacto con la piel o los ojos. En caso de contacto lavar la superficie
afectada con agua y solicitar asistencia médica.
Use únicamente los protocolos descritos en este prospecto. Si los
intervalos o temperaturas de incubación empleados en la prueba no
son los especificados, los resultados pueden ser erróneos.
La contaminación cruzada por suero de distintos pacientes en un
portaobjetos puede causar resultados equívocos. Tome las
precauciones necesarias para evitarla.
La óptica del microscopio, el mantenimiento y el tipo de fuente de
luz pueden afectar la calidad de la fluorescencia.
No dejar los reactivos a temperatura ambiente más tiempo del
absolutamente necesario.
Cada portaobjetos debe ser utilizado una sola vez. No debe ser
fraccionado, ni se deben reutilizar los pocillos no usados.
El kit contiene elementos de vidrio que en caso de rotura podrían
provocar lesiones físicas. Manipular con precaución.
Comprobar que la adición de sorbente a la muestra produce un
inmunoprecipitado visible a simple vista.
TOMA DE MUESTRA:
La sangre debe extraerse en condiciones asépticas mediante técnicas de
venipuntura por personal experimentado. Se recomienda el uso de técnicas
estériles o asépticas para evitar la contaminación de la muestra. Los sueros
deben mantenerse refrigerados entre 2 y 8ºC si se van a procesar dentro de
los 7 días siguientes a la toma. Si el procesamiento se va a prolongar deben
congelarse a -20ºC, evitando las congelaciones y descongelaciones
innecesarias ya que estas podrían provocar una disminución del título de
las inmunoglobulinas, especialmente de IgM. No utilizar sueros
hiperlipémicos o contaminados. Los sueros que presenten partículas
pueden ser clarificados por centrifugación.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO:
Cada lote se somete a control de calidad interno antes de su liberación
asegurando el cumplimiento del protocolo de validación por el usuario
mediante especificaciones más estrictas. Los resultados de control final de
cada lote están disponibles. La correlación del material de control se
asegura mediante ensayos paralelos frente a paneles de sueros de
referencia internamente validados.
PROTOCOLO DE VALIDACIÓN POR EL USUARIO:
En cada ensayo se deben incluir control positivo y negativo. Su utilización
permite la validación de la prueba y el equipo. El patrón de fluorescencia
que debe observarse será:
Control positivo: Fluorescencia periférica, color verde manzana.
Control negativo: Patrón celular rojo.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Una reacción positiva será aquella en la que se observe fluorescencia
periférica, color verde manzana.
Una reacción negativa será aquella en la que se observe un patrón celular
rojo.
Si en un suero se observara el patrón de fluorescencia positivo sobre más
del 50% de las células del pocillo se considerará una reacción inespecífica.
Patrones de fluorescencia diferentes a los definidos en el protocolo de
validación no deben ser interpretados como positivos.
Los anticuerpos IgG e IgM se comportan de diferente manera durante las
primoinfecciones y las reinfecciones. En una primoinfección las IgG e IgM
aparecen en casi todos los casos (la IgM aparece antes que la IgG). En una
reinfección no aparecen anticuerpos de tipo IgM en todos los casos, siendo
la detección de IgG el único modo de realizar el diagnóstico. En muchas
enfermedades pueden existir títulos altos de IgG durante toda la vida del
paciente, mientras que la IgM, en general, sólo se mantiene en suero
durante 2 ó 3 meses después de la enfermedad, y por tanto son un
marcador efectivo de infección reciente.
LIMITACIONES DEL MÉTODO:
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:
El único reactivo que es necesario preparar con antelación a la realización
de la prueba es el PBS. Para ello, agregar el contenido del vial 2 a 1 litro
de agua destilada y agitar hasta completa disolución. Una vez preparada
conservar entre 2 y 8ºC.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO:
1.-Dejar que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Permita que
los portaobjetos alcancen la temperatura ambiente antes de abrirlos.
2.-Realizar una dilución 1/2 de los sueros, para ello poner 25 µl de suero
en 25 µl de PBS 2. Los sueros control 3 y 4 no deben ser diluidos.
3.-Tratar los sueros diluidos con el sorbente de IgG 7, poniendo 5 µl de los
sueros a 25 µl de sorbente y agitar vigorosamente. Los sueros control 3 y
4 no deben ser diluidos ni tratados con sorbente. Los sueros tratados se
deben centrifugar para aclarar el precipitado del suero, el cual interfiere
con la prueba.
4.-Poner 20 µl de suero tratado en cada pocillo del portaobjetos 1. Realizar
lo mismo con los controles positivo 3 y negativo 4.
5.-Incubar en cámara húmeda durante 90 minutos a 37ºC.
6.-Enjuagar brevemente el portaobjetos 1 con PBS 2 (evitar verter
directamente el PBS sobre los pocillos). Sumergir el portaobjetos durante
10 minutos en PBS. Dar un ligero lavado con agua destilada.
7.-Dejar que los portaobjetos 1 se sequen.
8.-Añadir 20 µl de solución de anti-IgM humana 5M en cada pocillo. (No
requiere dilución).
9.-Incubar en cámara húmeda durante 30 minutos a 37ºC.
10.-Repetir los pasos 6 y 7.
11.-Añadir una pequeña gota de medio de montaje 6 a cada pocillo y poner
el cubreobjetos.
12.-Examinar en microscopio de fluorescencia a 400x lo más rápidamente
posible. De no ser así, mantener a 2-8ºC en oscuridad durante un máximo
de 24 horas, hasta la observación.
1.-Este método está diseñado para ser utilizado con suero humano.
2.-El uso de este kit requiere la cuidadosa lectura y comprensión del folleto
de instrucciones. Es necesario seguir estrictamente el protocolo para
obtener resultados fiables, en particular el correcto pipeteo de muestras y
reactivos, lavados y tiempos de incubación.
3.-Los resultados de las muestras deben ser valorados junto con la
sintomatología clínica y otros procedimientos diagnósticos.
4.-El test no indica el lugar de la infección. No pretende sustituir al
aislamiento.
5.-La ausencia de un aumento significativo en el nivel de anticuerpos no
excluye la posibilidad de infección.
6.-Las muestras recogidas muy pronto en el transcurso de una infección
pueden no tener niveles detectables de IgG. En esos casos se recomienda
realizar un ensayo para determinación de IgM, u obtener una segunda
muestra transcurridos entre 14 y 21 días para ser ensayada en paralelo con
la muestra original, con el fin de determinar una seroconversión.
7.-Los resultados obtenidos en la detección de IgG en neonatos deben ser
interpretados con precaución, ya que las IgG maternas son transferidas
pasivamente de la madre al feto antes del nacimiento. La determinación de
IgM es mejor indicador de infección en niños menores de 6 meses.
8.-Los resultados de determinación de anticuerpos de una muestra única no
deben ser usados para el diagnóstico de una infección reciente. Se deben
recoger muestras pareadas (aguda y convaleciente) para ser ensayadas
paralelamente y determinar seroconversión o un incremento significativo
en el nivel de anticuerpos.
9.-Los sueros de algunos pacientes con enfermedades autoinmunes dan
respuesta inespecífica sobre el sustrato celular empleado en la técnica de
inmunofluorescencia. Estos sueros no podrán ser evaluados por esta
técnica.
PRODUCTO PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712
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RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO DE TRABAJO:
PRESTACIONES
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD:
Añadir la dilución del suero y los controles a los
pocillos del portaobjetos 1
Se ensayaron 101 muestras de suero con EPSTEIN-BARR VIRUS (VCA)
IFA IgM frente a un equipo de inmunofluorescencia indirecta de otra casa
comercial, obteniendo los siguientes resultados:
IgM
Nº MUESTRAS
101
SENSIBILIDAD
97,9%
Cámara húmeda
ESPECIFICIDAD
100,0%
90 minutos a 37ºC
2 lavados con PBS 2 y un lavado con agua
destilada
Los sueros que no presentaron reacción específica fueron excluidos de los
cálculos finales.
Secar
PRECISIÓN INTRAENSAYO:
Añadir el conjugado con fluoresceína 5M
Se titularon 3 sueros, 2 positivos y 1 negativo, pipeteados individualmente
en grupos de 5 en un único ensayo realizado por el mismo operador en
condiciones de trabajo idénticas.
En ningún caso se observaron oscilaciones superiores a 1 título.
Cámara húmeda
30 minutos a 37ºC
2 lavados con PBS 2 y un lavado con agua
destilada
PRECISIÓN INTERENSAYO:
Se titularon 3 sueros, 2 positivos y 1 negativo, pipeteados individualmente
en 5 condiciones diferentes en las que variaron el operador o el día de
realización.
En ningún caso se observaron oscilaciones superiores a 1 título.
Secar
Una gota de medio de montaje 6
Depositar
cubreobjetos
REACCIÓN CRUZADA E INTERFERENCIAS:
Se ensayaron 9 muestras caracterizadas positivas frente a otros virus o
microorganismos del grupo taxonómico (citomegalovirus, herpes simplex
1 y 2, varicella-zoster) y grupo sindrómico (Brucella melitensis).
Las muestras ensayadas dieron resultados negativos, demostrando la
reacción específica del ensayo sin reacción cruzada o interferencias
ocasionadas por los agentes descritos.
Examinar al microscopio de fluorescencia 400x
OTROS ESTUDIOS DE INTERFERENCIAS:
Se realizó un ensayo IFI a 25 sueros con factor reumatoide para
determinación de anticuerpos IgM e IgG frente a 2 antígenos bacterianos y
2 antígenos virales. Además se realizó un ensayo IFI para determinación
de anticuerpos IgG e IgM a otros 2 sueros caracterizados para cada uno de
los antígenos. Para determinación IgM los sueros fueron tratados con
sorbente anti-IgG. Se demostró la eficacia del tratamiento con sorbente
para evitar interferencias en IgM ocasionadas por factor reumatoide.
Se ha comprobado la eficacia del sorbente recomendado para evitar la
aparición de falsos negativos por exceso de IgG.
SÍMBOLOS UTILIZADOS EN EL PRODUCTO:
Producto para el diagnóstico in vitro
Fecha de caducidad
8ºC
Conservar entre 2-8ºC
2ºC
∑
x
Contiene suficiente para <X> pruebas
Lote
Referencia (catálogo)
Consultar instrucciones de uso
BIBLIOGRAFÍA:
1. Bruu, A. L., R. Hjetland, E. Holter, L. Mortensen, O. Natas, W.
Petterson, A. G. Skar, T. Skarpaas, T. Tjade, and B. Asjo. 2000. Evaluation
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8. Swanston, W., J. Mahony, B. McLaughlin, and M. Chernesky. 1986.
Assessment of serologic markers for Epstein-Barr virus. Diagn Microbiol
Infect Dis 5:235-44.
Para cualquier aclaración o consulta, contactar con:
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<X> pocillos
REVISADO: Octubre-09
PRODUCTO PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO
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