INHIBIDOR DE LA INTERLEUCINA 6 HUMANA.(ES2183846)

k
OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : C07K 14/47
11 Número de publicación:
2 183 846
7
51
ESPAÑA
A61K 38/17
C12P 21/00
//(C12P 21/00
C12R 1:91)
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
12
kNúmero de solicitud europea: 95111894.2
kFecha de presentación: 28.07.1995
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 696 594
kFecha de publicación de la solicitud: 14.02.1996
T3
86
86
87
87
k
54 Tı́tulo: Inhibidor de la interleucina 6 humana.
k
73 Titular/es: Bayer Corporation
k
72 Inventor/es: Penza, Delia E.;
k
74 Agente: Carpintero López, Francisco
30 Prioridad: 10.08.1994 US 288516
100 Bayer Road
Pittsburgh, PA 15205-9741, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.04.2003
ES 2 183 846 T3
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.04.2003
Aviso:
k
k
Faris, Susan K. y
Lembach, Kenneth J.
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 183 846 T3
DESCRIPCION
Inhibidor de la interleucina 6 humana.
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Antecedentes de la invención
1 Campo
10
Esta descripción está relacionada en general con una nueva preparación antagonista de citocinas y
especı́ficamente con la preparación, caracterización, y uso de un inhibidor de la interleucina-6 que puede
aislarse del fluido de cultivo tisular y tiene actividad antagonista de la interleucina-6 in vitro.
2 Antecedentes
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30
35
40
45
50
55
60
La relación de la interleucina-6 (IL-6) con la salud y la enfermedad en humanos está bajo investigación
intensiva. Se han encontrado niveles elevados de IL-6 en el torrente sanguı́neo y/o fluidos corporales de
individuos con infecciones bacterianas y vı́ricas, traumatismo, trastornos autoinmunes, y neoplasias. La
correlación entre los niveles de IL-6 con la gravedad de los sı́ntomas y el efecto beneficioso de los anticuerpos anti-IL-6 en modelos animales sugiere que la citocina puede jugar un papel patofisiológico en
algunas indicaciones patológicas. Por tanto los antagonistas de IL-6 pueden ser de uso terapéutico.
Todavı́a no se ha descrito un antagonista de la IL-6 natural especı́fico. Portier y col. (Blood, 81
(11): 3076-82 (1993)) descubrieron que el γ-interferón (γ-IFN) inhibe el crecimiento celular del mieloma
dependiente de IL-6 pero el γ-IFN no inhibe la actividad de la IL-6 en otros tipos de ensayos in vitro.
Brakenhoff y col. (J. Biol. Chem., 269 (1):86-93 (1994)) construyeron mutantes de IL-6 biológicamente
inactivos que se unı́an a la IL-6R de 80 kDa pero no se unı́an a gp130, impidiendo ası́ la transducción de
la señal. Estas proteı́nas mutantes actuaban como antagonistas de la IL-6 evitando que la IL-6 nativa se
uniera a las subunidades del receptor de IL-6. Sin embargo, la inmunogenicidad potencial de la proteı́na
mutante podrı́a constituir una dificultad para el uso terapéutico.
La solicitud de patente europea EP-A-448 181 describe composiciones inhibidoras de interleucina-6
que comprenden una clase de inhibidores con más de un peso molecular.
Klein y col. (Blood, 78: 1198-1204 (1991)) descubrieron que la administración de un anticuerpo antiIL-6 murino a un paciente con leucemia bloqueaba la proliferación celular del mieloma en la médula ósea.
Sin embargo de nuevo, debido a que el anticuerpo murino es una proteı́na extraña, hay una inmunogenicidad potencial.
Se ha postulado que los derivados de bioingenierı́a de un receptor soluble de 80 kDa podrı́an actuar
como antagonistas de IL-6 por unión a la IL-6 circulante pero no a gp130 evitando ası́ la transducción de
la señal (J. Bauer, Biotechnology Therapeutics, 2(3&4): 285-298 (1991)). Sin embargo, estas proteı́nas
podrı́an tener un epı́topo que podrı́a ser reconocido como extraño y podrı́an resultar inmunogénicos si se
usan como agente terapéutico. Bauer también estableció que han comenzado ensayos clı́nicos usando anticuerpos humanos anti-IL-6 humana para el tratamiento de múltiples mielomas (Id.). En este momento,
el resultado de los ensayos clı́nicos es desconocido.
Se ha mostrado que los monocitos/macrófagos producen citocinas e inhibidores de citocinas, tales
como el inhibidor de IL-1 que Roberts y col. encontraron en monocitos infectados con el virus respiratorio sincitial (VRS) (J. Exp. Med., 163: 511-519 (1986)) y la proteı́na antagonista del receptor IL-1 (Janson
y col., J. Immunol., 147 (12): 4218-4223 (1991)). En esta invención, investigamos la posibilidad de que
tales células pudieran secretar también un inhibidor de la IL-6. Ya que era difı́cil establecer un aporte
constante de monocitos humanos de sangre periférica, se utilizó la lı́nea celular de leucemia promielocı́tica
humana, HL-60. El tratamiento de HL-60 con diésteres de forbol induce la diferenciación a células que
muestran varias caracterı́sticas de macrófagos (Hall y col., Cell. Immunol., 76: 58-68 (1983)), mientras
que el tratamiento con dimetilsulfóxido (DMSO) o ácido retinoico (RA) resulta en la diferenciación por
la vı́a de los granulocitos (Leftwich y col., Canc. Res., 46: 3789-3792). Se encontró que la exposición
de las células HL-60 a los diésteres de forbol inducı́a especı́ficamente la secreción de un inhibidor de
IL-6. Parece que este inhibidor de IL-6 es una proteı́na humana aparentemente nueva. Debido a que la
lı́nea celular HL-60 es humana, el inhibidor de IL-6 contendrá la secuencia de aminoácidos humana y por
tanto no será inmunogénica in vivo. Esto podrı́a constituir una mejora sobre los anteriores ejemplos de
antagonistas de IL-6.
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Resumen de la invención
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10
La preparación del inhibidor de esta descripción comprende un inhibidor caracterizado por poder
obtenerse de la lı́nea celular HL-60 y tener un peso molecular de aproximadamente 20.000 daltons determinado por cromatografı́a de filtración en gel. El inhibidor además se puede unir a y eluı́r de Azul de
R
, se puede unir a y eluı́r de resinas de intercambio aniónico y se puede unir a y eluı́r de resinas
Sefarosa
de cromatografı́a en fase inversa. El inhibidor suprime la proliferación dependiente de IL-6 en la lı́nea
celular B9. La actividad inhibidora se reduce más de 50 veces por digestión con tripsina, y el tratamiento
de la lı́nea celular HL-60 con cicloheximida durante la estimulación abroga completamente la actividad
inhibidora del sobrenadante celular. La actividad es resistente al tratamiento ácido y por calor.
El inhibidor puede aislarse parcialmente de sobrenadantes de HL-60 estimuladas por cromatografı́a
R
, cromatografı́a de intercambio aniónico, y cromatografı́a en fase inversa.
en Azul de Sefarosa
15
Se ha encontrado que el inhibidor es útil en el estudio del efecto de la IL-6 en las funciones celulares
in vitro y dentro de algún tiempo puede encontrarse como terapéuticamente útil en el tratamiento de
trastornos caracterizados por niveles aumentados de IL-6.
Descripción de las Figuras
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Figura 1: Inducción Del Inhibidor De IL-6 En Células HL-60.
25
30
35
Los cultivos de HL-60 se trataron con PMA (10 ng/ml), PDBu (130 ng/ml), A23187 (50 ng/ml),
DMSO (1,2 % v/v), PMA y A23187, o etanol (EtOH, 1 % v/v) durante 24 horas. Se añadió RA (10
nM) 5 dı́as antes de la inducción de 24 horas con PDBu (130 ng/ml) o sin el. Se lavaron las células y
se resuspendieron en RPMI-2 a 1 x 106 células/ml. Tras 3 dı́as de incubación, se prepararon los fluidos
del cultivo libres de células por centrifugación a temperatura ambiente durante 10 minutos a 200xg y se
analizó la inhibición de la actividad IL-6 en el ensayo de células B9.
Figura 2: Efectos Del Inhibidor IL-6 En La Proliferación De Células U373.
Se trataron células HL-60 (1 x 106 células/ml) con PMA (10 ng/ml) durante 24 horas. Se lavaron las
células, se resuspendieron en RPMI-2 y se incubaron durante 3 dı́as. Se prepararon por centrifugación
los fluidos del cultivo y se analizaron en el ensayo U373 con IL-1α o sin ella. Como comparación se usó
anti-IL-1 (1 µg/pocillo).
Figura 3: Optimización De La Densidad Celular Y La Concentración De PMA.
40
45
50
Se prepararon los cultivos HL-60 a la densidad celular indicada y se incubaron durante 24 horas con
la concentración indicada de PMA en RPMI-2. Se recogieron las células, se lavaron y se resuspendieron
a la densidad celular inicial. Tras 24 horas, se analizaron los fluidos del cultivo tisular libre de células en
el ensayo B9 en presencia de IL-6. Se muestran los efectos de la densidad celular (A) y la concentración
de PMA (B) sobre la expresión del inhibidor.
R
HR 10/30 Del Sobrenadante De HL-60.
Figura 4: Cromatografı́a En Superosa 12
Se concentró el fluido del cultivo tisular aproximadamente 17 veces con una membrana YM3 y se
dializó por filtración en fosfato de sodio 50 mM pH 7,0 (tampón de partida). Se aplicaron 0,5 ml del concentrado en la columna. El tampón de la columna era Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,8. La velocidad
de flujo de la columna era 0,5 ml/min y se recogieron fracciones de 1 ml. Se analizaron directamente las
fracciones en cuanto a actividad del inhibidor con el ensayo B9.
R
Del Sobrenadante De HL-60.
Figura 5: Cromatografı́a Mono Q
55
60
Se concentró el fluido del cultivo tisular aproximadamente 17 veces con una membrana YM3 y se
dializó por filtración en tampón de partida. Se equilibró la columna con Tris 20 mM pH 7,5. Se diluyó
1:2 el fluido del cultivo tisular concentrado con el tampón Tris y se cargaron en la columna 0,5 ml. Se
eluyó la proteı́na con un gradiente lineal conteniendo el tampón final Tris 20 mM, NaCl 1M pH 7,5. Se
recogieron fracciones de 0,5 ml en tubos que contenı́an BSA. Para el ensayo de la actividad del inhibidor,
se concentraron de 4-8 veces 0,4 ml de una fracción y se dializaron por filtración con RPMI-1640.
R
Del Sobrenadante De HL-60.
Figura 6: Cromatografı́a En Azul De Sefarosa
3
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5
10
15
Se concentró el fluido del cultivo tisular aproximadamente 87 veces con una membrana YM10 y se
dializó por filtración en tampón de partida. El fluido del cultivo tisular concentrado se cargó en una
columna de 50 ml y se lavó la columna con tampón de partida. Se aplicó entonces un gradiente lineal de
NaCl de 0 a 1 M en tampón de partida seguido de elución con etilén glicol 50 % en fosfato de sodio 50
mM, NaCl 4 M pH 7,0. Se recogieron fracciones de 10 ml. Para el uso en el ensayo B9, se concentraron
de 4-8 veces fracciones de las muestras recogidas y se dializaron por filtración en RPMI-1640.
Figura 7: Cromatografı́a En Fase Reversa De La Actividad Inhibidora HL-60 Eluida Por CromatoR
.
grafı́a En Azul De Sefarosa
R
que contenı́an la
Se combinaron las fracciones obtenidas por cromatografı́a en Azul de Sefarosa
actividad inhibidora en dos mezclas, la primera (A) eluida con NaCl 900 mM aproximadamente en el
gradiente lineal y la segunda (B) eluida con etilénglicol 50 %, NaCl 4 M. Las mezclas se concentraron
R
de 2
aproximadamente 100 veces y se aplicaron por separado a una columna en fase inversa ProRPC
ml equilibrada con ácido trifluoroacético (TFA) 0,1 % (v/v) en agua. Se lavó la columna con el tampón
de partida y se eluyó con un gradiente lineal de 20 % (v/v) a 80 % (v/v) de acetonitrilo calidad de HPLC
en TFA 0,1 % (v/v). Se recogieron las fracciones (0,3 ml), se evaporaron a sequedad, y se resuspendieron
en 0,1 ml de H2 O para el análisis por el ensayo B9.
20
Figura 8: Cromatografı́a En Fase Inversa De La Actividad Inhibidora HL-60 Aislada Por Cromatografı́a En Fase Inversa.
25
Se combinaron las fracciones activas de las mezclas A y B provenientes de la cromatografı́a en fase
R
R
y se recromatografiaron en la columna ProRPC
de 2 ml usando un grainversa de Azul de Sefarosa
diente de acetonitrilo 20 % a 80 % (v/v) en TFA 0,1 %. Se analizaron las fracciones con relación a la
actividad del inhibidor de IL-6 como se describe en la Figura 7.
Figura 9: Tratamiento Por Calor Del Inhibidor De HL-60.
30
35
Se calentaron las siguientes muestras durante 15 minutos a 100◦ C y luego se analizó su actividad inR
R
: no diluido, (2) Pico 2 de Azul de Sefarosa
:
hibidora en el ensayo B9. (1) Pico 2 de Azul de Sefarosa
R
R
1:10, (3) Pico 2 de Azul de Sefarosa : 1:100, (4) Pico 2 de Azul de Sefarosa : 1:1.000, (5) Anti-IL-6,
5,0 µg/ml, (6) Anti-IL-6, 0,5 µg/ml, (7) AntiIL-6, 50 ng/ml, (8) Anti-IL-6, 5 ng/ml, (9) RPMI-2: no
diluido, (10) RPMI-2: 1:10, (11) RPMI-2: 1:100, (12) RPMI-2: 1:1.000.
Figura 10: Digestión Con Tripsina Del Inhibidor De HL-60.
40
R
que contenı́a actividad de
Se dializaron por filtración 500 µl de una mezcla de Azul de Sefarosa
inhibidor de IL-6 usando un filtro de 10 kDa de peso molecular de corte en bicarbonato de amonio 0,1
M pH 8,0 (tampón de digestión). Se añadieron las muestras (250 µl/muestra) a sedimentos aislados de
tripsina inmovilizada previamente lavada con tampón de digestión y se incubaron a 37◦C durante 3,5
horas. Se recogieron los digeridos de tripsina por centrifugación, se sometieron a filtración esterilizante,
y se compararon frente a muestras no tratadas en el ensayo B9.
45
Figura 11: Tratamiento Ácido Del Inhibidor De HL-60.
50
R
que contiene inhibidor de IL-6 en ácido trifluoroacético
Se diluyó 1:2 una mezcla de Azul de Sefarosa
0,1 %/ acetonitrilo 100 %, pH ≤ 2 o en agua estéril. Tras la evaporación a sequedad, se reconstituyeron
las muestras en 100 µl de RPMI, se sometieron a filtración esterilizante, y se analizaron por el ensayo B9.
Figura 12: Efecto De La Cicloheximida En La Sı́ntesis Del Inhibidor De HL-60.
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Se trataron células HL-60 (106 /ml) con PMA (10 ng/ml). Tras 24 horas se lavaron las células adherentes con RPMI-2 y se eliminaron las células no adherentes. Después se incubaron cultivos por duplicado
en RPMI-2 o en RPMI-2 que contenı́a 100 µg/ml de cicloheximida. Tras otras 24 horas, se eliminó el
fluido del cultivo tisular y se lavaron las células para eliminar la cicloheximida. Se incubaron las células
en RPMI-2 durante 2 dı́as más, tiempo en el que se cultivó el fluido del cultivo tisular para el análisis de
la actividad inhibidora en el ensayo B9. Todas las muestras de fluido de cultivo tisular se dializaron por
filtración antes del ensayo para asegurar la eliminación de la cicloheximida.
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Descripción detallada de la invención
Reactivos
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El acetato miristato de forbol (PMA), el dibutirato de forbol (PDBu), A23187, el ácido retinoico todo
trans (RA), y el dimetilsulfóxido (DMSO) se obtuvieron de Sigma Chemical Co. Las soluciones de reserva
de PMA, PDBu, A23187, y RA se almacenaron en etanol a -20◦ C. Todos los reactivos se protegieron de la
luz y se diluyeron en el medio apropiado inmediatamente antes de su uso. La IL-6 humana recombinante
se obtuvo de Genzyme. El Anti-IL-6, el anti-IL-1α, el anti-IL-1β y la IL-1α humana recombinante se
obtuvieron de R&D Systems.
Cultivo Celular
15
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Se usaron dos lı́neas celulares HL-60 (ATCC # CCL-240) para generar la actividad inhibidora. La
primera lı́nea celular secretó altos niveles de IL-6 y la segunda secretó 20 pg/ml o menos de IL-6. Las
lı́neas celulares se mantuvieron en RPMI-1640 (Gibco) suplementado con FBS 10 % (Hyclone) inactivado
por calor (RPMI-10). Se lavaron las células con solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato sin
Ca2+ y Mg2+ (DPBS-CMF, Gibco) y se resuspendieron en RPMI-1640 que contenı́a el(los) agente(s)
inductor(es) apropiado(s). Se recogieron los fluidos de cultivo tisular (TCF) y se determinó la actividad
del inhibidor del IL-6 usando el ensayo B9.
25
Se realizaron experimentos iniciales para determinar las concentraciones óptimas de inductor y de
células con la lı́nea celular secretora de IL-6. Los experimentos siguientes mostraron que la lı́nea no
secretora HL-60 producı́a un inhibidor IL-6 tras la estimulación con diéster de forbol (por ejemplo, PMA,
PDBu, etc.). Por filtración en gel, el inhibidor sintetizado por la no-secretora de IL-6 tenı́a el mismo peso
molecular que el inhibidor sintetizado por la secretora de IL-6. Para evitar resultados aberrantes debido
a la presencia de IL-6, se hicieron estudios de caracterización y purificación usando la lı́nea celular no
secretora que está disponible de ATCC.
30
Ensayo B9 Dependiente De IL-6
35
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45
La lı́nea celular de hibridoma murino B9 (cortesı́a de P. Scuderi, Miles Research Center; West Haven,
CN) se mantuvo en RPMI-10 suplementado con al menos 1 unidad/ml de IL-6. Para el uso en el ensayo,
las células se sembraron a 5 x 104 células/ml en RPMI con FBS 5 % (RPMI-5) en placas de 96 pocillos
(Corning) con 100 µl/pocillo. Se añadieron volúmenes de 20 µl (TCF bruto) o 10 µl (fracciones de la
columna) de las muestras a analizar. La mitad de los pocillos recibió 100 µl de IL-6 a 2 unidades/ml
en RPMI-5 y la otra mitad recibió 100 µl de RPMI-5. Se añadió antiIL-6 a los pocillos de control a
0,5-1 µg/pocillo para asegurar que se estaban midiendo los efectos especı́ficos de la IL-6. Tras un periodo
de incubación de 3-4 dı́as, se midió la proliferación celular por incorporación de 3 H-timidina (3 H-Tdr,
DuPont-NEN) o por conversión de tetrazolio MTS (Promega) en un formazan acuoso soluble. Para la
incorporación de 3 H-Tdr, las células se marcaron con 3 H-Tdr 0,5 µCi/pocillo durante 5 horas, se recogieron en filtros usando el Atrapador Automático Tomtec y se determinó la incorporación de 3 H usando
un Betaplate BS 1205 (LKB-Wallac). Para la detección no radiactiva de la proliferación celular, se usó
en ensayo de Proliferación Celular no radiactivo 96 AQ de valoración celular (Promega). Las muestras
se analizaron por triplicado y se calculó el porcentaje de inhibición a partir de los valores medios de la
siguiente manera:
[(CP M(RP M I+IL−6) −CP M(RP M I−IL−6) )−(CP M(ensayo+IL−6) −CP M(RP M I−IL−6) )]x100
[(CP M(RP M I+IL−6) −CP M(RP M I−IL−6) )]
50
Para determinar el porcentaje de inhibición en el ensayo no radiactivo, se usaron en la ecuación anterior los valores de la D.O. en lugar de las CPM.
Ensayo U373 Dependiente De IL-1
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Se han descrito los efectos promotores del crecimiento de la IL-1 sobre la lı́nea celular U373 (astrocitoma/glioblastoma humano) (Lachman y col., J. Immunol., 138 (9): 2913-29-6 (1987)). Para el uso
en el ensayo, se crecieron células U373-MG (ATCC # HTB 17) hasta confluencia en RPMI-10. Un dı́a
antes del ensayo, se trataron las células con tripsina y se sembraron 1 x 104 células/pocillo en placas de
96 pocillos en RPMI que contenı́a FBS 1 % (RPMI-1). Después se añadieron las muestras del ensayo,
20 µl de fluido de cultivo tisular (TCF), sin o con 5 unidades/ml de IL-1α en un volumen total de 200
µl/pocillo. Se añadió un volumen apropiado de RPMI-2 para servir como control negativo. Se cultivaron
las células durante 2 dı́as y se añadió 0,5 µCi/pocillo de 3 H-Tdr para las últimas 5 horas. Se recogieron
5
ES 2 183 846 T3
las células y se determinó la incorporación del 3 H.
Cromatografı́a En Columna
5
10
Los sobrenadantes del cultivo HL-60 inducido con PMA se dializaron por filtración en el tampón indicado y se concentraron por ultrafiltración con una membrana YM10 o YM3 (Amicon). Los sobrenadantes
concentrados se aplicaron a las resinas de cromatografı́a y se eluyeron como se describe en las figuras.
Para el ensayo de la actividad del inhibidor de IL-6, se filtraron las fracciones a través de un filtro de
0,22 µm y, si el tampón de elución era incompatible con el ensayo B9, se dializaron por filtración con
RPMI-1640. Todas las resinas se obtuvieron de Pharmacia salvo que se indique otra cosa.
SDS-PAGE
15
Las muestras que se iban a someter a electroforesis se diluyeron 1:2 con un tampón no reductor de
SDS-PAGE y se hirvieron durante 5-10 minutos a 100◦C. Se cargaron 20 µl de las muestras diluidas en
geles SDS-PAGE de gradiente 10-20 % (BioRad) y se sometieron a electroforesis a 200 V durante aproximadamente 45 min. Los geles de tiñeron con Azul Coomassie R-250 o con tinción de plata.
Ejemplo 1
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35
En la Figura 1 se resumen los efectos de varios compuestos que ejercen una actividad moduladora en
la diferenciación de las células HL-60 in vitro. Se trataron 0,5-2 x 106 células HL-60 por ml de RPMI1640 con PMA 10 ng/ml o PDBu 130 ng/ml, ambos conocidos como inductores de la diferenciación de
monocitos. Tras 24 horas, las células se hicieron adherentes, se vacuolaron y cesó su crecimiento. Se
transfirieron las células a RPMI-2 y 3 dı́as más tarde se determinó un inhibidor IL-6 con el ensayo B9
en los fluidos del cultivo de las células tratadas con PMA o con PDBu, pero no en los fluidos del cultivo
tratado con DMSO o RA, que inducen la diferenciación granulocı́tica. En algunas lı́neas celulares los
ionóforos de calcio y los ésteres de forbol potencian sinérgicamente la activación celular. Sin embargo,
encontramos que la coestimulación con PMA y un ionóforo de calcio (A23187) no aumentó el nivel de
inhibidor respecto al inducido con PMA solo. El A23187 solo no generó un inhibidor detectable.
El inhibidor IL-6 se detectó en fluidos de cultivo a las 24 horas tras la adición de PMA y la secreción
continuó durante otras 48 horas tras la eliminación del agente inductor. A pesar del hecho de que el
PMA solo puede estimular el crecimiento de las células B9 y que el primer cultivo de fluidos de cultivo de
HL-60 contenı́a potencialmente 10 ng/ml de PMA residual, todavı́a se observaba la actividad inhibidora
en el sobrenadante bruto de este cultivo.
Ejemplo 2
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Además de inhibir la proliferación estimulada por la IL-6 de las células B9, el inhibidor derivado de
HL-60 suprimı́a el crecimiento endógeno (IL-6 independiente) de las células B9. El anti-IL-6 sólo afectaba
la proliferación estimulada por la IL-6. Para excluir la posibilidad de que la actividad derivada de HL-60
fuera por un inhibidor de la incorporación de timidina o un inhibidor no especı́fico de la proliferación
celular, se analizó el efecto sobre células U373. La proliferación de las células U373 es estimulada por la
IL-1 pero no por la IL-6. Véase la Figura 2. Se trataron 1 x 106 células HL-60/ml con PMA 10 ng/ml
durante 24 horas. Las células se transfirieron a RPMI-2 y se incubaron durante 3 dı́as más. Se recogió el
sobrenadante y se analizó en el ensayo U373. No se detectó inhibidor de la proliferación estimulada por
IL-1 o inhibidor no especı́fico del crecimiento celular en los fluidos del cultivo de células HL-60 inducidas
con PMA según la determinación por el ensayo U373. De hecho, se encontró que los fluidos del cultivo
HL-60 estimulaban la proliferación de las células U373 presumiblemente debido a la presencia de IL-1 en
el sobrenadante. Los experimentos de control usando antiIL-1 dieron los resultados esperados. Además,
el inhibidor HL-60 no inhibı́a la proliferación dependiente de IL-2 o la proliferación no especı́fica de las
células CTLL.
Resultados
Se extendieron los estudios iniciales para determinar las mejores condiciones para la inducción del
inhibidor. La producción óptima del inhibidor se observaba usando densidades de células HL-60 que
variaban de 0,5 a 2,0 x 106 células/ml y concentraciones de PMA de 1-10 ng/ml (véase la Figura 3).
60
6
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Caracterización del Inhibidor
Cromatografı́a en columna
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Se usó la lı́nea celular HL-60 no secretora de IL-6 para seguir caracterizando al inhibidor además de
para fraccionar la actividad del inhibidor de proteı́nas contaminantes. Se utilizaron las cromatografı́as
R
, y en fase inversa. Con el fin de
de exclusión molecular, de intercambio aniónico, de Azul de Sefarosa
simplificar la purificación a gran escala, se indujeron las células en RPMI-1640 que carecı́a de suero.
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Para determinar de forma aproximada el peso molecular del inhibidor, se sometió a ultrafiltración al
TCF a través de una membrana de 30 kDa. Se encontró actividad en el filtrado tras la concentración con
una membrana de 10 kDa, lo que indica que el peso molecular del inhibidor es menor de 30 kDa pero
mayor de 10 kDa.
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Para seguir caracterizando al inhibidor, el TCF concentrado y dializado por filtración se cromatografió
R
. Véase la Figura 4. La actividad eluyó en una
en una columna de filtración en gel de Superosa 12
posición correspondiente a aproximadamente 20 kDa. Se determinó la IL-6 por ELISA (R&D Systems).
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R
. Véase
Se concentró el TCF de HL-60 y se aplicó a una columna de intercambio aniónico Mono Q
R
la Figura 5. Se analizaron las fracciones de la columna Mono Q con relación a la actividad inhibidora y
R
, se encontró que la actividad
se encontró que la actividad eluı́a con NaCl 175 mM. En DEAE-Sefacel
eluı́a con NaCl 150 mM.
R
se ha usado previamente para aislar citocinas, se cromatografió el
Debido a que el Azul de Sefarosa
TCF que contenı́a el inhibidor de IL-6 en esta resina. Véase la Figura 6. Bajo las condiciones usadas, la
mayor parte de la proteı́na en el TFC no se unı́a a la columna. La actividad del inhibidor eluı́a en un
ancho pico con NaCl 900 mM aproximadamente (Mezcla A) o con el siguiente etilén glicol 50 %/ NaCl
R
contenı́an
4 M (Mezcla B). Según el SDS-PAGE, las fracciones del pico inhibidor de Azul de Sefarosa
múltiples proteı́nas.
R
) se usó para purificar más el inhibidor. Véase la
La cromatografı́a en fase inversa C1/C8 (ProRPC
R
(Figura
Figura 7. Se encontró que la actividad inhibidora de IL-6 de la mezcla A de Azul de Sefarosa
7A) o la mezcla B (Figura 7B) eluı́a con acetonitrilo aproximadamente al 40 %. Las fracciones activas
R
usando un gradiente más lineal para
de estas series se combinaron y recromatografiaron en ProRPC
mejorar la resolución (Figura 8). La actividad inhibidora eluyó con acetonitrilo aproximadamente al
32 %. El análisis por SDS-PAGE (gradiente en gel de 10 a 20 %) reveló la presencia de múltiples bandas
de proteı́na. Ası́, aunque se alcanzó una purificación significativa del inhibidor a partir del TCF, todavı́a
no se ha purificado el inhibidor a homogeneidad.
Caracterización
R
a 100◦C
Se calentó una mezcla parcialmente purificada del inhibidor eluido de Azul de Sefarosa
durante 15 minutos sin una pérdida significativa de la actividad inhibidora en contraste con lo observado
R
con tripsina inmocon antiIL-6 (véase la Figura 9). El tratamiento de la mezcla de Azul de Sefarosa
vilizada redujo 64 veces la actividad inhibidora (véase la Figura 10). El tratamiento del TCF con ácido
trifluoroacético 0,1 % en acetonitrilo a pH ≤ 2 resultó en una pérdida de actividad de 3 veces (véase la
Figura 11). La incubación con cicloheximida, un conocido inhibidor de la sı́ntesis de proteı́nas, de células
HL-60 tras la estimulación con PMA, resultó en la completa supresión de la actividad inhibidora en el
ensayo B9 (véase la Figura 12). Los resultados de los experimentos anteriores sugieren claramente que la
inhibición vista es el resultado de una proteı́na presente en el TCF de HL-60.
Discusión
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Se detectó un inhibidor de la proliferación de células de hibridoma B9 estimulada por IL-6 en los
fluidos de cultivo de células HL-60 inducidas para diferenciarse por la lı́nea de los macrófagos. El acetato
miristato de forbol (PMA) y el diéster no lipófilo de dibutirato de forbol (PDBu) fueron efectivos como
inductores de la actividad inhibidora. Se encontró que la concentración del inductor y la densidad celular eran parámetros crı́ticos para la optimización de la expresión del inhibidor, por ejemplo, PMA 1-10
ng/ml y 0,5-2,0 x 106 células/ml. La diferenciación de las células HL-60 por la vı́a granulocı́tica con ácido
retinoico (RA) y dimetilsulfóxido (DMSO) no indujo niveles detectables del inhibidor. La exposición de
las células al ionóforo de calcio A23187 con o sin PMA o a combinaciones de RA y PMA, condiciones
que se han descrito como potenciadoras de la activación de las lı́neas celulares monocı́ticas, no tuvo un
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efecto significativo en la expresión del inhibidor.
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La actividad derivada de HL-60 no tuvo un efecto inhibidor en la tasa de proliferación espontánea o
dependiente de IL-1 de las células U373. Estos datos sugieren que la actividad no es de un inhibidor de la
captación de timidina o de la acción de la IL-1, o de un inhibidor no especı́fico de la proliferación celular.
Sin embargo, el inhibidor HL-60 suprimió la tasa espontánea de proliferación de células B9 observada en
ausencia de IL-6 añadida, además de la tasa de estimulación inducida por exposición de las células B9 a
PMA. Aunque el anti-IL-6 no tiene efecto sobre la proliferación espontánea de las células B9, la sı́ntesis
endógena de la citocina puede proporcionar un efecto de crecimiento autocrino y tales efectos autocrinos
pueden ser refractarios a la inhibición por anticuerpos. No se conocen los mecanismos por los que el PMA
estimula la proliferación de las células B9, pero podrı́a ser también dependiente de la sı́ntesis endógena
de IL-6, ya que las células B9 no responden a otras citocinas conocidas. Provisionalmente concluimos que
la actividad derivada de HL-60 es probablemente un inhibidor especı́fico de la IL-6 tanto añadida como
endógena. Es interesante mencionar que la actividad inhibidora puede encontrarse en los sobrenadantes
de HL-60 que contienen concentraciones bastante altas de IL-6. Este hecho sugiere un mecanismo distinto
para el antagonismo del receptor, que podrı́a ser consistente con los efectos diferenciales de antiIL-6 y del
inhibidor de HL-60 sobre la proliferación de las células B9 espontánea e inducida por PMA.
Por lo que sabemos, no se han descrito hasta la fecha inhibidores de IL-6 naturales. Tal como se usa
aquı́, inhibidor humano natural significa un compuesto no construido genéticamente derivado de células
humanas que inhibe la actividad de la IL-6. Se han descrito receptores de la IL-6 solubles, pero se ha
encontrado que estimulan más que inhiben la actividad de la IL-6. Esta es una observación única, ya
que se sabe que otros receptores de citocina solubles son antagonistas. La actividad agonista es probablemente debida a la configuración del receptor de IL-6; una subunidad primeramente extracelular de 80
kDa se une a la IL-6 con baja afinidad y gp130, que tras la unión al complejo IL-6/80 kDa, aumenta
la afinidad del receptor de 80 kDa por la IL-6 y produce la transducción de la señal. Presumiblemente
gp130 reconoce y se une al complejo receptor-IL-6 soluble y se transduce la señal de IL-6.
La sobreexpresión de IL-6 se ha documentado en enfermedades autoinmunes tales como el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide y se sabe que la citocina es un factor de crecimiento de las
células plasmáticas neoplásicas. Aunque no se han citado efectos de los antagonistas de la IL-6 en las
enfermedades autoinmunes, se ha propuesto un papel para la citocina en la patogénesis en función de
los datos disponibles. Se menciona una respuesta clı́nica a corto plazo usando un anticuerpo monoclonal
murino en pacientes con leucemia de células plasmáticas, lo que sugiere que el bloqueo efectivo de la
función IL-6 podrı́a ser un complemento beneficioso para la terapia actual.
Los ejemplos anteriores pretenden ilustrar la invención y para los expertos en la técnica será claro
que se pueden dar variaciones. En consecuencia, se entiende que el alcance de la invención debe limitarse
sólo por las siguientes reivindicaciones.
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REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de interleucina 6 purificado caracterizado por:
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A poder obtenerse de la lı́nea celular HL-60,
B tener un peso molecular de aproximadamente 20.000 daltons determinado por cromatografı́a de
filtración en gel,
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C ser capaz de suprimir la proliferación dependiente de interleucina 6 de las lı́neas celulares dependientes de interleucina 6,
D poder unirse a y eluirse de resinas unidas a azul de Cibacron,
E poder unirse a y eluirse de resinas de intercambio aniónico y
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F poder unirse a y eluirse de resinas en fase inversa.
2. La preparación del inhibidor de la reivindicación 1 en la que el inhibidor eluye de resinas de azul
de Cibacron a concentraciones de NaCl mayores de aproximadamente 800 mM y a pH entre aproximadamente 6,5 y 7,5.
3. La preparación del inhibidor de la reivindicación 1 en la que el inhibidor eluye de resinas de
intercambio aniónico a concentraciones de NaCl mayores de aproximadamente 140 mM y a pH entre
aproximadamente 7,0 y 8,0.
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4. La preparación del inhibidor de la reivindicación 1 en la que el inhibidor eluye de resinas en fase
inversa C1/C8 a concentraciones de acetonitrilo de aproximadamente 30-50 %.
5. La preparación del inhibidor de la reivindicación 1 en la que la supresión de la proliferación se
reduce más de 50 veces por digestión con tripsina.
6. La preparación del inhibidor de la reivindicación 1 en la que la supresión de la proliferación se
abroga por incubación de dichas células HL-60 con cicloheximida.
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7. La preparación del inhibidor de la reivindicación 1 en la que la supresión de la proliferación no se
ve afectada por el calentamiento a 100 grados C durante 15 minutos.
8. La preparación del inhibidor de la reivindicación 1 en la que la supresión de la proliferación se
reduce igualo o más de 2 veces por tratamiento con ácido.
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9. La preparación del inhibidor de la reivindicación 1 en la que la lı́nea celular dependiente de Interleucina 6 es B9.
10. La preparación del inhibidor de la reivindicación 1 en la que las células HL-60 son tratadas con
diésteres de forbol.
11. Un procedimiento para preparar el inhibidor de interleucina 6 de la reivindicación 1 que comprende el paso de poner en contacto las células HL-60 con ésteres de forbol en condiciones suficientes
para inducir la producción de dicho inhibidor de interleucina 6.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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