2.3.3.3.2.- Análisis del ADN por PCR

Silène legionensis ESP: Teruel
28-VI-1995
ESP: Burgos
5-VII-1995
ESP: Palencia
10-VII-1995
Silène nutans
ESP: Burgos
5-VII-1995
Silène vulgaris
ESP: Palencia
13-VII-1995
MA-Fungi
33578
MA-Fungi
33588
MA-Fungi
33591
MA-Fungi
33582
MA-Fungi
33610
TAL 181
TAL 193
TAL 199
TAL 185
TAL 235
2.3.3.3.2.- Análisis del A D N por P C R - R F L P s .
A partir del ADN amplificado por PCR, se procedió a su digestión enzimàtica. Para elio,
de cada muestra se digirieron 10 ul de ADN, durante 1 hora, con 3 unidades de cada una
de las 10 enzimas de restricción que reconocían secuencias de 4, 5 ó 6 pb.
Tabla 4. Enzimas empleadas para la digestión enzimática del ADN.
SITIO DE RESTRICCIÓN
ENZIMA
Alw26I (BsmAI)
BsuRI (HaelII)
Bsul5I(ClaI)
Mval269I (Bsml)
Taql
Bspl286I
5' GTCTC ( N ) , l 3 '
3'CAGAG ( N ) , f 5'
5' G G l C C 3 '
3' CCÎGG 5'
5' ATÍCGAT 3'
3' TAGCÎTA 5'
5' GAATGCN! 3'
3' CTTACÎGN 5'
5' TlCGA 3'
3' A G C Î T 5 '
5' G(G/A/T)GC(C/A/T) i C 3'
T* DE
INCUBACIÓN
CONCENTRACIÓN
PROVEEDOR
37°C
10 u / u l
Fermentas
37°C
10 U/ul
Fermentas
37°C
8 U/ul
Fermentas
37°C
5 U/ul
Fermentas
65°C
10 u / u l
Fermentas
37°C
5 U/ul
65°C
5 U/ul
37°c
4 U/ul
37°C
10 u / u l
37°C
5 U/ul
New England
Biolabs
New England
Biolabs
New England
Biolabs
G1BCO
BRL
GIBCO
BRL
3' C Î (CAT/A)CG(G/T/A)G 5'
Bsrl
Fokl
EcoRI
Pvul
5'
3'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
ACTGGNi 3'
TGACtCN 5'
GGATG (N) 4-3'
CCTAC ( N ) , T 5 '
GIAATTC3'
CTTAAÎG 5'
CGATÍCG 3'
GCÎTAGC 5'
9
3
En la tabla 4 se especifican los datos de estas 10 enzimas que se eligieron sobre la base de
que cortaran en zonas supuestamente variables de las regiones ITS y, sobre todo, de
forma diferente en cada secuencia, para destacar al máximo posible las
diferencias
intraespecíficas. Se buscaron también aquellas que produjeran fragmentos grandes para
facilitar el estudio de los fragmentos en el gel. Gracias a que conocíamos las secuencias