anexo_702-5-2014-05

Extracción de ADN método CTAB
1.- Moler 0.3g de tejido con pistilo en 200 µl de buffer CTAB 3%.
2.- Agregar 600 µl de buffer CTAB 3% y 1.6 µl de β - mercaptoetanol agitar por inversión varias veces (5-10).
3.- Incubar 30 min a 60°C agitando por inversión 5 minutos.
4.- Adicionar 600 µl de cloroformo, alcohol isoamilico (24:1) a cada muestra.
5.- Agitar vigorosamente y centrifugar por 10 minutos a una velocidad de 13,000 rpm.
6.- Tomar la fase superior formada y agregar en un tubo nuevo rotulado.
7.- Adicionar 15 µl de RNAsa con una concentración de1 µg/ µl e incubar las muestras a 37 °C durante una
hora.
8.- Agregar 600 µl de cloroformo alcohol isoamilico (24:1) a una temperatura de -20°C a cada una de las
muestras.
9.- Agitar vigorosamente por inversión y pasar a centrifugar durante 10 minutos a una velocidad de 13,000
rpm.
10.- En un tubo nuevo colocar la fase superior formada.
11.- Adicionar isopropanol al 100% a una temperatura de -20°C (un volumen similar al recuperado de la fase
superior que es aproximadamente 600 µl).
12.- Agitar por inversión de 6-7 veces y centrifugar inmediatamente durante 8 minutos a13,000 rpm (Se
formara una pastilla en el fondo del tubo donde se encuentra el ADN).
13.- Decantar el sobrenadante conservando la pastilla en el tubo.
14.- Agregar un mililitro de etanol al 70% a -20 °C y agitar por inversión.
15.- Centrifugar a 13,000 rpm durante 4 minutos.
16.- Decantar el sobrenadante, conservando la pastilla en el tubo.
17.- Dejar secando el tubo 4-5 horas conteniendo las pastilla en su interior (al secar el alcohol se volatiza).
18.- Resuspender la pastilla en 30 – 50 µl de agua estéril (agua libre de nucleasas).
19.- Agitar hasta disolver en vortex posteriormente centrifugar a 13,000 rpm durante 2 minutos (al centrifugar
el material queda disperso).
20.- Almacenar la muestra a -20°C.
Notas:
I.- En el paso 7 se puede detener el protocolo y guardar las muestras a 4 °C.
II.- El buffer CTAB al 3% está compuesto de (1.4M NaCl, 20mM EDTA PH: 8, 100mM de Tris – HCl PH: 8) y
CTAB al 3%.