Diagnostico directo

DIAGNÓSTICO
?Clínico
Coprológico
Coprocultivos
?Directo=Etiológico=Morfológico
Hemático
Genitourinarios
Biopsias
Precipitación
Inmunodiagnóstico
?Indirecto
Aglutinación
Complemento
Anticuerpos marcados
Genético
Principales parasitosis diagnosticadas coprologicamente
Helmintos (huevos)
1
Principales parasitosis diagnosticadas coprologicamente
Protozoos (trofozoitos de amebas)
Principales parasitosis diagnosticadas coprologicamente
Protozoos (quistes)
2
Principales parasitosis diagnosticadas coprologicamente
Protozoos (flagelados)
Principales parásitos notificados al Sistema de Información Microbiológica (SIM)
Total anual
Anisakis
Ascaris lumbricoides
Blastocystis hominis
2002
2001
3
5
1
2
64
37
2000
37
1999
10
409
378
308
213
Chilomastix mesnili
4
2
1
1
Cryptosporidium sp
121
88
54
97
Cyclospora cayetanensis
Echinococcus granulosus
Entamoeba coli
Entamoeba histolytica
Entamoeba sp
Enterobius vermicularis
Fasciola hepatica
Giardia lamblia
Leishmania donovani
Leishmania sp
Plasmodium falciparum
30
0
1
0
5
10
38
29
20
37
32
31
33
15
3
6
5
2
0
3
262
197
243
232
0
2
1
2
730
561
508
523
2
3
4
1
24
26
16
7
120
114
100
84
Plasmodium malariae
2
Plasmodium ovale
8
7
10
3
Plasmodium sp
3
10
18
16
Plasmodium vivax
8
3
2
23
38
29
22
Schistosoma haematobium
2
1
0
1
Schistosoma mansoni
0
2
1
Taenia saginata
Taenia sp
Toxocara canis
Toxoplasma gondii
Trichomonas vaginalis
Trichuris trichiura
Otros
0
39
29
19
19
1
39
29
47
37
1
4
1
78
58
61
45
198
168
164
165
86
72
35
11
146
122
92
88
35
35
36
37
Número de laboratorios
declarantes
3
Artefactos o pseudoparásitos-I
Huevo
Trichuris
Polen
Polen
Polen
Artefactos o pseudoparásitos-II
Cel. sanguíneas
Eritrocitos
Macrófagos
Célula vegetal
Pelo vegetal
Espiral vegetal
Cuerpos grasos
Cristal CharcotLeyden
Polen
Huevos insectos
Levaduras
Parásito vegetal
4
TOMA DE MUESTRAS
?Recomendaciones al paciente
?Número de muestras
?Cantidad
?Recipientes y seguridad
?Examen y consistencia de las heces
CONSERVACIÓN DE LAS HECES-I
?Fijador de Schaudinn
HgCl2 , etanol, glicerina y acético
Quistes y trofozoitos
Tinciones
No concentración
?Alcohol polivinilico
Schaudinn+PVA
Quistes y trofozoitos (óptimo)
Tinciones
Concentración
Laborioso
?SAF
Acetato sódico, acético y formol
Conserva la mayoría de las formas parasitarias
Concentración
No Hg
Preparación fácil y vida media muy alta
5
CONSERVACIÓN DE LAS HECES-II
?Formol
5% (quistes) y 10% (huevos helmintos)
No valido para trofozoitos
Concentración
No tinción
Preparación sencilla
?MYF
Mertiolato, yodo y formol
¿Permite concentración?
Preserva y tiñe
?Azida sódica
Conserva casi todas las formas
Muy tóxica
EXAMEN MACROSCÓPICO
?Consistencia de las heces
Formes
Semiformes
Blandas
Líquidas
?Presencia de mucus y sangre
?Formas parasitarias
macroscópicas
Limpieza
Montaje
6
EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO
?Heces muco-sanguinolentas (rápido o fijar en PVA)
?Líquidas o semilíquidas (pocas horas)
Métodos de observación
?Formes o semiformes (hasta 24h)
?¿Cómo realizarlo?
Toma de muestra
Tinción opcional
Observación
Cubreobjetos
Heces
Solución
fisiológica
Frotis fecal para tinción permanente
Toma de muestra
Aplicación de la
muestra
Extensión de la
muestra
7
EXAMEN MICROSCÓPICO PREVIA CONCENTRACIÓN
Homogeneizar
?Operaciones previas Restos voluminosos
Restos pesados
Físicos
?Métodos
Sedimentación
Flotación
Físico-químicos
(difásicos)
Efectividad del diagnostico en función del
método seleccionado
Operaciones previas
Homogeneización
Eliminación restos
voluminosos
Eliminación restos
pesados
8
MÉTODOS DE SEDIMENTACIÓN-I
?Faust e Ingalls
?Jahnes y Hodges
?Baroody y Most
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Agua glicerinada
Tamizar
Sedimentar (1h)
Decantar sobrenadante
Repetir el proceso dos veces (45 y 30 min)
Observar sedimento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Agua glicerinada o alcoholizada
Tamizar
Sedimentar 30 s
Centrifugar sobrenadante (1500rpm, 1-2 min)
Resuspender y centrifugar de nuevo
Repetir el ultimo proceso hasta clarificar
Observar sedimento
MÉTODOS DE SEDIMENTACIÓN-II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Tween-80 al1%
Tamizar
Llenar tubo con pinza abierta (2 m aprox)
Sedimentar (20 min)
Cerrar pinza y abrir llave
Observar
?Van Someren
(Modificado por Gregoire)
9
MÉTODOS DE FLOTACIÓN-I
Capas obtenidas- flotación
1. Homogeneizar
2. Reposar 45 min
3. Observar capa superior
?Fulleborn (salmuera)
1.
2.
3.
4.
5.
?Willis (salmuera)
Homogeneizar
Llenar tubo Borrel hasta formar menisco
Cubreobjetos sobre menisco
Reposar 15 min
Observar
Toma de muestra en un método basado en la flotación
MÉTODOS DE FLOTACIÓN-II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Homogeneizar en agua
Tamizar y recoger tamizado en tubo
Centrifugar 1500 rpm, 5 min
Decantar y repetir hasta clarificar
Resuspender sedimento en SO 4Zn
Centrifugar 1500 rpm, 2min
Observar
?Faust (sulfato de zinc)
1. Homogeneizar directamente en SO4Zn
2. Tamizar
3. Seguir pasos 6 y 7.
?Faust simplificado
10
MÉTODOS DE FLOTACIÓN-III
1.
2.
3.
4.
Homogeneizar (Biyoduro-yoduro)
Tamizar
Centrifugar 2500 rpm, 3min
Observar
?Janeckso y Urbanyi
1. Homogeneizar en sacarosa
2. Centrifugar 500 g, 5 min
3. Observar
?Sheather
MÉTODOS DIFASICOS-I
?Rivas
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Homogeneizar (ácido acético 5%)
Tamizar
Tubo ensayo (tamizado+eter)
Emulsionar
Centrifugar 1500rpm, 1min
Observar sedimento
Capas obtenidas
?Ritchie
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Homogeneizar (solución salina)
Tamizar
Centrifugar 1500rpm, 1min
Decantar, resuspender y repetir hasta clarificar
Resuspender en formol 10% y añadir eter
Emulsionar
Centrifugar 1500rpm, 2min
Observar sedimento
11
MÉTODOS DIFASICOS-II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
?Ritchie simple
?Bailenger
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Homogeneizar en formol 10%
Tamizar
Tubo ensayo (tamizado+eter)
Emulsionar
Centrifugar 1500rpm, 2min
Observar sedimento
Homogeneizar (aceto-acetico)
Sedimentar 60 s
Tamizar el sobrenadante
Tubo ensayo (tamizado+eter)
Emulsionar
Centrifugar 1500rpm, 1min
Observar sedimento
MÉTODOS DIFASICOS-III
1.
2.
3.
4.
5.
6.
?Thebauld
Homogeneizar en MYF
Tamizar
Tubo ensayo (tamizado+eter)
Emulsión estable
Centrifugar 1500rpm, 1min
Observar sedimento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
?Blagg y col.
Homogeneizar (TCA+formol)
Tamizar y sedimentar 1min
Ampolla decantación (tamizado+eter)
Emulsionar y reposar 2min
Tomar el liquido claro del fondo
Centrifugar 1500rpm, 1min
Resuspender en solución densa (NaBr)
Centrifugar 1500rpm, 1min
Observar película superficial
12
MÉTODOS DIFASICOS-IV
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Homogeneizar (sulfato sodico)
Añadir gota de Triton
Tamizar
Tubo ensayo (tamizado+eter)
Emulsionar
Centrifugar 1500rpm, 1min
Observar sedimento
?Faust e Ingalls
PARASEP (método comercial patentado)
13
PARASEP (método comercial patentado)
METODOS ESPECIALES COPROLOGICOS-I
Diagnóstico de Enterobius vermicularis
?Técnica de Graham (cinta adhesiva)
Modalidad 1
Modalidad 2
?Técnica de Markey (torunda vaselinada)
14
METODOS ESPECIALES COPROLOGICOS-II
Métodos migratorios (Strongyloides stercoralis)
?Metodo de Baermann y Brugg
?Metodo de Baermann y Lee
?Metodo de la placa de agar (S. stercoralis)
METODOS COPROLOGICOS CUANTITAVIVOS-I
?Útiles para pocas especies
?Intensidad / encuesta epidemiológica
?Orientación tratamiento
?Seguimiento eficacia
?Metodo de Kato-Katz
15
METODOS COPROLOGICOS CUANTITAVIVOS-II
?Método de Stoll
?Método de Cadwell
?Método de la cámara
McMaster
1.
2.
3.
4.
5.
6.
4g heces + Erlenmeyer
60ml NaOH 0.1M
10 bolas vidrio
Homogeneizar
0.15ml en porta + cubre
Huevos contados x 100 = huevos/g
1.
2.
3.
4.
5.
4g heces + Erlenmeyer
4ml antiformina, mezclar y reposar 1h
Solución sacarosa hasta 40ml
Tomar 0.1ml en porta + cubre
Huevos contados x 100 = huevos/g
1.
2.
3.
4.
5.
3g heces + Erlenmeyer
Añadir liquido hasta 45ml
Homogeneizar
Llenar cámara
Huevos contados x 100=huevos/g
DIAGNOSTICO PARASITOS GENITOURINARIOS-I
Schistosoma haematobium
1.
2.
3.
4.
5.
?Sedimentación
Tomar la orina
Depositarla en copa sedimentación
Sedimentación 1-2h
Centrifugar 2000g, 2min
Observar sedimento
?Filtración
1.
2.
3.
4.
Filtrar la orina y extraer filtro
Colocarlo en un portaobjetos
Añadir 1 gota de Lugol
Contar huevos en 10 ml de orina
Infección leve: 1-49 h/10ml
Infección grave: mas de 50 h/10ml
16
Filtración
Toma de orina y filtración
Pase de aire
S. haematobium
Tinción con Lugol
DIAGNOSTICO PARASITOS GENITOURINARIOS-II
Microfilarias
?Triple concentración
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Añadir timerosal al 1% en la orina
Dejar reposar toda la noche (Baermann)
Recoger 10-30ml
Centrifugar 400g, 3-5 min
Resuspender sedimento en solución salina
Centrifugar y examinar
Dispositivo Baermann
Loa loa
?Filtración
Igual que para Schistosoma
17
DIAGNOSTICO PARASITOS GENITOURINARIOS-III
Trichomonas vaginalis
?Muestras
1.
2.
3.
4.
Trichomonas vaginalis
Exudado vaginal
Exudado uretral
Semen
Orina
?Métodos
1. Examen directo:
Diluir con solución salina
Centrifugar si es orina
2. Tinción
3. Cultivo
DIAGNOSTICO HEMATICO-I
Parásitos
Muestra
1.
2.
3.
4.
5.
Plasmodium sp
Babesia sp
Trypanosoma sp
Microfilarias
Leishmania sp
Gota gruesa
1. Sangre
2. ¿Cuándo tomarla?
Frotis fino
Métodos
1.
2.
3.
4.
Examen directo
Gota gruesa
Frotis fino
Previa concentración
18
Plasmodium
Tripomastigotes
Trypanosoma
Amastigotes
19
DIAGNOSTICO HEMATICO-II
Tinciones
1. Giemsa
2. Wright
Examen preparaciones
1. Gota gruesa (100 campos; inmersión)
2. Frotis (200-300 campos; inmersión)
Recomendaciones
1. Fijar frotis o hemolizar gota gruesa
antes de 48h
2. Conservación larga (resina de montaje)
Métodos de concentración
1.
2.
4.
6.
7.
Capa opalina=Buffy Coat
QBC; 3. Knott
Filtración; 5. Gradiente
Triple centrifugación
PHA
DIAGNOSTICO HEMATICO-III
Extensión de la capa opalina (buffy coat)
1. Llenar un capilar de hematocrito (Wintrobe)
2. Centrifugar 100g, 30min
3. Examinar buffy coat
Capas: plasma, células blancas (buffy coat) y eritrocitos
Filtración
Concentración de Knott
1. Sangre citratada (1ml) +
formol 2% (10ml)
2. Centrifugar 500g, 2min
3. Observar sedimento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Sangre citratada (1ml)+agua 10ml
Agitar (hemolisis) y filtrar (5 micras)
Pasar 10ml agua destilada
Pasar aire por el filtro
Pasar 3ml de metanol
Retirar filtro, secar y teñir
20
DIAGNOSTICO HEMATICO-IV
Centrifugación en gradiente
1. Ficoll-Hypaque (4ml)+Sangre heparinizada (4ml)
2. Centrifugar 400g, 40min
Capas: plasma, cel.blancas, parásitos, cel.rojas
Triple centrifugación
1.
2.
3.
4.
Centrifugar la sangre heparinizada 300g, 10min
Recoger sobrenadante y centrifugar 500g, 10min
Recoger sobrenadante y centrifugar 900g, 10min
Examinar sedimento
Método fitohemaglutinina (PHA)
1.
2.
3.
4.
5.
Sangre heparinizada+PHA (0.1mg/ml final)
Mezclar suavemente
Centrifugar 150g, 10min
Centrifugar sobrenadante 700g, 10min
Examinar sedimento
Metodo “Quantitative Buffy Coat” (QBC)
21
ANALISIS DE MUESTRAS ESPECIALES
?Esputo
Paragonimus sp
Quiste hidatidico
Amebosis pulmonar
Larvas Ascaris, Ancylostoma, Necator o Strongyloides
Cryptosporidium
?Líquido cefalorraquídeo
?Aspirados
Tripanosomiosis africana
Meningoencefalitis amebiana
Angiostrongylus cantonensis
Duodenales
Sigmoidoscopia
Gastroscopia
Abscesos pulmonares o hepáticos
Ganglios linfáticos, medula y bazo
Ulceras cutáneas
CULTIVO DE PARASITOS
?Coprocultivos de helmintos
Cultivo en placa Petri
Cultivo fecal en
tira de papel
?Coprocultivos de protozoos
?Inoculación animal
?Xenodiagnóstico
22