Tipificación del virus del papiloma humano en neoplasias

Resumen: M-055
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
Tipificación del virus del papiloma humano
en neoplasias epiteliales malignas de cavidad bucal.
Rosende, Virginia C. - Zibelman de Gorodner, Ofelia - Vallejos, Arnaldo R. - Lucero, Horacio
Lugar de trabajo donde se desarrolla la actividad: Instituto de Medicina Regional
Dirección: Av. Las Heras 727 C.P.: 3500 Resistencia, Argentina
Tel/Fax: 03722-422793 email: [email protected]
Antecedentes:
El rol de los virus en la etiología del cáncer oral es materia de especulación desde hace largo tiempo.1
Silverman menciona que los virus que tienen potencial oncogénico conocido pueden dividirse en dos grupos: los
herpesviruses y los papillomaviruses.1 Los HPV están extendidos en toda la población, producen tumores epiteliales de
la piel y las membranas mucosas2. Componen el género papillomavirus de la familia papovaviridae, son virus sin
envoltura de 50-55mm de diámetro con una cápside icosahédrica formada por 72 capsómeras de distribución oblicua3
que encierran un genoma de DNA circular de doble cadena. 4 – 2 Es un virus epidermotropo.5
De los grupos virales mencionados es tema de nuestra investigación el HPV. Los virus del papiloma humano infectan
selectivamente el epitelio de la piel y las mucosas. Estas infecciones pueden ser asintomáticas, producir verrugas o
asociarse a diversas neoplasias, benignas y malignas.4
Hasta el presente fueron identificados 75 tipos de HPV y se reconocieron muchos otros2, entre ellos hay tipos que
comúnmente se relacionan con lesiones benignas y otros bien reconocidos que implican un alto grado de
transformación maligna.
Los tipos diferentes comparten menos del 90% de sus secuencias de ADN en L1.4 Los HPV son específicos de especie
y los tipos concretos se asocian a manifestaciones clínicas específicas. Reguezi menciona especificidad de sitio de tejido
o latencia del HPV en algunas lesiones epiteliales bucales que se asocian con el HPV.
Además los diferentes tipos de HPV no solo se diferencian por la morfología de las lesiones que producen, sino también
por su posible potencial oncogénico.6 Es por ello que se los ha clasificado en tres grupos de acuerdo a su potencial
oncogénico y al tipo de lesión que producen7 basándose en neoplasias intraepiteliales cervicales. Bonnez y varios
autores los agrupan en los de mayor riesgo HPV tipos 16 y 18, los de riesgo intermedio HPV tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51
y 52 y los de menor riesgo los tipos 6, 11, 42 y otros.2,8
El papel que juegan determinados tipos de dicho virus en la oncogénesis está bien establecido en las lesiones genitales,
no así en otras localizaciones, como la cavidad bucal. Es de aquí que surge el interés por identificar en lesiones bucales
malignas cual o cuales de estos tipos son los más frecuentemente implicados.
La presencia viral ha sido detectada en lesiones precursoras utilizando técnicas de inmunohistoquímica (Peroxidasa –
antiperoxidasa) entre otras.9-10 Como así también en neoplasias benignas y malignas de la cavidad bucal en muchos
trabajos realizados por numerosos grupos de investigadores.11-12-13-14-15
La relación causa – efecto del virus del papiloma humano en el cáncer bucal todavía está siendo estudiada, pudiendo
desempeñar un activo papel en su iniciación. Se han identificado virus de alto riesgo que codifican oncoproteínas que
comprometen el crecimiento celular fisiológico a través de la unión con los productos de los genes supresores tumorales
y posiblemente el efecto oncogénico de estos virus sea la consecuencia, al menos en parte, de estas interacciones. Se ha
postulado también que pueden actuar sinérgicamente con otros co-factores como el tabaco y el alcohol en el desarrollo
de un carcinoma.
Rodrigo Tapia y col16 estudiaron 29 carcinomas de orofaringe con un seguimiento de 36 meses y observaron integración
del gen E6 del HPV 6b y 16 en 23% de los casos. Ehaim y col17 realizaron una evaluación similar y hallaron un 33% de
incidencia de HPV 6 y 16 sugiriendo que la infección viral es un evento temprano en la transformación maligna en los
carcinomas espinocelulares.
Una investigación realizada en la India por D´Costa y col14 sobre 180 pacientes masticadores de tabaco con lesiones
precancerosas y cancerosas bucales, utilizando la técnica de PCR, indicó que el HPV 16 es un agente etiológico
importante en el desarrollo temprano del cáncer oral.
Otros numerosos estudios que vinculan al HPV 16 con el cáncer oral fueron realizados en diversas universidades en
Taiwán,18 Israel,19 Iowa20 y Los Ángeles (EEUU). 4
Un estudio reciente realizado en la Escuela de Medicina Johns Hopkins en Baltimore21 sobre 102 lesiones premalignas,
34 carcinomas espinocelulares y 18 integración del HPV 16 raramente contribuye en la progresión maligna en la
cavidad oral.
Pero no sólo el HPV 16 fue identificado en lesiones malignas bucales, otros tipos también tienen gran incidencia como
ser el HPV 18. Varias investigaciones realizadas en los últimos años 22, 23,24, 25 concluyen que tanto el HPV 16 como el
18 constituyen un factor de riesgo en la carcinogénesis de cabeza y cuello, especialmente en orofaringe y laringe.
Premoli-De-Percoco y Ramirez12 investigaron la presencia de HPV y algunos cofactores etiológicos en el carcinoma de
células escamosas de la cavidad bucal sobre una población de 50 mujeres con ese diagnóstico. Utilizando la técnica de
PCR identificaron los tipos 6, 11, 16 y 18 en el 60% de los casos. El grupo fue analizado de acuerdo a los hábitos de
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fumar, consumo de alcohol, embarazos, salud bucal y nivel socioeconómico. De este trabajo se rescata no sólo la
asociación del HPV con el carcinoma de células escamosas, sino también que apoya un modelo multifactorial de la
etiología del cáncer bucal.
Los propósitos principales de este estudio han sido determinar los tipos de HPV asociados a carcinomas epidermoides
bucales, establecer que tipo viral es el más frecuentemente implicado en ellos y compararlos con los tipos de mayor
incidencia en mucosa genital. Para tal fin se utilizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Materiales y Métodos:
Se analizaron 56 casos de biopsias de lesiones epiteliales malignas de la cavidad bucal diagnosticados durante el
período comprendido entre el 01-01-97 y el 31-12-99 en el Servicio de Patología y Citodiagnóstico del Hospital Dr.
José R. Vidal (Corrientes). Las mismas fueron fijadas en formol e incluidas en parafina.
Además se recolectaron 60 muestras obtenidas por hisopados de lesiones con diagnóstico presuntivo o confirmado de
neoplasias epiteliales malignas de boca de pacientes que concurren al Servicio de Cabeza y Cuello del Instituto de
Oncología “Ángel H. Roffo” las cuales fueron suspendidas en buffer de PBS para su posterior procesamiento.
La técnica de diagnóstico que se utilizó es la de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). Se realizó la amplificación
por PCR usando los primers genéricos MY 9 y 11 que amplifican un fragmento de 450 pb dentro de la región L1.
Las muestras de tacos parafinados primero se analizaron microscópicamente para seleccionar los que presentan
características histológicas de HPV. Luego se realizó la desparafinización de los cortes de tejido con xilol; la extracción
de ADN se realiza de dos maneras: extracción con bromuro de cetil trimetilamonio, con purificación y extracción con
buffer de digestión con proteinasa K con o sin purificación.
A las muestras de hisopados se les realizó, la extracción de ADN con bromuro de cetil trimetilamonio, con purificación,
y extracción con buffer de digestión con proteinaza K con purificación.
En ambos tipos de materiales se realizó la amplificación del ADN por PCR. Los productos amplificados fueron
evaluados por electroforesis en gel de agarosa 3%, y observados en transiluminador previa tinción con bromuro de
etidio.
Se realizó documentación fotográfica.
Además se realizó amplificación de control interno de integridad de ADN extraído: amplificación del gen de β globina.
Las muestras positivas fuertes para HPV fueron sometidas a la técnica PCR – RFLP para tipificar al virus utilizando las
siguientes enzimas de restricción; Bam H1, Dde1, HaeIII, Hinf1, Pst1, Rsa1, y Sau3A1. Fueron evaluados por
electroforesis en gel de poliacrilamida. También se realizó documentación fotográfica.
Discusión de Resultados:
En total se identificaron 56 casos de carcinoma bucal, presentes en tejidos incluidos en tacos de parafina. De los cuales
24 presentaban características histopatológicas de lesiones por HPV y 4 eran dudosos. Cuadro I
Biopsias
56
HPV +
24
HPV 28
Dudosos
4
Cuadro I: Análisis histopatológico de biopsias del Servicio de
Patología y Citodiagnóstico del Hospital “Dr. J. R. Vidal”
Luego de realizar la PCR específica para HPV de 20 muestras que presentaban características histopatológicas de HPV,
ninguna de ellas presentó la banda correspondiente en gel de agarosa (450pb). También se realizó el control interno de
amplificación del gen de β - globina, el que tampoco demostró bandas del amplicón correspondiente (289 bp).
En base a este control se concluyó que los métodos de extracción de ADN no arrojaron cantidades suficientes de ADN
molde que sirviera para la amplificación con primers específicos de HPV.
Debido a los inconvenientes citados se optó por trabajar con muestras frescas obtenidas de hisopados bucales
resuspendidos en buffer de PBS, por lo cual se obtuvieron 60 casos procedentes del Servicio de Cabeza y Cuello del
Instituto de Oncología “Ángel Roffo”, de la Ciudad de Buenos Aires. Se extrajo material genómico y se realizó
amplificación por PCR de todos ellos.
Una vez que se realizó la extracción del material genómico de las muestras de hisopado con bromuro de cetil
trimetilamonio y su posterior amplificación por PCR tanto para HPV como para el gen de β -globina, se observó que
51 casos eran β - globina positivos, 34 HPV negativos y 17 HPV positivos; en los 9 casos restantes el material fue
insuficiente para realizar el estudio. Cuadros II y III
Estudiadas por
PCR
Genotipificadas
20
0
51
6
71
0
Cuadro II: Total de muestras de ambos tipos de materiales.
Tipos de muestras
Biopsias
Hisopados bucales
Totales
Nº
56
60
116
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Hisopados HPV + HPV 60
17
34
Material insuficiente*
9
Cuadro III: Resultados de PCR de hisopados bucales procedentes del
Servicio de Cabeza y Cuello del Instituto de Oncología “Ángel Roffo”
* corresponde a muestras que presentaron baja carga genómica.
De las 17 muestras HPV positivas, solo 6 presentaron suficiente carga viral como para realizar la PCR – RFLP, para
tipificación del virus.
Conclusión:
De acuerdo al análisis de nuestros resultados podemos concluir que las muestras de biopsias no presentaban carga
genómica suficiente. Una probabilidad es que no hubieran sido fijadas correctamente para la técnica de PCR en el
momento de la toma de la muestra y por ello nuestros resultados fueron desfavorables.
En cambio las muestras de hisopados, pudieron ser perfectamente procesadas; en ellas se observó un 30% de infección
de HPV, por lo que no podemos determinar que el virus esté directamente vinculado con la carcinogénesis o bien sea un
factor que al sumarse a otros contribuye a la producción de carcinomas bucales.
Por presentar baja carga viral no se pudo tipificar en gran parte el material HPV positivo. Esto puede deberse a dos
motivos: que la técnica de hisopado bucal no obtenga suficiente material, o que el virus no se encuentre infectando con
mucha intensidad a la mucosa bucal.
De las muestras que pudieron ser tipificadas, en su mayoría presentaban tipos indeterminados. Por lo tanto nuestra
hipótesis de que los tipos infectantes en mucosa genital y vinculados con carcinomas genitales coincidirían con los de
mucosa bucal quedaría refutada.
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