universidad nacional abierta ya distancia

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo Prácticas LN y A – Prof: Jairo Granados
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA
ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLA, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE
ECAPMA
PROTOCOLO DE PRÁCTICAS PARA LA ESCUELA
LABORATORIO DE NUTRICIÓN ANIMAL Y ALIMENTACIÓN
Coordinador
JAIRO ENRIQUE GRANADOS MORENO., MSc.
2014
1
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo Prácticas LN y A – Prof: Jairo Granados
Análisis Químico Proximal de Wendee
1. Determinación de Humedad
Este método determina el agua contenida en los alimentos, (Harris col, 1970)
2. Determinación de materia seca total por estufa
2.1 Equipos y materiales:

Estufa 105º

Tamiz 1 mm

Balanza Analítica

Molino

Crisoles de porcelana
2.2 Procedimiento:

Moler la muestra seca en el molino con un tamiz de 1 mm

Pesar 2 g de muestra en un crisol de porcelana

Introducir la muestra en la estufa de aire forzado a una temperatura de 105º
C hasta peso constante (aproximadamente 12 h) y pesar nuevamente la
muestra. El resultado puede usarse para la determinación de grasa.
2.3 Cálculos:
% Materia Seca =
P, muestra seca
X 100
P .muestra húmeda
Donde: P = Peso
3. Determinación de la humedad método por destilación con tolueno
El método tiene aplicación especialmente cuando el material de análisis contiene
además de agua otras sustancias volátiles (AOAC, 1960).
3.1 Equipos y materiales

Aparato de destilación

Balanza Analítica.

Reactivos: Tolueno R. A.
3.2 Procedimiento:
2
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo Prácticas LN y A – Prof: Jairo Granados

Se pasa la cantidad de muestra necesaria para que se obtenga de 2 a 5 ml
de agua, se agrega suficiente tolueno para cubrir la muestra (75 ml.
aproximadamente).

Si la muestra probablemente va a salpicar, para regular la ebullición se
agrega en el fondo del matraz un poco de arena seca previamente lavada o
piedra pómez.

Se conecta el matraz al aparato,

se llena el tubo de recepción con tolueno, vertiéndolo en la parte superior
del condensador y se lleva a ebullición.

Se destila aproximadamente a una rata de dos gotas por segundo hasta
que casi toda el agua haya pasado, luego se aumenta la rata de destilación a
cuatro gotas/segundo.

Al terminar la destilación se lava cuidadosamente el refrigerante de reflujo
con tolueno.

Si alguna gota de agua permanece en el refrigerante, se mueve por medio
de un alambre de cobre con su punta envuelta en una banda de caucho
humedecida con tolueno; se lee el volumen de agua que haya destilado.
3.3 Cálculos:
El contenido de humedad expresada como porcentaje se calcula aplicando la
siguiente fórmula:
H = (V / W )*100
H = Porcentaje de humedad
V = Volúmenes de agua leído, en mililitros
W = Peso de la muestra en gramos
4. Determinación de Ceniza y de Materia Orgánica
Este método cuantifica la materia mineral total de alimentos, es el residuo de la
eliminación de la materia orgánica (AOAC, 1990).
4.1 Equipos y materiales

Molino

Tamiz 1mm

Balanza Analítica

Crisoles de porcelana

Mufla
4.2 Procedimiento:
 Pesar crisoles de porcelana previamente secados y tarados en mufla a 550
3
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo Prácticas LN y A – Prof: Jairo Granados
ºC
 Pesar 2.0 g muestra seca de 1 mm en el crisol de porcelana.
 Llevar crisoles a la mufla
 Calcinar previamente a 200 o C por 20 min. aproximadamente
 Aumentar a 550oC y calcinar la muestra por cuatro horas hasta alcanzar
una coloración blanca o grisácea (aproximadamente 4 a 6 h)
 Aumentar una hora más si no se ha eliminado todas las partículas de
carbón.
 Apagar y esperar que baje la temperatura.
 Abrir y llevar crisoles al desecador hasta que alcance la temperatura
ambiente (aproximadamente 30 min.) y pesar
4.3 Cálculos:
% Ceniza =
Peso Residuo X 100
Peso muestra
% Materia Orgánica 100 % Ceniza
5. Determinación de proteína cruda (MICRO-KJELDAHL)
Este método determina el nitrógeno total, en forma de amonio, de los alimentos sin
diferenciar si proviene de proteínas o de otra fuente proteica. En las condiciones
en que se realiza la prueba no determina el contenido de nitrógeno en forma de
nitratos o nitritos (AOAC, 1990).
5.1 Equipos y materiales

Balanza analítica

Balones para Kjeldahl de 100 ml

Aparato digestor para análisis para Kjeldahl.

Aparato destilador

Erlenmeyers 50 ml

Vasos de precipitado de 50 ml

Agitador magnético

Buretas

Titulador
4
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo Prácticas LN y A – Prof: Jairo Granados
5.2 Reactivos
 Ácido Sulfúrico concentrado
 Catalizador:
 Dióxido de Titanio  TiO2
0.3 g
 Sulfato de Cobre  CuSO4. 5H2O
0.3 g
 Sulfato de Sodio  Na2SO4 anhidro 16.0 g
 Hidróxido de sodio al 60%
 Zinc en granallas
 Indicador mixto:
 Bromocresol
0.25 g
verde
0.05 g
 Rojo de metilo 100 ml
 Etanol absoluto
 Ácido bórico al 4 %; 40 g de ácido bórico en 1 litro de agua
 Ácido estándar 0.1 N (Puede ser ácido clorhídrico o ácido sulfúrico).
 Agua destilada
5.3 Procedimiento:
5.3.1 Digestión:
 Moler la muestra seca en el molino con un tamiz de 1 mm,
 Pesar 0.1 g de la muestra en un balón para Kjeldahl de 100 ml, adicionar
1,6 g de catalizador y 2,5 ml de ácido sulfúrico concentrado.
 Calentar en el digestor, primero a temperatura moderada hasta que la
formación de la espuma cese y después a modo de mantener una ebullición
activa subir la temperatura hasta que la solución clarifique.
 Continuar por 15-20 minutos más después de alcanzar este punto.
 Dejar enfriar y agregar 30 ml de agua destilada.
Nota: El análisis puede suspenderse en este punto en caso que así sea necesario.
Dejar los matraces debidamente tapados con tapón de hule.
5.3.2 Destilación:
 Colocar 5 ml de ácido bórico con indicador en un erlenmeyer de 50 ml,
asegurarse de que la punta del condensador (tubo de salida del destilador)
quede totalmente sumergido en el ácido bórico.
 Añadir al balón para Kjeldahl 1 o 2 granallas de zinc
 Sosteniendo el balón en posición inclinada, añadir cuidadosamente por las
paredes del balón, 8 ml de hidróxido de sodio, de tal forma que forme dos
5
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo Prácticas LN y A – Prof: Jairo Granados
capas.
 Conectar inmediatamente el balón Kjeldahl al aparato de destilación y agitar
el contenido.
 Calentar hasta que todo el NH3 haya sido destilado (30 ml de destilado son
suficientes).
 Bajar el erlenmeyer de manera que el extremo del condensador quede
fuera de la solución de ácido bórico y apagar el sistema de calentamiento.
 Enjuagar con agua destilada la punta del condensador.
 Hacer una prueba en blanco con todos los reactivos por lo menos una vez
al día y cuando se cambie de reactivos.
5.3.3 Titulación:
 Titular con la solución 0.1 N de ácido clorhídrico o sulfúrico el contenido del
erlenmeyer hasta el cambio de color del indicador de azul a rosado.
 Substraer de esta cifra el volumen de ácido estándar necesario para
neutralizar la determinación del blanco
5.3.4 Notas:
 La cantidad de H2SO4 necesaria para obtener una digestión completa de la
muestra es variable y depende de la composición de la misma, 1 g de grasa
consume 12 ml y 1 de carbohidratos 6 ml de H2SO4 durante la digestión.
 Si se quiere determinar también nitrógeno de nitratos deberá adicionarse un
reductor durante la digestión como tiosulfato de sodio o polvo de Zinc
(Consultar técnica especifica).
 Por cada 10 ml de ácido sulfúrico usado o su equivalente en ácido diluido,
agregar 15 gramos de NaOH sólido o suficiente en solución para alcalinizar
fuertemente.
 Cuando se usa ácido bórico durante la destilación hay que titular los
matraces inmediatamente, ya que a temperaturas superiores a 25º C suele
haber pérdidas de nitrógeno.
5.4 Cálculos:
% Nitrógeno = (ml ácido x normalidad del ácido) x (0.014)
(Peso de la muestra en gramos)
% Nitrógeno = % Proteína calculada = % Nitrógeno x Factor de Proteína (6.25)
Donde:
V1 = Volumen del ácido gastado en la titulación de la muestra problema
V2 = Volumen del ácido gastado en la elaboración del blanco de reactivos
N = Normalidad del ácido usado en la titulación
6
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo Prácticas LN y A – Prof: Jairo Granados
P = Peso
6. Determinación de Grasa
Los aceites y grasas presentes en la muestra seca se extraen para cuantificar con
un disolvente orgánico, éter etílico o de petróleo. Por este método se extrae
también otras substancias solubles en estos disolventes como ceras y pigmentos.
En el caso de forrajes verdes ricos en clorofila y pigmentos el método descrito
sobrestima el contenido de grasa. (AOAC, 1990).
6.1 Equipos y materiales
 Extractor de grasa en serie Goldfisch o una serie de extractores Soxhlet
 Beaker de vidrio de 100 ml
 Dedales de vidrio
 Tubos de vidrio
 Papel filtro
 Pinzas metálicas
 Balanza
 Reactivos: Éter etílico, éter de petróleo o bencina
6.2 Procedimiento
 Pesar 1.0 g de la muestra seca en un papel filtro
 Doblar perfectamente y numerar
 Previamente lavar y secar los beaker en estufa 105 x 3 horas
 Llevar beaker al desecador por media hora (hasta alcanzar la temperatura
ambiente)
 Utilizar bandejas de madera y pinzas para transporte y manipuleo de
beaker, para evitar contaminar el vaso con grasa de las manos o de los
mesones.
 Pesar los beaker
 Colocar el papel con muestra dentro del dedal de vidrio y llevarlo al aparato
extractor Goldfisch.
 En los beaker colocar 40 ml de éter
 Llevar los beaker al Goldfisch
 El tiempo de extracción de 4 horas a velocidad de condensación de 5 a 6
gotas por segundo, un goteo más lento requiere un tiempo de extracción
mayor, hasta 16 horas, de 2 a 3 gotas por segundo.
 Retirar el dedal y reemplazarlo por un tubo recolector del éter.
 Colocar los beaker en estufa a 60 º C por 2 horas.
 Enfriar en desecador y pesar.
7
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo Prácticas LN y A – Prof: Jairo Granados
6.3 Cálculos
% Extracto etéreo  Peso del extracto x 100
Peso muestra
6.4 Notas:
 Grandes cantidades de componentes solubles en agua como carbohidratos,
urea, ácido láctico, glicerina y otros pueden interferir con la extracción de
grasa; si ese es el caso extraer 2 g de muestra sobre un papel filtro en un
embudo con cinco porciones de 20 ml de agua antes de secar la muestra para
determinar el extracto etéreo.
 Muestras ricas en grasa en ocasiones requieren una extracción antes del
secado y una segunda extracción después.
 La asociación Europea de producción animal sugieren el uso del éter de
petróleo, argumentando que el éter etílico extrae sustancias aparte de la grasa
como azúcares y pigmentos, además por razones de seguridad del laboratorio
ya que el punto de ebullición del éter de petróleo es de 55-65 ºC aunque para
realizar la extracción con estos disolventes se requiere mayor temperatura.
7. Determinación de Fibra Cruda
Es una mezcla heterogénea de glúcidos (celulosa y hemicelulosas) y otros
materiales como lignina, esencialmente indigeribles por animales de estómago
simple. El método de análisis establecido incluye una doble digestión con ácido
sulfúrico e hidróxido de sodio, sin embargo se ha probado que la combinación de
las dos digestiones disuelve hasta el 80% de la hemicelulosa, del 20-50% de la
celulosa y del 50-90% de la lignina presente en la muestra, lo que subestima el
contenido de la fibra cruda (Adenskog, 1977).
Este método determina la fibra como la pérdida por calcinación del residuo de las
digestiones ácidas y alcalinas de la muestra. El método es aplicable a granos,
pastos, harinas y concentrados que contengan material fibroso.
7.1 Equipos y materiales
 Balanza analítica
 Aparato digestor con vasos de 600 ml (Labconco Corp.)
 Crisoles de porcelana de 30 ml
 Desecador
 Bomba de vacío
 Baño de agua
 Crisoles de porcelana
 Bolsas de digestibilidad cuyas dimensiones son 6x9 cm. Y poro de 50μm
 Beakers Berzelius 600 ml
 Mufla 550º C
8
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo Prácticas LN y A – Prof: Jairo Granados
7.2 Reactivos
 1. Solución de ácido sulfúrico 0.255 N (1.25 g de H2SO4 en 100 ml de
agua)
 Hidróxido de sodio 0.313 N (1.25 g de NaOH en 100 ml de agua)
 Fragmentos de vidrio o porcelana para regular la ebullición
 Alcohol etílico al 75% o Acetona
7.3 Procedimiento
7.31 Digestión Ácida
 Pesar con exactitud aproximadamente 2 gramos molido en tamiz de 1 mm
de muestra seca y desengrasada con éter de petróleo (Si el contenido de
grasa es  1 % se debe realizar extracto con éter etílico o de petróleo, si su
contenido es menor este procedimiento se puede omitir).
 Transferirla a un vaso de Berzelius de 600 ml. Evitar contaminación de la
fibra de la muestra por el papel o el cepillo.
 Adicionar 200ml de ácido sulfúrico 1.25 % caliente (cercano a ebullición) en
pequeños chorros directamente sobre la muestra para ayudar a su completo
remojo. Se puede adicionar los fragmentos de vidrio o porcelana para regular
la ebullición.
 Colocar los beaker sobre los aparatos de digestión y hervir por 30 min.,
rotando los beakers constantemente evitando que los sólidos se adhieran a
las paredes.
 Cerca del final del reflujo transferir la muestra en crisoles con filtro de vidrio
y filtrar con bomba de vacío, lavar con abundante agua cercana al punto de
ebullición, filtrar a sequedad en bomba de vacío y lavar el residuo con 4
porciones de 50 ml de agua caliente, filtrando cada lavado.
7.3.2 Digestión Alcalina
 Transferir el residuo cuantitativamente, incluyendo un Lavado del residuo
del crisol filtrante con Hidróxido de sodio 1.25% cercano al punto de
ebullición.
 Añadir 200 ml de la solución de NaOH 1.25 % caliente, y hervir
exactamente por 30 minutos.
 Filtrar como se indico en la digestión ácida.
 Lavar con una porción de 25 ml de H2SO4 de 1.25% caliente (cercano al
punto de ebullición), tres porciones de 50 ml de agua y 25 ml de alcohol
etílico (luego de cada lavado dejar filtrar la muestra de 3-5 min., antes de
colocarla en la bomba de vacío).
 Secar el residuo y transferir a un crisol de porcelana previamente tarado y
pesado (el tarado se realiza en la mufla a 550 º C por 2 horas).
7.3.3 Secado y Calcinación
9
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo Prácticas LN y A – Prof: Jairo Granados
 Secar el residuo por 12 h a 110º C o por 2 h de 128-132º C, enfriar en
desecador y pesar.
 Calcinar a 550 º C por 2 horas
 Enfriar en desecador y pesar. No sacar los crisoles de la mufla hasta que la
temperatura sea  250º C.
7.4 Cálculos:
% C = (Peso del crisol con residuo seco- Peso después de la calcinación) x 100
Peso de la muestra
% FC = (C) X (100-% humedad- % grasa cruda)/100
Donde:
C= Fibra Cruda en muestra seca y desengrasada
FC = fibra cruda en muestra original
7.5 Notas:
 Existe una modificación realizada por el laboratorio de Nutrición Animal , la cual
consiste en:
 La muestra es pesada y transferida en bolsas de digestibilidad cuyas
dimensiones son 6x9 cm. Y poro de 50 µm, la muestra sufre todo el proceso
de digestión tanto ácida como alcalina y los lavados se realizan en la misma
forma como antes se indicó.
 La muestra una vez digerida y lavada se transfiere a crisoles porosos
tarados y pesados.
8. Determinación del Extracto libre de Nitrógeno (ELN) o, Carbohidratos no
estructurales (CNE)
Este valor se estima por diferencia restando de 100 los porcentajes de humedad,
proteína cruda, extracto etéreo, fibra cruda y cenizas. Esta constituido por
almidones, azucares solubles, pectinas, ácidos orgánicos, mucílagos y también
incluye cantidades variables de celulosas y ligninas (AOAC, 1990).
% ELN o, CNE = 100 - (% H+ % C + % PC + % E.E. + % F.C)
Donde:
% H = % humedad
% C = % Ceniza
% PC = % Proteína Cruda
% E.E = % Extracto Etéreo
% F.C = % Fibra Cruda
10