Cambios en el transportador de hierro DMT

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FARMACOLÓGICA Y
TOXICOLÒGICA
Cambios en el transportador de hierro DMT-1 en yeyuno
proximal de pacientes obesos sometidos a bypass gástrico
Profesor Patrocinante:
Directores de Memoria:
Dr. Guillermo Díaz Araya
Dr. Guillermo Díaz Araya
Dr. Andrés MarambioGranic
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO
FARMACÉUTICO
ROBERTA FABIOLA ZÚÑIGA MAÑARICÚA
SANTIAGO-CHILE
SEPTIEMBRE DE 2011
Agradecimientos
Antes que todo quisiera agradecer la oportunidad y confianza que tuvo
hacia mi persona el profesor Guillermo Díaz al poner en mis manos este proyecto
en el cual había que tener mucho cuidado con las muestras por su tamaño y
escasez. Decir también que además de ser un profesor es un buen guía y como
un padre para los que trabajamos en el laboratorio.
Además agradecer la oportunidad generada por el Dr. Andrés Marambio de
participar en este proyecto y su disponibilidad ante cualquier duda, así como
también agradecer la confianza depositada en mí para llevar a cabo el análisis de
este estudio.
No puedo dejar de mencionar que nada de esto hubiese funcionado sin el
apoyo, cariño y amor incondicional que me brindó, me brinda y me seguirá
brindando mi familia, tanto mis padres (Roberta y José) como mis hermanos (José
y Bárbara), a mi abuelita (Elza), a mis amigos (los del colegio y los de la U.) por su
apoyo en los buenos y malos momentos, a mi pololo Raúl Valenzuela no sólo por
el apoyo y amor incondicional sino también por su paciencia, su tiempo y
dedicación, por sus palabras de aliento cuando las necesité, cuando no me
resultaban los experimentos, y, como no mencionarla, a mi lelita (Matilde), quien
vivió mis primeros 5 años de universidad y que hoy y siempre ha estado presente
en todo, ya no física pero si espiritualmente.
También agradecer a la familia de mi pololo por la preocupación, el apoyo y
el cariño entregado, que también fue un impulso para ponerme una fecha límite
para terminar mi tesis y dar mi examen de grado.
Finalmente pero no por eso menos importante agradecer a todos quienes
estuvieron siempre ayudándome en el laboratorio, dándome consejos de todo tipo
(Mabel, Ivonne, Diego, Marcelo, Raúl, Pedro), a quienes siempre me facilitaban los
equipos y/o reactivos (Fidel y Ruth), que fueron parte fundamental para llevar a
cabo mi tesis.
Sólo me resta decirles a todos y cada uno de ustedes MUCHAS GRACIAS por
todo, espero que después me sigan apoyando en el nuevo camino que emprenda.
2
ÍNDICE GENERAL
Resumen ............................................................................................................................... 5
Summary ............................................................................................................................... 6
Introducción .......................................................................................................................... 7
1.1
Obesidad ................................................................................................................ 7
1.2
Tratamiento de la obesidad ................................................................................. 9
1.2.1
Tratamiento fármaco terapéutico ................................................................ 9
1.2.2
Tratamiento quirúrgico ................................................................................ 10
1.3 Complicaciones nutricionales en la cirugía bariátrica por bypass gástrico
(anemia por déficit de hierro) ....................................................................................... 12
1.4
Tipos de anemia .................................................................................................. 14
1.4.1
1.5
Anemia ferropénica ..................................................................................... 14
Absorción gastrointestinal de hierro ................................................................. 15
1.5.1. Histología del intestino delgado................................................................. 15
1.5.1.1
Mucosa ...................................................................................................... 16
1.5.1.2
Submucosa ............................................................................................... 19
1.5.1.3
Muscular .................................................................................................... 19
1.5.1.4
Serosa ........................................................................................................ 20
1.6
Transportador intestinal de hierro..................................................................... 20
2.
Hipótesis ...................................................................................................................... 24
3.
Objetivo general ......................................................................................................... 24
4.
Objetivos específicos ................................................................................................ 24
5.
Materiales y métodos ................................................................................................ 25
5.1
Pacientes .............................................................................................................. 25
5.2
Reactivos .............................................................................................................. 26
5.3
Toma de muestra ................................................................................................ 26
5.4
Tratamiento y conservación de muestra ......................................................... 26
5.5
Electroforesis en gel de poliacrilamida ............................................................ 27
5.6
Electrotransferencia de proteínas..................................................................... 27
5.7
Western blot ......................................................................................................... 27
5.8
Inmunohistoquímica ............................................................................................ 28
5.9
Análisis estadístico ............................................................................................. 30
3
6.
7.
Resultados .................................................................................................................. 31
6.1
Comorbilidades asociadas a la obesidad ........................................................ 31
6.2
Disminución de peso post operatorio............................................................... 32
6.3
Exámenes de sangre .......................................................................................... 32
6.4
Inmunohistoquímica ............................................................................................ 34
6.5
Expresión de DMT-1 ........................................................................................... 40
Discusión ..................................................................................................................... 42
7.1
Reducción de las comorbilidades asociadas a la obesidad ......................... 42
7.2 Disminución de peso post operatorio en pacientes sometidos a cirugía de
bypass gástrico .............................................................................................................. 43
7.3
Presencia de anemia en pacientes sometidos a cirugía de bypass gástrico
44
7.4
Cambios tisulares en yeyuno proximal post cirugía de bypass gástrico .... 46
7.5
Cambios en la expresión y localización de DMT-1 ........................................ 47
7.6
Limitaciones del estudio ..................................................................................... 49
8.
Conclusiones .............................................................................................................. 50
9.
Bibliografía .................................................................................................................. 51
4
Resumen
En las últimas décadas ha habido un aumento explosivo del número de cirugías
bariátricas, entre ellas la de mayor importancia ha sido el bypass gástrico en Y de
Roux. A pesar de que estos pacientes son sometidos a una dieta suplementada
con hierro, estos pacientes a largo plazo (un año después), padecen de déficit de
hierro y/o anemia. Por lo tanto, en esta memoria se estudió si existe correlación
entre la anemia y el nivel del transportador de hierro a nivel del yeyuno proximal,
porción del intestino delgado que en esta cirugía, queda inmediatamente después
del estómago.
En este estudio se analizaron muestras de yeyuno proximal de pacientes
sometidos a cirugía bariátrica al tiempo de la cirugía y seis meses después, con el
fin de evaluar: a) cambios histológicos, b) cambios en expresión y en la
localización tisular del transportador de hierro-1 (DMT-1), y c) exámenes de
sangre para evaluar presencia de anemia.
La cirugía bariátrica disminuyó el peso de pacientes obesos, en al menos un 54%
del exceso de peso; sin embargo, a los seis meses estos pacientes no
presentaron anemia ferropénica. La cirugía de bypass gástrico produjo cambios
histológicos en el yeyuno proximal, entre ellos una atrofia parcial de las
vellosidades de la mucosa yeyunal proximal, y un aumento en las células
caliciformes,
El
análisis
de
DMT-1
tanto
por
inmunowesternblot
como
inmunohistoquímica, mostró que a los seis meses de la cirugía hubo una
disminución en los niveles de expresión y cambios en su localización en las
vellosidades del yeyuno proximal.
Conclusión: Estos resultados sugieren que el déficit de hierro y/o anemia que
presentan los pacientes después de un año de la cirugía bariátrica, podrían
deberse a los cambios histológicos y de expresión observados después de los seis
meses, los cuales podrían explicar la anemia tardía que en ellos se presenta.
5
Summary
Changes in the iron transporter DMT-1 in proximal jejunum of gastric
bypass obesity patients
In recent decades there has been an explosive increase in the number of bariatric
surgeries, the most important has been the gastric bypass Roux. Although the
patients are subjected to a diet supplemented with iron, these patients long-term
(one year later), suffer from iron deficiency and / or anemia. Therefore, in this
thesis, we examined whether there is a correlation between anemia and iron
transporter levels at the proximal jejunum of the small intestine, which in this
surgery is immediately after the stomach.
This study analyzed samples of proximal jejunum of patients undergoing bariatric
surgery at the time of surgery and six months later to assess: a) histological
changes, b) changes in expression and tissue localization of iron transporter -1
(DMT-1), and c) blood tests to assess anemia.
Bariatric surgery reduces the weight of obese patients, at least 54% of excess
weight, but after six months these patients did not have iron deficiency or anemia.
Gastric bypass surgery produced histological changes in the proximal jejunum,
including a partial atrophy of the villi of the proximal jejunal mucosa, and increased
goblet
cells.
The
analysis
of
DMT-1
both
inmunowesternblot
as
immunohistochemistry, showed that six months after surgery there was a decrease
in expression levels and changes in its location in the villi of the jejunum.
Conclusion: These results suggest that iron deficiency or anemia after a year of
bariatric surgery may be due to the histological and expression levels changes
observed after six months, which could explain the late anemia.
6
Introducción
1.1
Obesidad
El sobrepeso y la obesidad se definen como una acumulación anormal o
excesiva de grasa que puede ser perjudicial para la salud [1].
Hoy en día la obesidad constituye una verdadera epidemia, dado un
aumento sostenido de sus cifras desde las últimas décadas, llegándose a doblar
en cantidad los obesos desde 1980 al 2008 [2], año en el cual se estimó una
prevalencia de 200 mil obesos y cerca de 300 mil obesas en todo el mundo. En
2010, alrededor de 43 millones de niños menores de cinco años tenían sobrepeso
[1].
En términos antropométricos la obesidad se define como un Índice de Masa
Corporal (IMC)>30 (definido IMC como el peso / talla2). El IMC proporciona la
medida más útil del sobrepeso y la obesidad en la población, puesto que es la
misma para ambos sexos y para los adultos de todas las edades. Sin embargo,
hay que considerarla a título indicativo porque es posible que no se corresponda
con el mismo nivel de masa muscular en diferentes personas [1].
Según la OMS se han clasificado distintos grados de obesidad según el
IMC o severidad de ésta. De esta forma tenemos obesidad grado I, II o III (u
obesidad mórbida), lo que permite clasificar a los pacientes y poder estimar no
solo su riesgo cardiovascular, sino que también su asociación con diversas
comorbilidades (Tabla N°1). Sin embargo esta clasificación ha sido sobrepasada
en la medida que no solo aumenta el número de obesos, sino que también el peso
de estos, reconociéndose nuevas categorías tales como los super obesos (IMC
40-50), super-superobesos (IMC 50-60) y megaobesos (IMC>70) [3].
7
TABLA N°1: Clasificación Internacional de estado nutricional de adulto según IMC
Clasificación
IMC (kg/m2)
Bajopeso
<18,5
Delgadez severa
<16
Delgadez moderada
16-16,99
Delgadez leve
17-18,49
Normal
18,5-24,49
Sobrepeso
≥25
Preobeso
25-29,99
Obeso
≥30
Obeso clase I
30-34,99
Obeso clase II
35-39,99
Obeso clase III
≥40
Adaptado de OMS 2011
En Chile, según la última Encuesta Nacional de Salud 2009-2010, sólo el
36,9% de la población presenta un estado nutricional normal (IMC 18,5<24,9), un
37,8% está sobrepeso (IMC 25<30), 23,2% presenta obesidad (IMC >30) y un
1,3% presenta obesidad mórbida (IMC > 40) [4].
El sobrepeso y la obesidad son el quinto factor principal de riesgo de
defunción en el mundo. Cada año fallecen por lo menos 2,8 millones de personas
adultas como consecuencia del sobrepeso o la obesidad. Además, el 44% de la
carga de diabetes, el 23% de la carga de cardiopatías isquémicas y accidentes
vasculares y entre el 7% y el 41% de la carga de algunos tipos de cánceres
(endometrio, mama y colon) son atribuibles al sobrepeso y la obesidad [5]
8
1.2
Tratamiento de la obesidad
El tratamiento de la obesidad se divide en fármaco terapéutico o quirúrgico.
1.2.1
Tratamiento fármaco terapéutico
El tratamiento fármaco terapéutico es el de primera línea en cualquier
paciente que desee bajar de peso, ya sea por voluntad propia o por indicación
médica. Este consiste en diversos pilares de tratamiento, que incluyen desde
cambios en el estilo de vida, dieta y/o fármacos. Todo paciente debe ser instruido
en diversos cambios a los cuales debe atenerse a fin de no solo bajar de peso
sino también disminuir su riesgo cardiovascular. De esta forma se deben instruir
medidas que permitan llevar una vida más saludable, alejados del tabaco, alcohol
y sedentarismo, siendo en este punto importante la realización de una actividad
física aeróbica regular, que permita aumentar el consumo de calorías además de
traer consigo beneficios cardiovasculares, osteoarticulares, pulmonares, etc.
Asociado a esto se debe instruir una dieta adecuada a las necesidades de cada
paciente, que sea balanceada e incluya suplementos de acuerdo a cada caso
particular. En este punto es importante la consulta nutricional, ya que es el
nutricionista el profesional encargado de instruir al paciente, realizar el cálculo
calórico, favorecer ciertos alimentos y adecuar la dieta según las preferencias,
comorbilidades y avances en el tratamiento de cada paciente. Asociado a los
cambios en el estilo de vida y régimen alimentario, se deben abordar todas las
aristas que incluyen al síndrome metabólico, por lo que es importante incluir las
alteraciones de la presión arterial, glicemia y dislipidemias. Todos los pacientes se
deben realizar un chequeo médico completo que incluya la anamnesis, exámen
físico y de laboratorio a fin de pesquisar las diversas comorbilidades asociadas al
sobrepeso/obesidad, como las mencionadas anteriormente.
Dado el grado de especialización hoy existente, es tarea del nutriólogo
realizar estas actividades y dar las indicaciones de acuerdo a sus hallazgos,
derivar a la nutricionista o referir a otros especialistas. Además debe controlar los
avances ponderales y según lo estime conveniente, indicar el segundo pilar del
tratamiento, el cual es el farmacológico. Diversos fármacos han estado en uso
9
para esta patología, el más utilizado hasta octubre de 2010 fue la sibutramina, el
cual fue retirado debido a los accidentes vasculares presentados por quienes lo
consumían. También se autorizó el uso de los inhibidores de endorfinas
(Rimonabant), con buenos resultados, pero su uso hoy en día está nuevamente en
evaluación dado efectos asociados importantes, tales como alteraciones
psiquiátricas.
A pesar de todos estos esfuerzos los resultados a mediano y largo plazo no
son buenos con altas tasas de recidiva, lo cual es más evidente aún a mayores
pesos iniciales, no lográndose llegar a las metas establecidas en estos últimos
pacientes (entre el 5 y 10% de pérdida de peso en 6 meses), en contraste, la
cirugía bariátrica produce una pérdida de un 50 a 75% del exceso de peso
corporal, además de disminuir las comorbilidades asociadas a la obesidad, es por
esto que hoy es la medida más utilizada en pacientes obesos cuyo IMC sea
superior a 40 y/o pacientes cuyo IMC es menor a 35 con comorbilidades
asociadas [2].
1.2.2 Tratamiento quirúrgico
1.2.2.1
Bypass gástrico por bandeo (LAPBAND)
En esta operación se crea un pouch estomacal para restringir la ingesta de
comida. Luego, una sección con forma de Y
del intestino delgado es ligado al pouch que
no deja pasar comida al bypass de la parte
inferior del estómago, el duodeno (el primer
segmento del intestino delgado), y la
primera
porción
del
yeyuno
(segundo
segmento del intestino delgado) (ver figura
1). Este bypass disminuye la absorción de
nutrientes y de ese modo reduce la ingesta
calórica.
10
1.2.2.2
Gastrectomía por manga (SLEEVE GASTRECTOMY)
Es una cirugía bariátrica restrictiva. Durante
este procedimiento, los cirujanos crean una
pequeña manga con forma de estómago.
Es más grande que el pouch estomacal
creado durante el bypass en Y de Roux y
tiene el tamaño similar a una banana (ver
figura 2).
La manga gástrica es considerada como
opción de tratamiento de cirugía bariátrica
en pacientes con un IMC de 60 o más. Esta
es llevada a cabo como primera parte de un tratamiento de dos partes. La
segunda parte del tratamiento puede ser bypass gástrico [7].
1.2.2.3
Bypass gástrico
Dentro de las cirugías bariátricas, la que se ha realizado con mayor éxito es
el bypass gástrico, dado sus excelentes resultados, sobre todo en lo que respecta
a la resolución de comorbilidades [9] y la baja tasa de complicaciones [10]. El
bypass gástrico considera: a) reducir el
estómago
y
conectarlo
directamente
al
yeyuno proximal, b) de esta forma la comida
pasa directamente a él, disminuyendo la
absorción calórica, c) como el estómago ha
reducido su tamaño, la saciedad se alcanza
pronto, con la consecuente baja de peso y d)
el duodeno, principal sitio de absorción de
cationes divalentes queda fuera de uso.
11
El bypass gástrico más comúnmente realizado hoy, es el bypass de gástrico en Y
de Roux (ver figura 3), en la cual se secciona el yeyuno a 20 cm aproximadamente
del ángulo de Treitz, ascenso del cabo distal para la realización de la
gastroyeyunoanastomosis y finalmente la éntero-enteroanastomosis entre el asa
biliopancreática excluida y el yeyuno, dejando un asa alimentaria de 150 cm.
La parte de estómago excluida no utilizada y el duodeno quedan intactos,
porque tienen una provisión normal de sangre. La pérdida promedio de peso con
esta técnica es aproximadamente de 70% del exceso de peso. El azúcar que pasa
al intestino delgado tiende a producir una sensación de nauseas o dolor, por lo
que se sugiere no ingerir azúcar, lo que a su vez ayuda a perder peso. Sin
embargo, a medida que existe una mayor cantidad de pacientes operados y a los
cuáles se les ha hecho un seguimiento post cirugía, se ha detectado la aparición
de una serie de complicaciones a largo plazo, entre las que destacan las
nutricionales, siendo la más frecuente el déficit de fierro y la anemia secundaria
[11-13], aunque en ocasiones también secundario al déficit de otros minerales o
vitaminas, entre las que destacan la vitamina B12 (cianocobalamina) y los folatos.
1.3
Complicaciones nutricionales en la cirugía bariátrica por bypass
gástrico (anemia por déficit de hierro)
Debido a las complicaciones nutricionales, es que existen protocolos de
seguimiento de estos pacientes y de suplementación nutricional, habitualmente
con multivitamínicos y fierro vía oral, a pesar de ello, igual existe una proporción
de pacientes que presentan el déficit de hierro manifestando cuadros de anemia.
No existen estudios randomizados y controlados que estudien el déficit de
fierro en los pacientes operados por bypass gástrico, más que todo se describen
series de casos y datos retrospectivos. Con esto se ha podido estimar que entre
un 30 y 50 % de los pacientes operados va a presentar algún grado de alteración
del metabolismo del fierro en algún momento, ya sea déficit de fierro o anemia [12,
14, 15]. Se ha visto que esto se puede presentar desde algunos meses posterior a
la cirugía hasta años después, aunque en general la alteración está presente ya
12
dentro de los primeros 12 meses [15], por lo que, la proporción va a variar
dependiendo del momento en que se haga la medición, lo que hace que estos
pacientes deban mantenerse en control en forma permanente. Se ha descrito que
algunos grupos de pacientes tienen mayor propensión a presentar esta
complicación siendo las mujeres en edad fértil (por pérdidas aumentadas), los
niños, adolescentes y las embarazadas (todos ellos por mayores requerimientos).
También se ha visto que a mayor largo del asa alimentaria, mayor es la incidencia
de esta patología [14], dado la mayor malabsorción que podría ocurrir.
Los motivos para presentar esta propensión al déficit de fierro y la anemia
secundaria en los pacientes operados de bypass gástrico son varios:
 El hierro habitualmente viene en los alimentos en su estado férrico, el cual
debe ser reducido a su estado ferroso, más soluble, para así ser absorbido
en el intestino. Todo este paso se ve favorecido por el ambiente ácido que
proporciona al ácido clorhídrico del estómago, el que se reduce con el
bypass gástrico, al confeccionar el pouch gástrico, luego de resecar el antro
y gran parte del cuerpo.
 El hierro se absorbe principalmente en duodeno y yeyuno proximal,
quedando el primero totalmente excluido del tránsito intestinal al
confeccionarse la Y de Roux. Además las enzimas pancreáticas y secreción
biliar juegan un rol en la absorción del hierro heme, al degradar su cubierta
proteica facilitando su posterior absorción.
 Dado el carácter restrictivo del bypass gástrico, estos pacientes quedan con
una baja capacidad de ingesta de alimentos a lo que se suele asociar
además cierta aversión por ciertos tipos de alimentos tales como las carnes
rojas, rica fuente de hierro.
 Asociado a esto existen algunos otros factores promotores de la anemia
tales como las pérdidas sanguíneas aumentadas (por ejemplo: ya sea
postoperatorias o por sangrado del tubo digestivo, úlceras marginales, etc.),
la presencia de una enteropatía perdedora de fierro que pueden presentar
algunos pacientes o el sobre crecimiento bacteriano que puede existir en el
13
asa ciega resultando en daño y descamación de las células epiteliales y
pérdida de las reservas de hierro.
1.4
Tipos de anemia
Existen distintos tipos de anemia, de acuerdo a la deficiencia presente:
anemia megaloblástica (deficiencia de ácido fólico o de vitamina B12), anemia
perniciosa (ocurre cuando el cuerpo no puede absorber apropiadamente la
vitamina B12 del tubo digestivo), anemia aplásica (la médula ósea no logra
producir apropiadamente células sanguíneas), anemia hemolítica (destrucción
prematura de glóbulos rojos en la sangre) y anemia ferropénica (déficit de hierro).
Es ésta última la que pueden presentan los pacientes sometidos a bypass
gástrico.
1.4.1
Anemia ferropénica
Esta anemia implica una disminución del número de glóbulos rojos en la
sangre provocada por la escasez de hierro. Es la forma más común de anemia.
Aproximadamente el 20% de las mujeres, el 50% de las mujeres embarazadas y el
3% de los hombres no tienen suficiente hierro en el cuerpo. Las causas de
deficiencia de hierro son pérdida de sangre, absorción deficiente de hierro por
parte del cuerpo, muy poco hierro en la alimentación, o puede estar relacionada
con la intoxicación con plomo en niños.
En los hombres y en las mujeres post menopáusicas, la anemia
generalmente es provocada por sangrado gastrointestinal a raíz de algunos tipos
de cáncer (esófago, estómago, colon), várices esofágicas, uso prolongado de
ácido acetilsalicílico o antinflamatorios no esteroidales (AINES), úlcera péptica,
etc.
Síntomas: coloración azul en la parte blanca de los ojos, uñas quebradizas,
disminución del apetito (especialmente en niños), dolor de cabeza, irritabilidad,
dificultad respiratoria, dolor en la lengua, antojos alimentarios inusuales, color
14
pálido de la piel y mucosas, fatiga, debilidad, siendo éstas 3 últimas los más
importantes.
1.5
Absorción gastrointestinal de hierro
1.5.1.
Histología del intestino delgado
Las paredes del intestino delgado se encuentran conformadas por mucosa,
submucosa, muscular y serosa.
En un corte longitudinal de la pared intestinal la mucosa y la submucosa se
sitúan por encima de la muscular formando pliegues, llamados Plicaecircularis o
pliegues circulares o válvulas de Kerckring, La médula de estas estructuras es la
submucosa.
Debido a su gran número, los pliegues circulares son los responsables de la
disminución de la velocidad del tránsito intestinal y del aumento del área de
superficie de la mucosa intestinal.
15
1.5.1.1
Mucosa
Está conformada por:
 Epitelio: El epitelio de la mucosa remeda en escala pequeña a los pliegues
circulares, pues se proyecta hacia la superficie intestinal para luego hundirse
de
nuevo
conformando proyecciones a manera de dedos llamadas
vellosidades, en este caso la médula de las vellosidades es la lámina propia.
Las vellosidades son responsables del área de superficie de la mucosa
intestinal. La superficie de las vellosidades está tapizada por una sola hilera de
células epiteliales de diversos tipos. Entre vellosidades y vellosidad se
encuentran glándulas tubulares simples de 320 a 450 micrones de longitud, las
que penetran en la lámina propia hasta casi ponerse en contacto con la
musculares mucosae, llamadas criptas o glándulas de Lieberkuhn.
Puede dividirse en epitelio de las vellosidades y epitelio de las criptas.

Epitelio de las vellosidades
La célula principal es la llamada célula de absorción, ésta es una célula alta
columnar, con un núcleo situado basalmente, redondo u oval y un citoplasma
eosinofílico. La superficie apical posee un borde en cepillo intensamente
eosinofílico, que, las hace fácilmente identificable. Este sobresale nítidamente
con el método histoquímico de Pass. El borde en cepillo se halla compuesto de
microvellosidades y glicocalix.
El glicocalix es sintetizado por las células de absorción y es transportado a
la superficie en reemplazo del persistente roce de manera dinámica.
Interpuestas entre las células de absorción se encuentran células, con escaso
borde de cepillo a nivel con una característica gota de mucina ácida y neutral a
nivel apical, que les da forma de una copa o cáliz, y de allí el nombre células
caliciformes. La secreción de la mucina mantiene un ambiente viscoso y
húmedo a la superficie epitelial.
Las células endocrinas se hallan entre las células epiteliales de las
vellosidades, las cuáles son más abundantes en las criptas. También se hallan
16
entre las células inmediatamente por encima de la membrana basal, los
linfocitos en una proporción de 1 por cada 5 células epiteliales. La mayoría de
los linfocitos son T supresoras citotóxicas (CD8).
 Epitelio de las criptas
Contienen las células "madres" de las cuatro principales células epiteliales
de la mucosa: células de absorción, células caliciformes, células de Paneth y
células endocrinas. Es por eso que a nivel de las criptas se distinguen de 1 a
12 mitosis.
La diferenciación y maduración de estas células ocurre en 5 a 6 días a
medida que las células viajan de la profundidad de las criptas a las puntas de
las vellosidades, de donde se desprenden al lumen. Las células de Paneth
permanecen en las criptas.
Las células de Paneth tienen una forma piramidal con el ápice apuntado al
lumen. Su función no está clara aún, pero como contienen lisozimas e
inmunoglobulinas, y además, poseen capacidad fagocítica se cree que su
función es la regulación de la flora microbiana intestinal.
Las células endocrinas son numerosas en las criptas del intestino delgado y
están solas en pequeños grupos de manera discontinua. Las células
endocrinas se pueden distinguir con inmunohistoquímica. La microscopía
electrónica permite identificar los diferentes gránulos de las células endocrinas.
Por lo menos 16 tipos de células endocrinas han sido identificadas, con una
composición y distribución regional característica. Las células que contienen:
colecistoquinina, secretina e inhibidor gástrico polipéptidico, se hallan en la
porción
proximal
del
intestino
delgado
mientras
la
que
contiene
enteroglucagón, sustancia P y neurotensina se hallan con mucho más
frecuencia en el ileon. Las células que contienen serotonina y somastatina se
encuentran a lo largo del intestino.
 Lámina propia: El epitelio de las vellosidades y de las criptas se encuentra
separado de la lámina propia de la membrana basal, la cual es fácilmente
17
visible al microscopio de luz con una coloración de PAS. A la microscopía
electrónica de transmisión, la membrana basal es continua y está compuesta
por una lámina basal del colágeno y matriz amorfa con una lámina reticular de
fibras colágenas reticulares.
Cinco células inmunocompetentes o inflamatorias, se encuentran acá y son:
células plasmáticas, linfocitos, eosinófilos, histiocitos y células cebadas. No
debe haber polimorfonucleares ni en el epitelio ni en la lámina propia.
Las células más abundantes son plasmáticas, las cuales contienen en su
mayoría
IgA.
De
los
linfocitos
T
los
más
frecuentes
son
los
ayudadores/inductores (CD4).
A medida que nos alejamos del estómago, se vuelven más frecuentes las
agrupaciones de linfocitos usualmente por encima de la musculares mucosae,
y agrupaciones más densas con formación de folículo linfoides, con o sin
centros germinativos, algunos acúmulos linfoides pueden llegar a la membrana
submucosa.
Los histiocitos conocidos también como macrófagos se localizan cercanos a
las puntas de las vellosidades. Como se sabe, estos actúan regulando la
función de los linfocitos T, preparando el antígeno.
Los eosinófilos son células fácilmente distinguibles, y su número varía en
numerosas
desconocida.
entidades,
Las
desafortunadamente
células
cebadas
son
su
función
relativamente
todavía
es
numerosas
en
comparación con otros órganos y su número disminuye a medida que nos
acercamos al colon.
 Muscularis mucosae o muscular de la mucosa: Es una banda continua de
tejido muscular liso y de fibras elásticas. El tejido muscular está compuesto de
una banda circular interna y una banda longitudinal externa. Pequeñas bandas
de ésta se extienden por la lámina propia hacia las vellosidades. Su armazón
está compuesto por fibras colágenas y elásticas, las células que se hallan a
este nivel son histiocitos, linfocitos, células plasmáticas y células cebadas;
además de tejido adiposo.
18
1.5.1.2
Submucosa
La submucosa es una vía por la que atraviesan capilares y vasos de mayor
calibre sanguíneo y linfáticos, estos drenan y dan alimento a la mucosa y muscular
externa.
La inervación de los intestinos está dada por un componente extrínseco y
otro intrínseco, este último está dado por agrupaciones de neuronas que
conforman en la submucosa, el plexo de Meissner, y el plexo mientérico o de
Auerbach que está en la muscular externa. Los plexos contienen algunas
neuronas sensoriales que reciben información de terminaciones nerviosas cerca al
epitelio de las vellosidades y en la muscular externa sobre la composición del
contenido intestinal (quimiorreceptores) y el grado de expansión de la pared
intestinal (mecanoreceptores). Las otras células nerviosas son efectoras e
intervienen las capas musculares y las células que secretan hormonas. La
inervación extrínseca está dada por fibras simpáticas y parasimpáticas.
1.5.1.3
Muscular
Esta posee 2 bandas musculares distintas dispuestas perpendicularmente
entre sí: la interna que se dispone de manera circular y la externa que se dispone
longitudinalmente. Los vasos sanguíneos, linfáticos y nervios atraviesan la
muscular externa.
La cantidad de tejido fibroso a este nivel es muy escaso y si es
pronunciado, refleja patología como isquemia, esclerodermia e infección por
micobacteria.
El plexo mientérico de Auerbach reside justo entre las dos bandas de la
muscular externa. Este es muy similar al plexo submucoso ya mencionado, con la
diferencia que posee más ganglios, neuronas y se trata de un plexo más
compacto, lo que lo hace más fácilmente visible y, por lo tanto más evaluable, que
el plexo submucoso para detectar las enfermedades, aunque de menor
importancia. Existen plexos musculares profundos, mucosos y subserosos.
19
1.5.1.4
Serosa
Se trata de un mesotelio que cubre una banda de tejido conectivo suelto
que contiene vasos sanguíneos y nervios.
Macroscópicamente el yeyuno se diferencia de sus vecinos por poseer
abundantes y grandes pliegues circulares.
Histológicamente las vellosidades muestran una relación vellosidad:cripta 4-5:1.
Son delgadas y digitiformes. A diferencia de las vellosidades menos altas del
íleon, y a las vellosidades en forma de hoja, algo romas y ramificadas del duodeno
proximal. Los pliegues circulares no son tan prominentes. El número de células
caliciformes es mayor, las vellosidades son más cortas y tienen una configuración
digitiforme pronunciada [16].
1.6
Transportador intestinal de hierro
El hierro es un micronutriente esencial para una adecuada función
eritropoyética, metabolismo oxidativo, crecimiento y respuesta inmune celular. En
individuos con estado nutricional adecuado, el contenido total de hierro es de
aproximadamente 4 a 5g en el hombre y de 3,5 a 4g en la mujer. De éste,
alrededor del 65% se encuentra formando parte de la hemoglobina, el 15% está
contenido en las enzimas y la mioglobina, el 20% se encuentra como hierro de
depósito y solo el 0,1 al 0,2% se encuentra unido a la transferrina como hierro
circulante. Del total del hierro que se moviliza diariamente, sólo se pierde una
pequeña proporción (0,5 a 2 mg al día) a través de las heces, la orina, el sudor y la
descamación celular. La reposición de esta pequeña cantidad se realiza a través
de la ingesta [17].
El tipo de hierro presente en la dieta es importante ya que de esto dependerá
el tipo de absorción que ocurrirá a nivel intestinal. La principal proteína
transportadora de hierro es la proteína transportador-1 de metales divalentes
(DMT-1 del inglés divalent metal transporter 1), ubicada en la superficie apical del
enterocito y distribuida en paralelo con la absorción de hierro a nivel intestinal, es
20
decir, mayores niveles de expresión a nivel duodenal y expresada de manera
decreciente hacia la región más distal, lo que indica que en el yeyuno y en el ileon
su nivel de expresión se reduce o está ausente, respectivamente. El principal rol
de DMT-1 es absorber hierro en su estado ferroso, aunque se ha determinado que
también tiene la capacidad de transportar en forma no específica otros metales
tales como manganeso, plomo, cadmio, zinc y cobre [18].
El hierro que se consume a través de la dieta, principalmente se presenta
como Fe+3. Éste Fe+3solubilizado por el ácido gástrico, es reducido a Fe +2,
aparentemente por citocromo b duodenal (dcytb) o una reductasa similar en la
superficie apical. Fe+2 entra al borde en cepillo vía DMT-1. Debido a que DMT-1
actúa como un protón simporter, transportando un H+ por cada Fe+2, se asume
que la captación de Fe+2 es facilitada por el pH medianamente ácido en el
duodeno proximal. Se dice que DMT-1 se encuentra en la superficie apical del
enterocito, o que está asociado a las vesículas de membrana del borde en cepillo
(también conocida como chapa estriada). Subsecuentemente, y dependiendo de la
disponibilidad celular y plasmática, el ión ferroso puede ser almacenado como
ferritina o salir del enterocito por el lado basolateral a través de MTP-1
(ferroportina o Irg1). Como la especie que se une a transferrina es Fe +3, el Fe+2
debe ser oxidado para que se pueda unir. Quien lleva a cabo esta función es una
ferroxidasa multi-cobre anclada a la membrana llamada hefaestina, o la oxidación
también puede llevarse a cabo por ceruplasmina circulante. Aún no está claro
como el Fe+2 alcanza MTP-1, una de las posibilidades es que DMT-1 está
involucrado en la transcitosis. Muchos investigadores creen que Fe +2 alcanza la
superficie basolateral antes de liberar a transferrina, hay evidencias fuertes que
apo-transferrina entra desde la superficie lateral para unir hierro [15].
La regulación de la absorción del hierro a nivel intestinal es un proceso
complejo, mediado por múltiples señales locales y sistémicas, en el cual tendría un
rol central la capacidad del enterocito de inducir o disminuir la expresión de DMT1. Un modelo de regulación de la absorción de hierro a nivel intestinal ha sido
recientemente propuesto y se ha denominado el modelo de programación de la
21
cripta. Este modelo propone que los enterocitos de la cripta del duodeno expresan
en su membrana basolateral un complejo proteico compuesto por los receptores
de transferrina 1 y 2(TfR1, TfR2) y la proteína HFE. Este complejo es capaz de
censar el nivel de fierro circulante transportado por la transferrina. Frente a un
déficit en la cantidad de fierro transportado por la transferrina (saturación de la
transferrina), el enterocito es programado para aumentar su capacidad de
absorción, principalmente a través del aumento en la trascripción de las proteínas
DMT-1 y ferroportina-1 [17, 19, 20]. Así frente a un déficit en la disponibilidad de
hierro, medido a través de la ferritina y/o saturación de transferrina, podríamos
esperar un aumento en la expresión de los niveles de la proteína DMT-1 y
eventualmente de la ferroportina.
Se ha visto que en deficiencias de hierro, la mucosa duodenal es la que más
se adapta. Trabajos han demostrado que el mRNA del DMT-1 a nivel del duodeno
aumenta unas 10 veces en estados de deficiencia de fierro, describiéndose lo
mismo para Dcytb [21, 22], sin embargo, nada se ha descrito respecto del yeyuno.
En cambio ferroportina solo aumenta unas 2-3 veces. Los mecanismos
moleculares de esta adaptación aún no se conocen, aunque se sugiere que los
transportadores apicales se regularían por señales locales y los basolaterales por
señales sistémicas [21]. Aparte de la reservas de hierro, otros potentes
estimuladores de la absorción son la eritropoyesis, la hipoxia, el embarazo y los
estados inflamatorios. Por lo anterior, si el duodeno queda excluido del paso de
nutrientes en la cirugía de bypass gástrico, surge la pregunta si el yeyuno se
adaptará y tratará de cumplir las funciones del duodeno respecto de la absorción
de hierro. Al respecto, nada se sabe de los cambios que podrían ocurrir a nivel del
yeyuno, en donde la absorción de hierro es mucho menor.
22
En vista a los antecedentes anteriormente expuestos, surgen algunas dudas
como por ejemplo:
a) ¿son los niveles del DMT-1 en yeyuno proximal semejantes al duodeno
distal?
b) ¿cambiará al cabo de seis meses la localización del DMT-1 en pacientes
operados de cirugía bariátrica?
c) ¿cambiarán los niveles de expresión de DMT-1 en yeyuno proximal
después de seis meses de cirugía bariátrica?
d) ¿se asociarán los cambios de DMT-1, antes mencionados, al desarrollo de
anemia ferropénica?
Para responder estas interrogantes nos hemos planteado la siguiente hipótesis
y objetivos específicos:
23
2.
Hipótesis
 La cirugía de bypass gástrico reduce los niveles de expresión y altera la
localización de DMT-1 en yeyuno proximal humano.
3.
Objetivo general
 Analizar si los cambios en niveles de expresión y localización de DMT-1 en
yeyuno proximal humano en pacientes con cirugía de bypass gástrico se
asocian al desarrollo de anemia ferropénica.
4.
Objetivos específicos
 Estudiar los cambios en los parámetros de IMC, peso, y niveles de ferritina,
hematocrito, hemoglobina en pacientes de cirugía de bypass gástrico
 Estudiar la relación entre ingesta de suplementos de hierro y el estado
anémico en estos pacientes
 Determinar la localización y distribución tisular de DMT-1 en yeyuno
proximal humano al momento de la operación y 6 meses post cirugía de
bypass gástrico
 Determinar y comparar los niveles de expresión de DMT-1en duodeno distal
versus yeyuno proximal
 Determinarlos niveles de expresión de DMT-1 en yeyuno proximal al
momento de la operación y 6 meses post cirugía
24
5.
5.1
Materiales y métodos
Pacientes
Se reclutaron 15 pacientes quienes fueron reclutados desde el servicio de
cirugía del Hospital Clínico de la Universidad de Chile, sometidos a cirugía de
bypass gástrico. Para ingresar al estudio debieron firmar un consentimiento
informado, el que contaba con la aprobación previa del comité de ética del
Hospital clínico. De los 15 pacientes, 1 no cumplió con la terapia post cirugía por lo
que nos quedaron 14 pacientes que cumplieron los siguientes criterios. De los 14
pacientes, 4 muestras no fueron tomadas a los 6 meses post cirugía, por lo que
nos quedaron solo 10 pacientes.
Criterios de inclusión
 Pacientes sometidos a bypass gástrico (abierto o laparoscópico) como
tratamiento de su obesidad
 Evaluado por alguno de los integrantes del equipo de cirugía digestiva del
HCUCH
 Firma del consentimiento informado por parte del paciente o representante
de este
Criterios de exclusión
 Anemia o déficit de fierro preoperatorios
 Pacientes que estén tomando suplementos de hierro
 Poseedores de enfermedades con repercusión en la serie roja
 Portadores de alguna enfermedad gastrointestinal que afecte el yeyuno
 Fumador habitual (> 1 cajetilla a la semana)
 Paciente no evaluado por alguno de los integrantes del equipo de cirugía
digestiva del HCUCH
 Negación a firmar el consentimiento informado
 Embarazo actual
25
 Paciente que no vaya a seguir sus controles con la UNI o la no adherencia
a las indicaciones de alimentación o suplementación postoperatorias
 Presencia de complicaciones intra o postoperatorias (leaks, colecciones
intraabdominales, infecciones, HDA, obstrucción, etc.)
5.2
Reactivos
Los compuestos inorgánicos y orgánicos, sales, ácidos y solventes se
adquirieron en MERCK (Darmstadt, Alemania). El reactivo quimioluminiscente
para Western blot (Western Lightning) se adquirió a PerKinElmerLifeSciences, Inc.
(Boston, MA, EEUU). El material de plástico utilizado se obtuvo en Falcon. El
anticuerpo primario para DMT-1 fue donado por el profesor Marco Tulio Nuñez
(Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Santiago,
Chile). Los anticuerpos secundarios anti-IgG ratón y anti-IgG conejo, conjugados a
peroxidasa se obtuvieron en Calbiochem (La jolla, CA, EEUU).
5.3
Toma de muestra
La muestra para análisis del transportador se toma a tiempo 0 mes por
medio de una biopsia durante la operación de bypass gástrico, la segunda
muestra a tiempo 6 meses se realiza a través de una biopsia al momento del
control por endoscopía.
La muestra para exámenes de laboratorio se obtiene a través de una toma
de sangre realizada en el servicio de laboratorio clínico del Hospital Clínico de la
Universidad de Chile (HCUCH), quienes analizan la muestra y entregan el
resultado.
5.4
Tratamiento y conservación de muestra
Para Western blot, las muestras se mantendrán a -80°C, durante todo el
tiempo que dure el experimento. Parte de la muestra se homogenizará con
26
solución de RIPA en un homogenizador vidrio-vidrio Wheaton. Luego se
cuantificarán por el método de Lowry, para finalmente realizar el western blot.
Para inmuhistoquímica, las muestras se fijaron con formaldehido 4%.
5.5
Electroforesis en gel de poliacrilamida
La separación de las proteínas de acuerdo a su masa molecular se realizó
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida, los geles concentrador y
separador fueron al 5 y 10% respectivamente. Para la detección se cargaron 50µg
de extracto proteico. La electroforesis se realizó a un voltaje constante de 100 V
en tampón de electroforesis 1X (Tris base 30,25g, Glicina 144g, SDS 10g, agua
1.000mL para tampón de electroforesis 10X).
5.6
Electrotransferencia de proteínas
Una vez realizada la electroforesis, las proteínas se electrotransfirieron a
una membrana de nitrocelulosa (BioRad) a 400mA durante 120 min en tampón de
transferencia.
5.7
Western blot
Una vez transferidas, la membranas se bloquearon con tampón de bloqueo
(TBS 1X; Tween-20 0,1%; leche sin grasa 5% p/v) durante 60 min a temperatura
ambiente y posteriormente se incubaron con los anticuerpos primarios
correspondientes según ensayo. DMT-1 en tampón de incubación (TBS 1X;
Tween-20 0,1% en Leche sin grasa 5% p/v) a una dilución 1:1000 toda la noche a
4°C con agitación suave. Para GAPDH se usó tampón de incubación a una
dilución 1:10000 toda la noche a 4°C con agitación suave. Posterior a la
incubación, las membranas se lavaron 3 veces por 10 min en TBS 1X / Tween-20
al 0,1%, e incubadas durante 2 h a temperatura ambiente con anti-IgG de conejo o
ratón conjugado con peroxidasa, a un título de 1:5.000 para DMT-1, 1:10000 para
27
GAPDH ambos en tampón de incubación. Para detectar las proteínas, las
membranas, previamente lavadas, se incubaron durante 1 min en solución de ECL
(enhanced chemiluminescence) y se expusieron a la película de fotografía KodakBiomax. Las películas se digitalizaron y las imágenes se cuantificaron por
densitometría con ayuda de los programas computacionales Photoshop 7.0 e
Image J. Después de realizar los ensayos de Western blot, las membranas de
nitrocelulosa se incubaron por 45 min en una solución de rojo Ponceau (rojo
Ponceau 2%, TCA 30%, ácido sulfosalicílico 30%) para desprender los
anticuerpos, posteriormente se lavaron en TBS 1X / Tween-20 al 0,1% por tres
veces. Luego de este tratamiento, las membranas pudieron ser reutilizadas para
nuevos ensayos de Western blot.
5.8
Inmunohistoquímica
Inmediatamente después de obtenidas, las muestras se fijaron en
formaldehido al 4% en PBS durante 24 horas. A continuación se sometieron a
deshidratación e impregnación en parafina en procesador automático y se
confeccionaron inclusiones (bloques) de parafina con soportes de cassettes
plásticos.
Se obtuvieron cortes de 5µ en micrótomo rotatorio utilizando navajas
desechables, los que fueron montados sobre portaobjetos silanizados y luego
secados en estufa a 60ºC por 24 horas.
A los cortes de tejido se les realizó tinción doble de hematoxilina y eosina
para estudio morfológico y tinción inmunohistoquímica para demostración de DMT1.
Los cortes para tinción con hematoxilina y eosina fueron desparafinados en
xileno e hidratados en batería de etanol de concentración decreciente, hasta agua
destilada. Se realizó tinción nuclear con hematoxilina de Harris por 3 min y lavado
en agua corriente para viraje al azul. A continuación se aplicó tinción
citoplasmática con eosina Y al 0,5% acuosa por 30 segundos.
28
Finalmente, los cortes se deshidrataron en etanol, se aclararon en xileno y
se montaron con medio de montaje permanente sintético.
Los cortes para inmunohistoquímica fueron desparafinados en xileno e
hidratados en batería de etanol de concentración decreciente, hasta agua
destilada. A continuación se sometieron a pre-tratamiento con solución de EDTA
1mM, pH 8,0 durante 25 min a 96ºC en una vaporera para recuperación de
reactividad antigénica. A continuación, se lavaron en agua destilada y se realizó
bloqueo de peroxidasa endógena por incubación con peróxido de hidrógeno al 3%
acuoso. Se lavaron 3 veces por 2 min cada vez en TBST (buffer tris salino 0,01M
pH 7,6 más 200µL/L de Tween 20) y se realizó bloqueo de reactividad inespecífica
con suero de caballo por 10 min a temperatura ambiente (TA).
Una vez terminados los bloqueos, los cortes se incubaron con anticuerpo
anti DMT-1 1:200 diluido en TBST, durante 45 min a 37ºC en cámara húmeda. En
forma paralela, se incubaron cortes con suero de caballo en las mismas
condiciones, como control negativo. Después de la incubación con el anticuerpo,
los cortes se lavaron con TBST y se trataron con el kit de sistema de detección
Vector PK 7200 (Vector Laboratories Inc. 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010
USA). Los cortes se incubaron 25 min TA con anticuerpo secundario biotinilado del
kit, seguido de lavado en TBST y luego incubación con complejo avidina biotina
por 25 min TA seguido por lavado en TBST.
Finalmente, los cortes se incubaron con solución de revelado (dimetil amino
benzidina 1mg/mL de buffer fosfato salino 0,01M pH 7,6 con peróxido de
hidrógeno 0,003% concentración final) por 2 min TA. La reacción se detuvo por
lavado con agua destilada.
Se realizó contraste nuclear con hematoxilina de Harris por 1 min y por
último los cortes fueron deshidratados con etanol, aclarados con xileno y
montados con medio permanente sintético.
29
5.9
Análisis estadístico
Los resultados mostrados corresponden al promedio ± SEM de, al menos,
tres experimentos independientes. Los datos se analizaron por t-student con una
significancia de p0,05.
30
6.
6.1
Resultados
Comorbilidades asociadas a la obesidad
Todos los pacientes sometidos a cirugía de bypass gástrico presentan al
menos una enfermedad concomitante, siendo esto un factor determinante al
momento de decidir si llevar a cabo la cirugía o no. En este estudio 4 pacientes
padecen de hipertensión arterial (HTA), 9 pacientes presentan diabetes mellitus
tipo 2 (DM), resistencia a la insulina (RI) o hiperinsulinemia (HI), 3 pacientes con
dislipidemia, 1 paciente con esofagitis, 1 paciente con hipotiroidismo y 1 paciente
con asma. La enfermedad más frecuentemente encontrada en dichos pacientes
es la diabetes mellitus tipo 2, resistencia a la insulina o hiperinsulinemia, las cuales
se presentan por lo general en pacientes obesos, y que suelen regularizarse a
medida que el paciente disminuye su exceso de peso. Los pacientes que son
sometidos a cirugía son aquellos en que el tratamiento farmacológico en conjunto
con la dieta no fue eficaz y/o suficiente para que el paciente llegase a su peso
ideal.
31
6.2
Disminución de peso post operatorio
En la figura 6A se puede visualizar que a los 6 meses post- cirugía todos los
pacientes bajaron de peso y todos sobre los 10kg, siendo sólo 2 pacientes (20%)
quienes bajaron menos de 20kg, 3 pacientes (30%) entre 20 y 30kg y 5 pacientes
(50%) bajaron mas de 30kg.
En la figura 6B se aprecia que al comienzo del estudio, ningún paciente tenía
un IMC inferior a 30, por ende, todos estaban obesos, 6 pacientes (60%)
presentaban un IMC entre 30 y 40, y 4 pacientes (40%) presentaban un IMC sobre
40, luego de 6 meses post cirugía 2 pacientes (20%) presentan un IMC inferior a
25, por lo tanto están en el rango normal, 5 pacientes (50%) presentan un IMC
entre 25-30 (sobrepeso) y 3 pacientes (30%) tienen un IMC entre 30 y 40.
6.3
Exámenes de sangre
La figura 7 muestra el promedio de los valores de hematocrito, el promedio de
los valores de hemoglobina y el promedio de los valores de ferritina, todos ellos
realizados a los pacientes a tiempo 0 y tiempo 6 meses.
Estos parámetros son importantes ya que nos informan si el paciente
presenta o no anemia y además si la causa es o no el déficit de hierro. El
hematocrito indica la densidad de glóbulos rojos presentes, la hemoglobina es una
32
proteína que contiene hierro, y la ferritina es la principal proteína almacenadora de
hierro.
En la figura 7C se evidencia una disminución clara en la ferritina, aunque no
significativa, mientras que en las figuras 7A y7B se mantienen los valores casi
constantes, con una disminución no significativa para hematocrito y una
disminución significativa (p<0,05) para hemoglobina.
En este estudio sólo 1 paciente presentó un valor de ferritina bajo el nivel
normal, lo cual nos informa que puede tener anemia o déficit de hierro.
En la tabla 2 se presenta el suplemento de hierro que fue administrado por
cada paciente y si presentó anemia o déficit de hierro a los 6 meses post cirugía
de bypass gástrico
33
TABLA N°2 Suplemento de hierro administrado y anemia o déficit de hierro.
Suplemento de hierro
Paciente
Maltofer®
Otro
Anemia o Déficit
de Hierro
1
Si
No
No
2
Si
No
No
3
Si
No
No
4
No
Si
Si
5
Si
No
No
6
No
Si
No
7
Si
No
No
8
Si
No
No
9
Si
No
No
10
Si
No
No
El paciente N° 4 presentó una anemia leve o mejor dicho un déficit de
hierro.
Este
resultado
deja
evidenciado
la
variabilidad
que
existe
interindividualmente, así como también una probable diferencia entre los distintos
suplementos de hierro administrados, ya que a diferencia de los otros pacientes,
aquel que presentó déficit de hierro, ingirió un suplemento de hierro en estado
ferroso.
6.4
Inmunohistoquímica
En la figura 8 se muestra la histología de yeyuno proximal de un paciente
en condición inicial que es representativa de todas las muestras.
La sección
tisular de tinción con hematoxilina y eosina muestran en todos los casos,
conservación de la morfología general de la mucosa yeyunal. Las vellosidades
intestinales son de longitud y grosor normales. El epitelio de revestimiento es de
tipo cilíndrico simple, con chapa estriada y presencia de moderada cantidad de
34
células caliciformes. Las criptas glandulares presentan epitelio cilíndrico simple a
pseudoestratificado, con una que otra mitosis.
El estroma de la mucosa exhibe vascularización capilar normal. Hay
discreta a moderada cantidad de linfocitos, y células plasmáticas, fibroblastos y
matriz extracelular delicada con fibras colágenas delgadas.
En la figura 9
se muestra una imagen representativa
del análisis
inmunohistoquímico realizado para DMT-1 de uno de los pacientes en estudio. La
reacción positiva es una tinción color marrón, la cual se observa en el citoplasma
de las células epiteliales que revisten las vellosidades intestinales, especialmente
la porción distal de estas. La marca está localizada predominantemente en la zona
media y apical de las células, con mayor intensidad en la zona absortiva. La figura
9ª muestra una ampliación de la vellosidad en la que se observa una marcada
tinción en la chapa estriada. Las células de las criptas glandulares presentan
reacción mucho menor que las de las vellosidades (ver figura 9B). El estroma es
35
negativo. La tinción oscura observada en las criptas es tinción de núcleo y no
necesariamente reacción positiva para el transportador.
En la figura 10 se muestra la expresión y localización deDMT-1 por técnica
de inmunohistoquímica en el epitelio de algunos pacientes representativos del
estudio. En la figura 10A se observa un aumento en la expresión del transportador
a los 6 meses post cirugía de bypass gástrico; mientras que en la figura 10B no
hubo cambios significativos a los 6 meses post cirugía. Finalmente en la figura
10C hubo una disminución en la expresión del transportador a los 6 meses post
bypass gástrico. Sin embargo, cabe destacar que en la mayoría de los pacientes
se encontró una disminución del transportador al cabo de los 6 meses.
36
En la figura 10 se muestra una imagen representativa para el análisis de las
células caliciformes, en la que se evidencia un aumento del 52% (ver figura
N°11D). Estas células son las encargadas de secretar mucus, cuya función es
protectora. Tal como se visualiza en la figura 11B el número de células
caliciformes a tiempo 0 mes es menor que el número de células caliciformes a
tiempo 6 meses post cirugía (figura 11C).
37
Como se dijo con anterioridad, el aumento del número de células caliciformes
puede ser el causante de la disminución en la expresión del transportador de
hierro DMT-1 en las vellosidades de la mucosa yeyunal proximal, para poder
determinar el aumento se utilizó la siguiente técnica de recuento. La vellosidad
marcada en la foto (ver figura 11A) mide 250µ de longitud y presenta 10 células
caliciformes en total (6 en el epitelio que recubre el lado izquierdo y 4 en el que
recubre el lado derecho), por lo que presentaría 10 células en 500µ de longitud. En
este caso, se contaron dos áreas equivalentes para hacer 1 mm (1000µ)
38
39
6.5
Expresión de DMT-1
En la figura 12 se visualiza una imagen representativa de los niveles de
expresión de DMT-1 de duodeno versus yeyuno proximal en pacientes sin
obesidad, es decir, en sujetos normales. Aquí se puede observar que no hay
diferencias significativas entre ambos tejidos pese a que como se dijo
anteriormente la expresión de dicho transportador disminuye a medida que se
avanza por el tubo digestivo.
En la figura 13 se muestra el análisis gráfico de la expresión de DMT-1, en
yeyuno proximal, pre y post cirugía de bypass gástrico en los 10 pacientes que
cumplieron totalmente el estudio. En la figura 13A se visualiza la expresión de
DMT-1 a tiempo 0 y 6 meses post cirugía de bypass gástrico, expresado en
unidades arbitrarias. En ella se observa que solo tres de los 10 pacientes
40
tenían niveles de expresión de DMT-1 muy elevado en yeyuno proximal; sin
embargo, en cada uno de ellos, excepto en el paciente número 7, se observó
una disminución a los seis meses post cirugía. En la figura 13B se muestra el
valor promedio de expresión de DMT-1 pre y post cirugía de bypass gástrico,
evidenciándose una disminución significativa a tiempo 6 meses.
41
7.
7.1
Discusión
Reducción de las comorbilidades asociadas a la obesidad
Todos los pacientes obesos de este estudio presentan alguna enfermedad
concomitante, ya sea DM, RI, HI, HTA, dislipidemia, esofagitis, hipotiroidismo o
asma, siendo la más frecuente alguna relacionada con la glucosa e insulina. Estas
enfermedades han aumentado con el paso de los años, así como también ha
aumentado explosivamente la obesidad, la cual ha sido llamada como epidemia
mundial según la Organización Mundial de la Salud. Según estadísticas actuales,
más de 1 billón de personas están sobrepeso y cerca de 315 millones están
clínicamente obesos [24]. Algunos estudios han reportado que existe una estrecha
correlación entre la obesidad (principalmente la obesidad visceral) y enfermedades
cardiovasculares, así como también entre obesidad y diabetes.
Existe una teoría que sugiere que los efectos benéficos en el metabolismo de
la glucosa y resistencia a la insulina resulta, en el corto plazo, por la disminución
de la estimulación del eje enteroinsular, por disminución de la ingesta calórica y, a
largo plazo, por diminución de la masa grasa y los cambios resultantes en la
liberación de adipocitoquinas [23].El rol de incretinas y el eje enteroinsular en la
homeostasis de la glucosa ha sido aún más enfatizada después de los resultados
en pacientes diabéticos obesos sometidos a cirugía de bypass gástrico, revelando
la rápida resolución glicémica en muchos casos [23, 25].
Parte fundamental del eje enteroinsular son las incretinas. Una de las
incretinas más importante conocidas es el polipeptido inhibitorio gástrico, también
llamado péptido insulinotrópico glucosa dependiente (GIP), el cual es secretado
por las células K entero endocrinas en el yeyuno y representa más del 50% del
total del efecto incretina. Otra hormona clave es el péptido análogo a glucagón 1
(GLP-1), un producto del gen proglucagón y formado principalmente en las células
L intestinales; los niveles plasmáticos de GLP-1 aumentan más de 6 veces
después de ingerir carbohidratos. Diversos estudios han demostrado que el efecto
de las incretinas está reducido en pacientes con DM tipo 2. Cuando GLP-1 es
administrado estimula efectivamente la secreción de insulina tanto en pacientes
sanos como en pacientes con DM tipo 2. En contraste, el efecto insulinotrópico
42
GIP es altamente reducido en pacientes diabéticos. Así, el potencial terapéutico de
GLP-1 ha sido estudiado extensamente enfatizando no sólo su efecto
hipoglicémico a través de la estimulación de secreción de insulina sino que
también otras propiedades benéficas, tales como retraso del vaciamiento gástrico
e inducción de la saciedad.
En este mismo sentido en un estudio de bypass gástrico en ratas se ha
demostrado la importancia del cotransportador intestinal Na+/glucosa SGLT1, el
cual es el responsable de la parte principal de la recaptación de glucosa dietaria
bajo condiciones fisiológicas normales, en pacientes obesos y con DM tipo 2,
evidenciando que éste se sobre expresaría 3 a 4 veces tanto en pacientes como
en ratas con DM tipo 2, y que en ratas sometidas a cirugía de bypass gástrico
disminuye la capacidad de transporte de glucosa mediada por SGLT1 en unas 2,7
veces comparado con las ratas control [26].
Por todo lo anteriormente dicho es que la cirugía bariátrica de bypass gástrico
ha cobrado tanta importancia los últimos años.
7.2
Disminución de peso post operatorio en pacientes sometidos a
cirugía de bypass gástrico
La pérdida de peso de los pacientes obesos sometidos a bypass gástrico
fue bastante significativa, mostrando que en algunos casos se llegó a tener un
IMC normal después de 6 meses de la cirugía, lo cual es bastante importante, y
demuestra que la cirugía es exitosa, pero también para obtener estos resultados,
no sólo es necesario realizar la cirugía sino que también se necesita que el
paciente siga las instrucciones entregadas por el equipo médico a cabalidad. A
pesar que no todos los pacientes llegaron a un IMC normal, todos pasaron de un
estado de obesidad a un estado de sobrepeso, y, según estudios, éstos llegarán
con el tiempo a un estado normal. Los estudios demuestran que la cirugía gástrica
reduce entre un 50 y un 75% del exceso de peso, además de prolongar el efecto
de disminución de peso por hasta 16 años [2]. En este estudio se ve claramente
que la menor pérdida de exceso de peso fue de un 54%, en el resto se disminuyó
sobre un 70% del exceso de peso, y en algunos casos los pacientes redujeron el
43
total del exceso de peso que presentaban al momento de realizar la cirugía
bariátrica de bypass gástrico [27]. Los resultados también se condicen con lo
expresado por otros autores, quienes
reportaron que post cirugía de bypass
gástrico se disminuye un 61% del exceso de peso y que en promedio la cirugía
bariátrica reduce el IMC entre 10 y 15 kg/m2 y entre 30 y 50 kg de peso [28].
Como se mencionó anteriormente, los pacientes sometidos a cirugía de bypass
gástrico experimentan una disminución del exceso de peso considerable. Según
Elder and Wolfe, la pérdida de peso se mantiene por más tiempo que la observada
en aquellos pacientes sometidos a tratamiento no quirúrgico. Algunos estudios
indican que la pérdida de peso puede sostenerse por hasta 16 años después de la
cirugía, mientras que con los tratamientos psicofarmacológicos se vuelve a ganar
peso entre los 6 y 24 meses siguientes [2].
Esto último también ha hecho del bypass gástrico una elección de primera
línea en pacientes obesos cuyo tratamiento fármaco terapéutico haya fracasado, o
bien, en aquellos pacientes que tengan comorbilidades de importancia, es decir,
que provoque un aumento de la morbilidad y mortalidad [27].
7.3
Presencia de anemia en pacientes sometidos a cirugía de bypass
gástrico
En los exámenes de sangre practicados a los pacientes sometidos a bypass
gástrico antes y 6 meses después de la cirugía, se evidenció la importancia de
mantener sus niveles normales para que no se produzcan anomalías de tipo
anemia. La anemia es usualmente presentada en estos pacientes, ya sea a tiempo
temprano o tardío y es el resultado de la depleción de diversas vitaminas o
elementos trazas que conllevan a disminuir la función eritroide. En algunos casos
se
presenta
una
anemia
gastroyeyunoanastomosis
o
debido
a
un
sangrado
yeyunoyeyunoanastomosis,
anastomótico
lo
cual
en
puede
identificarse a través de una endoscopía. En ocasiones el remanente gástrico
excluido puede ulcerarse y sangrar, pero esto es más difícil de diagnosticar.
También puede haber úlceras que resulten en anemia aguda por pérdida de
44
sangre. La formación de hematoma que involucra el espacio peritoneal y
retroperitoneal puede causar también anemia aguda [11]. La anemia en períodos
tardíos de la cirugía de bypass gástrico alcanza entre un 30 a 50% de los
pacientes [11-14, 29-31], de los cuales un 3,5% requiere transfusión sanguínea a
largo plazo. La anemia ocurre generalmente entre 8 meses y 2 años después de la
cirugía, con deficiencias de hierro, folato, y vitamina B12 comprendiendo la más
importante etiología reportada [11].
Es por esta razón que existen protocolos de seguimiento de los pacientes
operados por bypass gástrico y de suplementación nutricional, habitualmente con
multivitamínicos y hierro vía oral, a pesar de lo cual igual existe una proporción de
pacientes que presentan el déficit. En este caso los pacientes recibieron
instrucciones de suplemento de hierro en estado férrico (Maltofer®) durante 1
mes. El hecho de que ellos hayan tomado hierro férrico y no ferroso (que es el
absorbible) y que a la vez sólo un paciente haya presentado anemia, hace pensar
que la acidez gástrica del estómago no sea un punto clave en la absorción de
hierro, sino que más bien la reductasa férrica apical (Dcytb) que se encuentra en
la mucosa duodenal y que reduce el hierro del lumen intestinal, sería la más
importante vía de reducción de hierro, al menos en los pacientes sometidos a
cirugía bariátrica.
Se ha descrito que algunos grupos de pacientes tienen mayor propensión a
presentar esta complicación siendo las mujeres en edad fértil (por pérdidas
aumentadas), los niños, adolescentes y las embarazadas (todos ellos por mayores
requerimientos). También se ha visto que a mayor largo del asa alimentaria, mayor
es la incidencia de esta patología [11], dado la mayor malabsorción que podría
ocurrir.
El paciente que presentó anemia es una mujer en edad fértil lo que
concuerda con lo escrito anteriormente, y quizás su suplementación de hierro no
fue suficiente, o bien el suplemento que administró no era el más indicado, ya que
no era el que se le indicó. Esto podría conllevar a un estudio futuro para
determinar cuál es el suplemento de hierro que estos pacientes necesitan así
como también determinar cuál es la cantidad que los pacientes, sobre todo las
45
mujeres en edad fértil, necesitan administrar para no presentar déficit de hierro y/o
anemia.
7.4
Cambios tisulares en yeyuno proximal post cirugía de bypass
gástrico
Los cambios histológicos que presentó el yeyuno proximal, fueron la atrofia
parcial de las vellosidades y el cambio en el número de células caliciformes.
Desde el punto de vista tisular, se apreció un cambio histológico, como una
“deformación” de la estructuración de la mucosa yeyunal. En este sentido, un
estudio acerca de anemia por deficiencia de hierro post gastrectomía se demostró
que había atrofia de las vellosidades de la mucosa en aquellos pacientes que no
respondieron a terapia por hierro oral y que necesitaron una fortificación de hierro
vía endovenosa [32]. A la vez, un estudio acerca de la importancia de la biopsia de
yeyuno en estudio del síndrome de malabsorción intestinal, se observaron
alteraciones histológicas en el 55% de las muestras de la biopsia de la mucosa
intestinal obtenida. La alteración más frecuente que mostró este estudio fue la
atrofia parcial, que se presentó en un 22% de los pacientes. Otros hallazgos
fueron la atrofia total y la linfocitosis, cada una de ellas en el 11% de las muestras,
yeyunitis en el 7% [33]. Estos datos concuerdan con lo encontrado, y que los
cambios que se ven se refieran a una atrofia de las vellosidades de la mucosa.
El número de células caliciformes presentes en la mucosa yeyunal proximal
antes y 6 meses después de la cirugía de bypass gástrico mostró un aumento
importante de células caliciformes por sobre las absortivas, el que llevado a
porcentaje
corresponde
a
un
52%.
Este
cambio
puede
deberse
al
acostumbramiento del yeyuno al aumento del roce mecánico provocado por los
alimentos que ahora pasan directamente, saltándose el estómago y duodeno que
están fuera de circulación, lo que a su vez induce un aumento de secreción de
mucus como una barrera de defensa, lo que se podría llamar un proceso de
“duodenalización” de yeyuno proximal. De esta forma, el yeyuno proximal enfrenta
de mejor manera la llegada de la comida ingerida con todo lo que ello conlleva
(ulceraciones, sangrados, etc).
46
No hay muchos estudios previos acerca de los cambios que experimenta el
yeyuno proximal, más, como se dijo anteriormente, un estudio revela que hay una
atrofia de las vellosidades de la mucosa yeyunal proximal en pacientes sometidos
gastrectomía y que padecen de anemia por deficiencia de hierro, todo lo anterior
hace pensar que los resultados encontrados apuntan a lo mismo.
Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que los cambios
histológicos encontrados en los pacientes a los 6 meses post cirugía de bypass
gástrico, podrían ser los causantes de la anemia que se presenta, generalmente
entre los 8 meses y los 2 años después de realizada la cirugía como se mencionó
anteriormente.
7.5
Cambios en la expresión y localización de DMT-1
La comparación de expresión de DMT1 entre duodeno y yeyuno proximal no
mostró diferencias. Según la literatura la expresión de dicho transportador es
mayor en el duodeno y disminuye a medida que se avanza por el tubo digestivo
hacia la zona distal [18]. Este resultado indica que la histología de duodeno y
yeyuno proximal no son tan diferentes como se cree, si no que más bien, las
diferencias son mínimas, e incluso pueden ser idénticas. Esto se puede deber a
que la el duodeno distal y el yeyuno proximal son muy semejantes, y no exista
diferenciación de una zona u otra.
La disminución de la expresión del transportador de hierro DMT-1 en mucosa
yeyunal proximal fue el cambio más significativo. A este respecto se ha
demostrado que a medida que aumenta la cantidad de hierro en el organismo,
disminuye este transportador (DMT-1), y que en estado de deficiencia de hierro, el
mRNA del transportador DMT-1, se induce aumentando unas 10 veces al igual
que aumentaría Dyctb [21, 22].Por ende, nuestros resultados sugieren un aumento
de hierro en el organismo, debido tanto a la ingesta de suplementos de hierro, y a
que el hierro que es consumido en estado férrico se absorbe en el yeyuno
proximal gracias al aumento de Dcytb que logra reducirlo a su estado ferroso para
47
luego ser absorbido por el DMT-1. Estos cambios producirían una disminución en
los niveles de expresión de este receptor.
Por otra parte la disminución de la expresión del transportador también podría
deberse a un aumento en el número de células caliciformes lo que produciría la
consecuente disminución de las células absortivas. Por lo tanto, el cambio en el
tipo de célula llevaría a la menor expresión de DMT-1, o bien, la cantidad de
mucus secretado por células caliciformes en yeyuno proximal de estos pacientes
es mayor (por haber un número mayor de células caliciformes), y por ende, esto
“amortiguaría” la expresión del transportador DMT-1, tomando en cuenta que este
resultado se obtuvo a través de inmunowestern blot, lo que implica que hubo un
homogeneizado de células, tanto de absortivas como de caliciformes, de por
medio.
Cabe mencionar que en el estudio realizado las muestras se obtuvieron a los 6
meses post cirugía de bypass gástrico, y las anemias se han reportado entre los 8
meses y los 2 años después de realizada la cirugía, es decir a un plazo mayor del
que se ocupó. La anemia presentada por los pacientes que son sometidos a
cirugía de bypass gástrico se puede deber tanto a un síndrome de malabsorción
de nutrientes, como a los cambios histológicos encontrados.
A su vez, la anemia puede ser también una consecuencia de la disminución del
transportador DMT-1 encontrado en nuestro estudio.
El suplemento de hierro administrado a los pacientes del estudio realizado fue
durante un corto período de tiempo, no más de 4 meses, esto llevaría a pensar en
la posibilidad de que estos pacientes ingieran suplementos de hierro por toda su
vida o bien un período más largo de tiempo a fin de evitar la presencia de déficit
de hierro y/o anemia.
48
7.6
Limitaciones del estudio
La principal limitación es el número de pacientes, ya que al ser poca
cantidad no es una muestra representativa de la población.
El tamaño de cada muestra fue sin duda una limitación de gran importancia
de este estudio, ya que la muestra a los 6 meses fue tomada a través de una
endoscopía, por lo que su tamaño era muy pequeño en contraste con aquella
tomada a tiempo 0 mes, la cual fue obtenida por vía quirúrgica.
Otra limitación importante es que a pesar de que los pacientes fueron
controlados por una nutricionista, no todos siguieron las instrucciones de la dieta,
pudiendo terminar o prolongar la ingesta de suplementos de hierro. Además no
todos ingirieron el suplemento de hierro indicado (Maltofer ®), lo que también pudo
haber provocado una variación en los resultados.
Por todo lo anteriormente dicho, hubiese sido ideal tomar una tercera muestra
de yeyuno proximal al cabo de un año post cirugía de bypass gástrico, para así
poder correlacionar la presencia de anemia con los cambios histológicos y los
niveles de expresión de DMT-1 hallados, así como también, visualizar si a medida
que avanza el tiempo estos cambios permanecen constantes o varían de acuerdo
al estado nutricional de los mismos pacientes.
49
8.
Conclusiones
La cirugía bariátrica de bypass gástrico además de solucionar el problema de
la obesidad, soluciona de manera adicional problemas asociados (comorbilidades)
a ella como lo es la diabetes.
La disminución de peso obtenida después de una cirugía de bypass gástrico
es significativa, además que ésta cirugía es la que tiene mejor pronóstico a largo
tiempo, tanto en pérdida de peso como en problemas asociados a la cirugía.
Los suplementos de hierro evitan que el déficit de hierro se presente en
dichos pacientes, o bien, retrasan su aparición.
La cirugía de bypass gástrico produce cambios histológicos, entre ellos una
atrofia de las vellosidades de la mucosa yeyunal proximal.
El número de células caliciformes aumenta en la mucosa yeyunal proximal a
los 6 meses post cirugía de bypass gástrico, lo que provoca una especie de
duodenalización en dicha zona.
La expresión del transportador de hierro DMT-1 en la mucosa yeyunal
proximal disminuye a los 6 meses post cirugía de bypass gástrico debido a los
cambios físicos y fisiopatológicos que sufren los pacientes, lo que explicaría el
déficit de hierro presentado por los pacientes a largo plazo.
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