Técnicas en Bioquímica y Biología Molecular

Técnicas en Bioquímica y
Biología Molecular
•
Técnicas para la separación e identificación
f
de proteínas
•
Aproximaciones
A
i
i
bi
bioinformáticas
i f
áti
para ell análisis
áli i d
de d
datos
t d
de
espectrometría de masas
•
Construcción de librerías genómicas
•
Determinación de interacciones proteína-proteína mediante la
técnica del doble híbrido
•
Técnicas de secuenciación paralela masiva
Electroforesis SDS-PAGE
•
•
•
Tinción con Coomassie (100 ng) o Plata (1 ng)
Fácil, económico, reproducible y rápido (3 h)
Poca resolución en muestras complejas
Valoración de la Glicina
Glicina
pI = (pK1 + pK2)/2
•
Aparición
de
distintas
p
iónicas de la Gly
y
especies
dependiendo del pH
OH- (equivalentes)
Isoelectroenfoque
•
•
Primera dimensión (isoelectroenfoque) separa proteínas
por pI en gradientes de pH inmobilizados (IPGs)
IPG formados
IPGs
f
d por dos
d titipos de
d acrilamida
il id con pIs
I muy
distintos
Migración de proteínas por carga
pH 3.0
pH 10.0
Varias horas a 8.000V
Proteínas enfocadas
Isoelectroenfoque
Segunda dimensión
•
•
Una vez enfocadas las proteínas de acuerdo a su pI, se
separan por tamaño en un gel de SDS-PAGE
E ilib
Equilibrar
titira IPG con tampón
t
ó de
d SDS
SDS: m/z
/ constante
t t
P t í
Proteínas
enfocadas
f
d
Electroforesis Bidimensional (2D)
kDa
97
67
45
30
20
14
Ventajas e inconvenientes de 2D
•
R
Resolución
l ió tteórica
ói d
de 15
15.000
000 proteínas.
t í
P
Práctica
á ti 5
5.000
000
•
Detección de nanogramos de proteína
•
Detección de cambios por cantidad de proteína
proteína, o
cambios por modificación post-traduccional
•
Problemas de detección de proteínas transmembrana o
de solubilización difícil
•
Proteínas con pIs extremos se pierden en 1ªD
Proteómica: comparación geles 2D
Cerebro ratón KO
Cerebro ratón normal
2D DIGE : Differential in gel
electrophoresis
•
•
•
Marcaje de muestras con fluorocromos y separación en
el mismo gel
Vi
Visualización
li
ió en escáner
á
confocal
f
l y análisis
áli i automático
t áti
Se elimina variabilidad entre geles
DIGE: differential in gel
electrophoresis
•
•
Análisis fácil
Pérdida de resolución, incremento linearidad (103-105)
Identificación de proteínas
•
2D permite identificar manchas diferenciales entre 2
muestras, pero no proporciona la identidad de la
proteína sólo tamaño y pI
proteína,
Análisis de péptidos trípticos
•
•
•
Extracción de proteína del gel
Digestión con tripsina
Análisis de péptidos trípticos por MALDI-ToF
tripsina
Digestión con tripsina
proteína
péptidos
MSQTGSHPGRGLAGRWLWGAQPCLLLPIVPLSWLVWLLLLLLASLLPSARLASPLPREEEIVFPEKLNGSV
MSQTGSHPGR
GLAGR
WLWGAQPCLLLPIVPLSWLVWLLLLLLAS LLPSAR
LASPLPREEEIVFPEK
LNGSV
Ejercicio
•
http://us.expasy.org/
•
PeptideMass
•
ALB (Human)
•
Determinar en cuántos péptidos se digiere por Tripsina,
y en cuántos por Quimotripsina
Espectrometría de masas
•
•
•
Determinación de la masa exacta de un ión (relación
carga/masa)
M ti A i t dL
Matrix-Assisted
Laser-Desorption/Ionization
D
ti /I i ti (MALDI)
Time of Flight (ToF)
Péptidos
Pé
tid cargados
d
positivamente
Diferencia de potencial (30.000 V)
+
detector
+
+
++
Tiempo de vuelo (ToF)
P l d
Pulso
de Lá
Láser
Análisis MALDI-ToF
30.000V
+
+
WLWGAQPCLLLPIVPLSWLVWLLLLLLAS LLPSAR
+
+
+
+
+
+
+
H lá
Haz
láser
GLA
AGR
•
LNG
GSVAC
•
A pH ácido los péptidos tienen carga positiva
La energía de un haz láser en una matriz separa los
péptidos
é tid y permite
it que vuelen
l
La masa molecular (m/z) se determina a partir del
tiempo de vuelo (EK=1/2mv2)
LASPLPREEEIVFP
PEK
•
+
+
+
Espectro de masas
Detalle espectro de masas
•
Resolución de formas isotópicas
p
Bases de datos
•
El patrón de masas de los péptidos trípticos es único
para cada proteína
•
Existen bases de datos con el patrón de masas
esperado de los péptidos trípticos de cada proteína
•
4 ó 5 péptidos son suficientes para identificar una
proteína
ICAT: Espectrometría cuantitativa
•
La espectrometría de masas no es cuantitativa
•
Sólo un 30-40% de los péptidos vuelan, unos dando
más señal que otros: diferencias en secuencia facilitan
ionización y/o vuelo
•
La modificación de péptidos permite ver diferencias
cuantitativas entre muestras
•
ICAT: Isotope-coded affinity tag
Resolución de isótopos
•
•
La espectrometría permite diferenciar mezclas
isotópicas (D, 13C,…)
ICAT marcaje
ICAT:
j de
d dos
d muestras
t
con mismo
i
compuesto,
t
pero de composición isotópica distinta
Marcaje ICAT
o iTRAQ
•
•
•
•
•
Reactivo: pesado y ligero
Marcaje y combinación
Separación por afinidad
Cromatografía fase reversa
Análisis espectrométrico
Reactivo ICAT
Secuenciación péptidos MS
•
Espectrometría de masas en tándem
Separación
péptidos
Fragmentación
péptidos
Separación
péptidos
Secuenciación péptidos MS
Péptidos fragmentados
A-M-L-Q-S-R
A
M L Q S R+
M-L-Q-S-R+
Péptido original (m/z=687)
L-Q-S-R
L
Q S R+
A-M-L-Q-S-R+
Q-S-R+
Fragmentación por colisión
S-R
S
R+
A-M-L-Q-S-R+
R+
485
687
157
616
372
R+
S
244
Q
L
m/z
M
A
Identificación de péptidos por
ICAT o iTRAQ
•
•
•
Identificación por MS de pares de picos separados 8 Da
Cuantificación por altura y área
Selección péptidos diferenciales, secuenciación MS/MS
Aplicaciones: Perfil de péptidos
•
Las muestras
L
t
biológicas
bi ló i
contienen
ti
numerosos péptidos
é tid
de bajo peso molecular
•
La espectrometría de masas directa permite obtener
patrones de p
p
péptidos
p
específicos
p
de cada muestra
•
La prepurificación en chips de proteínas con distintas
afinididades
fi idid d permite
i obtener
b
gran iinformación
f
ió d
de una
muestra biológica
•
SELDI: Surphace-enhanced laser-desorption/ionization
Perfil de péptidos
SELDI + microcaptura
MALDI Imaging