Product Data Sheet

INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA
Kit ELISA para la detección del Inmunocomplejo de las variantes del Antígeno de
Carcinoma de Células Escamosas (SCCA-IgM)
Rev. 02/2015
XG003.P
96 Tests
SOLO PARA USO DIAGNÓSTICO
IN VITRO
Fabricado en:
Benedetti & Co Biosolutions s.r.l.
Via Bolognese, 250
51100 Pistoia
ES
SÍMBOLOS UTILIZADOS EN LA ETIQUETA
Dispositivo diagnóstico in vitro
Numero de lote
Código de catálogo
Fecha de caducidad (utilizar antes de…)
Limitaciones de temperatura
(conservar a …..)
Número de test
Atención, leer las Instruccione de uso
Riesgo Biológico
1.0 USO
Hepa-IC es un ensayo por inmunoabsorción
ligado a enzima (ELISA) para la medida
cuantitativa de los Inmunocomplejos de las
variantes del Antígeno del Carcinoma de
Células Escamosas (SCCA-IgM).
2.0 EXPLICACIÓN DEL TEST
Hepa-IC es un innovativo método de
diagnóstico in-vitro basado en la detección de
las variantes del Antígeno del Carcinoma de
Células Escamosas (SCCA) como Complejos
Inmunes circulates (IC). Hepa-IC es un
ensayo ELISA altamente específico y
sensible
para
la
detección
del
Hepatocarcinoma
(HCC) diseñada para
medir SCCA-IgM en el suero de los pacientes
(1-15). La cantidad de SCCA-IgM está
expresada en Unidades Arbitrarias (AU/mL),
usando un calibrador específico como
referencia. La medida de SCCA-IgM ofrece la
posibilidad de aumentar notablemente la
sensibilidad de la detección de HCC sin
comprometer la especificidad comparado con
los niveles en suero de alfa-fetoproteína
(AFP) (1,8,9,11-15). La evaluación de SCCAIgM es también útil en la monitorización del
desarrollo de HCC en pacientes con Hepatitis
crónica (CH) o cirróticos (CR) (2-7,10).
3.0 PRINCIPIO DEL TEST
Los calibradores estándar y las muestras son
simultáneamente incubadas en los pocillos
de una placa microtituladora sensibilizada
con
anticuerpo
anti-SCCA.
El
inmunocomplejo SCCA-IgM es detectado
mediante la incorporación de un anticuerpo
secundario conjugado con enzima y el
sustrato de la enzima (TMB). El color desarro
INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA
llado es proporcional a la cantidad del
inmunocomplejo de la muestra.
4.0
REACTIVOS
Y
MATERIALES
SUMINISTRADOS
XG003-PL: microplaca de 96 pocillos,
sensibilizada con
anticuerpo anti-SCCA
purificado de conejo.
XG003-Calibrator: Dos viales de calibrador
liofilizado
de
PBS.
Polvo
blanco.
Concentración exacta en la etiqueta.
XG-EA2: 14 mL de una solución de
anticuerpo secundario anti-IgM conjugado
con peroxidasa listo para usar.
XG-CH7: 14 mL de una solución cromógena
lista para usar de TMB (3,3’,5,5’Tetramethylbenzidine).
XG-ST7: 14 mL de solución bloqueadora de
H2SO4 0.3M lista para usar.
XG-DB5: 5 mL de solución de dilución
concentrada 5x. Diluir con agua desionizada.
Una vez diluida, la solución contiene 1% BSA
y 0.05% Tween 20. Contiene Proclin como
conservante.
XG-WB3: 100 mL de solución de lavado
concentrada
10x.
Diluir
con
agua
desionizada.
5.0 EQUIPAMIENTO NECESARIO NO
SUMINISTRADO
Pipetas de precisión con puntas desechables
Lavador de microplacas
Lector de microplacas con filtro 450 ± 20 nm
Agua destilada o desionizada
6.0 CONDICIONES ALMACENAMIENTO
El kit tiene que ser conservado entre 2 y 8°C.
La fecha de caducidad está impresa en cada
componente y en la etiqueta del kit.
7.0 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
7.1
NORMAS DE SEGURIDAD
• SOLO PARA USO DIAGNÓSTICO IN
VITRO
• La solución del estándar XG003Calibrator contiene proteínas de orígen
humano. Este material ha sido
analizado mediante métodos aprobados
para la presencia de anticuerpos
directos contra el virus del HIV, contra
el virus HCV y para la presencia del
antígeno de superficie de la hepatitis B
(HbsAg), y se han obtenido resultados
negativos. Como ningún test puede
ofrecer la completa seguridad de la
ausencia de los virus HIV, HBV, HCV, y
otros agentes infecciosos, todos los
reactivos de origen humano deben ser
considerados
potencialmente
infecciosos. Como consecuencia, se
recomienda manejar estos reactivos y
muestras de origen humano de acuerdo
con el Procedimiento Estándar OSHA
para patógenos presentes en la sangre
(16). La buena práctica de laboratorio y
nivel de seguridad 2 deben ser usados
en el caso de materiales que contienen
o sospechosamente contienen agentes
infecciosos (18, 19).
• No pipetear con la boca. Usar guantes de
un solo uso y protección para los ojos a la
hora de manipular las muestras y durante
el test. Lavar las manos una vez terminado
el test.
• Los
siguientes
reactivos
tienen
concentraciones base de sustancias
nocivas o irritantes:
• El tampón de lavado (XG-WB3)
contiene detergentes;
• El conjugado (XG-EA2) contiene fenol;
• El sustrato (XG-CH7) es ácido;
• Si un reactivo entra en contacto con la piel
o con los ojos lavar abundantemente con
agua.
• El material que no es de un solo uso debe
ser esterilizado después de usarse
preferiblemente en autoclave durante una
hora a 121 °C. El material de un solo uso
debe ser autoclavado o incinerado.
• El ácido sulfúrico presente en la solución
bloqueadora (XG-ST7) y el ácido clorídrico
INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA
utilizado para lavar el material de vidrio
son corrosivos; estas sutancias tienen que
ser utilizadas con cuidado. En caso de
contacto con la piel o los ojos, lavar
abundantemente con agua.
• Los ácidos neutralizados y otros residuos
líquidos
deben
ser
desinfectados
añadiendo hipoclorito de sodio a un
volumen suficiente para obtener una
concentración de al menos 1%. Una
exposición al hipoclorito de sodio al 1% de
al menos 30 minutos debería ser suficiente
para garantizar una desinfección eficaz.
Eventuales derramamientos de material
potencialmente infeccioso deben ser
eliminados inmediatamente con papel
absorbente y la zona contaminada deberá
ser limpiada con por ejemplo hipoclorito de
sodio 1% antes de continuar con el
trabajo. Si un ácido está presente, no
deberá utilizarse el hipoclorito de sodio
antes de que la zona haya sido secada.
Todos los materialesutilizados para limpiar
eventuales derramamientos, incluidos
guantes, tienen que ser tratados como
residuos potencialmente infeccioso. No
meter en el autoclave material que
contiene hipoclorito de sodio.
7.2
PRECAUCIONES TÉCNICAS
• Conservar de 2 a 8°C
• Antes del uso, poner los reactivos y
muestras a temperatura ambiente (1830°C). Volver a poner los reactivos a la
temperatura aconsejada de conservación
inmediatamente después de su uso.
• Abrir la bolsa de la placa al menos media
hora después de haber estado a
temperatura ambiente.
• No utilizar reactivos después de la fecha
de caducidad. Evitar la contaminación por
microorganismos de los reactivos porque
disminuye la validez del producto y puede
dar resultados erróneos.
• No modificar el procedimiento ni sustituir
los reactivos con los de otros productores
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
o otros lotes. No disminuir el tiempo de
incubación recomendado.
Toda la cristalería que se usa en el test
debe ser lavada atentamente con ácido
clorídrico 2M y aclarada con agua
destilada o desionizada.
Evitar el uso de congeladores con autodescongelación para la conservación de
las muestras.
No exponer a los reactivos a fuerte
iluminación ni a vapor de hipoclorito
durante la conservación y las fases de
incubación.
Evitar que los pocillos se sequen durante
el test.
Evitar la contaminación entre reactivos. Es
importante utilizar pipetas “dedicadas”
para el uso.
Evitar tocar el borde del pocillo con el
conjugado.
No
soplar
sobra
las
microplacas.
Los ensayos inmunoenzimáticos pueden
presentar un particular efecto sobre el
borde (“edge effect”); se puede minimizar
aumentado la humedad durante las fases
de incubación. Las placas tienen que estar
cubiertas con un cubreplacas y ser
incubadas en la oscuridad. Como
alternativa, se pueden incubar en un
analizador adecuado. Para más detalles
consultar el manual operativo específico
del instrumento. No se pueden usar
incubadores a CO2.
Antes de leer la placa asegurarse que el
fondo de la misma esté limpio y seco y que
no haya búrbujas en la superficie del
líquido.
Puede ser una fuente de error el uso de
muestras altamente hemolizadas, suero no
completamente coagulado o muestras que
presentan contaminación microbiológica.
Leer el manual operativo relativo a
cualquier instrumento utilizado, con
atención a los siguientes puntos:
• Instalación y requisitos particulares;
INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA
•
•
•
Principio operativo, instrucciones,
precauciones, riesgos;
Instrucciones específicas del producto
y utilización del instrumento;
Manutención y asistencia técnica.
8.0 RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE LAS
MUESTRAS
El suero es la muestra recomendada para la
ejecución del test Hepa-IC.
Las muestras de suero deben ser extraídas
en condiciones asépticas y en modo que no
se produzcan fenómenos de hemólisis.
Las muestras pueden ser conservadas a 28°C si el experimento se realiza en las 24
horas siguientes a la extracción, en caso
contrario las muestras deben ser congeladas.
Cuando se descongelan, la muestra debe ser
delicadamente agitada para asegurarse la
consistencia y homogeneidad de los
resultados.
Evitar ciclos repetidos de congelamiento y
descongelamiento. Las muestras
que
presentan sedimentos, eritrocitos o turbidez
tienen que ser centrifugadas y clarificadas
antes de efectuar el test.
9.0 INSTRUCCIONES DE USO
9.1 NOTAS TÉCNICAS
• Permitir a las muestras y a los reactivos de
alcanzar la temperatura ambiente antes de
ejecutar el test. No descongelar las
muestras o los reactivos al baño María.
• Agitar delicadamente las muestras y los
reactivos antes del uso.
• Evitar la formación de espuma . Evitar la
exposición de los reactivos a fuentes de
calor excesivo o de luz durante la
conservación y la incubación.
• Las muestras y el estándar deberían ser
analizados por duplicado.
• Realizar una curva estándar para cada test.
• Usar
solo
strip
sensibilizadas
y
provenientes del mismo lote para cada test.
No mezclar reactivos provenientes de kits
pertenecientes a lotes diversos.
• Realizar la incubación en una caja cerrada
con un papel húmedo en la base con el
objetivo de prevenir una evaporación
excesiva.
9.2 PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
• Reconstituir el calibrador XG003 con 440
μL de agua desionizada en cada vial.
• Preparar la cantidad necesaria del buffer
de dilución XG-DB5 diluyendo 5 veces la
solución
concentrada
con
agua
desionizada. Si aparecen cristales tras la
refrigeración, calentad la botella a 37°C y
agitad hasta su disolución.
• Preparar la cantidad necesaria del buffer de
lavado XG-WB3 diluyendo 10 veces la
solución concentrada en agua desionizada.
9.3 EJECUCIÓN DEL TEST
1. Preparar los reactivos como descrito
anteriormente.
2. Preparar la microplaca con suficientes
pocillos para llevar a cabo el test del
estándar y las muestras.
3. Extraer de la matriz de la microplaca las
strips sobrantes y conservarlas en la
bolsa de plástico con el desecante
suministrado.
4. Lavar las strips de la microplaca tres
veces con el buffer de lavado XG-WB3
(300 μL/well).
5. Distribuir 100 μL/pocillo del calibrador
estándar (por duplicado) empezando por
la solución reconstituida y llevando a
cabo en la placa diluciones seriadas con
factor de dilución 2 con el objetivo de
obtener una curva de calibración de 7
puntos. Usar el buffer de dilución XG-DB5
como
diluyente
(videoclip
en
http://www.xeptagen.com/elisains). Para
la concentración exacta del calibrador
reconstituido, hacer referencia al valor de
cocentración (AU/mL) indicado en el vial
XG003-Calibrator. Distribuir también 100
μL/pocillo del buffer de dilución DB5
como blanco por duplicado.
INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA
6. Distribuir 100 μL/pocillo de las muestras
diluidas 8 veces (1:8) por duplicado. Usar
el buffer de dilución XG-DB5 como
diluyente.
7. Incubar durante 1 hora a temperatura
ambiente.
8. Lavar seis veces con el buffer de lavado
XG-WB3 (300 μL/pocillo).
9. Añadir 100 μL/pocillo de la solución del
anticuerpo secundario conjugado XGEA2.
10. Incubar durante 1 hora a temperatura
ambiente.
11. Lavar seis veces con el buffer de lavado
XG-WB3 (300 μL/pocillo).
12. Distribuir 100 μL/pocillo de la solución
cromógena XG-CH7.
13. Permitir que la solución se colore durante
10-15 min a temperatura ambiente en la
oscuridad. A continuación, añadir 100
µL/pocillo de la solución de stop XG-ST7
y medir los valores OD de cada pocillo
usando
un lector de placas ELISA
equipado con un filtro de 450 nm. Una
vez bloqueada la reacción debe leerse
dentro de una hora.
14. Interpretar los valores de OD con el
software
Xerepro
(http://www.xeptagen.com/software)
o
como descrito en la próxima sección:
Elaboración de los resultados.
10.0 RESULTADOS
10.1
ELABORACIÓN
DE
LOS
RESULTADOS
a. Calcula la media de las densidades
ópticas obtenidas por duplicado para cada
punto del calibrador estándar y de las
muestras.
b. Sustrae la media de las absorbancias del
blanco.
c. Costruye la curva estándar colocando las
concentraciones del calibrador conocidas
en el eje X y los relativos valores de
absorbancia en el eje Y.
d. Calcula la concentración de SCCA-IgM de
las muestras por interpolación con un
curva de regresión según una ecuación a
cuatro parámetros.
e. Multiplica por el factor de dilución con el
objetivo de obtener la concentración de las
muestras antes de la dilución.
10.2 CONTROL DE CALIDAD
El coefficiente de variación intra- e
interensayo ha sido determinado sobre 4
curvas estándar y ha resultado ser inferior a
15%.
Para un esperimento óptimo, la absorbancia
relativa al blanco debería ser inferior a 0.2
OD@450.
Se recomienda que cada laboratorio efectúe
el test utilizando sus propias muestras
analizadas precedentemente y con resultado
positivo como control de calidad interno para
asegurarse de la exactitud del procedimento
y los reactivos.
10.3 INTERPRETACIÓN
Hepa-IC puede ser utilizado para (1-15, 2024):
• el diagnóstico de HCC ya que el análisis
de SCCA-IgM es altamente sensible, hasta
un 70% de detección de HCC, y
extremadamente específico, hasta el
100% en sujetos sin enfermedad.
• evaluar el riesgo de la evolución a HCC en
pacientes con enfermedades hepáticas
benignas.
• monitorar la progresión de la hepatitis en
pacientes HCV positivos.
• proporcionar la respuesta del paciente al
tratamiento de la hepatitis C.
• determinar el pronóstico de pacientes con
HCC ya que los niveles de SCCA-IgM
elevados están asociados con periodos de
supervivencia más breves.
• monitorar la eficacia del tratamiento en
pacientes con HCC.
INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA
11.0 CARACTERÍSTICAS DEL ENSAYO
11.1 INTERVALO
El intervalo de calibración está comprendido
entre 5 y 200 AU/mL. El “efecto gancho”
puede
verificarse
para
valores
de
cocentración superiores a 200 AU/mL (valor
leído en la curva de calibración antes de
multiplicar por la dilución). Las muestras con
valores superiores a 200 AU/mL deben ser
aún más diluidas y analizadas de nuevo.
11.2 PRECISIÓN
Precisión intraensayo
Muestra
C1
C3
N
8
8
AU/mL
112
249
CV
2.3% 6.4%
H5
8
565
6.3%
H1
8
1014
12.3%
Precisión interensayo
Campione
C1
C3
N
24
24
AU/mL
111
254
CV
1.3% 4.1%
H5
24
580
2.3%
H1
24
1140
11%
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INSTRUCCIONES DE USO Y FICHA TÉCNICA