MS/MS

Espectrometría masas
tandem y su empleo en
tamiz neonatal
Michel David dos Santos, PhD
0
Noviembre
2010
Coordinador de Ventas
Genetic Screening
Región Latinoamérica-sur
São Paulo, Brasil
© 2009 PerkinElmer
Temario
 El tamiz neonatal y la espectrometría masas tandem
(MS/MS) para detección de EIM
 Conceptos y componentes del sistema MS/MS
 Aplicaciones de la MS/MS en el tamiz neonatal
 Productos y soluciones PerkinElmer
 Escenario global de la MS/MS aplicada al tamiz neonatal
1
Espectrometria de masas tandem...
¿Por que MS/MS en el tamiz neonatal?
 Ampliación del panel de tamiz;
 Técnica de alto impacto;
 Detección de disturbios con incidencia
relativa alta (MCAD);
 Única alternativa para la detección de
algunos EIM;
 Diferencial de mercado;
Ampliado
Básico
PKU TSH
PKU TSH GAO
Hb IRT 17OH
Hb IRT
Toxo G6PD BTN
2
Expandido
PKU TSH GAO BTN 17OH
Toxo G6PD
Hb IRT
AMINOACIDOPATIAS
DEFECTOS DEL
METABOLISMO DE LAS
GRASAS
(30+ errores innatos del
metabolismo)
...revolucionando el mercado de tamiz neonatal
Componentes principales del sistema
Espectrómetro de masas
Control del sistema
Procesamiento de datos
Automuestreador
Bomba HPLC
3
No-break Bomba vacío Generador Gas colisión
(Ar)
N2
Equipo, técnicas de ionización y análisis
Espectrómetro de masas tandem (MS/MS)
Ionización: electrospray (ESI)
Análisis (separación): quadrupolos (triple)
Quattro micro
4
TQD
La técnica MS
¿Qué es la espectrometría masas (MS)?
 Herramienta analítica poderosa, ampliamente difundida en
diferentes áreas de investigación y aplicación práctica.
 La MS es un método de análisis que separa, detecta y
cuantifica IONES de acuerdo con sus razones masa/carga
(m/z).
5
La técnica MS
MS
Los analitos neutros, después de IONIZADOS, pueden ser
separados y cuantificados de acuerdo con sus razones masa
carga (m/z).
AB
6
Ionización
+ H+
ABH+
Molécula neutra
Ion
(no puede ser analizada)
(puede ser analizado)
El espectrómetro de masas en detalle
Inyección
Ionización
Transferencia
Análisis y
detección
Filtros
Aguja de jeringuilla/capilar
Gotitas de
solvente/analito
(spray)
Capilar de
transferencia
Para los
analizadores
de masas
Flujo
solvente/analito
(Jeringuilla o
LC)
Flujo de N2(g)
Cono
PRESIÓN ATMOSFÉRICA
Vacío
7
Fuente generadora de iones
Esquema del mecanismo de formación de iones por ESI
Cono (contraelectrodo)
Punta de la aguja (spray)
Gotita con
cargas
múltiplas
Cono de
Taylor
Explosión
Evaporación
solvente
“Coulumbica”
El limite de
“Rayleigh” es
alcanzado
Molécula del
analito
Fuente de
energía
8
Gotita con
cargas
múltiplas
Iones del
analito
El proceso de ionización por electrospray
El proceso de
ionización por
electrospray
9
La técnica MS/MS
¿Qué es la espectrometría masas tandem (MS/MS)?
 La espectrometría de masas tandem es una técnica de ionización
y separación que emplea dos (o mas) analizadores (filtros) de masas
dispuestos en línea.
 Entre estos analizadores hay una celda de colisión, donde
ocurren fragmentaciones de iones.
10
La técnica MS/MS
MS/MS
“Los
iones,
informaciones
después
de
estructurales
FRAGMENTADOS,
importantes
para
generan
que
sean
identificados y cuantificados (especificidad)”.
ABH+
Ion
(puede ser
fragmentado)
11
Fragmentación
BH+
Ar(g)
Ion
(puede ser
analizado)
+
A
Molécula neutra
Esquema general del espectrómetro triple quadrupolo
Cono de
muestras
Lentes RF
transf.
óptica
Celda
Quadrupolo colisión
Quadrupolo
(hexapolo)
MS1
MS2
Dinodo de
conversión
Fuente
ESI
Fósforo
Pre-Filtro
10-1 mbar
Bomba
rotativa
12
10-3 to 10-4 mbar
Bomba
turbomolecular
Pos-Filtro
Pre-filtro
10-5 mbar
Bomba
turbomolecular
PMT
El proceso
Gates, P.J.; Santos, M.D.; Gobbo-Neto, L.; Carollo, C.A.; Crotti, A.E.M.; Vessechi, R.; Lopes, N.P.
Current methods in medicinal chemistry and biological physics. (Taft, C. & Silva, C.H.T.P., eds),
2006
16
Ionización – Separación - Detección
17
Ganadores del premio Nobel...
18
...que crearan y revolucionaran la espectrometría de masas
MS/MS: aplicaciones…

Identificar esteroides anabolizantes en atletas

Muchas
aplicaciones,
revolucionando
los mas variados
Determinar
la composición
molecular
de rocas espaciales
campos e áreas...

Detectar adulteración de miel por jarabe de maíz

Monitorear fermentaciones en la industria de biotecnología

Detectar sustancias tóxicas en productos alimenticios

Realizar análisis forenses (intoxicación por drogas)
...incluyendo el TAMIZ NEONATAL
 Determinar el origen y la edad de especies vegetales y animales (geología e
paleontología)

Identificar contaminaciones ambientales

Generar imágenes diagnósticas

Aplicaciones biomédicas generales
19
Aplicaciones de la MS/MS en el Tamiz Neonatal
20
Finalidad del ensayo
Detección y cuantificación, por la técnica MS/MS, de:
Aminoácidos
Carnitina libre
Acilcarnitinas
en muestras de sangre, secas en papel filtro, colectadas del talón
de recién nacidos.
Los datos generados pueden ser indicativos de una o mas
desordenes, auxiliando en el diagnóstico de varios disturbios
metabólicos en neonatos.
21
Finalidad del ensayo
El análisis cuantitativo de las muestras proveen perfiles de
concentración de analitos (incluyendo sus razones).
Detección de errores innatos que pueden resultar en
deficiencias permanentes o óbito en recién nacidos.
22
¿Qué analitos se puede medir con la MSMS?
Aminoacidos y acilcarnitinas




Más de 30 enfermedades
Aminoacidopatías
Acidemias orgánicas
Defectos del metabolismo de los ácidos grasos
PKU (Phe y Tyr)
 Sin la necesidad del teste PKU separado
Incidencia general: ~1:4000 nacimientos
23
¿Qué analitos se puede medir con la MSMS?
Test de perfil  Un ponchado  Varios analitos  > 30 enfermedades

Aminoacidos
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–

Phenylalanine
Tyrosine
Methionine
Isoleucine/Leucine
Valine
Alanine
Glycine
Serine
Pyroglutamic
Glutamic acid
Citrulline
Arginine
Ornithine
Arginosuccinic acid
Glutamic acid
– 10 razones adicionales
24
Acilcarnitinas
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Carnitine
C14
C2
C3
C3DC
C4DC
C5DC
C6DC
C6
C8
C5
C4
C10
C10:1
C18:1:OH
C12
C10:2
C14:1
C14:2
C16
C18
C18:1
C18:2
C14:OH
C16:OH
C18:OH
C5:OH
C5:1
C4OH
– 20 razones adicionales
!95 parámetros directos o indirectos en 90 segundos!
Disturbios del metabolismo: aminoácidos
Aminoácidos
 En las aminoacidopatías, las enzimas que participan del metabolismo de
algunos aminoácidos no están disponibles o presentan actividad
reducida.
 Así, las concentraciones de los aminoácidos afectados (o de metabolitos
alternativos) se tornan elevadas en el sangre.
 Como resultado, estas concentraciones elevadas provocan graves daños
a la salud del niño, incluyendo la posibilidad de muerte.
27
Disturbios del metabolismo: aminoácidos
Fenilcetonuria (PKU)
Fenilalanina
hidroxilasa
Fenilalanina
Tirosina
Deficiencia mental
(varios grados)
Fenilpiruvato
28
Aminoacidopatías: algunos ejemplos
Homocistinuria
Metionina ↑
Cistationa
Homocisteína
beta-sintase
Osteoporosis
Desenvolvimiento mental retrasado
Enfermedad de orina con olor a jarabe de arce (MSUD)
Leucina ↑
Isoleucina ↑
Valina ↑
Letargo
Convulsiones
Desenvolvimiento mental retrasado
Coma
Citrulinemia
Ciclo de la urea
(Argininosuccinato
sintetasa)
29
Amôníaco ↑
Convulsiones
Anorexia
Letargo
Coma
El espectro de masas: resultados de análisis
Perfil de aminoácidos de una muestra de sangre seca en papel filtro: Normal
100
Pro
Modo de análisis: pérdida
neutra
Estándares internos
Razón Phe/Tyr
% Intensity
Ala
Phe
50
Leu + Ile
Phe
Leu
Gln
Val
Ala
Gly
Gly
140
30
Tyr
Tyr
Ser
160
Val
180
Cit
Met
200
220
m/z, amu
Glu
Asp
240
Glu
260
280
300
El espectro de masas: resultados de análisis
Perfil de aminoácidos de una muestra de sangre seca en papel filtro: PKU
100
Phe
Modo de análisis: pérdida
neutra
Estándares Internos
Pro
% Intensity
Razón Phe/Tyr***
Ala
50
Phe
***Diferencial
Leu + Ile
Val
Ala
Gly
Gly
140
Ser
160
Gln
Leu
Met
Val
180
200
Tyr
220
m/z, amu
31
Tyr
Cit
240
Asp
Glu
Glu
260
280
300
Disturbios del metabolismo: ácidos grasos
Ácidos Grasos
 En los disturbios del metabolismo de los ácidos grasos, las enzimas
que metabolizan (oxidan) estos compuestos no están disponibles o
presentan actividad reducida.
 La oxidación de los ácidos grasos es fundamental como fuente
secundaria de energía cuando los niveles de glucosa están bajos.
 En períodos de ayuno, pueden ocurrir crisis metabólicas
caracterizadas por vomito, letargo, convulsiones o coma. La falla del
diagnóstico puede resultar en problemas de desarrollo muscular,
encefalopatía y complicaciones vasculares, pudiendo ocurrir muerte.
32
Disturbios del metabolismo: ácidos grasos
MCAD
deficiencia de la Acil-CoA dehidrogenasa de cadena media
La enzima MCAD, que oxida octanoil-CoA, está ausente. Hay niveles elevados de
C6, C8, C10 y C10:1 (la análisis debe considerar todos analitos);
En algunas estimativas, la MCAD tiene la misma ocurrencia que la PKU;
Aprox. 25% de los pacientes mueren en el primero episodio de crisis metabólica;
En caso que la MCAD sea diagnosticada rápidamente (antes de un episodio de
crisis), es posible prevenir las complicaciones de la enfermedad;
Varias publicaciones muestran las ventajas del costo x beneficio con la
implementación del sistema MS/MS para el tamiz de este disturbio.
33
El espectro de masas: resultados de análisis
Perfil de acilcarnitinas de una muestra de sangre seca en papel filtro: MCAD
MCAD
Intensidade (%)
Normal
m/z
MCAD: Deficiencia de la Co-enzima A Desidrogenasa.
Defecto de beta oxidación. Hay niveles elevados de C6, C8, C10 y C10:1.
34
Disturbios del metabolismo: ácidos orgánicos
Ácidos Orgánicos
 En las acidúrias orgánicas, las vías responsables por el metabolismo de
los ácidos orgánicos se encuentran funcionalmente comprometidas.
 La activación de las vías metabólicas intermedias, y el acumulo de
estos ácidos orgánicos en la sangre y orina alteran el balance ácidobase del organismo.
 Como un resultado, hay el aparecimiento de varios síntomas clínicos
incluyendo acidosis metabólica, cetosis, fallas en el desenvolvimiento,
sepsis y coma, los cuales pueden levar a la muerte.
35
Disturbios del metabolismo: ácidos orgánicos
Ácidos Orgánicos
C3: acidemia propionica o acidemia metilmalonica
La enzima propionil-CoA carboxilasa está deficiente, causando la elevación de
los niveles de C3.
C5DC
Niveles elevados de C5DC son indicativos de acidemia glutárica del tipo I (GA-I)
36
El espectro de masas: resultados de análisis
Perfil de acilcarnitinas de una muestra de sangre seca en papel filtro: Normal
100
C2 C2
Estándares Internos
% Intensity
C16
Modo de análisis:
búsqueda por el
precursor de m/z 85
C8
50
C18:1
C4
C3
C16
C3
C4DC
C5OH
270
37
300
330
C14:1
360
390
420
m/z, amu
450
480
510
540
El espectro de masas: resultados de análisis
Perfil de acilcarnitinas de una muestra de sangre seca en papel filtro: Acidemía propionica
100
C3
Estándares Internos
% Intensity
Modo de análisis:
búsqueda por el
precursor de m/z 85
50
C2
C16 C18:1
C16
C2
C3
C4
270
38
300
C8
330
360
390
420
450
m/z, amu
480
510
540
Disturbios del metabolismo
Claramente, cualquier pre-diagnóstico no debe ser hecho
considerándose el aumento, disminución o ausencia de un único
metabólito.
Muchos disturbios metabólicos presentan un perfil diferenciado de
metabólitos, y este perfil es altamente sugestivo de un desorden
específico.
Entre varias otras ventajas, la MS/MS es capaz de ofrecer
informaciones valiosas con respecto a este perfil.
Diferencial
39
NeoLynx: software específico
40
MS/MS: aplicaciones en el tamiz neonatal
¿Por qué utilizar un sistema MS/MS en el tamiz
neonatal?
 Ampliación del panel de screening
 Posibilidad de detectar errores innatos del metabolismo no detectables anteriormente
(por ejemplo, MCAD).
 MS/MS – Técnica de Alto Impacto
 Permite analizar varios metabólitos en un único análisis;
 El índice de falsos positivos relativamente menor;
 Ventajas sobre métodos tradicionales: + Sensible + Eficiente + Específico + Fiable
41
MS/MS: aplicaciones en el tamiz neonatal
¿Por qué utilizar un sistema MS/MS en el tamiz
neonatal?
Varias enfermedades, un análisis:
High Impact (alto impacto).
Una enfermedad, un análisis: High Throughput (alta productividad).
30 o más analitos, indicativos de 30 o más errores
innatos del metabolismo en un análisis de 2
minutos!
42
MS/MS: aplicaciones en el tamiz neonatal
¿Por qué utilizar un sistema MS/MS en el tamiz
neonatal?
 El tamiz neonatal se modifica a través el tiempo
 Los padres reconocen más la importancia del tamiz neonatal para la salud
futura de sus niños;
 Los padres están más conscientes de sus derechos sobre la realización de
este tipo de evaluación;
 Diferencial de mercado.
43
Soluciones y productos PerkinElmer
Equipos
44
Reactivos
Software Soporte
Proposición de valor: Seguridad y Productividad
 Consultoría
 Planeo
 Implementación del software
 Equipos
 Reactivos (kits)
 Instalación
Procesamiento de
datos y reportes
 Mantenimiento y actualización
 Servicio y soporte
Colección de muestra
Análisis
Reactivos
Preparación de
muestras
45
Proveemos
resultados fiables
en el tiempo
adecuado
Kit NeoBase™ MS/MS Non-derivatizado
Kit Neobase
 3040-0010 Kit NeoBase MS non derivatizado







Controles DBS (Niveles Bajo y Alto)
Estándares internos de Aminoácidos y Acilcarnitinas
Placas de 96 pocillos con fondo en V resistentes al calor (10 placas)
Placas de 96 pocillos transparentes con fondo en V truncado (10 placas)
Coberturas adhesivas y de aluminio para microplacas (20 de cada)
Códigos de barras para las placas (30 piezas)
Certificado de Control de Calidad
 3041-0010 Soluciones de ensayo NeoBase
 NeoBase solvente de flujo (2 botellas, 400 ml cada)
 NeoBase solución de extracción (1 botella, 140 ml)
SA
NeoBase
AAAC
 3042-0010 Solución de Ensayo para succinilacetona NeoBase
 Solución NeoBase p/ ensayo de succinilacetona (1 vial, 2,8 ml) – Tirosinemia tipo 1
47
Procedimiento del ensayo NeoBase no derivatizado
OPCIONAL
Extracción
Transferencia
MSMS
Inyección y
cuantificación
por MS/MS
Añada solución de
extracción con
estándares internos
Solución de succinilacetona
OPCIONAL
48
Escenario actual
Escenario actual de la espectrometría de
masas en el mundo
51
Latinoamérica: escenario actual
52
Posición global de PerkinElmer – mercado MSMS
PKI MSMS kits
53
Norteamérica
A
K
Alberta y Ontario - Canada
WA
ME
ND
MT
OR
SD
ID
CA
MO
KS
OH
IN
AZ
NM
WV
VA
NC
SC
AR
GA
AL
PKI Kit
“In house”
Otros (No
MS/MS, o
desconocido)
54
HI
DE
KY
MS
TX
MA
RI
NJ
TN
OK
CT
PA
IA
IL
CO
NY
WI
WY
UT
VT
NH
MI
NE
N
V
MI
M
N
LA
FL
MD
El panel del ACMG
Situación en
2007
 ACMG – reporte de mayo 2006
 29 enfermedades identificadas

Panel recomendado
 Tirosinemia I está incluida – pero con
problemas.

Solución de PerkinElmer: kit succinilacetona
– NeoBase™ MSMS
 EEUU estableció normas para la
implementación de programas de tamiz
neonatal
 Otros países la adoptaron – y algunos
definieron sus propios “modelos
ACMG”

55
Dinamarca, Noruega, España, Suecia, UK.
2009: 23 estados usan reactivos MSMS de PerkinElmer –
debido a la colaboración entre los estados, hay la
cobertura de ~38 estados* (con PKI Genetics)
Tamiz neonatal MS/MS en Europa
56
Tamiz neonatal MS/MS en Europa
2004
J. Gerard Loeber, Neonatal Screening in
Europe; the situation in 2004,
J Inherit Metab Dis (2007) 30:430-438
57
Tamiz neonatal MS/MS en Europa
2004
2007
O. A. Bodamer, G. F. Hoffmann, M. Lindner,
Expanded Newborn screening in Europe 2007,
J Inherit Metab Dis (2007) 30:439-444
58
Tamiz neonatal MS/MS en Europa
2004
2007
2009
59
Conclusión
Hay una tendencia mundial de crecimiento del uso de la MS/MS
para el tamiz neonatal;
Generalmente, las iniciativas regionales abren camino para la
expansión;
Conclusión
PerkinElmer provee los equipos
y el software de análisis, el cual es
aprobado por la FDA y exclusivo en el mercado.
Proveemos Kits con calidad certificada, siguiendo las
recomendaciones de la ACMG (Tyr tipo I - succinilacetona).
Proveemos todo el soporte pos-venta, con la experiencia de líder
mundial en tamiz poblacional.
60
¡MUCHAS GRACIAS!
61