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CARACTERIZACIÓN DE FIBRAS DE CELULOSA MEDIANTE MICROSCOPÍA
LÁSER CONFOCAL y ANÁLISIS DE IMÁGENES
M. ALONSO GUERVÓS*, F. GONZÁLEZ-RÍo**, MARTÍNEZ- NISTALA.*, R. ASTORGA** & A.
SAMPEDRO*.
* SERVICIO DE PROCESO DE IMÁGENES DE LA UNIVERSIDAD DE OVIEDO. cl JULIAN CLAVERÍA
SiN (FAC. DE QUÍMICA). 33006 OVIEDO.
** CELULOSAS DE ASTURIAS S. A. (CEASA). 33710 NA VIA (ASTURIAS).
RESUMEN
Se ha utilizado la microscopía láser confocal para el estudio de fibras de celulosa. Esta
técnica simplifica la preparación de las muestras y permite obtener rápidamente secciones
transversales de la imagen de un modo no destructivo. Se han obtenido, mediante análisis de
imágenes, varios parámetros morfométricos y se ha calculado el grado de colapso de las
fibras. Se han estudiado las variaciones en la morfología de la fibra utilizando nueve o una
sección transversal por fibra sin encontrarse diferencias significativas entre ambos métodos.
Igualmente se han estudiado las posibles correlaciones entre la longitud de las fibras, el
espesor de la pared y el grado de colapso.
P.e.: Microscopía láser confocal, Análisis de imágenes, Fibras de celulosa, Eucalipto.
SUMMARY
Confocallaser scanning microscopy has been used to study cellulose fibres. This technique
simplifies specimen preparation and allows to obtain rapidly non destructive cross-section
images. Several cross-sectional morphological parameters and shape parameters were
quantified using an image processing procedure. Variations in fibre morphology were studied
using either nine, or one, value by fibre. No significant differences have been found in most of
the measured parameters using either method. No correlation among fibre length, wall
parameters and shape parameters was found for these fibres.
K.W.: Confocallaser microscopy, Image analysis, Cellulose fibres, Eucalypt.
INTRODUCCIÓN
El control de calidad en la industria de la pasta y el papel se lleva a cabo
convencionalmente mediante medidas del producto final con el fin de satisfacer los
requerimientos de los clientes. Sin embargo, la caracterización de las propiedades individuales
de las fibras es necesaria para controlar su variación a lo largo del proceso y su contribución
al comportamiento del producto final (PAULAPURO y RITY, 1976; HEIKKURINEN el al.,
1991).
101
La definición de parámetros y el desarrollo de métodos fiables de cuantificación mediante
la aplicación de nuevas tecnologías como el análisis de imágenes y la microscopía láser
confocal, pueden contribuir al conocimiento sobre la estructura y composición de las fibras.
La anchura de la fibra y su longitud puede ser observada fácilmente con microscopía óptica
de luz transmitida, pero la obtención de secciones transversales para el estudio del espesor de
la pared y su grado de colapso requiere de una metodología más compleja (KIBBLEWHITE
& BAILEY 1988). El uso de la microscopía láser confocal simplifica la preparación de las
muestras y permite obtener rápidamente secciones transversales de un modo no destructivo
(lANG et al. 1992).
En este trabajo se presenta la utilización de microscopía láser confocal y análisis de
imágenes para la obtención y cuantificación de secciones transversales de las fibras. Se realiza
un estudio de las posibles variaciones en los parámetros en función del número de secciones
transversales obtenidas por cada fibra y se analizan las posibles correlaciones entre la longitud
de la fibra y el espesor de pared y el grado de colapso.
MATERIAL Y MÉTODOS
Para la realización del presente trabajo se ha utilizado un sistema de microscopía láser
confocal Bio-Rad MRC-600 CLSM (Bio-Rad Laboratories S.A.). Las fibras de celulosa
analizadas procedían de pasta Kraft blanqueada, a partir de madera de Eucalyptus globulus
(Labill.). Para la preparación, se disuelve la pasta de celulosa en agua destilada hasta obtener
una disolución de fibras, tiñéndose las fibras con el fluorocromo Texas Red. Para la
realización de secciones transversales (x-z) se orienta la fibra perpendicularmente a la
dirección de barrido del láser y se toma una serie de líneas mientras se desplaza la muestra
verticalmente a lo largo del eje z. La cuantificación de los parámetros morfométricos de las
secciones transversales se realizó mediante el empleo de un equipo de análisis de imágenes
IMCO 1000 (Kontron Instruments Gmbh).
Además de la longitud de la fibra se han cuantificado los siguientes parámetros (figura 1):
área de pared (AP), área de lumen (AL), longitud de pared (LP), perímetro total (PT),
perímetro del lumen (PL), diámetro máximo (Dmax) y diámetro mínimo (Dmin). El valor
medio del espesor de la fibra (Esp) es igual a AP dividido por LP (KIBBLEWHITE &
BAILEY, 1988).
Durante el proceso de elaboración de la pasta de celulosa la fibra es expuesta a procesos
fisico-químicos que cambian su forma original produciendo el aplastamiento o el colapso.
Estos cambios pueden ser estimados a partir de la forma de las secciones transversales de las
fibras.
La elongación (E), definida como la relación entre Dmin y Dmax, ha sido propuesta por
KIBBLEWHITE y BAILEY, (1988). como un parámetro para estimar el grado de colapso de
las fibras. Un valor pequeño de E indicaría un mayor grado de aplastamiento de la fibra.
JANG et al (1995) definen un nuevo parámetro denominado índice de colapso (lC) que se
basa en calcular la disminución sufrida por la fibra en el tamaño dellumen:
IC=AL/ALa
siendo AL el área del lumen y ALa el área que tendría la fibra si no hubiese. sufrido
aplastamiento. El valor de ALa es calculado por JANG et al. asumiendo que la forma original
dellumen es rectangular. En nuestro caso y dado que se ha trabajado con fibras de diferentes
procedencias y que es extremadamente difícil y arriesgado predecir una forma original de área
de lumen para todas ellas, hemos considerado el círculo como forma· teórica dellumen en una
fibra sin colapsar. IC es igual a 1 si ellumen es completamente circular y vale O si la fibra está
totalmente colapsada.
102
La figura 2 muestra nueve secciones transversales de diferentes fibras y sus
correspondientes valores de : área de pared (AP), área de lumen (AL), espesor de pared (EP),
elongación (E) e indice de colapso (lC). Se presenta además un nuevo índice de deformación
(ID), que hemos definido para corregir los problemas que aparecen, en algunos tipos de fibras,
al utilizar los valores de E o IC para medir el grado de colapso.El valor de ID se ha definido
como el promedio de E e le. Su ventaja es que tiene en cuenta tanto la forma externa de la
pared como el área dellumen, con lo que fibras con una forma externa aplastada pero con un
lumen redondeado presentan un valor de ID menor que si sólo se considerase el le. Otra
ventaja de este índice es que permite diferenciar grados de aplastamiento, cuando el lumen
está completamente cerrado (IC=O), en función de la forma externa de la fibra.
RESULTADOS
Se realizó un análisis de 210 fibras correspondientes a un mismo tipo de pasta para estudiar
como las variaciones en la morfología de la fibra pueden afectar a los parámetros
cuantificados a partir de las secciones transversales. De cada fibra se realizaron nueve
secciones transversales en su zona media, con una distancia entre secciones de 9 ~m. A
continuación se calcularon los valores medios y la desviación standard de cada parámetro
utilizando nueve valores por fibra (los correspondientes a las nueve secciones de cada fibra) o
usando un único valor por fibra. En este segundo caso el valor único de cada fibra fue
obtenido de cuatro formas distintas: a partir de las medias de las nueve secciones, utilizando
el valor de la sección que tenía mayor espesor de la pared, utilizando el valor de la sección
central y utilizando el valor de la sección más extrema de las nueve.
Para el AP los valores medios son muy similares en todos los casos. Para el valor de AL el
análisis ANOV A ha mostrado diferencias significativas entre los diferentes métodos,
obteniéndose el valor más bajo de AL si utilizamos la sección de mayor espesor y el valor
más alto si utilizamos la sección central. Como era de esperar los valores medios más altos de
EP se obtuvieron en el caso de utilizar las fibras con mayor espesor de pared, mientras que no
se apreciaron diferencias significativos en los valores obtenidos por los otros cuatro métodos.
La figura 3 presenta los valores obtenidos para los diferentes índices de colapso utilizados. En
este caso, no se han encontrado diferencias significativas entre los distintos métodos.
Según estos resultados no es necesario tomar más de una sección transversal por fibra para
el estudio de la mayoría de los parámetros definidos. Únicamente en el caso de del área del
lumen se ha visto que presenta variaciones significativas según se utilice uno u otro método.
La longitud de las fibras se comparó con el área de pared (AP) en una sección transversal
tomada en su zona media y con el espesor de pared en esa misma sección. Igualmente se
realizó una comparación entre el índice de deformación (ID) y el espesor de pared (figura 4)
y entre ID y la longitud total de la fibra. El valor de correlación obtenido entre longitud y AP
fue de p = 0.381 (p<O.Ol), y entre longitud y espesor fue de p = 0.312 (p<O.Ol). Para el caso
del índice de deformación (lD) los valores de correlación obtenidos fueron: p = 0.440
(p<O.Ol) en relación con el espesor y p = 0.148 (p<O.Ol) en relación con la longitud de la
fibra.
CONCLUSIONES
Con la microscopía láser confocal es posible obtener secciones transversales de fibras de
pasta sin necesidad de una preparación de la muestra compleja y tediosa. Usando métodos de
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análisis de imágenes es posible cuantificar varios parámetros morfométricos que nos permitan
conocer la estructura de la fibra y su grado de colapso. Se ha estudiado el efecto de las
variaciones en la morfología de la fibra utilizando nueve secciones o una única sección en el
cálculo de los parámetros, encontrándose que no existen diferencias significativas entre
ambos métodos. El análisis de las correlaciones bivariadas entre longitud, espesor y grado de
colapso muestra bajos coeficientes de correllación siendo el más significativo el observado
entre el ID y el espesor (p = 0.440).
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo ha sido, financiado dentro del 11 Plan Regional de Investigación del
Principado de Asturias gestionado por la FICYT.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
HEIKKURINEN A, LEVLIN JE, PAULAPURO H (1991) PrincipIes and Methods y in
Pulp Characterization -Basic Fiber Properties. Paperi la Puu- Paper and Timber. Vol 73, Iss
5, pp 41 l.
JANG, H.F, ROBERTSON, A.G., SETH R.S. (1992) Transverse dimensions of Wood Pulp
Fibers by Confocal Laser Scanning Microscopy and Image-Analysis. lournal qf Materials
Science. 27, 6391-6400.
JANG, H.F., HOWARD, Re., SETH, RS. (1995) Fiber characterization using confocal
microscopy - the effects of recycling. Tappi lournal. 78, 131-137.
KIBBLEWHITE, RP., BAILEY D.G. (1988). Measurement of Fibre Cross-Section
Dimensions U sing Image Processing. Appita. 41, 297- 303.
PAULAPURO, H, RITY, N (1976) Pulp characterization for process control purposses.
Pulp & Paper Canada.vol 77: n° 6: 109 -11l.
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Perímetro convexo (pe)
Area de pared
erímetro total (PT)
erímetro dellumen (PL)
del lumen (AL)
Longitud de
pared (LP)
iámetro mínimo
(Dmin)
Diámetro máximo (Dm
Fig. 1. Sección transversal de una fibra de celulosa donde se representan los diferentes parámetros
medidos.
AP =136.2 1¡.¡.m2
AL =5.92 ¡.¡.m2
EP= 5.32 ¡.¡.m
E = 0.81
le= 0.95
10=0.88
r ")
4
AP = 106.96¡.¡.m2
AL = 26.80 f.tm
EP=3.44 ¡.¡.m
E=0.78
le= 0.87
ID= 0.82
AP = 89.92 ¡.¡.m2
AL = 58.23 ¡.¡.m2
EP=2 J9 f.tm
E= 0.56
le == 0.71
lD=0.81
AP = 97.49 ¡.¡.m2
AL = of.tm2
EP=4.78 ¡.¡.m
E==0.74
le=O
lD "" 0.37
.-
8
2
AP =84.12 ¡.¡.m2
AL == 27.75¡.¡.m2
EP=2.64 ¡.¡.m
E= 0.75
IC = 0.61
lD= 0.72
AP = 81.04 ¡.¡.m2
AP == 108.13 ¡.¡.m)
AL = 28.57 ¡.¡.m2
EP= 3.13 ¡.¡.m
E= 0.65
EP= 3.15 ¡.¡.m
E= 0.42
le = 0.64
le= 0.64
lD=O.64
lD= 0.53
AP = 112.85 f.tm2
AL=0f.t m2
EP=3.62 f.tm
E= 0.45
Ie=o
AP = 78.13 ¡.¡.m2
AL=Of.tm2
EP=2.53 ¡.¡.m
E=0.32
IC=O
ID= 0.22
ID "" 0.16
AL"" 9.03 ¡.¡.m2
Fig 2. Conjunto de nueve secciones transversales, correspondientes a nueve fibras distintas con sus
correspondientes valores de: área de pared (AP), área de lumen (AL), Espesor de pared (EP),
elongación (E), indice de colapso (IC) e indice de deformación (ID).
105
0,800
0,700
0,600
o
0,500
E
.
0,400
.2
~
O,SOO
:¡
0,200
0,100
0,000
9sec.
Med.9
Max. Esp.
Seco Central
SeCo Extrem.
Fig 3. Valores medios de los parámetros de elongación (E) , índice de colapso (Ie) e índice de
deformación (ID); obtenidos usando nueve o una sección por fibra.
p= 0.440 (p<0.01)
.....#........• •••••. .
0,9
•
0.8
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0,7
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0,5
#.
0,4
0,3
0,2
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0,6
º
#.
•
•
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0,1
O
0,000
1,000
2,000
3,000
4,000
5,000
Espesor de pared (.... m)
Fig. 4. Gráficas del índice de deformación (ID) frente al espesor de pared
106
6,000
7,000
8,000