042 - Universidad Nacional del Nordeste

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Actividad antagónica in vitro de aislamientos de Trichoderma spp.,
sobre esclerocios de Sclerotinia sclerotiorum
Cundom, María A. - Mazza de Gaiad, Silvia M.
Mazzanti de Castañon, María A. - Gutierrez, Susana A.
Cátedra de Fitopatología - Facultad de Ciencias Agrarias - UNNE.
Sargento Cabral 2131 - (3400) Corrientes - Argentina.
Tel./Fax: +54 (03783) 427131 - E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, es un hongo habitante del suelo de extensa distribución en los climas
templado y subtropical, que causa marchitamiento y muerte de plantas o esclerotiniosis, enfermedad que
afecta a más de 360 especies cultivadas y espontáneas, pertenecientes a 64 familias botánicas diferentes (1;
16). Dicha enfermedad es importante en cultivos hortícolas bajo cobertura plástica del NE de Argentina,
donde se han registrado ataques severos en tomate, pimiento y berenjena (12).
El hongo produce esclerocios, cuerpos de resistencia que le permiten sobrevivir en el suelo bajo condiciones
climáticas adversas durante largos períodos, pudiendo permanecer viables por al menos 4-5 años (1). Cuando
las condiciones son favorables, los esclerocios germinan e infectan los tallos a nivel del suelo, o forman
apotecios cuyas ascosporas al ser dispersadas, pueden producir infecciones a la parte aérea de las plantas. Por
consiguiente, los esclerocios son de principal importancia en la supervivencia y epidemiología de S.
sclerotiorum.
A pesar de su resistencia, en investigaciones de agentes de biocontrol se ha demostrado que los esclerocios
del fitopatógeno son vulnerables al ataque de muchos microorganismos, algunos de los cuales incluso pueden
ocasionarle la muerte (1; 3; 5; 10; 11; 23). Debido a los inconvenientes para obtener cultivares resistentes, el
empleo de productos químicos y la aplicación de prácticas culturales son las principales medidas adoptadas
para reducir los daños causados por S. sclerotiorum. Sin embargo, el control del hongo por medio de tales
prácticas convencionales es difícil, debido a sus características epidemiológicas. Por otra parte, el empleo de
plaguicidas está cuestionado en todo el mundo, por los serios perjuicios que ocasionan a la salud humana y
animal, y por los cambios ecológicos provocados debido al abuso de los mismos. Por tales razones, el
control biológico está recibiendo considerable atención en todo el mundo y en pruebas de laboratorio, de
invernáculo y de campo ha sido comprobada la eficiencia de este método, principalmente para hongos
patógenos de suelo (2; 5; 7; 17; 18; 19; 20; 23).
Se conocen numerosos hongos que se comportan como antagonistas de S. sclerotiorum; especies saprofitas
del género Trichoderma, habitantes del suelo, figuran entre los biocontroladores más prometedores e
investigados. En el país se ensayaron varias especies de Trichoderma, obtenidas de diferentes cultivos y
procedencias, para determinar su capacidad antagónica frente a aislamientos del fitopatógeno (8; 13; 14; 15;
21; 22).
En un trabajo anterior (4), evaluamos el potencial antagónico de distintos aislamientos de Trichoderma spp.
en cultivos duales con S. sclerotiorum, a través de la medición del área de las colonias y a partir de esa
información, la velocidad de crecimiento. Considerando la importancia de los esclerocios como órgano de
resistencia y fuente de inóculo de la enfermedad, en este trabajo investigamos la actividad antagónica de siete
aislamientos de Trichoderma spp., seleccionados en ensayos anteriores, sobre la viabilidad de dichas
estructuras producidas por S. sclerotiorum, en condiciones de laboratorio.
MATERIALES Y METODOS
Los trabajos fueron realizados en los Laboratorios de Fitopatología de la Facultad de Ciencias Agrarias,
UNNE. Fueron probados un aislamiento de punta de hifa de S. sclerotiorum y siete aislamientos
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
monospóricos de Trichoderma spp. utilizados en un trabajo anterior en el que se detalla procedencia y modo
de obtención de los mismos (4).
Los esclerocios necesarios para la ejecución del ensayo, fueron obtenidos del cultivo del fitopatógeno en agar
papa glucosado (APG) 1,5 %, pH 6,5 en cajas de Petri, mantenidas en oscuridad, en estufa a 20-22° C,
durante 15 días. Los aislamientos de Trichoderma spp. desarrollaron en las mismas condiciones durante siete
días.
De cada aislamiento de Trichoderma se preparó una suspensión en agua destilada estéril de 10 6 conidios por
ml, en la que se sumergieron 30 esclerocios durante 30 minutos. Los esclerocios testigos fueron sumergidos
en agua destilada estéril. Una vez inoculados, los esclerocios fueron enterrados en arena estéril mantenida
húmeda, en cajas de Petri de 9 cm de diámetro (seis esclerocios por caja), las que se dejaron en condiciones
de laboratorio durante 30 días, lapso en que la temperatura varió entre 11,5 y 29° C. Después de
desenterrados, los esclerocios fueron desinfestados superficialmente en: alcohol 50 % un minuto; hipoclorito
de sodio 50 % cuatro minutos; alcohol 50 % un minuto; y lavados con agua destilada estéril.
Para comprobar la viabilidad, los esclerocios se sembraron en dos medios de cultivo diferentes: 1) Discos
estériles de zanahoria de 10 mm de diámetro y 2-3 mm de espesor, cortados con sacabocados, colocados en
cajas de Petri de 9 cm de diámetro, sobre papel de filtro humedecido con agua destilada estéril, ubicando un
esclerocio sobre cada disco; y 2) APG en cajas de Petri. Las cajas de ambos medios conteniendo seis
esclerocios cada una fueron colocadas en estufa regulada a 24-25° C, en oscuridad, durante 7 días, al cabo de
los cuales se realizaron los recuentos correspondientes.
La evaluación comparativa de la actividad antagónica de los aislamientos probados, se determinó a través de
la relación entre el número de colonias de S. sclerotiorum producidas por los esclerocios viables y el número
de esclerocios sembrados, y por la cantidad de esclerocios formados en dichas colonias. El ensayo se llevó a
cabo en un arreglo factorial, en bloques completos al azar con cuatro repeticiones. Previo al ANOVA y
prueba de Tukey se realizó la transformación arcocoseno de la raíz cuadrada de x.
DISCUSION DE RESULTADOS
Los aislamientos de Trichoderma spp. probados, demostraron actividad antagónica variable, según el número
de esclerocios inoculados que germinaron (Fig. 1), y la cantidad de esclerocios producidos en las colonias
desarrolladas de S. sclerotiorum (Fig. 2). Ninguno inhibió totalmente la germinación y formación de
esclerocios.
Los identificados como 1 y 7 denotaron la mayor actividad antagónica, comparados con el testigo, que incidió
sobre la viabilidad de los esclerocios, determinando el reducido número de colonias desarrolladas del
fitopatógeno (Fig. 1). Dicha actividad podría deberse a la liberación de sustancias enzimáticas o antibióticas,
producidas por especies de Trichoderma, según varios artículos (3; 5; 6; 9; 11; 17; 19; 23).
En cuanto a la influencia de Trichoderma spp. en la producción de esclerocios, también el mayor efecto
antagónico fue evidenciado por los aislamientos identificados como 1 y 7 (Fig. 2).
En coincidencia con varios autores (1; 5; 11; 18; 23), los resultados obtenidos demuestran la variabilidad en la
actividad antagónica de diferentes aislamientos de Trichoderma spp. No se detectaron diferencias
significativas entre los dos medios de cultivo utilizados, en los que los diferentes aislamientos tuvieron un
comportamiento similar.
Se considera conveniente continuar los estudios in vitro, con los aislamientos identificados como 1 y 7, que
son los que demostraron mayor actividad antagónica frente a S. sclerotiorum; también es aconsejable hacerlo
con los aislamientos identificados como 4, 5 y 6 que, si bien no se mostraron tan eficientes, tuvieron un
comportamiento intermedio.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
FIGURA 1: Número de esclerocios germinados de Sclerotinia sclerotiorum, inoculados con siete
aislamientos de Trichoderma spp.
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
2
4
5
6
7
8
10
1
2
4
5
6
7
8
TESTIGO
10
TESTIGO
Discos de zanahoria
APG
FIGURA 2: Cantidad de esclerocios de Sclerotinia sclerotiorum producidos en las colonias procedentes
de esclerocios inoculados con siete aislamientos de Trichoderma spp.
35
30
25
20
15
10
5
0
1
2
4
5
6
7
8
10
TESTIGO
1
2
4
5
6
7
8
10
TESTIGO
Discos de zanahoria
APG
BIBLIOGRAFIA
1.
2.
3.
ADAMS, P.B.; and W.A. AYERS. 1979. Ecology of Sclerotinia Species. Phytopathology 69
(8) :896-899.
BELL, D.K.; H.D. WELLS; and C.R. MARKHAM. 1982. In vitro Antagonism of Trichoderma
species Against Six Fungal Plant Pathogens. Phytopathology 72 (4) :379-382.
COOK, R.J.; and K.F. BAKER. 1983. The nature and practice of biological control of plant
pathogens. St. Paul. Minnesota, USA. The American Phytopathological Society. 539 p.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
CUNDOM, M.A.; S.M. de GAIAD; M.A. M. de CASTAÑON; S.A. G. de ARRIOLA; y M.
COUTINHO. 1999. Actividad antagónica in vitro de hongos saprofitos sobre Sclerotinia
sclerotiorum. En: Reunión de Comunicaciones Científicas y Tecnológicas, Secretaría General
de Ciencia y Técnica, UNNE. Actas Tomo V. p. 5-125-5-128.
DOS SANTOS, A.F.; and O.D. DHINGRA. 1982. Pathogenicity of Trichoderma spp. on the
sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum. Can. J. Bot. 60 :472-475.
ELAD, Y; I. CHET; P. BOYLE; and Y. HENIS. 1983. Parasitism of Trichoderma spp. on
Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii – Scanning electron microscopy and fluorescence
microscopy. Phytopathology 73 :85-88.
ELAD, Y.; I. CHET; and J. KATAN. 1980. Trichoderma harzianum: A Biocontrol Agent
Effective Against Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani. Phytopathology 7 (2):119-121.
ESCANDE, A.; F. LAICH; G. CUENCA; O. BAILEZ; y V. PEREYRA. 1994. Dispersión de
inóculo de Trichoderma spp. mediante abejas (Apis mellifera) para el control de la pudrición del
capítulo del girasol (Sclerotinia sclerotiorum). Fitopatología 29 (1):35. (Resumen).
HENIS, Y; P.B. ADAMS; J.A. LEWIS; and G.C. PAPAVIZAS. 1983. Penetration of Sclerotium
rolfsii by Trichoderma spp. Phytopathology. 73 (7) :1043-1046.
HOES, J.A.; and H.C. HUANG. 1975. Sclerotinia sclerotiorum: Viability and Separation of
Sclerotia from Soil. Phytopathology 65 :1431-1432.
JONES, D.; and D. WATSON. 1969. Parasitism and Lysis by Soil Fungi of Sclerotinia
sclerotiorum (Lib.) de Bary, a Phytopathogenic Fungus. Nature 224 :287-288.
MAZZANTI de CASTAÑON, M.A.; M.A. CUNDOM; y M.G. CABRERA de ALVAREZ.
1994. Enfermedades en cultivos protegidos de tomate, pimiento y berenjena, en el nordeste
argentino. Hort. Arg. 13 (34-35) :1-8.
MENENDEZ, A.B.; y A.M. GODEAS. 1995. Capacidad antagónica de algunos micoparásitos de
esclerocios de Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, presentes en la región de Pergamino,
Argentina. Rev. Fac. Agron. La Plata 71 (1):67-72.
MITIDIERI, I.Z.M. de. 1988. Control biológico de hongos del suelo con Trichoderma spp. in
vitro. IDIA 449-452 :45-49.
MONACO, C. 1990. Evaluación de la eficiencia de micoparásitos sobre esclerocios de
Sclerotinia sclerotiorum in vitro. Rev. Fac. Agron. La Plata 65 (1-2):67-73.
PURDY, L.H. 1979. Sclerotinia sclerotiorum: History, Diseases and Symptomatology, Host
Range, Geographic Distribution, and Impact. Phytopathology 69 (8):875-880.
REIS, A. ; S.M.A. de OLIVEIRA; M. MENEZES and R. de L.R. MARIANO. 1995. Potencial
de aislados de Trichoderma para biocontrole da murcha de Fusarium do feijoero. Summa
Fitopathologica 21 (1) :16-20.
SILVEIRA, N.S.S.; S.J. MICHEREFFI; M. MENEZES.; G.M. CAMPOS-TAKAKI. 1994.
Podetencial de isolados de Trichoderma spp. no controle de Sclerotium rolfsii em feijoeiro.
Summa Fitopathologica 20 (1) :22-25.
TRONSMO, A. 1996. Trichoderma harzianum in biological control of fungal diseases. En: Hall
R. ed. 1996. Principles and Practice of Managing Soilborne Plant Pathogens. St. Paul, Minnesota,
USA. The American Phytopathological Society. p. 213-236.
WELLS, H.D.; D.K.BELL; and C.A. JAWORSKI. 1972. Efficacy of Trichoderma harzianum as
a Biocontrol for Sclerotium rolfsii. Phytopathology 62 (4):442-447.
WRIGHT, E.R.; R. ZAPATA; O.S.F. de DELFINO; M.V. LOPEZ; y N. SENLLE. 1988.
Eficiencia in vitro de antagonistas de Sclerotinia sclerotiorum y Sclerotinia minor. Rev.
Facultad Agronomía. 9 (3) :109-116.
ZAPATA, R.; S. SPIVAK; O.S. FILIPINI; M.del C. FABRIZIO. 1997. Control de la
podredumbre de la endivia (Cichorium intybus L. var. foliosum) producida por Sclerotinia
sclerotiorum mediante la aplicación de Trichoderma harzianum. Rev. Facultad Agronomía 17
(2) :151-158.
ZAZZERINI, A; and L. TOSI. 1985. Antagonistic activity of fungi isolated from sclerotia of
Sclerotinia sclerotiorum. Plant Pathology 34 :415-421.