Actividad Antagónica in vitro de Hongos Saprofitos sobre Sclerotinia

Actividad Antagónica in vitro
de Hongos Saprofitos sobre Sclerotinia sclerotiorum
Cundom, María A. - Mazza de Gaiad, Sivia M. - Mazzanti de Castañon, María A.
Gutierrez de Arriola, Susana A. - Coutinho, Mariel
Cátedra de Fitopatología, Facultad de Ciencias Agrarias, UNNE
Sargento Cabral 2131 - (3400) Corrientes - Argentina
Tel./Fax: +54 (03783) 427131 - Email: [email protected]
INTRODUCCIÓN
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary es un hongo habitante del suelo, de extensa distribución en los climas
templado y subtropical. Por lo menos 383 especies, en 225 géneros de 64 familias de plantas, han sido listados
como hospedantes de este patógeno destructivo de muchos cultivos importantes, entre otros, numerosas
hortalizas y especies ornamentales, soja, girasol, maní, tabaco (1; 18). En los cultivos de tomate, pimiento y
berenjena bajo cobertura plástica del nordeste de Argentina, S. sclerotiorum, causa marchitamiento y muerte
de plantas o esclerotiniosis, una de las enfermedades principales por los daños que ocasiona, frecuencia y
amplia distribución; los ataques pueden iniciarse enseguida del trasplante (13).
El control del fitopatógeno por medio de prácticas convencionales es difícil, debido a los inconvenientes para
obtener cultivares resistentes; el tratamiento con productos químicos a veces es impracticable o
antieconómico; la eficacia de la rotación de cultivos es reducida, por su muy amplio rango de hospedantes
espontáneos y cultivados y por sobrevivir en el suelo por medio de esclerocios, bajo condiciones climáticas
adversas, durante largos períodos. Los esclerocios son de principal importancia en la supervivencia y
epidemiología de S. sclerotiorum; se ha demostrado que este hongo es capaz de formar esclerocios
secundarios en el suelo. Dichos cuerpos de resistencia, bajo condiciones favorables de sequía permanecen
viables por al menos 10 años (1).
En cultivos bajo cobertura plástica de la región, los plaguicidas son de uso muy frecuente. Si bien no se puede
negar su valor para el tratamiento de enfermedades importantes, dichos productos además de aumentar los
costos de producción, crean el grave problema de los residuos tóxicos, pueden generar resistencia de
parásitos-patógenos, e incluso ocasionar daños a los cultivos por sus efectos fitotóxicos, además de ser
perturbadores del equilibrio ecológico. Actualmente, el empleo de plaguicidas está cuestionado en todo el
mundo, por los serios perjuicio que ocasionan a la salud humana y animal, y por los cambios ecológicos
provocados, debido al abuso de los mismos.
El control biológico surge como una nueva alternativa, ante la necesidad de disminuir el uso de productos
químicos, conservando la sanidad de los cultivos. Según Adams y Ayers (1), el componente más significativo
del suelo que afecta la supervivencia de los esclerocios, parece ser biológico. Más de 30 especies de hongos y
bacterias han sido señalados como antagonistas de Sclerotinia spp. (1).
En investigaciones de agentes de biocontrol, se ha demostrado que los esclerocios de S. sclerotiorum, a pesar
de su resistencia, son vulnerables al ataque de muchos microorganismos, algunos de los cuales incluso pueden
ocasionarle la muerte. Entre los hongos que se comportan como antagonistas del fitopatógeno figuran
Coniothyrium minitans Campbell; Gliocladium catenulatum Gilman y Abbot; Gliocladium virens Miller y
Foster; Trichoderma spp. ; Trichothecium roseum (Pers. ex Fr.) Link (1; 3; 4; 5; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 14; 15;
16; 19; 20; 21; 22).
Los hongos que actúan como antagonistas tienen la capacidad potencial de ser usados en el control biológico.
Las pruebas in vitro para determinar la capacidad antagónica de un microorganismo con respecto a otro, no
representan necesariamente el grado de antagonismo y de control biológico en condiciones naturales, pero
reflejan la capacidad y variabilidad genética del antagonista, y la del fitopatógeno para resistir el antagonismo.
Dichas pruebas permiten realizar la selección preliminar de aislamientos facilitando el trabajo, ya que no es
probable que un antagonista eficiente en el campo no lo sea en el laboratorio.
En pruebas preliminares, hemos aplicado con buenos resultados metodología básica para la investigación del
antagonismo in vitro, aislando hongos saprófitos de la rizosfera mediante la técnica del cebo (7; 8; 14; 16;
22); por medio de cultivos apareados ( 2; 9; 10; 11; 14; 15; 16; 19; 22), evaluamos el potencial antagónico de
algunos aislamientos, comparando el crecimiento de los hongos saprófitos y del fitopatógeno, mediante la
medición del diámetro de las colonias. Creemos necesario repetir y ampliar esta prueba, aplicando otro
método de evaluación del antagonismo.
Considerando posible la presencia de micopatógenos regionales efectivos, de buen potencial antagónico, se
espera que la investigación en ejecución finalmente proporcione aislamientos seleccionados entre los de
mayor eficacia, para posteriores pruebas de invernáculo. La importancia del marchitamiento y la muerte de
plantas por S. sclerotiorum y las dificultades para su control, justifican el esfuerzo de tratar de incorporar el
antagonismo como método de lucha, estrategia adicional para el manejo de la enfermedad en el sistema de
cultivos hortícolas protegidos del nordeste de Argentina.
En esta etapa de la investigación, el objetivo del trabajo es averiguar in vitro la actividad antagónica de
aislamientos de hongos saprófitos regionales, en cultivos duales con S. sclerotiorum.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los materiales y la metodología utilizada para el aislamiento del fitopatógeno S. sclerotiorum y de los
hongos saprófitos del filoplano y de la rizosfera, fueron detallados en un trabajo anterior (6).
Fue planificado un ensayo con 14 aislamientos monospóricos de hongos saprófitos, para la evaluación
comparativa de la actividad antagónica en cultivos duales con un aislamiento de punta de hifa de S.
sclerotiorum, de patogenicidad probada. Se aplicó un diseño en bloques completos al azar con cuatro
repeticiones y unidad experimental una caja de Petri..
Los tratamientos fueron:
1.
T 1 Trichoderma sp.
16.
T
1 + Ss 15
2.
T 2 Trichoderma sp.
17.
T
2 + Ss 15
3.
T 3 Trichoderma sp.
18.
T
3 + Ss 15
4.
T 4 Trichoderma sp.
19.
T
4 + Ss 15
5.
T 5 Trichoderma sp.
20.
T
5 + Ss 15
6.
T 6 Trichoderma sp.
21.
T
6 + Ss 15
7.
T 7 Trichoderma sp.
22.
T
7 + Ss 15
8.
T 8 Trichoderma sp.
23.
T
8 + Ss 15
9.
T 9 Trichoderma sp.
24.
T
9 + Ss 15
10.
C 10 Cladosporium sp.
25.
C 10 + Ss 15
11.
C 11 Cladosporium sp.
26.
C 11 + Ss 15
12.
Tt 12 Trichothecium sp.
27.
Tt 12 + Ss 15
13.
Tt 13 Trichothecium sp.
28.
Tt 13 + Ss 15
14.
A 14 Aspergillus sp.
29.
A 14 + Ss 15
15.
Ss 15 Sclerotinia sclerotiorum
Los discos de los aislamientos utilizados para la ejecución del ensayo, fueron obtenidos de cultivos
sembrados en cajas de Petri con agar papa glucosado (APG) 1,5 % pH 6,5 mantenidos en oscuridad en estufa
a 23-24° C , durante dos días los Trichoderma spp.; durante cuatro días S. sclerotiorum y los Trichothecium
sp.; y durante seis días los Cladosporium sp. y Aspergillus sp. En la periferia de las colonias fueron cortados
discos con sacabocados de 0,5 cm de diámetro.
En los tratamientos 1 al 15, cada disco fue cultivado en APG, en caja de Petri de 9 cm de diámetro situándolo
en una extremidad del diámetro; en el extremo opuesto, se colocó un disco de APG estéril, del mismo tamaño.
En los tratamientos 16 al 29, el disco de APG estéril fue reemplazado por uno de S. sclerotiorum.
En ensayo fue mantenido en estufa, en las condiciones ya señaladas. Se midió el área de las colonias mediante
el software Map Maker, a los dos, tres y cuatro días, y se efectuó análisis de la varianza y prueba de Tukey de
los valores obtenidos. A partir de esta información se determinó la velocidad de crecimiento por diferencia de
áreas en los sucesivos días.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Según las mediciones realizadas, a las 48 y 72 h, no hubo diferencia significativa entre la superficie de las
colonias de S. sclerotiorum en el cultivo puro y en los apareamientos con los 14 aislamientos de hongos
saprófitos. En la tercer medición, S. sclerotiorum en los cultivos duales con los nueve tratamientos de
Trichoderma spp. (tratamientos 16 a 24), tuvo menor superficie de colonia que en cultivo puro (Fig. 1). Las
diferencias detectadas podrían atribuirse al efecto antagónico de los aislamientos participantes.
La superficie de las colonias de los 14 aislamientos de hongos saprófitos en cultivo puro, en las tres
mediciones, presentan diferencias que se explican por las características del crecimiento in vitro de sus
respectivos géneros. Las especies de Trichoderma son de crecimiento rápido, generalmente en pocas horas
cubren la superficie de la caja de Petri. También Trichothecium es un género de crecimiento regular, que
cubre toda la caja, aunque la velocidad puede ser menor. Los géneros Aspergillus y Cladosporium, en
cambio, generalmente producen colonias de crecimiento lento y limitado. Dicha característica no es óbice
para que en tales géneros puedan encontrarse aislamientos de buen potencial antagónico, por cuanto esto en
gran parte depende del mecanismo de acción de los antagonistas. Similar situación se detecta al analizar la
velocidad de crecimiento, determinada por las diferencias de área de colonia entre las 96 y 48 h, según se
presenta en las Figs. 2 y 3, donde es posible observar la velocidad promedio y su variación expresada a través
del desvío estándar.
El género Trichoderma comprende especies saprófitas habitantes del suelo, varias de las cuales se citan entre
los antagonistas más prometedores e investigados, principalmente para el control biológico de fitopatógenos
del suelo, entre éstos, de S. sclerotiorum. Por consiguiente, se considera conveniente continuar los estudios
con los aislamientos T 1 a T 9, y desechar los restantes, que en la prueba no denotaron diferencia significativa
con S. sclerotiorum, en la superficie de las colonias.
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
48 Hs
96 Hs
Area de las colonias a las 48, 72 y 96 horas de la siembra. Tratamientos 1 al 14: antagonistas en cultivos puros; 15:
Sclerotinia sclerotiorum en cultivo puro y del 16 al 29: S.sclerotiorum. en cultivos duales.
Velocidad
Velocidad
Figura 1:
72 Hs
Tratamiento
Tratamiento
Figura 2: Velocidad de crecimiento de los antagonistas en
cultivo puro.
Figura 3: Velocidad de crecimiento de S. sclerotiorum en
cultivo puro (tratamiento 15) y en cultivos duales.
CONCLUSIÓN
En las condiciones del ensayo, nueve aislamientos de Trichoderma spp. denotaron actividad antagónica en
cultivos apareados con S. sclerotiorum.
BIBLIOGRAFÍA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
ADAMS, P.B.; and W.A. AYERS.1979. Ecology of Sclerotinia Species. Phytopathology 69 (8) :896-899.
BELL, D.K.; H.D. WELLS; and C.R. MARKHAM. 1982. In vitro Antagonism of Trichoderma species Against Six
Fungal Plant Pathogens. Phytopathology 72 (4) :379-382.
CAMPBELL, W.A. 1947. A new species of Coniothyrium parasitic on sclerotia. Mycología 39 :190-195.
CASSIOLATO, A.M.R..; R. BAKER; & I.S. MELO. 1996. Parasitismo de Sclerotinia sclerotiorum e S. minor por
mutantes de Trichoderma harzianum em segmentos de aipo. Fitopatol. Bras. 21 (1):120-122
COOK, R.J.; and K.F. BAKER. 1983. The nature. and practice of biological control of plant pathogens. St. Paul.
Minnesota, USA. The American Phytopathological Society. 539 p.
CUNDOM, M.A.; y M.A. MAZZANTI de CASTAÑON. 1997. Obtención de antagonistas de Sclerotinia
sclerotiorum, en cultivos de solanáceas bajo cobertura plástica. En: Reunión de Comunicaciones Científicas y
Tecnológicas, Secretaría General de Ciencia y Técnica, UNNE. Actas Tomo III. p. 128-130.
DOS SANTOS, A.F.; and O.D. DHINGRA. 1982. Pathogenicity of Trichoderma spp. on the sclerotia of Sclerotinia
sclerotiorum. Can J. Bot. 60 :472-475.
HOES, J.A.; and H.C. HUANG. 1975. Sclerotinia sclerotiorum: Viability and Separation of Sclerotia from Soil.
Phytopathology 65 :1431-1432.
HUANG, H.C. 1978. Gliocladium catenulatum: hyperparasite of Sclerotinia sclerotiorum and Fusarium species.
Can. J. Bot. 56 :2243-2246.
HUANG; H.C.; and J.A. HOES. 1976. Penetration and infection of Sclerotinia sclerotiorum by Coniothyrium
minitans. Can. J. Bot. 54 :406-410.
HUANG, H.C.; and E.G. KOKKO. 1993. Trichothecium roseum, a micoparasite of Sclerotinia sclerotiorum. Can.
J. Bot. 71 :1631-1638.
JONES, D.; and D. WATSON. 1969. Parasitism and Lysis by Soil Fungi of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary,
a Phytopathogenic Fungus. Nature 224 :287-288.
MAZZANTI de CASTAÑON, M.A.; M.A. CUNDOM; y M.G. CABRERA de ALVAREZ. 1994. Enfermedades en
cultivos protegidos de tomate, pimiento y berenjena, en el nordeste argentino. Hort. Arg. 13 (34-35) :1-8.
MENENDEZ, A.B.; y A.M. GODEAS. 1995. Capacidad antagónica de algunos micoparásitos de esclerocios de
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, presentes en la región de Pergamino, Argentina. Rev. Fac. Agron. La Plata
71 (1):67-72.
MITIDIERI, I.Z.M. de. 1988. Control biológico de hongos del suelo con Trichoderma spp. in vitro. IDIA 449-452
:45-49.
MONACO, C. 1990. Evaluación de la eficiencia de micoparásitos sobre esclerocios de Sclerotinia sclerotiorum in
vitro. Rev. Fac. Agron. La Plata 65 (1-2):67-73.
PEREZ, E.; P. MONDINO; y J. BURGUEÑO. 1997. Efecto antagónico in vitro de Penicillium rugulosum sobre
Sclerotinia sclerotiorum. En: IX Congreso Latinoamericano de Fitopatología, Montevideo, Uruguay. Resúmenes. p.
197.
PURDY, L.H. 1979. Sclerotinia sclerotiorum: History, Diseases and Symptomatology, Host Range, Geographic
Distribution, and Impact. Phytopathology 69 (8):875-880.
TRUTMANN, P.; P.J. KEANE; and P.R. MERRIMAN. 1982. Biological control of Sclerotinia sclerotiorum on
aerial parts of plants by the hyperparasite Coniothyrium minitans. Trans. Br. Mycol. Soc. 78 (3):521-529.
TU, J.C. 1980. Gliocladium virens, a Destructive Mycoparasite of Sclerotinia sclerotiorum. Phytopathology 70
(7):670-674.
WRIGHT, E.R.; R. ZAPATA; O.S.F. de DELFINO; M.V. LOPEZ; y N. SENLLE. 1988. Eficiencia in vitro de
antagonistas de Sclerotinia sclerotiorum y Sclerotinia minor. Rev. Facultad Agronomía. 9 (3) :109-116.
ZAZZERINI, A; and L. TOSI. 1985. Antagonistic activity of fungi isolated from sclerotia of Sclerotinia
sclerotiorum. Plant Pathology 34 :415-421.