CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
EFECTO COMBINADO DE LAS ALTAS PRESIONES HIDROSTÁTICAS Y
DEL POLVO DE ACEITUNA EN LA INACTIVACION DE Bacillus cereus EN
UNA BEBIDA DE VEGETALES
LINA MARIA VELASCO CUCAITA
Director:
ANTONIO MARTINEZ LOPEZ
Ph.D.
INSTITUTO DE AGROQUIMICA Y TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS (IATA) VALENCIA. ESPAÑA
Codirectora:
CARMEN FERRER BERNAT
Asesora:
ANA KARINA CARRASCO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTÁ, D.C.
ENERO 2009
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
EFECTO COMBINADO DE LAS ALTAS PRESIONES HIDROSTÁTICAS Y
DEL POLVO DE ACEITUNA EN LA INACTIVACION DE Bacillus cereus EN
UNA BEBIDA DE VEGETALES
LINA MARIA VELASCO CUCAITA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICRIOBIÓLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTÁ, D.C.
ENERO 2009
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución No13 de julio de 1946.
"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la
moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia".
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
EFECTO COMBINADO DE LAS ALTAS PRESIONES HIDROSTÁTICAS Y
DEL POLVO DE ACEITUNA EN LA INACTIVACION DE Bacillus cereus EN
UNA BEBIDA DE VEGETALES
APROBADO
______________________
Antonio Martínez López
PhD.
Director
____________________
Carmen Ferrer Bernat
Lic. Tecnología Alimentos U.P.V
____________________
Ana Karina Carrasco
MsC.
______________________
Jurado
____________________
Jurado
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
EFECTO COMBINADO DE LAS ALTAS PRESIONES HIDROSTÁTICAS Y
DEL POLVO DE ACEITUNA EN LA INACTIVACION DE Bacillus cereus EN
UNA BEBIDA DE VEGETALES
LINA MARIA VELASCO CUCAITA
APROBADO
______________________
Ingrid Schuler
PhD.
Decana académica
Facultad de Ciencias
____________________
Janeth del Carmen Arias
M.Sc- M.Ed
Directora carrera de
Microbiología Industrial
DEDICATORIA
A mi familia, a mi madre quién con sus oraciones en la distancia siempre supo como
animarme a seguir adelante.
A mis hermanos, que han sido mi mayor apoyo y un ejemplo a seguir.
A Julio R. Sánchez, quién hizo que en tierras lejanas me sintiera como en casa.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Antonio Martínez López, vicedirector del Instituto de agroquímica y Tecnología
de alimentos IATA, por brindarme la oportunidad de hacer parte de su equipo de
trabajo.
A la Licenciada Carmen Ferrer Bernat, investigadora del Instituto de agroquímica y
Tecnología de alimentos IATA por su colaboración para sacar adelante este trabajo de
grado.
A la Dra. Aurora Marco, funcionaria del Instituto de agroquímica y Tecnología de
alimentos IATA, por su infinita paciencia, su dedicación y su espíritu de colaboración.
A Daniela Saucedo Reyes, becaria del Instituto de agroquímica y Tecnología de
alimentos IATA, por su valiosa colaboración y su apoyo, más que una compañera de
trabajo una amiga incondicional.
A la profesora Ana Karina Carrasco, profesora de la Pontificia Universidad Javeriana,
Bogotá, por asesorarme y colaborarme con la realización de esta investigación
Gracias a todos…………
TABLA DE CONTENIDOS
Página
INTRODUCCIÓN
1
1. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
4
2. OBJETIVOS
6
2.1. Objetivo general
6
2. 2. Objetivos específicos
6
3. MARCO TEÓRICO
7
3.1. BEBIDA VEGETAL
7
3. 1.1. Inactivación enzimática
8
3. 1. 2. Compuestos bioactivos
9
3. 1. 3. Biodisponibilidad de nutrientes
9
3. 2. CONTROL MICROBIOLOGICO
10
3. 3. TRATAMIENTOS TÉRMICOS DE CONSERVACIÓN
10
3. .3. 1. Esterilización
11
3. 3. 2. Pasteurización
11
3. 3. 3. Escaldado
11
3. 4. CARACTERÍSTICAS DEL ALIMENTO A TENER EN
CUENTA PARA ELEGIR EL TRATAMIENTO TÉRMICO
12
3. 4. 1. pH
12
3. 4. 2. Viscosidad
12
3. 4. 3. Caracterización microbiológica del producto
13
3. 5. PROCESADO MÍNIMO DE ALIMENTOS VEGETALES:
13
NUEVAS TECNOLOGIAS DE CONSERVACION NO TERMICAS
3. 5. 1. Aditivos naturales
14
3. 5. 2. Altas Presiones Hidrostáticas (APH)
14
3. 5. 3. Pulsos eléctricos de alta intensidad
14
3. 5. 4. Campos magnéticos oscilatorios
15
3. 5. 5. Ultrasonidos de alta intensidad
15
3. 5. 6. Irradiación
15
3. 6. DESCRIPCIÓN DEL MICROORGANISMO DE ÍNTERES
(Bacillus cereus)
16
3. 6. 1. Género Bacillus
16
3. 6. 2. Bacillus cereus
16
3. 6. 3. Características generales
16
3. 6. 4. Hábitat y condiciones de crecimiento
17
3. 6. 5. Aislamiento e identificación
18
3. 6. 6. Infección alimentaria por Bacillus cereus
18
3.7. LA ESPORA BACTERIANA
19
3. 7. 1. Estructura de la espora
21
3. 7. 1. 1. Exosporium
22
3. 7. 1. 2. Cubiertas esporales
22
3. 7. 1. 3. Córtex
22
3. 7. 1. 4. Membrana interna o intina
23
3. 7. 1. 5. Protoplasto
23
3. 8. PROCESO DE ESPORULACIÓN
24
3. 9. PROCESO DE ACTIVACIÓN DE LA ESPORA
27
3. 9. 1. PROCESO DE GERMINACION DE LA ESPORA
28
3. 10. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS
29
3. 10. 1. Absorción de los biocidas y su respuesta en las células
30
3. 10. 2. Objetivo de acción de un biocida
30
3. 10. 3. Clasificación de los antimicrobianos
31
3. 10. 4. Antimicrobianos de origen químico
31
3. 10. 5. Antimicrobianos de origen natural
32
3. 10. 6. Polifenoles y su efecto antimicrobiano
33
3. 10. 6. 1. Propiedades del polvo de aceitunas como antimicrobiano
35
3. 11. FUNDAMENTOS Y DEFINICIONES DE LAS ALTAS
PRESIONES HIDROSTTICAS
36
3. 11. 1. Aspectos técnicos de las Altas Presiones Hidrostáticas
39
3. 11. 1. 1. Generación de la Alta presión
39
3. 11. 1. 2. Operación de una cámara de Alta Presión Hidrostática
42
3. 11. 2. Descripción general de un sistema de Alta Presión industrial
43
3. 12. EFECTOS BIOLÓGICOS DE LA ALTA PRESIÓN
44
3. 12. 1. Efectos sobre los microorganismos
45
3. 12. 2. La alta presión hidrostática y las reacciones bioquímicas
47
3. 3. 13. Efecto de las Altas Presiones sobre los alimentos
51
3. 12. 2. 1. Agua
51
3. 12. 2. 2. Lípidos
51
3. 12. 2. 3. Carbohidratos
52
3. 12. 2. 4. Proteínas
52
3. 12. 2. 5. Enzimas
52
3. 12. 2. 6. Vitaminas
53
3. 12. 4. Aplicación de las Altas Presiones en jugos de frutas y/o
vegetales
54
3. 13. MODELOS CINÉTICOS DE INACTIVACIÓN Y
CRECIMIENTO MICROBIANO.
54
3. 13. 1. Modelos matemáticos de inactivación
55
3. 13. 1. 1. Modelo de Bigelow
55
3.13. 1. 2. Modelos de Weibull
56
3. 13. 2. Modelos matemáticos de crecimiento
58
3. 13. 2. 1. Modelo de Baranyi
58
3. 13. 2. 2. Modelo de Gompertz
59
4. MATERIALES Y MÉTODOS
61
4.1. Esporulación del microorganismo
61
4. 2. Recuento de Bacillus cereus
62
4. 3. Ingrediente utilizado como antimicrobiano
62
4. 4. Preparación del medio de referencia
63
4. 5. Efecto del polvo de aceitunas sobre el crecimiento de Bacillus
cereus en función del tiempo en medio de referencia
63
4.6. Preparación de la bebida vegetal
63
4. 7. Efecto del polvo de aceituna en el crecimiento de Bacillus
64
cereus en sustrato vegetal
4. 8. Prelación de los viales para el tratamiento con APH
64
4. 9. Tratamiento a Altas Presiones Hidrostáticas APH
65
4. 10. Efecto de las Altas Presiones y el polvo de aceitunas en la
inactivación de Bacillus cereus en medio de referencia
66
4. 11. Efecto de las Altas Presiones y el polvo de aceitunas en la
inactivación de Bacillus cereus en la bebida vegetal
67
4. 12. Modelización
67
4. 12. 1. Desarrollo del modelo
67
4. 13. Análisis estadístico
68
5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
69
5. 1. Efecto del polvo de aceituna en medio de referencia y bebida
vegetal
69
5. 2. Efecto de las Altas Presiones Hidrostáticas en medio de
referencia y bebida vegetal
77
5. 3. Efecto del tiempo de tratamiento con APH en la bebida de
vegetales
82
6. CONCLUSIONES
85
7. RECOMENDACIONES
86
8. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
87
9. ANEXOS
100
9.1. ANOVA SIMPLE ENTRE PRESIONES Y
CONCENTRACIONES PARA MEDIO DE REFERENCIA
100
9. 2. ANOVA MULTIPLE ENTRE MEDIO DE REFERENCIA Y
BEBIDAVEGETAL (10 MINUTOS)
103
9. 3. ANOVA MULTIPLE ENTRE 10 Y 25 MINUTOS DE
105
TRATAMIENTO EN BEBIDA VEGETAL
LISTA DE TABLAS
Página
Tabla 3.1. Resumen de Condiciones de crecimiento para Bacillus
cereus
18
Tabla 6.1. Valores medios y desviación estándar de la población de 70
B. cereus (Log N (UFC/ml)) en medio de referencia a diferentes
temperaturas y concentraciones de polvo de aceitunas tras 24 horas
de almacenamiento
Tabla 6. 2. Valores medios y de desviación estándar para la tasa 72
máxima de crecimiento (µmax) y la fase de latencia (λ) a diferentes
condiciones de estudio en medio de referencia
Tabla 6. 3. Valores medios y desviación estándar de logaritmo de la 76
fracción de recuentos de B. cereus después de 24 horas de
almacenamiento a diferentes condiciones de estudio en sustrato
vegetal
Tabla 6. 4. Valores medios y desviación estándar de la población de 79
B. cereus (N/N0), en medio de referencia y bebida vegetal,
sometidos a tratamiento por APH a 200, 400 y 500 MPa (10 min) y
con diferentes concentraciones de polvo de aceitunas
Tabla 6. 5. Valores medios y desviación estándar de Log N/No de
B. cereus, después de 24 horas de almacenamiento en sustrato
vegetal con APH con dos tiempos de tratamiento a APH
84
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 3. 1. Estructuras químicas de compuestos fenólicos
identificados en un extracto acuoso procedente de residuos de la
industria de las aceitunas.
Figura 3. 2. Compresión directa.
Figura 3. 3. Compresión indirecta.
Figura 3. 4. Sistema de Altas Presiones Hidrostáticas a nivel
industrial
Figura 3. 5. Productos hechos en base a frutas y verduras en el
mercado tratados con APH.
Figura 3. 6. Zumos en el mercado tratados con APH.
Figura 3. 7. Ejemplo de curva de supervivencia de esporas de B.
stearothermophilus a temperatura constante (115 ºC)
Figura 4.1 Dilución y siembra de las muestras tratadas
Figura 4. 2. Unidad de Altas Presiones Hidrostáticas. Fuente:
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA).
35
40
41
44
49
50
56
62
66
Figura 6. 1. Ejemplo de curvas de crecimiento al 2.5 % de polvo de 70
aceituna a las diferentes temperaturas estudiadas
Figura 6. 2. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus log N 73
(UFC/ml) en la bebida vegetal sin polvo de aceitunas y con una
concentración del 2,5% almacenado a una temperatura de 20 ºC.
Figura 6. 3. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus Log N 74
(UFC/ml) en la bebida vegetal sin polvo de aceituna y con una
concentración del 1,5% almacenado a una temperatura de 32 ºC.
Figura 6. 4. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus Log N 74
(UFC/ml) en la bebida vegetal sin polvo de aceituna y con una
concentración del 1,5% almacenado a una temperatura de 20 ºC.
Figura 6. 5. Curva de crecimiento de fracción de B.cereus Log N 75
(UFC/ml), comparando con el control en presencia de 2.5% de polvo
de aceituna a 32 ºC de almacenamiento.
Figura 6. 6. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus
entre medio de referencia bebida de vegetales a diferentes presiones
sin polvo de aceitunas
Figura 6. 7. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus
entre medio de referencia y bebida vegetal a diferentes presiones en
presencia de polvo de aceitunas a 200 MPa
Figura 6. 8. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus
entre medio de referencia y bebida vegetal a diferentes presiones en
presencia de polvo de aceitunas a 500 MPa
77
77
78
Figura 6. 9. Efecto de la presión y la concentración de polvo de 80
aceitunas sobre la población de B. cereus en medio de referencia y
bebida vegetal, sometidos a 10 min de tratamiento con APH.
Figura 6. 10. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus 82
entre dos tiempos de tratamiento con APH diferentes.
Figura 6.11 Efecto del tiempo de tratamiento con APH sobre la
población de B. cereus (N/N0) en bebida vegetal a las diferentes
presiones y concentraciones de polvo de aceitunas estudiadas
83
Resumen
La reciente demanda de los consumidores por productos listos para comer que sean
similares en apariencia y valor nutricional a los alimentos “frescos”, han conducido a
una creciente investigación en el uso de tecnología no térmicas de conservación, como
es el caso de las Altas Presiones Hidrostáticas (APH) y el empleo de conservantes de
origen natural, como los extractos de plantas, con el objetivo de sustituir el tratamiento
térmico y el uso de conservantes químicos que poseen desventajas en términos de
calidad de los alimentos. El presente estudio evalúa el efecto antimicrobiano del polvo
de aceituna en diferentes concentraciones (0, 1,5, 2,5 y 5%) para el control de esporas
de Bacillus cereus en medio de referencia (caldo de infusión cerebro corazón) y en una
bebida de vegetales elaborada a partir de zanahorias y judías verdes.
Además, se evalúo también el efecto de la APH (Alta Presión Hidroestática) que fue
estudiado en 200, 400 y 500 MPa, en los diferentes sustratos y para las diferentes
concentraciones de polvo de aceituna. Los resultados obtenidos sugieren que el polvo de
oliva tiene un efecto bacteriostático en la concentración del 2.5 %; por lo tanto esto
podría ser usado como una medida de control adicional en
combinación con
tratamientos físicos y el almacenamiento a bajas temperaturas, prolongando la vida útil
de la bebida vegetal susceptible a contaminarse por la presencia de esporas de Bacillus
cereus, lo cual es un riesgo para la salud humana No obstante los tratamientos con
APH, en presencia o ausencia de polvo de aceituna, no presentaron un efecto importante
desde el punto de vista microbiológico, ya que el número de reducciones logarítmicas
alcanzadas no fue significativo como para garantizar la seguridad microbiológica de
bebida.
Abstract
The recent consumer demands on ready to eat, that they are similar by all appearances
and nutritional value to the “like fresh”, products leads to the increasing research in the
use of technology not thermal of conservation application of new not thermal
technologies of conservation, as is the case of High Hydrostatic Pressures (HHP), and
the use of natural preservative compounds, especially plant extracts. With the aim to
replace the thermal treatment and the use of chemistry additives that possess
disadvantages in field quality food.
The present study evaluates the antimicrobial effect of olive powder in different
concentrations (0, 1,5, 2,5 and 5%) to control Bacillus cereus spores on reference media
(Brain Heart Infusion Broth) and a vegetable beverage based on carrots and green
beans. Moreover, the effect of HHP (high hydrostatic pressure) was studied at 200, 400
and 500 MPa, in the different substrates and for the different concentrations of olive
powder. The obtained results suggest that olive powder has a bacteriostatic effect at
2.5% concentration; therefore it could be used as an additional control measure in
combination with other physical treatments and low temperature storage prolonging the
life of the vegetable beverage wich is susceptible to contamination by the presence of
Bacillus cereus spores becoming a risk to human health.
However, HHP treatments, in the presence or absence of olive powder, did not present
an important effect from the microbiological point of view, as the number of logarithm
reductions achieved was not significant to ensure the beverage safety.
INTRODUCCIÓN
La alimentación es un proceso necesario para todos los organismos, que tiene que
producirse cumpliendo determinados requisitos en dependencia de requerimientos
nutricionales específicos, así la demanda por parte de los consumidores de alimentos sanos
que aporten nutrientes y energía necesarios para la vida diaria es un tema de interés
científico.
Los cambios demográficos y sociales producidos en los últimos diez años, han ejercido un
efecto muy marcado sobre el consumo de alimentos tanto en España como en el conjunto
de países Europeos. Cada día aumenta el número de consumidores interesados en conocer
con exactitud la composición de los alimentos que ingieren y el efecto de la dieta en su
salud, bienestar y en la prevención de determinadas enfermedades degenerativas.
Resulta necesario pensar en sistemas de conservación de alimentos que eviten la
contaminación con microorganismos deteriorantes y patógenos, no obstante muchos
métodos de conservación afectan considerablemente a los alimentos, los tratamientos como
el calor o la adición de conservantes químicos afectan no solamente el valor nutricional
sino las cualidades sensoriales de los alimentos.
La gran mayoría de los alimentos que consumimos a diario son perecederos y se deterioran
con el paso del tiempo cuando no existe un método adecuado de conservación. Diferentes
cambios físicos, químicos y reacciones enzimáticas tienen lugar en los alimentos dando
como resultado la proliferación de microorganismos indeseables que pueden alterar los
alimentos e incluso causar enfermedad en el ser humano. Muchas de las tecnologías de
conservación de microorganismos pueden inhibir el crecimiento microbiano (temperaturas
bajas, reducción de la actividad de agua, acidificación, y adición de conservantes). Sin
embargo, estas tecnologías no son suficientes ya que no eliminan las formas de resistencia
como el caso de las esporas bacterianas.
1
Los frutos y hortalizas han de ser procesados y conservados por conveniencia y razones
económicas, lo que implica numerosos cambios desde el momento de la cosecha, durante
las operaciones de acondicionamiento, procesamiento, almacenamiento, hasta que es
adquirido y consumido fresco o cocinado por el consumidor. Todos estos cambios suponen
un impacto potencial en los compuestos fitoquímicos y en las propiedades antioxidantes de
estos productos vegetales así como en las propiedades beneficiosas para la salud que
poseen en fresco (Cano et al., 2005).
En términos de inactivación microbiana el tratamiento térmico es el más utilizado. La
eliminación de microorganismos usando altas temperaturas da como resultado alimentos
más estables y seguros. Sin embargo el proceso implica altos costos en términos de uso de
energía y alteración de las propiedades del alimento como sabor, color y el valor
nutricional. Por estas limitaciones y debido a la demanda creciente por parte de los
consumidores de alimentos de alta calidad, seguros y agradables al gusto, se han
desarrollado nuevas tecnologías para inactivar microorganismos como es el caso de las
Altas Presiones Hidrostáticas (APH). Por otra parte en los últimos años se han adelantado
muchas investigaciones sobre antimicrobianos de origen natural a modo de alternativa a los
antimicrobianos químicos tradicionales.
Muchos estudios demuestran que el uso combinado de tecnologías no térmicas como las
Altas Presiones Hidrostáticas (APH) y de antimicrobianos de origen natural como aceites
esenciales de plantas o extractos en polvo, suponen un efecto sinérgico que permite
mantener poblaciones microbianas controladas en alimentos
manteniendo niveles
permisibles para el consumo humano, cumpliendo con la legislación vigente en cuanto al
tema de la seguridad alimentaria y en respuesta de la alta demanda de alimentos seguros.
Las investigaciones sobre antimicrobianos de origen natural han aumentado en los últimos
años, no obstante muchos aceites esenciales y extractos de plantas con propiedades
antimicrobianas no están autorizados para su uso como aditivos en alimentos. Un ejemplo
de antimicrobiano de origen natural autorizado por las autoridades sanitarias en España es
el olive powder ó polvo de aceitunas. Este ingrediente alimentario se utiliza en panadería.
En las aceitunas de este ingrediente hay polifenoles, los cuales han mostrado una
interesante actividad antimicrobiana.
2
En el presente trabajo, se estudiará el efecto de las Altas Presiones Hidrostáticas y el polvo
de aceitunas a diferentes concentraciones frente a esporas de Bacillus cereus en un medio
de referencia caldo BHI y posteriormente en una bebida de vegetales elaborada a base de
zanahorias y judías verdes.
3
1.
JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las nuevas demandas de los consumidores por productos saludables y con un valor
funcional agregado unido al desarrollo de nuevas tecnologías, está impulsando el desarrollo
del sector de aditivos de origen natural. El resultado es una amplia gama de productos que
se adaptan a las necesidades de todo tipo de consumidores. Por otro lado la creciente alarma
social por el uso de conservantes artificiales en la elaboración de alimentos impulsa a
sustituir aditivos artificiales por ingredientes naturales.
Numerosos estudios epidemiológicos asocian una dieta rica en productos de origen vegetal
con una menor predisposición a padecer ciertas enfermedades degenerativas como cáncer y
enfermedades cardiovasculares,
Para el desarrollo de este proyecto de investigación se elaborará una bebida con dos
ingredientes: zanahorias y judías verdes. Se evaluará en ella la capacidad antimicrobiana de
un ingrediente alimentario (polvo de aceitunas) actualmente comercializado como
ingrediente en productos de panadería. En estudios previos (Serra y col. 2008 y Pereira y
col. 2007) sobre aceitunas demuestran que estás poseen un amplio espectro de actividad
antimicrobiana. En el caso de alimentos mínimamente procesados entre ellos bebidas de
vegetales, Bacillus cereus es un microorganismo alterador y patógeno difícil de controlar
por su capacidad de producir esporas resistentes que pueden germinar durante el
almacenamiento de la bebida ó bien si se interrumpe la cadena de frío.
Para inactivar esporas de Bacillus cereus se estudiará experimentalmente el efecto
combinado de las Altas Presiones Hidrostáticas y diferentes concentraciones de Polvo de
aceitunas.
Tradicionalmente el tratamiento térmico es el más utilizado para evitar la contaminación y
deterioro de muchos alimentos, no obstante dicho tratamiento altera el sabor, la textura, el
color y el valor nutricional de los alimentos. Existen también tratamientos térmicos suaves
4
de conservación como la pasteurización con el inconveniente de que los alimentos tratados
deben ser inmediatamente almacenados en refrigeración y pueden aparecer después
bacterias patógenas esporuladas sin que la refrigeración evite su desarrollo.
Bajo estas premisas la industria tiene que adaptarse para desarrollar alimentos sometidos a
métodos de conservación menos drásticos para satisfacer las necesidades actuales del
consumidor. Es así como las Altas Presiones Hidrostáticas son una alternativa al uso de
tratamientos térmicos.
La presente investigación tiene un impacto socio- económico en la medida que la materia
prima empleada en la elaboración de la bebida es muy asequible en países como Colombia.
Conocer acerca de tecnologías como las Altas Presiones Hidrostáticas, hace posible pensar
en implementarlas en un futuro, para aumentar la calidad de los productos alimenticios
producidos en Colombia y proyectar la incursión en el mercado mundial de alimentos
mínimamente procesados. El interés científico de esta investigación gira en torno a obtener
resultados que revelen la utilidad de combinar tecnologías nuevas con aditivos alimentarios
que puede tener actividad antimicrobiana para prolongar la vida útil de la bebida, además
de obtener un producto de origen natural con un valor agregado de poseer compuestos
bioactivos (antioxidantes, vitaminas, flavonoides, etc.)
5
2. OBJETIVOS
2.1.
Objetivo general
Evaluar el efecto conjunto de los tratamientos con altas presiones hidrostáticas y del polvo
de aceitunas como posible antimicrobiano sobre el crecimiento e inactivación de esporas
Bacillus cereus y su uso potencial en alimentos.
2.1.
Objetivos específicos
1
Desarrollo de una nueva bebida de vegetales con características organolépticas
agradables y que a su vez, sirva como sustrato de tratamiento para medir el efecto
de las Altas Presiones y el Polvo de aceitunas.
2
Aplicar tratamientos de altas presiones con antimicrobiano a escala de laboratorio
primero en sustrato de referencia y luego en sustrato vegetal.
3
Aplicar estos tratamientos en alimentos mínimamente procesados (bebida de
vegetales) y evaluar su utilidad en términos de alargar la vida útil del producto.
4
Modelizar matemáticamente los datos obtenidos experimentalmente ajustándolos a
modelos matemáticos conocidos.
6
3. MARCO TEÓRICO
3.1 BEBIDA VEGETAL
Los jugos son una bebida refrescante y nutritiva. Aportando al organismo aquellos
nutrientes y además son una forma original de tomar ciertos alimentos entre ellos vegetales
que no muy atractivos en su preparación tradicional. Aunque los zumos más comunes sean
los de frutas, los zumos de verduras y hortalizas son también un buen complemento a la
alimentación y en los últimos años distintas industrias del sector de producción de zumos
han sacado al mercado jugos de vegetales por ejemplo, HERO España,
Coca cola
Company en España con Minute Vergelia, Granini, España. En Latinoamérica el consumo
de este tipo de bebidas no es masivo no obstante, Herdez. México que comercializa zumos
en toda Latinoamérica con su línea de “jugos de vegetales”. En Colombia estas bebida de
vegetales se comercializan en supermercados tipo gourmet, no son bebidas tratadas, puesto
que en Colombia hay oferta de vegetales frescos todo el año; sin embrago, al no ser tratadas
las bebidas tienen un vida útil muy corta que no permite almacenarlas por intervalos de
tiempo muy extensos.
La bebida de vegetales utilizada como sustrato en este estudio se compone de
dos
ingredientes, zanahorias y judías verdes. La zanahoria (Daucus carota) es una fuente de
vitaminas A y K, minerales como calcio y potasio, fibra y pigmentos, por otra parte las
judías verdes (Phaseolus vulgaris var. vulgaris) contiene vitaminas A, C, B1, B3, B6 y
B12; minerales como: potasio, calcio, fósforo, hierro, magnesio, cromo, yodo; también
ácido fólico y beta caroteno (Biesalki y Tinz, 2008).
Durante el procesado de las zanahorias y las judías ocurren diferentes cambios físicos y
químicos por ejemplo la rotura del tejido por el corte supone un incremento de la intensidad
respiratoria y transpiración además de favorecer determinadas reacciones enzimáticas
(polifenoloxidasa, peroxidasa, pectinasas, ascorbato oxidasa, etc) que conducen a un rápido
deterioro del producto, con posible pérdida de alguna de sus características sensoriales,
nutricionales y propiedades beneficiosas para la salud. Además, el corte aumenta la
superficie de tejido susceptible de alteraciones microbianas, por lo que la seguridad de los
7
frutos mínimamente procesados cortados en fresco es una de las principales preocupaciones
de investigadores y productores (Cano et al., 2007)
Las bebidas funcionales se pueden definir como productos que poseen componentes
fisiológicos que complementan su aporte nutricional y que representan un beneficio extra
para la salud de las personas, como por ejemplo en el metabolismo del colesterol, la
mineralización ósea y la reducción de riesgos de enfermedad. Existen al menos tres
categorías principales de bebidas funcionales; las bebidas enriquecidas (jugos y aguas con
vitaminas y minerales), bebidas isotónicas y las bebidas energéticas o estimulantes
Las bebidas a base de vegetales sean o no funcionales presentan muchas ventajas en
términos de nutrientes y aporte de energía sin embargo, esta son susceptibles a la
contaminación microbiana más aún cuando las condiciones de almacenamiento no son
adecuadas, B cereus es un microorganismo patógeno en alimentos que se ha asilado con
mucha frecuencia de bebidas de este tipo (Chen. J. L. et al. 2008)
El procesamiento térmico de jugos cítricos a altas temperaturas si bien elimina la
posibilidad de daño microbiológico y reduce la actividad enzimática, afecta la calidad del
producto, produce la pérdida de componentes termolábiles y termosensibles responsables
de las propiedades sensoriales y nutricionales de los alimentos. La calidad de los alimentos
esterilizados difieren mucho de los frescos, particularmente el aroma, las vitaminas y
componentes volátiles de estos productos son influenciados dramáticamente por los
tratamientos térmicos. Por otra parte tratamientos no térmicos como las APH influyen de
manera menos agresiva en los productos vegetales de tal manera que se pueden encontrar
una serie de ventajas en diferentes aspectos como:
3. 1. 1. Inactivación enzimática
La efectividad de los tratamientos de APH sobre la inactivación enzimática depende de
variables del tratamiento (presión, tiempo, temperatura), de la composición del alimento y
del tipo de enzima. Para la desactivación de enzimas relacionadas con la pérdida de calidad
de los alimentos vegetales (peroxidasas (POD), lipoxigenasas (LOX), pectinmetilesterasas
(PME), etc.) (Knorr,1995; Seyderhelm et al., 1996; Cano et al., 1997; Hendrix et al.,1998;
8
Hernández; Cano et al., 1999; Palou et al., 2000; Plaza et al., 2003; Tangwongchai et al.,
2000; Crelier et al., 2001). Probablemente las polifenoloxidasas (PPO) sean las enzimas
más estudiadas en relación con la efectividad de los tratamientos APH, debido a los graves
problemas de calidad sensorial relacionados con su actividad (pardeamiento enzimático)
(Weemaes et al., 1998; Cano et al., 1997; Hernández y Cano, 1998).
3. 1. 2. Compuestos Bioactivos.
El efecto de los tratamientos de APH sobre los compuestos bioactivos (vitaminas A, C y E,
Carotenoides: licopeno, -caroteno, luteína, zeaxantina, criptoxantina y flavonoides)
presentes en distintos productos vegetales. En general, los carotenoides con actividad
antioxidante (licopeno, criptoxantina, -caroteno, zeaxantina), no son afectados por los
tratamientos de APH solos o combinados con calor.
3. 1. 3. Biodisponibilidad de nutrientes.
El efecto de los tratamientos de APH sobre los compuestos bioactivos (vitaminas A, C y E,
Carotenoides: licopeno, -caroteno, luteína, zeaxantina, criptoxantina y flavonoides)
presentes en distintos productos vegetales no se ven afectados por tratamientos a APH. Por
lo tanto la biodisponibilidad de compuestos tampoco se ve afectada (Cano et al., 2007).
9
3. 2.
CONTROL MICROBIOLÓGICO
La contaminación microbiológica es uno de los problemas más importantes en el desarrollo
de este tipo de alimentos. Aunque la composición, propiedades físico-químicas y naturaleza
del fruto entero de partida determinan en gran medida la predisposición al ataque de un tipo
u otro microorganismos será el proceso de elaboración y en especial las fases de pelado y
corte de los productos, cuando se destruye la barrera natural de protección del vegetal y se
facilita la disponibilidad de nutrientes celulares liberados (azúcares, etc.), favoreciendo la
contaminación con microorganismos alterantes y/o patógenos (Nguyen,1994; Bracket,
1997). Los alimentos mínimamente procesados que presentan valores de pH y actividad de
agua (aw) altos (pH 4.6 y aw 0.85) son considerados como alimentos altamente perecederos
si no se realiza ningún proceso de conservación (Willey, 1997).
3. 3.
TRATAMIENTOS DE CONSERVACION TÉRMICA
Los zumos de frutas y verduras son productos muy sensibles a la pérdida de sus
características organolépticas más importantes:
•
Pérdida de color.
•
Modificación del aroma.
•
Destrucción de vitaminas.
•
Desnaturalización de proteínas.
•
Cambios físicos.
Por lo general, el almacenamiento de las materias primas y los jugos de fruta frescos, se
realiza a temperaturas de refrigeración, ya que se ha observado que a temperaturas
superiores se incrementa el pardeamiento no enzimático (reacción de Maillard,
caramelización de azúcares, reacción oxidativa de ácido ascórbico) y como resultado una
disminución en la calidad sensorial y valor nutritivo de los jugos frescos(Selman. 1994). El
tratamiento térmico altera en mayor medida las características del jugo y acelera las
reacciones de deterioro descritas anteriormente.
10
Desde hace varias décadas, el tratamiento de conservación por calor, ha sido la tecnología
más utilizada para la conservación de alimentos. A través de los años, se ha conseguido la
elaboración de alimentos microbiológicamente seguros y con baja actividad enzimática,
pero en detrimento de la calidad del producto.
Los dos métodos mas utilizados hoy en día para la conservación de alimentos son la
esterilización y la pasterización.
3. 3. 1. Esterilización
La esterilización comercial es un tratamiento de conservación por calor que tiene como
objetivo inactivar la totalidad de microorganismos patógenos y alteradores, y de enzimas
presentes en el alimento permitiendo prolongar la vida útil del producto en condiciones
microbiológicamente seguras a temperatura ambiente. Por lo general este tratamiento se
denomina también HTST (high temperature-short time) o UHT (ultra high temperature) que
supone aplicar temperaturas de proceso entre 100-120 ºC durante un periodo corto de
tiempo 2-5 segundos (Aleixandre, 1994).
3. 3. 2. Pasteurización
La pasteurización es un tratamiento de conservación por calor que tiene como objetivo
inactivar la mayoría de microorganismos y enzimas presentes en el alimento pudiendo
quedar una fracción residual resistente al tratamiento. Por lo general este proceso se
caracteriza por aplicar un rango de temperaturas inferior al de esterilización, no superando
los 100 ºC haciéndose necesario su almacenamiento y distribución en condiciones de
refrigeración (Aleixandre, 1994).
3. 3. 3.
Escaldado
El escaldado es un tratamiento térmico que tiene como objetivo reducir la actividad
enzimático y modificar la textura de ciertos vegetales. El tratamiento consiste normalmente
en la inmersión de los vegetales cortados, en agua a temperaturas entre 80 y 100ºC, este
tratamiento se considera previo al procesado de vegetales en conserva. Se utiliza en la
conservación de las hortalizas para fijar su color o disminuir su volumen, antes de su
congelación, con el fin de destruir enzimas que puedan deteriorarlas durante su
11
conservación. Esta manipulación no constituye un método de conservación, sino un
tratamiento aplicado en la preparación de la materia prima. El escaldado reduce el número
de microorganismos contaminantes, principalmente mohos, levaduras y formas bacterianas
vegetativas de la superficie de los alimentos, y contribuye, por tanto, al efecto conservador
de operaciones posteriores.
3. 4.
CARACTERÍSTICAS DEL ALIMENTO A TENER EN CUENTA PARA
ELEGIR EL TRATAMEINTO TERMICO
A la hora de aplicar un tratamiento de conservación por calor, es necesario identificar con
claridad las características físico-químicas y microbiológicas del alimento que influyen
sobre el proceso como:
3. 4. 1.
pH
El pH del alimento es un factor determinante a la hora de elegir el tratamiento térmico
adecuado para su conservación. Podemos clasificar los alimentos respecto a su valor de pH
como: alimentos muy ácidos, cuyo rango de pH es inferior a 3.5 (jugo de limón); alimentos
ácidos, cuyo valor de pH se encuentra entre 3.5-4.5 (jugos de frutas y conservas vegetales a
las que se adiciona un corrector de la acidez). El valor de pH crítico se sitúa en 4.5. Este es
el valor de pH al cual crece Clostridium botulinum, microorganismo esporulado y
termorresistente, que se encuentra ampliamente en la naturaleza, cuya toxina es una de las
más letales del mundo. Y por último, alimentos de baja acidez serán aquellos con un pH
superior a 4.5 (carnes, leche, huevo liquido y productos lácteos)
3. 4 .2. Viscosidad
La viscosidad del alimento es también un parámetro importante que definirá el tipo de
intercambiador de calor adecuado para la aplicación del tratamiento térmico. El
pasteurizador de placas será adecuado para alimentos poco viscosos mientras que un
pasteurizador tubular será más idóneo para el tratamiento de alimentos viscosos o con
partículas (Montaner, 2007).
12
3. 4 .3. Caracterización microbiológica del producto
Es esencial caracterizar la flora natural existente en el producto fresco y materias primas ya
que de este modo se definirán las condiciones del tratamiento térmico a aplicar para su
conservación. Caracterizaremos también la carga microbiana final tras el tratamiento para
asegurar que un producto cumpla con la legislación vigente. (Montaner, 2007).
3. 5.
PROCESADO
MÍNIMO
DE
ALIMENTOS
VEGETALES.
NUEVAS
TECNOLOGÍAS DE CONSERVACIÓN NO TÉRMICAS
El estudio de nuevas tecnologías de conservación de alimentos (Alta Presión, Pulsos
Eléctricos de Alta Intensidad de Campo, radiación ionizante, campos magnéticos
oscilantes, envasado en atmósfera modificada, antimicrobianos naturales, etc.) surge en el
contexto de las sociedades de países industrializados donde los consumidores valoran
positivamente aquellas características de los alimentos que les confieren mayor valor
añadido como son: una escasa manipulación en su preparación, el empleo de aditivos
naturales o la ausencia de los mismos, conservación de las características sensoriales
propias del alimento fresco de partida y la conservación o potenciación de las propiedades
nutricionales y las cualidades beneficiosas para la salud de los productos vegetales. Los
alimentos de origen vegetal que presentan estas características se han denominado
Alimentos Vegetales Mínimamente Procesados (MP). Como “Procesado Mínimo de
alimentos”, se entiende la aplicación de una serie de tecnologías (barreras), que combinadas
o no, deben mantener las características del alimento lo más cercanas posible a las del
producto fresco, además de mejorar su vida comercial útil en términos microbiológicos,
sensoriales y nutricionales. Dentro de esta terminología se incluyen dos tipos de productos
distintos (Cano et al., 2005).
Durante los últimos años se han desarrollado diferentes tecnologías de conservación que
han tratado de dar respuesta a las demandas del consumidor por alimentos
microbiológicamente seguros y de mayor calidad. Dentro de este grupo podemos encontrar
las denominadas “tecnologías de conservación no térmicas” que son aquellas que no
utilizan la temperatura como principal forma de inactivación de microorganismos y
13
enzimas. Si bien es cierto que en la mayoría de estos tratamientos se produce un leve
incremento de la temperatura, este nunca llega a ser tan elevado como en un tratamiento
térmico.
El objetivo principal de estas tecnologías no térmicas es lograr alimentos que conserven al
máximo todas las características de frescura y sabor sin renunciar a la seguridad
alimentaria. Dentro de las nuevas tecnologías las más aplicadas hasta el momento son:
3. 5. 1.
Aditivos naturales
Los aditivos de origen natural incluyen una gran variedad de compuestos antimicrobianos
naturales (canela, lisozimas y diferentes aceites aromáticos) que inhiben el crecimiento de
ciertos microorganismos alteradores y patógenos y que son susceptibles de ser combinados
con otras tecnologías de conservación.
3. 5. 2.
Altas Presiones Hidrostáticas APH
Esta tecnología esta adquiriendo mayor relevancia en los últimos años como alternativa al
tratamiento térmico en cierto tipo de productos (productos cárnicos, jugos de frutas y
salsas), ya que se han obtenido resultados importantes en inactivación de microorganismos
y enzimas sin alterar su calidad final (Mertens et al., 1992).
3. 5. 3.
Pulsos eléctricos de alta intensidad
Esta tecnología es uno de los tratamientos no térmicos desarrollados en la conservación de
alimentos líquidos cuyos componentes nutricionales son sensibles al calor, tales como jugos
de frutas, leche o huevo liquido, debido a que durante el tratamiento se alcanzan
temperaturas inferiores a los tratamientos térmicos convencionales (Quass, 1997).
Los pulsos eléctricos de alta intensidad consisten en la aplicación de pulsos de alto voltaje
(10-80 kV/cm) directamente sobre el alimento líquido el cual se encuentra entre dos
electrodos, durante un periodo de tiempo muy corto (50-2000 microsegundos). Entre otras
ventajas, esta tecnología no altera las propiedades sensoriales ni físico-químicas de los
alimentos consiguiendo niveles de inactivación de microorganismos considerables (Barbosa
et al., 1998).
14
3. 5. 4.
Campos magnéticos oscilatorios
Esta nueva tecnología se caracteriza por afectar de forma muy variada al microorganismo
provocando cambios estructurales y morfológicos en su membrana. El tratamiento tiene
como características principales tiempos de tratamiento cortos (25 milisegundos) y fuerzas
de campo altas (2-100 teslas) con una frecuencia de 5 a 500 kHz.
Dicho tratamiento afecta directamente a la multiplicación de los microorganismos ya que
actúa principalmente sobre la membrana provocando un cambio en la fluidez e interfiriendo
en el flujo de iones. En algunos casos estas alteraciones no llegan a producir la muerte
celular por lo que la eficacia del tratamiento en la inactivación de microorganismos es baja,
consiguiendo reducir únicamente dos ciclos logarítmicos en células vegetativas (Hendrickx
et al., 2001).
3. 5. 5.
Ultrasonidos de alta intensidad
Esta técnica se ha desarrollado para la conservación de alimentos ya que es capaz de
inactivar microorganismos en forma vegetativa y reducir la resistencia térmica de las
esporas.
La temperatura es un factor que influye directamente en el tratamiento ya que se produce
un efecto sinérgico a temperaturas moderadas, pero al incrementarse la temperatura, el
sinergismo se reduce. Para aumentar la efectividad del tratamiento a temperaturas altas, se
aplica una ligera sobrepresión sobre el producto. Esta tecnología podría reducir las
temperaturas de esterilización y pasterización pero únicamente en alimentos bombeables o
con características semisólidas (Earnshaw y et al., 1995; Villamiel et al., 2000).
3. 5. 6.
Irradiación
Este tratamiento consiste en la aplicación de ondas electromagnéticas o electrones al
alimento, utilizándose con mayor frecuencia rayos gamma y rayos X. La tecnología es
adecuada para la higienización de sólidos y superficies. Últimamente se esta desarrollando
su aplicación en la higienización de vegetales y productos de cuarta gama obteniendo
resultados importantes en la reducción de la carga microbiana (Al-Bachir & Zeinou, 2006)
15
3. 6. DESCRIPCIÓN DEL MICROORGANISMO DE INTERES (Bacillus cereus)
3. 6. 1.
Género Bacillus
El género Bacillus pertenece a la familia Bacillaceae, es un género que hoy en día incluye
más de 60 especies de bacilos. Este género está formado por microorganismos bacilares
Gram positivos, formadores de endosporas, quimioheterotrofos, que normalmente son
móviles y rodeados de flagelos perítricos. Son aerobios o anaerobios facultativos y catalasa
positivos. Las células bacterianas de este género tiene un amplio tamaño que varía entre
0,5–2,5×1,2–10µm (Ingraham & Ingraham., 1998).
Taxonómicamente, según la segunda edición del Manual Bergey (1982), el género Bacillus
pertenece a la Familia I Bacilliaceae, del orden I Bacillales, de la clase III Bacilli, del fillum
BXIII Firmicutes del Dominio Bacteria. En la primera edición el género es claramente
diverso desde el punto de vista fenotípico y genotípico. Más recientemente, los datos de la
secuencia de rRNA se han empleado para dividir el género Bacillus en al menos cinco
líneas diferentes. Entre las especies más representativas del género Bacillus se encuentran:
B. alkalophilus,
B. anthracis, B. azotoformans, B. brevis, B. cereus, B. subtillis, B.
coagulans, B. firmus, B. insolitus, B. licheniformis, B. polymixa y B. turingiensis, entre
otros (Delgado, 2005).
3. 6. 2.
Bacillus cereus
En 1887 Frankland y Frankland aislaron y describieron por primera vez la bacteria Bacillus
cereus. No fue hasta 1950 cuando se confirmo definitivamente que este microorganismo
podría producir una enfermedad transmitida por alimentos. Esto fue gracias a Hauge quien
publicó en 1950 y 1955 descripciones de cuatro brotes en salsa de vainilla. (Delgado,
2005).
3. 6. 3.
Características generales
B. cereus es un microorganismo aerobio, aunque también puede crecer anaerobicamente. Es
Gram positivo, catalasa positivo, reduce nitratos a nitritos y positivo en Voges-Proskauer
16
fermentando la glucosa por vía butanodiólica, la sacarosa y el glicerol. Es manitol negativo
y produce lecitina. Normalmente es móvil, gracias a sus flagelos perítricos. Aunque existen
variables inmóviles (Prescot et al., 2004)
3. 6. 4.
Hábitat y condiciones de crecimiento
B cereus esta muy difundido en la naturaleza. Se puede encontrar en el suelo, agua y aire,
por lo que es frecuente encontrarlo en los vegetales, en cosechas de cereales, en el pelo de
los animales y en muchos alimentos, tanto crudos como tratados o industrializados (Kramer
y Gilbert, 1989).
Las diferentes cepas de B. cereus son muy variables en cuanto a su forma de crecimiento y
características de supervivencia. La Tabla 3.1 resume los límites de crecimiento de este
microorganismo. Existen cepas mesófilas y que crecen en un intervalo de temperaturas
entre 15 ºC y 55 ºC. Pero hay algunas cepas psicrótrofas, que son capaces de crecer a 4 ó 5
ºC (Lechner et al., 1998). Éstas últimas representan un peligro para productos refrigerados
(Valero et al., 2003). En general para B. cereus la temperatura óptima de crecimiento es de
30 a 40 ºC.
En cuanto al pH ocurre algo muy similar que con la temperatura. El pH mínimo de
crecimiento es distinto de unas cepas a otras, aunque en general B. cereus crece a un pH
mínimo de 5 y máximo de 8.8 teniendo un intervalo de pH óptimo entre 6 y 7.
El efecto de la actividad del agua sobre las cepas causantes de intoxicaciones alimentarías
no está bien documentado, pero se acepta que B cereus necesita una (a w) mínima de 0.93.
Condiciones
Mínimo
Óptimo
Máximo
Temperatura (ºC)
4
30 - 40
55
pH
6.0
6.0-7.0
8.8
aw
0.93
-
-
Tabla 3.1. Resumen de Condiciones de crecimiento para Bacillus cereus. Adaptado de:
Delgado, 2005.
17
3. 6. 5.
Asilamiento e identificación
Los procedimientos de choque térmico y de selección de esporas con etanol son excelentes
métodos para la recuperación cuantitativa de especies de Bacillus de materia fecal y otras
muestras (incluidos alimentos) que contengan poblaciones mixtas de microorganismos.
3. 6. 6.
Infección alimentaria por Bacillus cereus
Las células vegetativas de B. cereus pueden ser eliminadas fácilmente mediante un
tratamiento térmico, sin embargo las esporas son más resistentes. Esto garantiza su
supervivencia a través de todas las fases de tratamiento de los alimentos (excepto después
de un tratamiento con autoclave) y de ahí que el microorganismo se halle en la mayoría de
las materias primas que se usan en la elaboración de alimentos. Es normal encontrarlo en
concentraciones de 10-2–10-3 por gramo, una concentración inocua, pues se ha estimado que
para causar enfermedad es necesaria una concentración mínima de 105 UFC/ gramo (Hobbs
y Gilbert, 1974). Pero las esporas que quedan en los alimentos son un peligro potencial, ya
que si las condiciones del medio son favorables, se induce la germinación aumentando
considerablemente en poco tiempo el número de microorganismos presentes en el alimento;
provocando el deterioro del alimento y una posible intoxicación.
Aunque, en un principio se pensó que el aumento del número de bacterias era el
responsable de la patología intestinal, más tarde se descubrió que las células vegetativas de
B. cereus producían una variedad de toxinas y enzimas extracelulares causantes de dicha
enfermedad. Estas enzimas son: lecitinasa, proteasas, β-lactamasas, cereolisina (hemolisina
I ó primaria) y hemolisina BL.
B. cereus se asocia con dos tipos de enfermedades alimentarias o intoxicaciones: una con
síndromes diarreicos y otra con síndromes eméticos ocasionados por dos tipos diferentes de
toxina que constituyen factores de virulencia en B. cereus (Granum et al., 1997). Por un
lado esta la toxina conocida como “cereulidina” causante del síndrome emético, en
términos de composición química se trata de una proteína de un dodecapéptido lactónico y
lipofílico de aproximadamente 1.2 KDa, posee residuos de aminoácidos como la alanina,
18
leucina y valina que le dan la capacidad de actuar como un potente ionóforo de potasio.
(Kuse et al., 2000; Pitchayawasin et al. 2003,2004). Recientemente se ha investigado sobre
esta toxina encontrándose su lata termorresistencia así con ciclos de esterilización de 121
ºC por 15 minutos no se inactiva y los residuos hidrofóbicos de esta toxina requieren
inactivación química para su inactivación (Rajkovic 2008).
El síndrome diarreico está producido por una toxina formada por un complejo tripartido
integrado por los componentes B, L1 y L2 que se denominan Hemolisina BL (HB) Esta
toxina provoca hemólisis, histólisis, dermonecrosis, permeabilidad vascular y actividad
enterotóxica. Y aunque no se ha demostrado que exista una enterotoxina única parece que
la HBL es la responsable del síndrome diarregénico (Rajkovic 2008).
3. 7.
LA ESPORA BACTERIANA
A fines del siglo XIX, Tyndall, Cohn y Koch descubrieron de forma independiente la
capacidad de ciertas especies bacterianas para diferenciar estructuras resistentes al calor y a
otros agentes letales, que les permitían mantenerse en estado de latencia durante largos
periodos de tiempo. Ferdinand Cohn descubrió que dichas estructuras se formaban en el
interior de los bacilos del heno, llamándolas endosporos. Cohn descubrió, además el ciclo
de vida de B subtilis y la formación y germinación de los endosporos mediante minuciosos
estudios microscópicos (Keynan y Sandler, 1983).
Basándose en los trabajos de Cohn y en sus propios hallazgos, el inglés John Tyndall
desarrolló y método eficaz para la eliminación de los endosporos mediante ciclos sucesivos
de ebullición e incubación a 37 ºC durante tres días. Este método de esterilización
fraccionada o intermitente es conocido como tindalización.
Por su parte Roberth Koch estudió el proceso de esporulación en B anthracis (agente causal
del ántrax o carbunco) y la participación de sus esporas en la transmisión de esta
enfermedad a animales sanos.
Las esporas son consideradas ahora como una de las formas más resistentes en la tierra a la
temperatura y la desecación. Son muchas las especies esporofomadoras y están distribuidas
19
principalmente dentro del grupo de la bacterias Gram positivas (Prescott et al., 2004). Esto
sugiere que la capacidad de esporulación esta relacionada con la capacidad de síntesis de
una pared gruesa, que además es indispensable para desarrollar esporas resistentes (Moat et
al., 2002).
Las bacterias esporuladas pueden encontrarse en hábitats muy diversos, en el agua y el
suelo y es en este último donde se haya en mayor abundancia. Las condiciones del suelo
son muy variables con periodos de sequía o escasez de nutrientes.
En la primera edición del Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology (1982) basado en
similitudes fenotípicas, se agrupan a las bacterias formadoras de esporas en la sección 13,
que incluye a los géneros Bacillus, Clostridium, Desolfotomaculum, Oscillospirina,
Soporolactobacillus y Sporosarcina.
La segunda edición del Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology (1984) se basa en
criterios filogenéticos (secuenciación de ARNr, ADN y proteínas). Esta edición considera
esporulados los géneros Bacillus, Desolfotomaculum, Paenibacillus, Sporohalobacter,
Soporolactobacillus, Sporosarcina y Thermoactinomyces, pertenecientes a la familia
Bacillaceae, y algunos géneros que se encuentran repartidos entre diferentes familias
taxonómicas (Prescott et al., 2004).
Funcionalmente la formación de la endospora es un claro ejemplo de adaptación de algunas
especies bacterianas a la falta de nutrientes. Ante el agostamiento de éstos, una célula
vegetativa se verá obligada a producir la endospora, en un proceso que involucra cambios
morfológicos, bioquímicos, fisiológicos y una diferenciación funcional clara. De tal modo
que puede considerarse a la esporulación como un ejemplo de diferenciación celular en
procariotas.
En su estado de latencia las esporas no muestran metabolismo detectable (fenómeno
conocido como abiosis) y, por tanto, se pueden considerar inertes, mostrando una marcada
resistencia a la inactivación por agentes físicos (desecación extrema, vacío, presión
hidrostática, temperatura, radiaciones ionizantes) o sustancias químicas (ácidos bases,
fenoles, aldehídos, etc.). Sin embargo, en dicho estado de latencia pueden responder ante un
20
incremento de cualquiera de los nutrientes para empezar la germinación, reiniciar el
crecimiento vegetativo y dar paso a una un incremento de población activa.
Tanto en la industria alimentaria, como en el campo de la microbiología clínica, las esporas
tienen una alta relevancia, gracias a su resistencia a casi cualquier método de inactivación,
lo cual constituye un problema y por esto se han desarrollado mayor control en los
alimentos, bebidas, quirófanos, hospitales, etc. Además de su influencia en el deterioro de
lo alimentos, muchas de estas especies esporoformadoras son patógenas, ya sea por
transmisión directa por aire o agua o a través de instrumentos quirúrgicos, utensilios de
cocina y manipuladores. Debido a la alta resistencia de las esporas hay dificultad a la hora
de diseñar y estandarizar métodos de esterilización y conservación que preserve las
características físicas y valor nutricional del alimento. Las esporas bacterianas resisten
condiciones de esterilización por calor mucho más drásticas que las toleradas por las
células vegetativas y esta resistencia es aplicable también cuando se emplean la radiación o
sustancias químicas desinfectantes. De hecho, las esporas bacterianas pueden utilizarse
como indicadores biológicos en el control de calidad de los procesos de esterilización
(Yawger, 1978).
3. 7. 1. Estructura de la espora
Las endosporas tienen una serie de características comunes en todos los procariotas y son
las siguientes: Tamaño: el tamaño medio de la endospora oscila entre 0.5 µm y 1.5 µm,
localización: se forman y se localizan en el citoplasma de la célula, refringencia: gracias a
esta propiedad las endosporas pueden verse en el microscopio óptico. Esta refringencia se
debe a los bajos valores de aw de las endosporas, debido a la compleja estructura
multilaminar de las esporas estas son muy impermeables a los colorantes. En su estructura
la espora tiene diferentes capas de proteínas y polisacáridos (Delgado, 2005).
3. 7. 1. 1. Exosporium
21
Es la capa más externa, su tamaño varía mucho entre esporas de diferentes especies, en
esporas de B. cereus la capa es muy grande en comparación con el exosporium de B.
subtillis que siendo pariente cercano es muy pequeño (Driks, 2002). El exosporium se
compone de carbohidratos y proteínas, posee macromoléculas exclusivas de las esporas. La
función exacta del exosporium es desconocida aún y no se sabe con certeza si la su
estructura juega un rol en la resistencia de las esporas (Setlow, 2006).
3. 7. 1. 2. Cubiertas esporales
Se encuentra debajo del exosporium y a su vez se compone de varias capas dichas capas se
componen principalmente de proteínas. Se han identificado más de treinta proteínas
diferentes únicas de las esporas en las cubiertas de esporas de B. subtillis. La cubierta
esporal es importante en la resistencia de la espora frente algunos agentes químicos, quizás
reacciona detoxificando el compuesto químico antes de que dañen puntos más profundos de
la espora. (Setlow, 2006). La cubierta protege también de la lisis y de ataques enzimáticos
(p. e. lisozimas) mediante la restricción del acceso de la enzimas al peptidoglicano. Una
gran proporción de la proteína de la cubierta puede ser separada mediante extracción con
detergentes sin dañar definitivamente a la espora. En esporas de B. subtilis se ha encontrado
que las cubiertas pueden presentar daños a nivel de las proteínas que conforman la
estructura de la cubierta. Se ha encontrado que esporas con cubiertas dañadas conservan su
capacidad de resistencia a altas presiones hidrostáticas, sugiriendo entonces que esta
cubierta no es importante en la resistencia de la espora a altas presiones; sin embargo,
estudios recientes han demostrado que esporas con cubiertas defectuosas retienen también
la resistencia a destrucción mecánica (Delgado, 2005).
3. 7. 1. 3. Córtex
Esta es una capa de grosor variable compuesta de peptidoglicano modificado con enlaces
más complejos que en las células vegetativas, lo que le proporciona mayor flexibilidad, el
peptidoglicano de las esporas contiene ácido diaminopimélico, mientras que el de células
vegetativas es sustituido por el aminoácido L-lisina. Adicionalmente, mucho del ácido
murámico en el peptidoglicano del córtex está presente como ácido murámico δ- Lactámico
(MAL), con pequeñas cantidades de ácido murámico enlazado solo a L- alanina (Black et
al., 2007). El córtex es más rígido y su función en la resistencia a la presión no ha sido
22
investigada aún, pero tiene mucha importancia en mantener a la espora en estado de
dormancia, manteniendo bajos los niveles de agua en la región central del protoplasto. El
peptidoglicano del córtex es degradado durante estadios tempranos de la germinación y la
hidrólisis de este córtex es esencial para que la espora “vuelva a la vida (Black et al., 2007).
3. 7. 1. 4. Membrana interna o intina
Se encuentra por debajo del córtex y es la pared que rodea al propoplasto. Es una
membrana completa que provee una externa de baja permeabilidad a moléculas pequeñas si
están cargadas o son hidrofobicas, inmoviliza lípidos e incluso el paso de agua a través de
la membrana (Black et al., 2007). La membrana interna parece estar comprimida en las
esporas, con la hidrólisis del córtex durante la germinación, en ausencia de producción de
fosfolípidos y síntesis de ATP el volumen abarcado por la membrana aumenta unas 2 a
3veces. La baja permeabilidad de la membrana interna es muy importante como barrera que
impide el acceso y posterior daño del ADN contenido en el protoplasto, por parte de
agentes químicos (Cortezzo & Setlow, 2005). Dentro de esta membrana están contenida
muchas proteínas que intervienen en el procesote germinación (Setlow, 2003). La inusual
composición de esta membrana indudablemente influye en el comportamiento de estas
proteínas; no obstante la estructura de esta membrana no se conoce.
3 .7. 1. 5. Protoplasto
Este núcleo se compone de solo dos constituyentes y tiene dos propiedades bioquímicas
importantes, una es que el contenido de agua es muy bajo en comparación con el de una
célula vegetativa donde un 80% del peso seco de la célula es agua, en una espora la
proporción es de 25% a 55% dependiendo de la especie; este bajo porcentaje de agua es la
mayor contribución a la resistencia de la espora al calor, cuanto mayor sea el contenido de
agua menor será la resistencia a altas temperaturas. El bajo contenido de agua es sin duda lo
que permite el estado de dormancia, en niveles normales de agua las proteínas tienen
solubilidad y movilidad, en el protoplasto están inmovilizadas. La segunda propiedad
bioquímica del protoplasto es que posee un pH con 1.0 a 1.5 unidades más bajo que la
célula vegetativa el cual es generalmente 7.5 a 8.0 (Paidhungat y Setlow, 2002), el pH bajo
se mantiene después de la esporulación y es un regulador en la actividad de enzimas clave
23
en el desarrollo de la espora durante la esporulación, el pH aumenta en la germinación en
los primeros minutos a través de la excreción de protones al medio.
Como se menciono anteriormente, el cortex de la espora tiene una baja cantidad de agua y
esto esta relacionado con la presencia de una molécula pequeña, el ácido dipicolínico (acido
dicarboxilico 2-6 pirimidina) (DPA), este DPA, esta presente en el citoplasma en una
proporción 1:1 como quelato con cationes divalentes donde predomina el Ca+2, formando
Ca-DPA, el DPA se hace en etapas tardías de la esporulación y se acumulan un 20% en
peso seco, en el protoplasto de la espora. Esporas de cepas mutantes que no sintetizan ni
acumulan DPA tiene un mayor contenido de agua y por lo tanto son más sensibles que las
cepas normales. El DPA también es importante porque ejerce una barrera de protección a
ADN (Setlow et al., 2006)
Existen en el protoplasto una serie de proteínas solubles, las SASP proteínas pequeñas
ácido solubles tipo α/β, estas proteínas provienen de una familia de genes que se expresan
solamente al final de la esporulación. Su tamaño es pequeño y comprenden solo un 5% del
total de las proteínas de la espora y se localizan solamente en el protoplasto de la espora, se
asocian estructuralmente solamente a ADN de la espora confiriéndole más resistencia a la
espora a altas temperaturas, desecación y radiación ultravioleta. En el momento de la
germinación las SASP son degradadas rápidamente mediante una proteasa específica
(Black et al., 2007)
3. 8.
PROCESO DE ESPORULACIÓN
Es el proceso por el cual una célula vegetativa se transforma en endospora. Mientras las
condiciones ambientales son favorables, el crecimiento de una célula vegetativa continúa
hasta que se divide en dos células hijas mediante fisión binaria y no se producirá la
esporulación. La esporulación puede iniciarse la final de la fase exponencial probablemente
como consecuencia de la falta de nutrientes en el medio de crecimiento. La división o
separación asimétrica de la espora depende generalmente, de una señal nutricional,
24
mientras que los eventos que siguen dependen de un control a nivel genético. Durante el
crecimiento vegetativo rápido se suprime ele inicio de la esporulación, en apariencia debido
a un catabolito de bajo peso molecular que contiene átomos de carbono, nitrógeno y
fósforo. Este catabolito podría controlar la síntesis de una enzima necesaria para la
esporulación. Cuando la concentración de un nutriente crítico alcanza un nivel limitante, se
reduce o se interrumpe la síntesis de esta enzima (Collado, 2000)
La esporulación también puede deberse a la acumulación en el medio de productos
resultantes del metabolismo de las células bacterianas (Moseel y Moreno, 1985). También
puede iniciarse este proceso por la presencia de determinados componentes, como ciertos
nucleótidos y antibióticos (Freese, 1981)
El crecimiento vegetativo no siempre termina en la esporulación, puesto que esta se ve
influenciada por factores como la temperatura, pH, compuestos nitrogenados, oxígeno
describió los cambios morfológicos producidos durante la esporulación. La aplicación de la
microscopía electrónica ha permitido la identificación de diferentes estadios en la
formación de la endospora. Así se han reconocido siete etapas morfológicamente distintas
durante la esporulación (Russel, 2003).
•
Estadío 0. Representa el momento final de la fase logarítmica de la célula
vegetativa. La inducción de la esporulación parece estar ligada a un
momento temporal en el ciclo de replicación del ADN, pues depende del
momento del ciclo de la célula. Una célula puede iniciar la esporulación una
vez se ha completado la replicación cromosómica, sí por ejemplo hay
limitación de nutrientes.
•
Estadío 1 o preseptación. Cuando se produce la señal del inicio de la
esporulación, se forma un filamento axial de cromatina, que se extiende por
la mayor parte de la célula. Sucede en ausencia de síntesis de proteínas o
ADN, posiblemente a un cambio iónico en la célula, por falta de
determinados iones (Hurst & Gould, 1983).
25
•
Estadío 2 o septación. Se inicia cuando una porción del material nuclear
migra a un polo de la célula. Se forma un septo asimétrico que da lugar a dos
compartimentos celulares separados, conteniendo cada uno parte del
material nuclear. A continuación, se inicia el englobamiento de la
protoespora por la membrana celular. En B cereus se ha comprobado que el
fenómeno de la esporulación es reversible en este punto, pues sí se
transfieren las endosporas en este estadío a medio fresco, vuelven a crecer,
mientras que, si alcanzan el siguiente estadío, continuarán su ciclo hasta la
formación de la espora (Setlow, 1981)
•
Estadío 3. Comprende la inclusión de la protoepsora por una invaginación
de la membrana, que se separa totalmente de la célula madre. La protoespora
está rodeada por dos membranas de polaridad opuesta. En este momento,
aparecen enzimas específicas de la endospora y se observan gránulos de
ácido beta-hidroxibutírico en el citoplasma de las células vegetativas.
•
Estadío 4. Se produce la deposición del córtex entre las dos membranas. El
córtex está constituido por péptidoglicanos distintos de los de la pared
celular y aumenta en grosor conforma la espora se desarrolla. En esta etapa
empieza a parecer la refringencia típica de la endospora.
•
Estadío 5. Se produce la síntesis de la cubierta de la endospora. Las
proteínas de la cubierta se sintetizan en forma de precursor de célula madre
y son depositadas sobre la espora en desarrollo. El DPA se sintetiza también
en la célula madre y se acumula en la endospora. Hay una toma de calcio y
otros iones metálicos divalentes (magnesio y manganeso), que penetran en la
protoespora, siendo esto, un proceso de difusión facilitada. En el protoplasto,
el calcio se combina con el DPA, lo que disminuye la concentración de
calcio libre y posibilita así una mayor entrada del mismo (Setlow, 1981). En
este estadío, aparece la resistencia a alcoholes como el octanol. En algunas
especies bacterianas, se desarrolla el exosporium externamente a la cubierta.
26
•
Estadío 6 o maduración de la espora. En este paso el córtex y las cubiertas
aumentan. Se produce la deshidratación del protoplasto, aumenta la
refractibilidad y se desarrolla la resistencia al calor, a la radiación ultra
violeta y a la lisozima.
•
Estadío 7 ó final. Incluye la liberación de la endospora madura por autolisis
de la célula vegetativa.
Las condiciones para que se produzca la esporulación son precias e incluso más estrictas
que las condiciones de crecimiento.
Se han revisado los factores medioambientales críticos para la esporulación. Estos factores
según Rusell (1982) son:
•
Temperatura
•
pH
•
Potencial de oxidación-reducción.
•
Composición mineral.
•
Presencia de determinados compuestos con carbono y nitrógeno.
•
Composición global del medio de esporulación.
3. 9. PROCESO DE ACTIVACIÓN DE LA ESPORA
Es un proceso reversible por el cual la endospora bacteriana termina con el estado de
letargo o estadío fisiológico de incapacidad para germinar, sin terminar la criptobiosis
(estado fisiológico de metabolismo detenido). Al ser irreversible, la activación, puede
conducir a una nueva etapa de letargo conocida como desactivación, o a la pérdida de
viabilidad si las condiciones ambientales no son las adecuadas para la germinación (Curran
y Evans, 1974)
27
Como consecuencia de la activación, se produce un incremento en la velocidad de
germinación y en el porcentaje de endosporas (Cook y Pierson, 1983). Por ello, en los
estudios de termorresistencia se recomienda activar las esporas antes del tratamiento
térmico. La endospora activada es retráctil, no teñible y mantiene la resistencia a agentes
físicos y químicos que pueden dañar la célula. El método más empleado para activar
endosporas es el tratamiento térmico a temperaturas no letales, lo cual, no supone una
pérdida de resistencia térmica. Otros métodos que permiten activar la endospora son la
exposición a niveles de pH ácidos, a radiaciones ionizantes o el empleo de compuestos
químicos, aunque son menos efectivos que el calor.
3. 9. 1. PROCESO DE GERMINACION DE LA ESPORA
El proceso de germinación es aquel donde la espora abandona definitivamente y de manera
irreversible su estado de latencia y sufre una transformación restaurando su actividad
metabólica. Se trata de un proceso irreversible, aunque el paso al desarrollo celular puede
detenerse incluso durante días si las condiciones no son adecuadas. De esta forma se puede
controlar la germinación mediante la adición o eliminación de algunos aminoácidos
esenciales. A lo largo de este proceso la espora se hace sensible a la temperatura y a la
radiación.
En la naturaleza la germinación de las esporas esta indudablemente ligada a la presencia de
nutrientes. Dichos nutrientes son específicos y varían de una especie y cepa a otras de
microorganismo esporoformadores, no obstante tiene nutrientes en común como: Laminoácidos, D- azucares y nucleósidos tipo purina. Estos nutrientes poseen una forma
estereoespecífica de acoplarse a los receptores localizados en la membrana interna de la
espora. Los receptores de la germinación se encuentran codificados genéticamente
mediante operones tricistrónicos que solo se expresan durante el desarrollo de la espora.
Las endopsoras han de ser capaces de germinar para mostrar su viabilidad, algunos
tratamientos como el tratamiento térmico por ejemplo pueden dañar este mecanismo. No
obstante otros tipos de tratamientos como las Altas Presiones Hidrostáticas pueden inducir
28
la germinación de las endosporas, como se explicará más adelante. La germinación se
puede inducir por otros tratamientos con diferentes tipos de germinantes:
•
Germinantes nutritivos, incluyen aminoácidos como L-alanina, ribósidos,
como Rosina o adenosina, azúcares, como la glucosa.
•
Germinantes no nutritivos, incluyen surfactantes (n.dodecilamina), iones
metálicos (calcio, potasio, manganeso), quelatos (etilendiamintetrracético ó
dipicolinato cálcico) y bicarbonato (Gould, 1970)
•
Enzimas, como la sublisina, enzimas líticas de la espora y la lisozima.
3. 11. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS
Se conoce que una serie de factores pueden afectar la actividad antimicrobial: a saber
periodo de contacto, concentración, temperatura, pH, presencia de materia sólida orgánica y
tipo de microorganismo (Rusell, 2003).
La conservación y seguridad en alimentos tiene un récord extenso de descubrimientos e
innovaciones para impedir el deterioro y alargar la vida útil de alimentos durante su
almacenamiento. Los métodos de preservación de alimentos se pueden clasificar en: físicos,
químicos y biológicos. Los métodos físicos incluyen: secado, almacenamiento en frío,
congelamientos y empaque en atmósferas modificadas (Ricke et al., 2005).
Un biocida puede inactivar a un solo o varios tipos de microorganismo. Es pertinente
considerar, si es posible, explicar las similitudes y diferencias en respuesta a biocidas en
microorganismos diversos estructural y fisiológicamente. En muchas maneras esto
representa un reto para los antibióticos donde un conocimiento claro sobre los mecanismos
de inactivación y resistencia permite conocer la especificidad y selectividad de un biocida
29
3. 11. 1. Absorción de biocidas y respuesta en las células
La interacción de un biocida con la célula microbiana esta determinada por la absorción. Se
conocen cinco clases de absorción: (i) Modelo en forma de S, en el cual la molécula de
soluto es monofuncional, está orientado verticalmente y encuentra una fuerte competición
con las moléculas del solvente o con otras sustancias que se puedan absorber. (ii) Modelo L
(Langmuir) en el cual muchos sitios en la membrana están llenos, esto dificulta al soluto
encontrar un sitio vacío por donde penetrar. (iii) Modelo H (High afinity), en este caso el
soluto es completamente absorbido. (iv) Modelo C (partición constante) en este caso el
soluto penetra más rápidamente que el solvente. (v) Modelo Z hay un punto en el cual el
incremento de la respuesta, se cree es causado por la rotura de la estructura y el contacto
con el soluto, generando nuevos puntos de absorción (Rusell, 2003).
La superficie de la célula microbiana puede actuar como barrera en respuesta a algunos
biocidas o a uno solo en especial. La impermeabilidad o disminución de la respuesta es un
mecanismo común para reducir la susceptibilidad a antibióticos y biocidas en diferentes
microorganismos como mycobacterias, bacterias Gram negativas y esporas bacterianas
pero, también en algunos tipos de estafilococos (Rusell, 2003).
3. 11. 2. Objetivo de acción de un biocida
A pesar de las variaciones en la estructura celular y fisiología es claro que los sitios de
acción pueden estar presentes en células vegetativas de diferentes especies. Muchos de los
trabajos publicados se refieren a bacterias. Como ejemplo de un biocida convencional esta
el fenol, utilizado como desinfectante o preservante. Los fenoles por ejemplo inducen
progresivamente pérdida intracelular de constituyentes, si la concentración de fenol
intracelular es alta se producen daños en la membrana induciendo coagulación dentro de la
célula. En células fúngicas hay daño en la membrana plasmática, no obstante A. niger y C.
albicans son menos susceptibles que las bacterias. Las esporas bacterianas son muy
resistentes inclusos a altas concentraciones de fenol, pero la germinación es inhibida por
bajas concentraciones de fenol (Rusell, 2003).
30
3. 11. 3. Clasificación de los antimicrobianos
La lista de aditivos químicos desarrollados en los últimos años, es muy extensa, los
antimicrobianos naturales incluyen por ejemplo ácidos orgánicos, esteres, sales y
compuestos específicos como la lisozima (Davidson, 2001). En la naturaleza se dan
compuestos usados para la preservación de alimentos incluyendo algunos de origen animal,
como la lactoperoxidasa y algunas proteínas férricas, otros derivados de plantas como:
especias, aceites y compuestos fenólicos (Davidson, 2001). Los sistemas biológicos que
pueden desarrollar o tener potencial para preservar alimentos incluyen el control por
acidificación en alimentos con bacterias ácido lácticas que producen ácidos orgánicos
provenientes de la fermentación de carbohidratos (Monteville et al., 2001). Bacteriocinas y
bacteriófagos están capturando interés por su potencial contra patógenos específicos (Weld
et al., 2004).
3. 11. 4. Antimicrobianos de origen químico
Los compuestos antimicrobianos tienen aditivos como el lactato de sodio o de potasio,
citrato de sodio y una variedad de compuestos antioxidantes que exhiben propiedades
antimicrobianas. Otro tipo de antimicrobianos tipo gas (ozono, cloro, dióxido de cloro, que
general halógenos oxidados) usualmente son aplicados en solución acuosa dando como
resultado una reducción aproximada de 2 a 4 ciclos logarítmicos para algunos patógenos,
dependiendo de la concentración, temperatura de aplicación y tiempo de contacto (Ransom
et al., 2003). El efecto de esto antimicrobianos no es permanente después del tratamiento,
principalmente porque estos compuestos son altamente reactivos en sus enlaces
insaturados, de este, modo se desprenden rápidamente del medio acuoso impidiendo la
acción contra las células bacterianas después de un tratamiento. Por otra parte el fosfato
trisódico en una sal alcalina puede liberar radicales hidroxilo que luego impedirán el
crecimiento de células tras el tratamiento (Pohlman et al., 2002). No es de sorprenderse que
combinando antimicrobianos se potencie el efecto ya que muchos antimicrobianos actúan
sinérgicamente.
31
Algunos antioxidantes sintéticos como hidroxianisol butirato e hidroxitolueno butirato
(BHA/BHT) y el ácido benzóico también se pueden utilizar como aditivos antimicrobianos
pero su uso está limitado en algunos alimentos lo cual presenta una desventaja.
3. 11. 5.
Antimicrobianos de origen natural
Se estima que hay de 250.000 a 500.000 especies de plantas en la Tierra, de los cuales más
o menos un 1 al 10 % son utilizadas en la alimentación de humanos y animales. Es posible
que un porcentaje más grande sea utilizado en medicina. Hipócrates (a finales del siglo v
A., C) mencionó la existencia de 300 a 400 especies de plantas medicinales. En el siglo
primero después de Cristo, Dioscorides, escribió De Materia Medica, un catalogo de
plantas medicinales qué se tomó como modelo para las farmacopeas que conocemos en la
actualidad. La Biblia ofrece una descripción de aproximadamente unas 30 plantas curativas;
como la mirra que gozó de estatus de planta milagrosa. Se reportó que tenía propiedades
antisépticas utilizándose también como enjuagues bucales (Cowan, 1999)
Los antimicrobianos naturales pueden definirse como una serie de sustancias químicas que
se encuentran repartidas de diversas formas en la naturaleza y que son capaces de inhibir el
crecimiento de los microorganismos que alteran alimentos actuando como bacteriostáticos e
incluso algunos antimicrobianos tienen acción bactericida (Delgado, 2005).
Muchos productos derivados de plantas (especias, preparaciones de frutas y vegetales) han
sido usadas desde hace siglos para la conservación y aumento de la vida útil de los
alimentos (Draughon, 2004). La mayor parte de la actividad antioxidante se atribuye a
varias preparaciones de frutas y vegetales que contienen compuestos fenólicos con grupos
hidroxil reactivos (ej. catequinas, ácido gálico, ácido colinérgico), ácido neocolinérgico y
otros compuestos como antocianinas, flavoniodes y carotenoides (Stacewicz-Sapuntzakis et
al., 2001). Estos compuestos son usados generalmente después de tratamientos
superficiales y son conocidos como ingredientes seguros. Muchos de estos antimicrobianos
pueden reducir de 1 a 2 ciclos logarítmicos, pero tienen que actuar sinérgicamente con
tratamientos térmicos o tratamientos químicos como adición de ácidos. Muchos de estos
antimicrobianos de origen natural proporcionan un efecto benéfico en la dieta humana.
32
La combinación de dos o más antimicrobianos en bajas dosis pueden tener un efecto
sinérgico reduciendo el número de patógenos manteniendo la calidad de los alimentos. Por
ejemplo, fuentes naturales de antioxidantes como extractos de especias tienen actividad
antimicrobiana y previenen la oxidación de lípidos por ejemplo en carnes. Sin embargo por
sí solo un antimicrobiano natural difícilmente actúa como bactericida y por lo general hay
que combinarlo con algún tratamiento como APH, pulsos eléctricos o temperaturas suaves.
En comparación con otros tratamientos más agresivos (ácidos orgánicos, tratamiento
térmico, tratamiento con vapor) el uso de antimicrobianos de origen natural tiene efecto
antimicrobiano y antioxidante, además de no alterar las propiedades organolépticas de los
alimentos.
Existen dos tipos de antimicrobianos naturales, las bacteriocinas y los aceites esenciales la
diferencia entre ambos radica en que las bacteriocinas son de origen bacteriano, mientras
que los aceites son de origen vegetal.
Las bacteriocinas son péptidos microbianos de reducido tamaño, con una actividad
antimicrobiana muy potente. Son resistentes al calor y son hidrolizadas por las proteasas
gástricas, lo que permite asegurar su inactivación por ingestión así como su posible
utilización como preservantes naturales de los alimentos. Se han aislado bacteriocinas de
muchos géneros, siendo la más importante la nisina, sintetizada por Lactococcus lactis. El
primer uso alimentario de la nisina lo hizo Hurst en queso suizo para inhibir el crecimiento
de Clostridium butyricum (Hurts, 1981). En 1998 la FDA (Food and Drug Administration)
reconoció la nisina como sustancia segura y muchos países, entre ellos España, permiten su
uso en alimentos en diferentes proporciones (Delgado, 2005)
3. 11. 5.
Polifenoles y su efecto antimicrobiano
El árbol de oliva Olea europea L, es uno de los árboles frutales más importantes en los
países del mediterráneo ya que las olivas de mesa son parte vital de la dieta mediterránea y
su consumo se extiende en casi todo el mundo. También son ampliamente conocidas sus
propiedades benéficas en la salud humana como por ejemplo la disminución de riesgos de
enfermedades cardiovasculares.
33
Existen tres tipos de las olivas de mesa o aceitunas, las verdes de Estilo español, aceitunas
negras maduras o Californian style, y aceitunas naturalmente negras. La producción de
aceitunas de mesa verdes incluye un tratamiento anterior con cloro. Después del lavado,
para eliminar el exceso de álcali, la fermentación de ácido láctico que ocurre
espontáneamente en la salmuera. El método de tratamiento de aceitunas negras maduras
incluye el almacenaje de la fruta en la salmuera (el 5-10 % NaCl) durante 2-6 meses, con
acidificación a pH 4 con ácidos lácticos y acéticos y almacenaje en condiciones anaerobias/
aeróbicas para prevenir la fermentación. Las aceitunas entonces son tratadas con la solución
diluida de NaOH y son oxidadas. Después del lavado, las aceitunas son colocadas en la
salmuera y se añade gluconato ferroso o lactato ferroso para mantener el color negro
(Pereira, 2007).
Las aceitunas de mesa son fuentes conocidas de compuestos con importancia biológica,
dichas propiedades están relacionadas con los ácidos grasos, especialmente con aquellos
monoinsaturados y otros componentes que se encuentran en menor proporción como
tocoferoles y compuestos fenólicos. Los polifenoles actúan como antioxidantes naturales,
son los principales metabolitos secundarios, representando aproximadamente el 2-2.5 % de
la pulpa (Pereira, 2007).
El contenido de compuestos fenólicos en la aceituna depende de varios factores, como las
condiciones de cultivo, el clima, los regímenes de irrigación, el grado de madurez de la
fruta, y el proceso de elaboración. En la figura 3. 1 se observan las diferentes estructuras
químicas de los principales compuestos fenólicos aislados de las aceitunas.
34
Figura 3. 1.
Estructuras químicas de compuestos fenólicos identificados en un
extracto acuoso procedente de residuos de la industria de las aceitunas. Fuente:
Pereira, 2007.
3. 11. 5. 1.
Propiedades del polvo de aceitunas como antimicrobiano
El polvo de aceitunas es un producto nuevo desarrollado por la multinacional farmacéutica
Natraceutical S.A. Es un extracto 100% natural de olivas, rico en nutrientes, fibra dietaria,
antioxidantes, polifenoles y se espera que ayude a mejorar la salud de los consumidores,
porque contiene también ácido oleico, escualeno, tocoferoles y pigmentos naturales
Investigaciones recientes señalan que el polvo de aceitunas como ingrediente alimentario,
tiene una nueva aplicación como antimicrobiano, este producto se ha utilizado
recientemente en España en la elaboración de productos de panadería y repostería. Existe
un alto riesgo de contaminación de panes y otros productos por hongos de los géneros
Aspergillus y Penicillium. Estos hongos generan defectos muy visibles en los panes, textura
más viscosa, cambios en el aroma y en el color. Por otra parte las materias primas de
35
panadería como la harina, la malta, la levadura en barra, los aditivos e incluso la maquinaria
y los utensilios se pueden contaminar por esporas termorresistentes de B. cereus y que
posteriormente pueden germinar durante el almacenamiento en el producto terminado. En
respuesta a este problema se buscan nuevos aditivos capaces de controlar esporas durante
periodos de almacenamiento del producto.
Actualmente se están estudiando muchos compuestos de olivas y sus derivados,
compuestos presentes en las olivas como los secoiriodoides (oleuropeina y derivados) son
la clase de polifenoles presentes en mayor proporción, el hidroxitirosol es un derivado
fenólico de la oleuropeina que ha sido estudiado en pruebas in Vitro contra bacterias Gram
positivas y Gram negativas mostrando una notable actividad antimicrobiana (Serra et al.,
2007).
La actividad in Vitro de ocho aldehídos alifáticos de cadena larga provenientes de olivas
mostraron actividad antimicrobiana contra cepas bacterianas frescas Adicionalmente
aldehídos α-β- insaturados mostraron tener un amplio espectro antimicrobiano contra
bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas (Bisignano et al., 2001). Otro estudio
reveló el potencial antimicrobiano de ocho compuestos fenólicos aislados de pasta de oliva,
contra E.coli, Klebsiella pnueumoniae, Bacillus cereus, Aspergillus flavus y Aspergillus
parasiticus, con resultados bastante promisorios. Los compuestos fenólicos incluían ácidos
p-hidroxibenzóico,
vainillínico,
cafeíco,
protocatequico,
siringico
y
p-cumárico;
oleuropeina y quercetina (Bisignano et al., 2001).
3. 12. FUNDAMENTOS Y DEFINICIONES DE LAS ALTAS PRESIONES
HIDROSTÁTICAS APH
Se entiende por Altas Presiones, a la tecnología que utiliza las presiones comprendidas
entre 100 y 1000 MPa junto con un liquido presurizante normalmente el medio utilizado
para transmitir a presión es el agua, así este tratamiento se le conoce como hidrostático.
Existen dos principios fundamentales en los que se basa la aplicación de las Altas Presiones
(Cheftel., 1991):
36
•
El primero indica que la presión se transmite de manera uniforme e
instantánea a través de todo el material biológico tratado, tratándose así de
un proceso isostático. Este proceso evita la presencia de zonas sobretratadas,
así como la deformación de producto y hace que este sea más homogéneo.
•
El segundo se refiere al principio de Le Chatelier que indica que los
fenómenos acompañados de una disminución de volumen (reacciones
químicas modificación de las configuraciones moleculares) son favorecidos
por un aumento de presión y viceversa. Según este principio la aplicación de
la alta presión desplaza el equilibrio de un proceso hacia el estado que ocupa
menos volumen. Por ejemplo en una macromolécula proteica donde hay
enlaces tipo puentes de hidrógeno, la aplicación de presión induce la ruptura
de interacciones hidrófobas y también pares de iones son acompañados de
una restricción de volumen favorecida por la presión (Cheftel., 1991), sin
embargo otros estudios suponen que los puentes de hidrógeno de las
proteínas son casi insensibles a la presión (Mozhaev, 1994).
Los efectos de la disociación iónica son favorecidos en general por el fenómeno de
electrostricción. Así la presión causa la separación de cargas eléctricas ya que el agua se
organiza de manera más compacta alrededor de las cargas iónicas y de los centros
polarizados de las moléculas, lo que causa una reducción del volumen total (Cheftel, 1991).
Se ha observado que los enlaces covalentes tiene baja compresibilidad y no se ven
afectados por presiones inferiores a 1000 – 2000 MPa (Hayasi, 1992; Tauscher, 1995). De
esta manera la estructura de las biomoléculas de bajo peso molecular (carbohidratos, lípidos
y proteínas) y la estructura primaria de las moléculas no se ve modificada (Heremans,
1995). Se ha reportado también que diferentes reacciones de Maillard (por ejemplo xilosalisina) son reducidas o inhibidas bajo presión. La alta presión también contribuye a la
disociación de grupos ácidos de las cadenas laterales de los aminoácidos y a la ruptura de
los puentes salinos intramoleculares (Heremans, 1995).
El comportamiento de las Altas Presiones sobre diferentes sistemas alimentarios demuestra
la utilidad de la aplicación de esta técnica en la conservación de alimentos, que además de
37
extender su vida útil, mantiene la textura, el sabor, las vitaminas y otros nutrientes naturales
en muchos productos.
Para conseguir la inactivación de microorganismos y enzimas se utilizan presiones que
varían entre 4000-9000atm. Con tiempos relativamente cortos (del orden de varios minutos)
y combinación de temperatura moderada (30-50ºC) sin afectar sensiblemente las
características sensoriales del producto. Las condiciones de procesado dependen
principalmente del alimento a tratar, la tecnología de APH es todavía ineficaz, sin la
combinación con temperatura alta, contra algunos microorganismos esporulados, ya que
estos presentan una alta tolerancia a las altas presiones (Barbosa et al., 1998; Mills et al.,
1998).
La efectividad de los tratamientos de APH sobre la inactivación microbiana depende de
variables del tratamiento (presión, tiempo, temperatura), de la composición del alimento y
de la naturaleza del microorganismo. Existen investigaciones que muestran la inactivación
microbiológica de los tratamientos de APH (Patterson, 2000). En general presiones entre
400 y 600 MPa producen importantes reducciones (4 unidades logarítmicas) de la mayoría
de los microorganismos de la forma vegetativa, mientras que las esporas pueden resistir
presiones superiores a los 1000 MPa. En general los microorganismos Gram negativos son
más sensibles a los tratamientos de APH, seguido de las levaduras y hongos, Gram
positivos y por último esporas. En productos vegetales de pH 4 es necesaria la combinación
de los tratamientos de APH con otras tecnologías de conservación como el calor suave
(Smelt, 1998; Patterson, 2000; Plaza et al., 2003). Aditivos como la nisina, la
lactoperoxidasa o lisozima (García, Graells et al., 1999, 2000; Cano et al., 2005)
En materia de APH hay estudios que datan del siglo XIX que tratamientos relativamente
cortos a presiones de 2 a 3000 bares son suficientes para reducir considerablemente el
número de microorganismos. Posteriormente un número de investigadores han centrado su
atención en formas vegetativas y latentes de los microorganismos, lo cual muestra que
evidentemente no es posible por ejemplo eliminar esporas a temperatura ambiente incluso
cuando se opera a Altas Presiones por encima de los 17000 bares. (Spilimbergo et al.,
2002)
38
La resistencia de las esporas bacterianas a agentes químicos y físicos y su habilidad para
estar en dormancia durante largos periodos de tiempo, representan un problema en la
industria alimentaria. El método más utilizado para la inactivación de esporas es el
tratamiento térmico, pero causa pérdida de nutrientes y modificaciones en el sabor de los
alimentos.
El principal objetivo de las tecnologías no térmicas es preservar los alimentos sin alterar sus
cualidades.
El tratamiento con Altas Presiones Hidrostáticas (APH) puede inactivar microorganismos a
temperatura ambiente o en combinación con bajas temperaturas en un tratamiento de
calentamiento suave manteniendo los nutrientes y las características organolépticas otra
ventaja sobre los tratamientos térmicos es que la presión empleada en el tratamiento es
independiente de la muestra, porque la presión actúa instantánea y uniformemente en los
alimentos; y mantiene la muestra bajo presión por un periodo extendido de tiempo sin
requerir energía adicional. (Mertens, 1992).
3. 12. 1.
Aspectos técnicos de las Altas Presiones Hidrostáticas
La tecnología de la alta presión es la aplicación de una presión uniforme en todo el
producto, y se aplica básicamente para presionar de forma isostática en principio se
utilizaba en la industria mineral y metalúrgica por ejemplo en la fabricación de cuarzo y
reactores químicos. Algunas reacciones químicas se llevan a cabo a alta presión para
aumentar el rendimiento de la reacción. Las cámaras de Alta Presión se utilizan también
como simuladores para probar equipos que se usan en un ambiente de Alta Presión; por
ejemplo, en el fondo del mar.
3. 12. 1. 1.
Generación de Alta Presión
Las cámaras son vasos de presión que pueden soportar las Altas Presiones se utilizan en la
industria del metal y la cerámica. Sin embargo, la industria alimentaría requiere equipos
que toleren presiones de más altas de 4000 atm con un ciclo más eficiente y duradero de
100.000 ciclos/año. La alta presión se puede generar del siguiente modo:
39
Compresión directa, que es generada por presurización de un medio con la parte final de un
pistón de diámetro pequeño. El diámetro de la parte final del pistón se mueve con una
bomba de baja presión este es método de compresión permite una compresión muy rápida,
pero las limitaciones del cierre dinámico de alta presión entre el pistón y la superficie
interna de la cámara restringe el uso de este método a escala de laboratorio o sistemas de
planta piloto la figura 3. 2 ilustra las partes que componen un sistema de compresión
directa.
Bomba de baja
presión
Pistón
Cámara de presión
Medio de presión
Cierre del fondo
Figura 3. 2. Compresión directa. Fuente: CURSO DOCTORADO: PROCESADO DE
ALIMENTOS POR CALOR Y NUEVAS TECNOLOGÍAS: ALTAS PRESIONES
HIDROSTÁTICAS. Universidad de Talavera, 2006
Compresión indirecta, que utiliza un intensificador de la Alta presión para bombear el
medio de presión desde un depósito hacia la cámara de presión cerrada hasta que alcanza la
presión deseada la figura 3. 3. muestra un esquema de la estructura de un sistema de
compresión indirecta. La mayoría de los sistemas industriales de presión isostática utiliza el
método de compresión directa.
40
Cierre superior
Medio de presión
Cierre inferior
Intensificador
Depósito del medio de
presión
Figura 3. 3. Compresión indirecta. Fuente: CURSO DOCTORADO: PROCESADO
DE
ALIMENTOS
POR
CALOR
Y
NUEVAS
TECNOLOGÍAS:
ALTAS
PRESIONES HIDROSTÁTICAS. Universidad de Talavera, 2006
Con respecto al aumento de temperatura durante un tratamiento a APH se puede decir que
el calentamiento del medio de presión, utiliza la expansión del medio de presión mediante
el aumento de temperatura para generar alta presión. Por tanto el calentamiento del medio
de presión se usa en combinación con alta temperatura; eso requiere un control muy
estrecho de la temperatura con el volumen interno entero de la cámara de presión (Rodrigo
2003).
Los sistemas de presión isostática pueden operar como sistemas fríos, templados y
calientes:
Presurización isostática fría (PIF), que es esencialmente una técnica antigua utilizadas en
las industrias del metal, cerámica, carbón, grafito y plástico. Los materiales en polvo se
colocan en un molde elastómero y sometido a alta presión. El proceso de PIF utiliza
configuraciones de bolsas húmedas y bolsas secas. En el método de bolsa húmeda el molde
se llena fuera de la cámara de alta presión.
41
Presurización isostática templada (PIT), la presión se aplica con temperaturas que van
desde la temperatura ambiente hasta 200ºC. PIT se usa en situaciones en las que una
reacción química tiene lugar durante la pasteurización.
Presurización isostática caliente (PIC), el material es uniformemente calentado y
presurizado. La temperatura puede llegar a los 2200ºC y la presión es de 1000- 4000 atm.
El medio de presión utilizado es un gas, como argón, nitrógeno, helio o aire (Barbosa,
1997)
3. 12. 1. 2.
Operación de una cámara de Alta Presión Hidrostática (APH)
Las muestras a tratar se colocan en un envase estéril con hielo y posteriormente es sellado y
se coloca en la cámara de presurización. Para el envasado de los alimentos en tratamientos
con APH se recomiendan películas de alcohol de polivinilo y películas de copolímero de
etilén–vinilo. Una vez que la cámara se haya cargado con el alimento envasado y se haya
cerrado, se llena con el medio de presión- transmisión. El fundamento para la aplicación de
la alta presión en alimentos, es la compresión del agua que rodea el alimento. A
temperatura ambiente, el volumen del agua decrece un 4 % a 1000 atm. Debido a la
compresión del líquido que provoca un pequeño cambio de volumen., las cámaras de alta
presión utilizan agua, ya que no presentan los peligros de operación de las cámaras que
utilizan gases comprimidos.
El alimento se coloca a presión durante un determinado periodo de tiempo. El tiempo de
tratamiento en la cámara de presión depende del tipo de alimento y de la temperatura del
proceso. Al final del tiempo de procesado se descomprime la cámara para sacar la carga
tratada. Se coloca una nueva carga de alimento en la cámara y se inicia de nuevo el ciclo.
Los retos de la ingeniería en la aplicación de APH en la industria alimentaría básicamente
son: la fabricación de las cámaras de presión para el manejo de grandes volúmenes de
alimentos y la resistencia a presiones elevadas. La cámara de presión debe tener un ciclo de
tiempo corto, ser fácil de limpiar y segura de operar. Desde el punto de vista industrial es
deseable el desarrollo de procesos continuos de pasteurización con costes de inmovilizado y
operación razonablemente bajos. La mayoría de estos retos se han cumplido, pero todavía
42
se llevan a cabo investigaciones para desarrollar tecnología de alta presión y el equipo
necesario.
3. 12. 2. Descripción general de un sistema de Alta Presión industrial
Un sistema industrial de alta presión consiste en una cámara cerrada, un sistema de
generación de presión, un dispositivo de control de la temperatura y un sistema de manejo
que puede ser automatizado o no.
La cámara de alta presión y su cierre: el corazón del sistema es la cámara de presión, la
cámara cilíndrica se construye en acero de baja aleación de resistencia a alta tracción.
Generación de la presión: una vez cargada y cerrada, la cámara se llena con el líquido
presurizante. Comúnmente en aplicaciones de presión isostática fría o tibia el medio
presurizante es simplemente agua mezclada con aceite soluble para lubricar y evitar la
corrosión. Alternativamente puede ser usado un aceite mineral de baja viscosidad. También
se puede utilizar agua destilada pero requiere que el equipo sea construido en acero
inoxidable en la cámara de presión, la tubería y los conductos de todo el sistema.
La alta presión hidrostática es generada mediante compresión directa, compresión indirecta
o a través del calentamiento del medio de presión. En el caso de compresión directa se hace
a través de un pistón, el medio de presión en la cámara de alta presión es presurizado
directamente mediante un pistón manejado por una bomba de baja presión.
Con respecto a como controlar la temperatura durante el tratamiento durante la fase de
carga y del medio de transmisión de presión dentro de la cámara de alta presión existen dos
métodos, uno, por calentamiento o enfriamiento de la cámara desde afuera o internamente
por una fuente de calor o enfriamiento ubicada dentro de la cámara, la manera más simple
de control externo de temperaturas se realiza mediante bandas eléctricas de transmisión de
calor que están alrededor de la cámara. Este método solo permite calentar el contenido de la
cámara por encima de la temperatura ambiente; cuando se requiere calentar o enfriar la
cámara puede tener una chaqueta con medio de calentamiento /enfriamiento en circulación.
43
La figura 3. 4 es una fotografía del equipo de Altas Presiones Hidrostáticas utilizado en
industria.
Figura 3. 4. Sistema de Altas Presiones Hidrostáticas a nivel industrial CURSO
DOCTORADO: PROCESADO DE ALIMENTOS POR CALOR Y NUEVAS
TECNOLOGÍAS:
ALTAS
PRESIONES
HIDROSTÁTICAS.
Universidad
de
Talavera, 2006
3. 13.
EFECTOS BIOLOGICOS DE LA ALTA PRESIÓN
La alta presión induce cambios en los sistemas biológicos, morfológicos, bioquímicos y
genéticos; así como cambios en la membrana y pared celular de los microorganismos. En
general las bacterias Gram negativas se inactivan a una presión menor que las Gram
positivas.
44
3. 13. 1.
Efecto sobre los microorganismos
Los primeros estudios sobre inactivación de microorganismos por efecto de la presión
fueron realizados en Francia por Certes en 1884 y en EUA por Hite en 1914 (Hoover,
1993).
Las altas presiones inducen cambios de tipo morfológico, bioquímico y genético que tiene
lugar en la membrana y en la parte celular de los microorganismos, además provocan
cambios en la reproducción de los microorganismos (Cheftel, 1999). Se han observado
varios cambios de la célula bajo el efecto de la presión como la compresión de las vacuolas
de gas, la elongación de la célula, la contracción con formación de poros y la modificación
del núcleo (Cheftel, 1992).
En cuanto al material genético este se ve afectado a nivel de las enzimas implicadas en la
replicación y la trascripción del ADN (Cheftel, 1992). Algunos sistemas enzimáticos son
inhibidos por la presión como es el caso de las deshidrogenasas en E.coli a 100 MPa y las
carboxilasas de las levaduras a 400MPa (Cheftel, 1992).
Según Cheftel (1992) la destrucción celular puede ser causada por la inhibición de la
ATPasa o por la cristalización de la membrana de fosfolípidos en cambios irreversibles en
la permeabilidad celular y el intercambio iónico.
En resumen los cambios que ocurren en la célula se pueden resumir así:
Inactivación microbiana: las altas presiones moderadas disminuyen la velocidad de
crecimiento y reproducción, las presiones muy elevadas provocan la inactivación de los
microorganismos. El umbral de presión para el retraso en la reproducción e inactivación
depende de cada microorganismo y especie.
Aunque las esporas son altamente resistentes a las altas presiones, estas pueden ser
germinadas bajo presión. Este proceso lleva a la aparición de células vegetativas que son
más sensibles a la presión y a otros métodos de inactivación (Earnshaw, 1996). Presiones
45
de 50 a 300 MPa son suficientes para inducir la germinación de las esporas (Wuytak et al,
1997). Los efectos en las esporas bacterianas se pueden resumir así:
Un aumento en la sensibilidad al calor y a la radiación, a la actividad respiratoria, a la
turbidez y coloración de la suspensión de esporas. Pérdida de la refractibilidad. Pérdida de
peso, liberación de calcio y ácido dipicolínico al medio circundante.
Con un tratamiento de APH, las esporas germinan en células vegetativas, entonces las
células vegetativas son inactivadas. A bajas temperaturas, una presión baja causa la
germinación y una sensibilidad al calor pero no se aprecia inactivación de las esporas
germinadas. Presiones medias causan una considerable germinación y gran producción de
esporas germinadas se inactivan. Presiones altas causan menor germinación y solo una
pequeña porción de las esporas germinadas se inactivan. Por encima de los 65 ºC, la
inactivación de esporas es debido al calor y no a la presión. Los intervalos de temperatura y
presión para la germinación e inactivación dependen de la clase de esporas. La pérdida de
resistencia el calor durante la germinación se asocia con el aumento de hidratación de las
células, y la transformación de sol a gel (Barbosa, 1997)
La inactivación de esporas por presión está fuertemente influenciada por la temperatura y
menos fuertemente por el pH, actividad del agua y fuerza iónica. La temperatura óptima
para la iniciación de la germinación de esporas difiere a diferentes presiones. La
inactivación de esporas es mayor cerca de la neutralidad y más pequeña a niveles extremos
de pH. Los solutos no iónicos a baja actividad del agua (a w) tienen un pequeño efecto en la
activación de esporas por presión, mientras que la presencia de solutos como NaCL y más
efectivamente CaCL2 disminuyen la inactivación. La mayoría de esporas no pueden
germinar por altas presiones en ausencia de iones inorgánicos. Los iones pueden afectar la
degradación catalizada por enzimas de peptidoglicano durante la germinación. La prioridad
efectiva de iones en la germinación inducida por presión es H> K > Mn> Ca, Mg, Na. Los
iones también causan un aumento de la pérdida de la resistencia al calor de esporas en
soluciones tampón con respecto a suspensiones en agua destilada a la misma presión y
temperatura (Raso y col. 1998)
46
La germinación iniciada por presiones bajas es afectada por los constituyentes del medio en
suspensión. Por ejemplo, los aminoácidos alanina e inosina ribosita son potenciadores
efectivos de la germinación por presión de esporas de B. cereus. Los potenciadotes e
inhibidores de la germinación se vuelven menos efectivos en la aceleración o prevención de
la germinación, respectivamente, a medida que la presión aumenta. Los inhibidores alcohol
octilo (10 mM) y cloruro de mercurio (1 mM y 10 mM) previene completamente la
germinación de B. cereus y B. coagulans a 400 y 600 atm, respectivamente, a medida que
la presión aumenta. El azúcar y la sal son entonces inhibidores de la inactivación de esporas
(Delgado, 2005).
3. 13. 2.
La Alta Presión Hidrostática y las reacciones bioquímicas
Las reacciones químicas que más deben afectarse por la alta presión son las reacciones con
reactantes que experimentan o bien un aumento o un descenso del volumen. La presión
provoca un descenso en el espacio molecular disponible, o un aumento en las interacciones
en cadena. La Alta Presión favorece las reacciones afectadas con formación de puentes de
hidrógeno debido a que los enlaces provocan un descenso en el volumen.
La alta presión desnaturaliza las moléculas de proteína. La desnaturalización de las
proteínas por la presión es un fenómeno complejo que depende de la estructura de la
proteína, del intervalo de presión, del pH y de la composición del disolvente
El principal interés de la aplicación de las APH en los alimentos se centra esencialmente en
introducir cambios positivos en ellos como la mejora de su conservación, textura y sabor
sin variar el valor nutricional del producto original. El tratamiento con Altas Presiones
Hidrostáticas se utiliza desde la década de los noventa en diferentes países y en distintos
productos tal como lo muestran las figuras 3. 5 y 3. 6 que muestran un resumen de la
evolución de las APH en el mercado mundial y los efectos de estas en diferentes alimentos
disponibles en el mercado.
La tecnología de la APH se puede aplicar para alargar la vida comercial de los alimentos y
modificar la textura y propiedades sensoriales de los alimentos y para el almacenamiento de
alimentos sin necesidad de congelación. La vida comercial de los alimentos se aumenta por
inactivación de los microorganismos esporas y enzimas indeseables, utilizando las
47
presiones apropiadas. Es deseable descongelar los alimentos congelados de modo uniforme.
La Alta Presión Hidrostática puede descongelar uniformemente los alimentos. La
descongelación con presión es más rápida cuando los alimentos contienen más sólidos,
tales como NaCL o azúcares.
Al exponer los alimentos a alta presión se producen cambios sensoriales dependiendo del
tipo de alimento. Por ejemplo, la estructura interna de los tomates se vuelve más firme, los
tejidos de pollo y filetes de pescado se vuelven opacos y la ternera se ablanda.
La alteración de la estructura del almidón y la proteína por alta presión se puede utilizar
para que el arroz se pueda cocinar en pocos minutos.
Bajo la influencia de la alta presión, los enlaces covalentes permanecen intactos, mientras
que los no covalentes se rompen. El tratamiento de presión aumenta la digestibilidad de las
proteínas cárnicas. El valor aparente biológico de las proteínas y la razón de eficacia
proteica de la carne tratada con presión son equivalentes a las proteínas cárnicas ablandadas
a presión atmosférica. Generalmente las enzimas de las hortalizas se inactivan mediante
escaldado con agua caliente. Las desventajas del escaldado incluyen el deterioro térmico,
extracción de nutrientes y la posible contaminación medioambiental debido a la producción
de efluentes con alta demanda bioquímica de oxígeno. El escaldado con agua reduce los
recuentos totales de microorganismos en 3 ciclos, mientras que la reducción de recuentos
totales por Ultra Alta Presión (UHP) es generalmente de 4 ciclos logarítmicos (Universidad
de Talavera, 2006)
País
producto
Proceso
envasado
Vida útil
Interés de las APH
(año)
Japón
1990
Mermeladas (fresa, Indirecto 400 Vidrio
con 2 a 3 meses a Higiniezación, mejora
manzana)
MPa
10–30 cubierta plástica
4ºC
del
proceso
de
minutos
gelificación
Salsas
(naranja,
cebolla y manzana)
48
Japón 2000
Arroz
precocido 400 MPa
hipoalergénico
Italia
Postres de fruta
Envases
Indireto
600MPa
3-5 triangulares
minutos a 17ºC plástico
2001
USA
Conservado a Desnaturalización por
Tº ambiente
APH de proteínas
hipoalergénicas
seguido
de
una
esterilización térmica
1 a 2 meses
de
Productos derivados Indirecto
del aguacate
Inactivación
enzimática
PPO
higienización,
mantenimiento de las
propiedades
sensoriales, sustitución
del tratamiento térmico
Ensalada
vegetales
Inactivación
enzimática
PPO
higienización,
mantenimiento de las
propiedades
sensoriales, sustitución
del
tratamiento
térmico, incremento de
vida útil
2002
USA
Inactivación
enzimática PPO ,
higienización,
mantenimiento de las
propiedades
sensoriales
de Indirecto
2003
Canadá
2003
Cebollas loncheadas Indirecto
USA 2004
Productos de soja,
tofú
España
2005
Platos preparados 500 MPa
de verduras “listos
para consumir”
Bolsas
(225g)
plásticas 45 días
Eliminación del sabor
amargo, aumento de la
frescura
y
alargamiento de vida
útil
Higienización,
aumento de vida útil
Envasados
al
vacío Skin pack
Higienización,
aumento de vida útil
Figura 3. 5. Productos hechos en base a frutas y verduras en el mercado tratados con APH. Fuente:
CURSO
DOCTORADO:
PROCESADO
DE
ALIMENTOS
POR
CALOR
Y
NUEVAS
TECNOLOGÍAS: ALTAS PRESIONES HIDROSTÁTICAS. Universidad de Talavera, 2006
49
País
producto
Proceso
envasado
Vida útil
Interés de las APH
(año)
Botellas de vidrio 6 a 12 meses a Inactivación
300 ml
4ºC
levaduras
mantenimiento
sabor original
400 MPa 15
producto
minutos 30ºC
Japón
Sake (licor de arroz) Indirecto
(bolsas PE)
1993
Francia
1994
Zumos de cítricos
Botellas de PE de 18 días a 4ºC
75 cl y 1L
Indirecto
400 MPa 1
minuto
Tº
ambiente
Líbano
sin
sus
Indirecto
MPa
500 Botellas
de
plástico 0,25, 0,5,
1 y 2L
Higienización
alteración
de
propiedades
sensoriales
sin
sus
Zumos de citricos
Indirecto
MPa
500 Botellas
plástico
Higienización
alteración
de
propiedades
sensoriales
sin
sus
de 2 o 3 veces del Higienización
zumo normal
alteración
de
propiedades
sensoriales
sin
sus
de
2000
USA
Higienización
alteración
de
propiedades
sensoriales
Zumos de frutas
2001
México
de
,
del
del
Zumo de manzana Directo
y Botellas
orgánico
semicontinuo
plástico
2001
Portugal
2001
Zumo de manzana y Indirecto 450 Bolsas
cítricos
MPa 20 a 90 (225g)
segundos
a
12ºC
Italia 2001
Zumos de frutas: Indirecto 600 Bolsas plásticas
manzana, cítricos y MPa
3-5
zanahoria
minutos 17ºC
República
Zumo de brócoli y Indirecto
Checa 2004 manzana
MPa
minutos
plásticas 28 días
600 PET botellas
10
Higienización
alteración
de
propiedades
sensoriales
sin
sus
1 a 2 meses
Higienización,
aumento de vida útil
21 días
Higienización
sin
alteración
de
sus
propiedades
sensoriales.
Anticarcinógenos
Figura 3. 6. Zumos en el mercado tratados con APH. Fuente: CURSO DOCTORADO: PROCESADO
DE
ALIMENTOS
POR
CALOR
Y
NUEVAS
TECNOLOGÍAS:
ALTAS
PRESIONES
HIDROSTÁTICAS. Universidad de Talavera, 2006
50
3. 13. 3.
Efecto de las Altas Presiones sobre los alimentos
3. 13. 3. 1 Agua
La presión modifica muchas propiedades del agua. El volumen de agua disminuye a un 4%
con 100 MPa y un 15% a 600 MPa a una temperatura de 22 ºC (Cheftel, 1992). Esta
disminución de volumen implica un aumento en la densidad y como consecuencia, los
coeficientes de difusión de los solutos disminuyen. La compresión adiabática del agua
causa un aumento de 2 a 3ºC por cada 100 MPa, aumento que depende de la temperatura
inicial del agua y de la velocidad de compresión. Este cambio es reversible cuando se
realiza la descompresión ya que se produce una disminución de la temperatura de la misma
magnitud (Cheftel y Culioli, 1997). El punto de fusión del agua disminuye con la presión,
de –5ºC a 70 MPa y –20ºC a 200 MPa. El pH del agua disminuye bajo presión de 7 a 6.27
cuando la presión aumenta de 0.1 MPa a 1000 MPa.
3. 13. 3 2. .
Lípidos
La temperatura de fusión de los lípidos en especial de los triglicéridos, aumenta con la
presión de manera reversible en más de 10 ºC por cada 100 MPa. Por esta razón los lípidos
en estado líquido a temperatura ambiente pueden cristalizar bajo presión. La presión induce
la formación de cristales densos y más estables que tiene un nivel de baja energía y alta
temperatura de fusión. Esto puede explicar algunas de las causas de la destrucción de
microorganismos por la presión debido a los cambios en los fosfolípidos de la membrana
celular (Cheftel, 1995). El aumento de presión puede producir un aumento en la oxidación
de lípidos insaturados del alimento. Se ha observado que el tratamiento de Alta Presión en
alimentos con alto contenido proteico produce un aumento en la oxidación lipídica. Se cree
que el aumento de oxidación esta relacionado con la desnaturalización de las proteínas
causadas por la presión así en algunos casos libera iones metálicos que pueden catalizar la
oxidación lipídica (Beltran et al., 2003).
51
3. 13. 3. 4.
Carbohidratos
Cheftel, 1992 asegura que los azúcares simples no resultan afectados por este tratamiento.
Las reacciones de Maillard son inhibidas por la aplicación de Alta presión entre 50 y 200
MPa (Sangonis et al., 1997). En consecuencia el color y sabor típicos de esta reacción no se
producen. La alta presión afecta el paso de sol a gel de los polisacáridos formándose geles
diferentes a los que se forman por calor.
3. 13. 3 .4.
Proteínas
Las modificaciones de las proteínas se deben a modificaciones a nivel inter e
intramolecular entre grupos funcionales de los aminoácidos. Resultan efectos como el
aumento de las interacciones hidrofóbicas a presiones de 300 a 400 MPa, debido a la alta
compresibilidad del agua libre comparada con la de los puentes de hidrógeno. Por otra parte
los grupos sulfíhidrilo pueden oxidarse dando lugar a puentes disulfuro en presencia de
oxígeno (Funtenberger et al., 1995), aunque en muchos casos este tipo de enlace son los
responsables de mantener la estructura de algunos tipos de proteínas debido a su gran
estabilidad frente a la presión. En general la aplicación de presiones superiores a 100-200
MPa a temperatura ambiente provocan la disociación de macroestructuras en subunidades,
así como el despliegue y desnaturalización de estructuras monómericas, probablemente
debido al debilitamiento de las interacciones hidrofóbicas y la separación de los puentes
salinos intermoleculares e intramoleculares (Cheftel, 1992). La desnaturalización inducida
por la presión es a veces reversible, pero la renaturalización puede ocurrir después de que
se haya liberado la presión. Los efectos de la alta presión en la estabilidad proteica están
gobernados por el principio de Le Chatelier: los cambios positivo/negativos en el volumen
con un aumento en la presión provocan un desplazamiento del equilibrio hacia la
rotura/formación de enlaces. Aplicación de las altas presiones hidrostáticas en el procesado
de alimentos.
3. 13. 3. 5.
Enzimas
La alta presión induce cambios en la velocidad de las reacciones que catalizan las enzimas
así como cambios estructurales. La función enzimática puede verse afectada de diferentes
52
maneras; la inactivación puede ser parcial o total dependiendo del tipo de enzima, del nivel
de presión, del tiempo y la temperatura o el pH del medio. Se ha sugerido que la eficiencia
de la alta presión en la inactivación de enzimas se puede aumentar mediante la aplicación
de ciclos de presión. Se trata de aplicaciones sucesivas de altas presiones produciendo una
mayor inactivación enzimática y una menor actividad residual que la obtenida después de
un proceso de presión continuo durante el mismo tiempo total del tratamiento (Basak et al.,,
2001). El trabajo realizado por Seyderhelm et al., 1996 sobre el efecto de la alta presión
sobre algunas enzimas en tampón fosfato, observaron que la sensibilidad a la presión en
orden ascendente fue: lipoxigeneas, lactoperoxidasa, pectiesterasa, lipasa, fosfatas, catalasa,
polifenoloxidasa y peroxidasa. El aumento en la temperatura indujo una mayor inactivación
de estas enzimas. La alta presión podría afectar la interacción sustrato enzima, sí el sustrato
es una macromolécula la alta presión podría modificar la conformación de la
macromolécula o la disociación en subunidades afectando su actividad (Balny y Masson,
1993).
3. 13. 3. 6.
Vitaminas
El efecto de las altas presiones sobre la estabilidad de las vitaminas ha sido uno de los
estudios que más interés ha suscitado entre los diferentes autores que evalúan este proceso
en comparación a los tratamientos térmicos (Mertens, 1993; Kübel et al., 1997 y Taukis et
al., 1998). En una investigación desarrollada por Sancho et al., 1999 sobre el efecto de la
alta presión en vitaminas hidrosolubles B1, B6 y C diluidas en tampón fosfato a pH 6.67
mostraron que los tratamientos a 200, 400 y 600 MPa durante 30 minutos a 20ºC no
tuvieron ningún efecto significativo sobre las vitaminas B1 y B6, mientras que la vitamina
C fue afectada y mostró un 87.8% y 88.6% de retención después del tratamiento de 200 y
600MPa, respectivamente. En otro estudio sobre el efecto de las altas presiones sobre la
vitamina C en jugo de frutas ácidas se observó una ligera degradación de esta vitamina
después de un tratamiento a 600 MPa a 40ºC durante 40 minutos la cual fue del orden del
15 al 26% (Taukis et al., 1998).
53
3. 13. 4. Aplicaciones en jugos de frutas y/o vegetales
Gran número de investigaciones muestran que es posible estabilizar productos ácidos como
jugos de frutas y derivados del tomate a partir de 300 MPa a temperatura ambiente
(Castellari et al., 2000).
Las bebidas de vegetales tradicionales en países mediterráneos como España se demoninan
“Gazpachos” y son una especie de sopas que se sirven frías. Tienen como ingredientes gran
variedad de hortalizas, que contienen gran número de vitaminas, compuestos antioxidantes,
son fuente de fibra vegetal o dietética soluble que se encuentra principalmente en los
vegetales e incluye también gomas, pectinas, mucílagos, algunos tipos de hemicelulosa y
carbohidratos de reserva (Bellaterra, 2004). Los gazpachos poseen un alto contenido en
minerales y glúcidos así como una serie de sustancias de interés fisiológico como los
compuestos fenólicos presentes en hortalizas que en muchos casos contribuyen al sabor y
color que estos poseen. Los compuestos fenólicos presentes en las plantas poseen acciones
farmacológicas y antioxidantes tal como se demuestra al inhibir en ensayos in Vitro la
peroxidación de los lípidos y lipoxigenasas (Bellaterra, 2004)
3. 14. MODELOS CINÉTICOS DE INACTIVACIÓN Y CRECIMIENTO
MICROBIANO.
Habitualmente, para el estudio de la resistencia microbiana a distintos agentes letales se
utilizan las denominadas curvas de supervivencia en las que se representa el logaritmo
decimal del número de supervivientes frente al tiempo de tratamiento. Estas gráficas se
suelen describir mediante distintos modelos matemáticos a partir de los cuales se obtienen
diferentes parámetros que permiten cuantificar y predecir la resistencia bacteriana.
La obtención de modelos y parámetros cinéticos son básicos para el desarrollo de nuevos
procesos de conservación de alimentos. Su aplicación directa en la industria se aprovecha
para optimizar procesos y mejorar la seguridad microbiológica de los alimentos, así como
para implementar planes de análisis de peligros y puntos de control críticos (APPCC)
54
también permite realizar estimaciones cuantitativas, considerando la acción simultánea de
diversos factores limitantes extrínsecos e intrínsecos; lo cual implica una gran ventaja, en
tiempo y costo, comparado a los métodos utilizados tradicionalmente en microbiología de
alimentos
Las técnicas de modelación matemática están siendo gradualmente aceptadas y reconocidas
para estimar la vida útil y seguridad en muchos productos alimentarios. El desarrollo
Muchos modelos de crecimiento para patógenos han sido reportados en la literatura desde
la pasada década e incluyen modelos para Aeromonas hydrophila, Clostridium botulinum,
Listeria monocytogenes, Salmonella spp, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus y
Yersinia enterocolitica. No obstante no existen muchos informes para bacterias
esporoformadoras (Meng y Schaffner, 1997).
El conjunto de estos modelos y simulaciones en microbiología creció al punto de ser
reconocida como una disciplina de la microbiología de alimentos, denominada
“microbiología predictiva”, concepto introducido por McMeekin et al., 1993.
3. 14. 1.
Modelos matemáticos de inactivación
Una gran parte de las investigaciones en inactivación microbiana se refieren a tratamiento
térmico y varios autores como Vijay & Eblen (1999), desarrollaron modelos matemáticos
que describen el efecto del pH y la temperatura en tratamientos térmicos, tomando como
parámetros D que es el tiempo de reducción decimal definido como el tiempo requerido
para reducir un ciclo logarítmico la concentración de microorganismos sumiendo una
relación lineal y logarítmica entre el número de microorganismos sobrevivientes y el
tiempo, después de un tratamiento térmico. Sin embargo no siempre se puede asumir esta
relación lineal por la presencia de colas y hombros en la curva de sobrevivientes. Por lo
tanto se pueden utilizar modelos matemáticos de distribución probabilística (Fernández,
2002)
3. 14. 1. 1. Modelo de Bigelow
Los modelos cinéticos clásicos asumen una relación de primer orden entre la población
microbiana y la intensidad de tratamiento. El modelo desarrollado por Bigelow, Ball y
55
Stumbo (Stumbo, 1973) (Ecuación 1) se ha usado principalmente para explicar las curvas
de supervivencia debidas al tratamiento térmico:
Log S =
−
t
D
Ecuación 1
donde S es la fracción de supervivientes calculada como la fracción entre el número de
microorganismos vivos tras un tratamiento especifico y el numero inicial de
microorganismos; D es el tiempo de reducción decimal definido como el tiempo requerido
para reducir un ciclo logarítmico la concentración de microorganismos (figura 7) y t es el
tiempo de tratamiento (en segundos). El valor de D o tiempo de reducción decimal se
calcula a partir de la pendiente de la recta.
Figura 3. 7. Ejemplo de curva de supervivencia de esporas de B. stearothermophilus a
temperatura constante (115 ºC).
3. 14. 1. 2.
Modelo de Weibull
La distribución de Weibull se ha aplicado en la industria mecánica para inquirir el tiempo
de fallo de un determinado componente. Este modelo consiste en una distribución de
frecuencias que considera al microorganismo como una población, donde cada individuo
56
tiene una resistencia al tratamiento, por lo tanto las curvas de inactivación representan la
distribución de la resistencia del conjunto de la población al tratamiento. Bajo esta
perspectiva es más fácil explicar que no exista una relación lineal entre el tiempo de
tratamiento y la muerte del microorganismo. Aparte de su sencillez, puede interpretar
curvas con hombros y colas, y líneas rectas.

S ( t ) = exp −


n
 t  
  
 a 
Ecuación 2
Donde S es la fracción de supervivientes, t es el tiempo de tratamiento expresado en µs, a
es el parámetro de escala expresado en µs relacionado con la intensidad del tratamiento y n
es el parámetro de forma, cuyo valor depende de la forma de la curva de supervivencia.
Cuando el valor de n<1 las curvas de supervivencia presentan colas, es decir, la fracción
residual de células que quedan por inactivar tienen menos probabilidades de morir, son las
mas resistentes o las que mejor se han adaptado al estrés producido por los tratamientos.
Cuando el valor de n>1, las curvas de supervivencia presentan hombros indicando que
durante las primeras condiciones del tratamiento las células son resistentes al tratamiento y
conforme aumentamos la intensidad del tratamiento se produce un aumento de la
inactivación. En el caso que el valor de n sea igual a 1 la probabilidad que el
microorganismo muera no depende del tiempo de tratamiento, en otras palabras, cada célula
es igual de sensible al tratamiento sin importar lo que dure el mismo.
Otro de los parámetros utilizados en el modelo de Weibull es el tiempo crítico que se puede
definir como el tiempo donde se produce la mayor muerte del microorganismo tras el
tratamiento y se puede expresar con la siguiente ecuación:
tcw = a * Γ (1 + b − 1 )
Ecuación 3
Donde a y b son los parámetros de la ecuación 1.3 y Γ es la función gamma.
57
3. 14. 2.
Modelos matemáticos de crecimiento
3. 14. 2. 1.
Modelo de Baranyi
El modelo de Baranyi fue desarrollado originalmente para curvas de crecimiento
microbiano (Baranyi et al.1993; Baranyi et al. 1994), sin embargo Xiong et al. 1999
adaptaron el modelo a las curvas de supervivencia, obteniendo la siguiente ecuación:
log
N
= log(q B + (1 − q B )e − k max ( t − B ( t )) )
N0
Ecuación 4
Siendo,
B (t ) =
(r + t ) 2
r 1
( ln 2
+
3 2 r − rt + t 2
3 arctan
2t − r
r 3
+
3 arctan
1
)
3 Ecuación 5
Este modelo se adapta bien a curvas de supervivencia sigmoidales, donde qB puede ser
usado como indicador de la existencia de colas en las curvas de supervivencia. El
parámetro kmax es el índice de muerte máximo y puede ser considerado como una constante
en la fase lineal de la curva de supervivencia. B(t) es una función que explica la fase lag
(hombro) de la curva y viene definida por el parámetro r.
Este modelo también se adapta a curvas de supervivencia no sigmoidales. En caso de la no
existencia de colas en las curvas (qB=0), la Ecuación 1.5 se transformaría en:
log(
N
t − B (t )
)= −
N0
Dmin
Ecuación 6
Donde Dmin=2.303/kmax., siendo Dmin el tiempo de reducción decimal. Como kmax se puede
considerar como una aproximación del índice de muerte para la fase lineal de la curva, Dmin
se define como el tiempo mínimo requerido para disminuir un ciclo logarítmico la
población de microorganismos a una temperatura de referencia. En caso de no presentar la
58
curva fase de latencia, entonces el modelo se puede simplificar a un modelo cinético lineal
de primer orden:
log(
N
t
)= −
N0
D
Ecuación 7
Donde D es el tiempo de reducción decimal. Definido como el tiempo requerido para
reducir un ciclo logarítmico la concentración de microorganismos.
3. 14. 2. 2.
Modelo de Gompertz
El modelado matemático es realizado, generalmente, asumiendo condiciones constantes
para determinar los valores de los parámetros cinéticos de crecimiento. Sin embargo,
condiciones tales como temperatura, pH o composición de la atmósfera gaseosa no se
mantienen constantes durante el almacenamiento refrigerado de los alimento. Debido a este
hecho, en la actualidad el modelado matemático está orientado a la obtención de modelos
dinámicos, es decir, modelos que permitan predecir la seguridad o vida útil de los alimentos
bajo condiciones fluctuantes. En microbiología predictiva se distinguen tres niveles entre
los modelos matemáticos: los modelos de nivel primario describen los cambios en el
número de microorganismos en el tiempo; los de nivel secundario brindan datos acerca del
efecto de las condiciones ambientales y los modelos de nivel terciario combinan los dos
primeros (Whitin, 1995)
Modelo de Gompertz: es considerado como un modelo primario esta definido por la
siguiente ecuación
log(Nt) = Log(N0) + C . e -e[-B(t-M)]
Ecuación 8
Donde: t es el tiempo en horas, Nt y N0 son la densidad de población expresada como UFC/
ml, a tiempo final e inicial respectivamente, C es el logaritmo de la población que cambia
desde la inecuación hasta la fase estacionaria, B es la tasa de crecimiento relativo la cual es
adimensional, M es el tiempo en horas en el cual se alcanza la máxima tasa de crecimiento.
59
Las ecuaciones de cinética de crecimiento en este modelos se pueden determinar mediante
dos parámetros la µ (velocidad específica de crecimiento) y λ (factor de latencia).
60
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4. 1. Esporulación del microorganismo
Para inducir la esporulación de B cereus se tomaron dos matraces de 50ml que contendrán
20ml de caldo nutritivo para inocular con colonias de B cereus. Se incubaron en un baño
termostatado a 32ºC con agitación durante 24 horas al cabo de las cuales se observarán
colonias características de B. cereus. (Barbosa y col., 1998)
La cepa de B cereus utilizada fue la ATCC 14579 proveniente de la Colección Española de
Cultivos Tipo. La esporas se obtuvieron usando el medio de esporulación descrito por
Mazas y col (1995), ligeramente modificado en su composición: Caldo nutritivo(g/L) de
acuerdo con la British Pharmacopoeia (Scharlau Chemie), 13 g: agar bacteriológico
(Scharlau Chemie) 0.05g; CaCl2 (Panreac, Montplet and Esteban) 0.06 g; glucosa (Panreac,
Monplet and Esteban) 0.1 g; (NH4)2S (Merck) 0.08 g; MnCl2 4H2O (Merck) 0.008 g;
CuSO45H2O (Panreac, Montplet & Esteban) 0.005 g y ZnSO47H2O (Panreac, Montplet &
Esteban) 0.005g y se distribuirá en frascos Roux esterilizándose durante 20 minutos a
121ºC.
Se utilizaron aproximadamente 20 frascos Roux con 0,5 ml del cultivo de células
vegetativas de B cereus. La suspensión de microorganismos se extenderá con un asa de
vidrio estéril. Posteriormente los frascos Roux se incubaran en una estufa a 30 ºC durante
24 horas (Delgado, 2005).
A partir de las 48 horas se realizaron tinciones diarias para controlar la esporulación.
Cuando la tasa de esporulación sea aproximadamente del 90% se procedió a recoger las
esporas. Para ello la superficie de agar se lavó con una mínima cantidad de agua estéril y se
rasparon cuidadosamente con un asa estéril. El agua con las esporas se depositó en frascos
de centrifuga de 250 ml esterilizados, centrifugándose posteriormente en una centrifuga
Beckman J2-21 a 2500 g durante 15 minutos a una temperatura de 5 ºC, se eliminó el
sobrenadante, se resuspendío el sedimento en agua destilada y se volverá a centrifugar en
las mismas condiciones (Larsen, 1999)
61
Las esporas limpias se almacenaron a 4 ºC en agua destilada estéril hasta su uso. Con este
procedimiento se alcanzó una concentración de 10 8 esporas por ml. (Delgado, 2005)
4. 2. Recuento de Bacillus cereus
Para determinar el número de microorganismos sobrevivientes se hicieron diluciones
seriadas, se sembró en agar BHI (profundidad) 100 µl de las diluciones 10-3 hasta 10-7 las
siembras se hicieron cada 24 horas, se incubaron a 32 ºC y todos los ensayos fueron
realizados por duplicado, teniendo en cuanta solo los recuentos que se encontraran en el
rango del microorganismo (30-300 UFC/ml). La misma técnica fue utilizada en todos los
ensayos de este estudio. Figura 4.1
Figura 4.1 Dilución y siembra de las muestras tratadas (IATA., 2006)
4. 3. Ingrediente utilizado como antimicrobiano
Se utilizará un ingrediente comercial a base de polvo de aceitunas denominado Olive
Powder comercializado por la multinacional Natraceutical S.A., España. Este aditivo fue
almacenado se mantuvo almacenado a temperatura ambiente a lo largo del estudio.
62
4. 4. Preparación del medio de referencia:
Como medio de cultivo de referencia se utilizará BHIB (caldo de infusión cerebro corazón).
Se prepararon frascos con un contenido de 30 ml de caldo BHIB (1.1 g x 30ml de agua)
para los controles del experimento. Frascos con 30 ml de caldo BHI a los que se les
agregarán diferentes concentraciones de polvo de aceituna: 1,5% (0.45 g/30ml de caldo
BHIB), 2.5% (0,75 g/30ml de caldo BHI), 5% (1,5 g/30ml de caldo BHI) y 10% (3g/30ml
de caldo BHI).
4. 5.
Efecto del polvo de aceitunas sobre el crecimiento de B cereus en función del
tiempo en medio de referencia
Se estudió el comportamiento de las esporas de B cereus en medio de referencia (caldo
BHI) en presencia de diferentes concentraciones de polvo de aceitunas 0, 1,5, 2,5 y 5%. Se
evaluó
el crecimiento
del microorganismo
a tres
temperaturas
diferentes
de
almacenamiento 7, 20 y 32 ºC. La temperatura de 7 ºC se utilizó como temperatura
promedio de refrigeración para observa la influencia del polvo de aceitunas sobre las
esporas de B cereus. La temperatura de 20 ºC fue una manera de simular una interrupción
en un sistema de almacenamiento en refrigeración y 32 ºC es una temperatura muy cercana
a la temperatura óptima de crecimiento de B cereus. El crecimiento del microorganismo en
estas condiciones se siguió en el tiempo hasta 30 horas, tomándose muestras en los
intervalos de tiempo 0, 1, 2, 3, 6, 10, 24, 27 y 30 horas, el recuento de Bacillus cereus se
realizo según la metodología descrita anteriormente.
4. 6.
Preparación de la bebida vegetal
Para preparar la bebida de vegetales se utilizaron 2 kilogramos de zanahorias frescas y 2
kilogramos de judías verdes frescas embolsadas adquiridas en un mercado local. Se lavaron
y picaron por separado, posteriormente se escaldaron a 90ºC durante tres minutos. El
proceso de escaldado tuvo como propósito inactivar enzimas y eliminar la flora
acompañante natural que esta presente en los vegetales. Tras el escaldado se pasaron por un
triturador de alimentos (Moulinex, Barcelona, España) tres veces con el fin de extraer la
mayor cantidad de zumo en volumen. La bebida obtenida se pasó por tres veces por un
63
tamiz. Finalmente se mezclo el zumo de judías verdes y el de zanahoria en una proporción
50:50 sin agregar agua. Se midió pH inicial. La bebida mezcla de vegetales resultantes se
distribuyó en tubos Falcon de 50ml que pasaron a congelación a 4º C para posteriores
ensayos.
4. 7. Efecto del polvo de aceitunas en el crecimiento de Bacillus cereus en sustrato
vegetal
Se estudió el efecto del polvo de aceitunas a distintas concentraciones (0, 1.5 y 2,5%) en el
sustrato vegetal sobre el crecimiento de B. cereus,
se evaluaron solamente dos
temperaturas de almacenamiento 20 y 32 ºC. Se utilizaron controles negativos con bebida y
sin ingrediente (polvo de aceitunas) se utilizaron frascos de 50 ml con perlas de vidrio (dos
por cada concentración de polvo de aceitunas se colocaron 2 ml de bebida de vegetales para
los controles y 2ml más con polvo de olivas), se inocularon con 10µl de la suspensión de
esporas refrigerada directamente a los frascos 10 µl de suspensión de esporas previamente
agitada, se procederá a agitar durante dos minutos y se tomarán 100µl que fueron
transferidos a viales con 900 µl de agua peptonada y se realizarán diluciones seriadas con
un factor de dilución de 1:10 (de 10 -2 a 10-7), se sembrarán las diluciones de 10-3 hasta 10-7.
El crecimiento del microorganismo se siguió en el tiempo hasta las 72 horas y se tomaron
muestras en las horas 0, 6, 24, 30, 48, 55 y 72. Para la realización de los recuentos se siguió
la metodología descrita previamente.
4. 8. Preparación de los viales para el tratamiento a Altas Presiones Hidrostáticas
Previo a cada experiencia, la bebida mezcla de vegetales fue descongelada e
inmediatamente esterilizada a 121 ºC por 21 minutos, permitiendo climatizarse a
temperatura ambiente. Treinta minutos antes de los tratamientos con APH, las suspensiones
de esporas fueron sacadas del refrigerador y se agitaron durante dos minutos. Se tomaron
dos viales (tubos Ependorf de 2ml) para cada tratamiento y control, así: dos viales para
tratamiento a altas presiones APH con caldo BHI sin polvo de aceitunas, dos para
tratamiento a APH con caldo BHI y polvo de aceitunas (2 por cada concentración), dos
viales de control con caldo BHI sin polvo de aceitunas y dos más con BHI. Se utilizarán
tubos capilares de vidrio 10 µl para inocular en los eppendorf con 10 µl de la suspensión de
64
esporas refrigeradas a los eppendorf que contenían los 10 µl de esporas de B. cereus se les
adicionaron 1.8 µl de caldo BHI en el caso de los controles y 1.8 µl de caldo BHI con polvo
de aceitunas en el resto de los eppendorf. Una vez preparados los viales se colocaron en
bolsas de polieteileno llenas de agua y se termosellaron (Thermosealer MULTIVAC) antes
de ser introducidas al equipo de APH.
4. 9. Tratamiento a Altas Presiones Hidrostáticas APH
La unidad de Altas presiones hidrostáticas utilizada para este estudio fue High Pressure
Food Processor EPSI NV, Walgoedstraat 19, Temse, Belgium (figura 4. 2) Este equipo
alcanza presiones nominales de hasta 680 MPa con 2,35 litros de capacidad. La vasija
contenedora de la presión hidrostática (diámetro interno de 100 mm y altura de 300 mm)
está rodeada de una doble cámara por la que fluye el líquido refrigerante y que la mantiene
a la temperatura de trabajo deseada, para este estudio la temperatura de tratamiento en
todos los ensayos fue de 20 ºC (baño termostatado externo). El líquido de presurización es
una mezcla de agua y glicol. El nivel de presión, el tiempo de presurización y la
temperatura son controlados automáticamente. La velocidad del incremento de la presión es
de 300 MPa/min y el tiempo de despresurización es menor a 1 min. El tiempo de
tratamiento descrito en este estudio no incluye los tiempos de subida y bajada. Se utilizaron
presiones de 200, 400 y 500 MPa, tiempos de tratamiento de 10 minutos para el medio de
referencia y la bebida vegetal, 25 minutos solamente para la bebida de vegetales y para las
concentraciones de polvo de aceitunas (0, 1,5 y 2,5%)
65
Figura 4. 2. Unidad de Altas Presiones Hidrostáticas. Fuente: Instituto de
Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA). Valencia
4. 10.
Efecto de las Altas Presiones y el polvo de aceitunas en la inactivación de
Bacillus cereus en medio de referencia
Para esta parte del estudio se utilizaron presiones de 200, 400 y 500 MPa con un tiempo de
tratamiento de 10 minutos. Se tomaron 12 viales de 2ml y se inocularon con 10µL de
suspensión de esporas de B. cereus. De estos viales 8 fueron tratados con APH, 4 viales
para la concentración 1.5% y 4 para la de 2.5% los 4 viales restantes fueron utilizados como
controles,
La toma de muestra se tomó únicamente tras 24 horas después de los
tratamientos.
66
4. 11. Efecto de las Altas Presiones y el polvo de aceitunas en la inactivación de
Bacillus cereus en la bebida vegetal
Para evaluar el efecto de las APH y del polvo de aceitunas se utilizaron presiones de 200,
400 y 500 MPa con un tiempos de tratamiento de 10 minutos para las presiones 200, 400 y
500MPa con concentraciones de polvo de aceituna (0,1,5 y 2,5%), por otra parte se ensayó
un tiempo de tratamiento más largo de 25 minutos pero solo con las presiones de 200 y
400MPa, ya que 500MPa con 25 minutos de tratamiento conducen a una sobrecarga de
presión en la máquina de APH. La toma de muestras se tomó únicamente tras 24 horas
después de los tratamientos.
4. 12. Modelización
Para este experimento se definieron tres variables independientes: Concentración de polvo
de aceitunas (0, 1,5, 2,5, 5%), presión (200, 400y 500 MPa) y temperatura de
almacenamiento (20 y 30 ºC) las variables de respuesta para el caso del efecto del polvo de
aceitunas en el medio de referencia en la cinética de crecimiento fueron velocidad máxima
específica de crecimiento µmax y Factor Lag (Factor de latencia) simbolizado con la letra λ.
Todos lo experimentos se realizaron por duplicado.
4. 12. 1. Desarrollo del modelo: los recuentos en palca fueron transformados a valores de
Log10 y la curva de crecimiento fue determinada mediante la prueba de Gompertz
(Zwietering et al., 1990) mediante el software GraphPad prisma 4.0. La ecuación de
Gompertz modificada definida como:
Ecuación 1
67
Donde:
Y0, es el logaritmo del número inicial de células
Y max, es el logaritmo del número final de células
µ max, es la tasa máxima específica de crecimiento
λ, es el factor de latencia
t, tiempo
4. 13. Análisis estadístico
Los estudios estadísticos se realizaron utilizando el software Statgraphics plus XV. Para
determinar el efecto de la concentración de polvo de aceitunas, la presión de tratamiento y
la temperatura de almacenamiento, se realizó un análisis de la varianza por ANOVA
factorial. En los casos en que los efectos fueron significativos, se aplicó el estudio de las
menores diferencias significativas de Fisher (LSD) (P<0.05).
68
5. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
5. 1. Efecto del polvo de aceituna en medio de referencia BHI y bebida vegetal
Se estudió el efecto de diferentes concentraciones de polvo de aceitunas (0, 1,5, 2,5 y 5%)
en el crecimiento y supervivencia de B. cereus incubado a 7, 20 y 32 ºC. La figura 5.1
muestra las curvas de crecimiento de B. cereus a las diferentes temperaturas de estudio en
presencia de 2,5% de polvo de aceitunas, concentración recomendada por los fabricantes.
El polvo de aceitunas mostró un efecto bacteriostático, ya que tras 24 horas de
almacenamiento el crecimiento fue menor en las muestras con polvo de aceitunas, que en
aquellas que no contenían dicho ingrediente, para todas las temperaturas y concentraciones
(tabla 5.1). En general se observó un mayor crecimiento a 32 ºC que a 20 y 7 ºC para todas
las concentraciones de polvo de aceitunas debido a que esta temperatura es muy cercana a
la óptima del microorganismo. Del mismo modo, a todas las temperaturas se observó un
menor crecimiento con el tiempo de incubación al aumentar la concentración de polvo de
aceitunas, si bien las diferencia observadas fueron mayores a la temperatura más baja. 7ºC,
es una temperatura tan baja que apenas hubo crecimiento de B.cereus, sin embargo la
reducción microbiana fue mayor que en las muestras que contenían el polvo de aceitunas.
Esto indica que aunque la temperatura fue muy baja el polvo de aceitunas tuvo un efecto de
control lo cual tiene relevancia en los procesos de conservación de alimentos en
refrigeración. Estos resultados concuerdan con los observados por Tassou et al., (1991)
quienes observaron una inhibición de la germinación y crecimiento de esporas de B. cereus
en presencia de oleuropeina y otros compuestos fenólicos extraídos de la aceituna.
69
Log N (UFC/ml)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
tiempo (h)
7ºC
20ºC
32ºC
Figura 6. 1. Ejemplo de curvas de crecimiento al 2.5 % de polvo de aceituna a las
diferentes temperaturas estudiadas
Tabla 6.1. Valores medios y desviación estándar de la población de B. cereus (Log N
(UFC/ml)) en medio de referencia a diferentes temperaturas y concentraciones de
polvo de aceitunas tras 24 horas de almacenamiento
Concentración polvo de aceitunas (%)
T (ºC)
0
1.5
2.5
5
32
8,20 a2 ± 0,01
8,20 a1 ± 0,04
8,12 ab1 ± 0,05
8,02 b1 ± 0,07
20
8,72 a1 ± 0,04
7,80 b1 ± 0,04
7,48 c2 ± 0,02
6.0 d2 ± 0,3
7
5,8 a3 ± 0,1
4,7 d2 ± 0,4
5,13 b3 ± 0,04
4,83 bc3 ± 0,05
1-3
: valores con diferente número indican diferencias significativas entre temperaturas de
almacenamiento a la misma concentración.
a-d:
valores con letras diferentes indican diferencias significativas entre concentraciones a la
misma temperatura
Posteriormente se modelizó el crecimiento y la cinética de inactivación de B. cereus en
presencia de polvo de aceitunas, los datos experimentales fueron ajustados a la ecuación de
70
Gompertz modificada (ecuación 1) descrita en materiales y métodos, utilizando el programa
estadístico Statgraphics plus XV.
La ecuación de Gompertz ha sido utilizada en diversas investigaciones para diferentes
microorganismos (McKellar y Lu, 2004). Chorin y et al., (1997) utilizaron este modelo
para describir el crecimiento de B. cereus en caldo BHI.
La tabla 6. 2 muestra los valores medios y la desviación estándar para la velocidad
específica de crecimiento μmax y la fase de latencia λ. En el caso de µmax, el análisis ANOVA
indicó diferencias significativas (p<0.05) con un intervalo de confianza del 95% entre los
valores de µmax a las distintas temperaturas para cada concentración de polvo de aceitunas,
excepto en el control, donde no se añadió polvo de aceitunas. A 32 ºC el análisis ANOVA
indicó que no hubo diferencias significativas entre las concentraciones, excepto al 1,5 y
2,5% de polvo de aceituna. A 20 ºC, el análisis indicó diferencias significativas (p<0.05)
entre todas las concentraciones excepto entre 1,5 y 2,5%. De acuerdo con estos resultados,
la concentración de polvo de aceitunas no afecta a la velocidad de crecimiento del B.
cereus a la temperatura óptima de crecimiento (32 ºC) utilizada en este estudio. Sin
embargo, a 20 ºC, que puede ser considerada como una temperatura de rotura de la cadena
de frío, se observó una disminución del valor µmax al aumentar la concentración del
ingrediente comparado con el control, al que no se le añadió el ingrediente.
Respecto a los valores medios y la desviación estándar para el factor de latencia (λ, tabla 6.
2), el análisis de la varianza para las distintas condiciones del estudio indicó que hubo
diferencias significativas entre 0 y 1,5% de polvo de aceitunas a 32 y a 20 ºC. En general, al
aumentar la concentración de polvo de aceitunas aumentó el factor de latencia. La fase de
latencia es el periodo durante el cual las células se modifican para poder iniciar el
crecimiento exponencial. Desde el punto de la vista de la seguridad alimentaria, ese
aumento en la fase de latencia es importante por ejemplo en caso de que se interrumpa la
cadena de frío, ya que las fluctuaciones de temperatura son un factor importante en la
conservación de los alimentos. Una manera de simular una interrupción de la cadena de
frío, por ejemplo en muchos lugares de Colombia la temperatura ambiente sobrepasa los 20
ºC, o bien no se utilizan condiciones de almacenamiento a bajas temperaturas, de esta
71
manera la presencia de polvo de aceitunas permitiría mantener la población de B.cereus en
niveles considerados seguros, en caso de condiciones inadecuadas. Es razonable decir que a
temperaturas desde 8 hasta 12 ºC el comportamiento de B.cereus en presencia de polvo de
aceitunas es similar a temperaturas de almacenamiento mayores. Medidas en la temperatura
de refrigeradores de uso doméstico en Europa, muestran que los alimentos son almacenados
a temperaturas no adecuadas (≥9 ºC) (Sergelidis et al., 1997; Bakalis et al., 2004). Estas
determinaciones de la temperatura sugieren la necesidad de aplicar barreras como la adición
de ingredientes con propiedades bacteriostáticas o bactericidas en alimentos que requieren
refrigeración.
Tabla 6. 2. Valores medios y de desviación estándar para la tasa máxima de
crecimiento (µmax) y la fase de latencia (λ) a diferentes condiciones de estudio en medio
de referencia
Tasa máxima de crecimiento
Fase de Latencia (λ)
específico (µmax)
Temperatura
Temperatura
32ºC
20ºC
32ºC
20ºC
0
0.56 ab ± 0.08
0.50 a ± 0.03
1.5 c2 ± 0.1
5.8 c1 ± 0.7
1.5
0.473 b1 ± 0.006
0.183 c2 ± 0.006
1.6 c2 ± 0.2
5.9 c1 ± 0.2
2.5
0.59 a1 ± 0.08
0.133 c2 ± 0.006
3.5 b2 ± 0.2
8.3 b1 ± 0.6
5
0.55 ab1 ± 0.04
0.28 b2 ± 0.09
9.5 a2 ± 0.7
21.05a1 ± 2.4
1-3
: valores con diferente número indican diferencias significativas entre temperaturas de
almacenamiento a la misma concentración.
a-d:
valores con letras diferentes indican diferencias significativas entre concentraciones a la
misma temperatura
El efecto bacteriostático del polvo de aceitunas se observó también en la bebida de
vegetales, respecto a la concentración 2,5 % de polvo de aceitunas se encontró un efecto de
72
control sobre el crecimiento de B. cereus desde la hora 6 hasta la hora 54 para las dos
temperaturas de almacenamiento (figura 2 y 3) La causa probable del incremento de la
concentración de microorganismos es la recuperación de algunas células que sufrieron daño
por parte del polvo de aceitunas y que la temperatura de 32 ºC es cercana a la temperatura
óptima de B. cereus. Por otra parte la concentración de 1.5% mostró también un efecto de
control sobre B. cereus a 20 ºC de almacenamiento (figura 4). En la figura 5 se observa una
diferencia con respecto al control a 32 ºC el comportamiento de B. cereus fue diferente en
presencia de 1,5 % de polvo de aceitunas, la curva correspondiente al polvo de aceitunas
creció más que el control, esto debido probablemente a que 32 ºC es una temperatura muy
cercana a la óptima al microorganismo, o bien que 1,5% de polvo de aceituna no es
suficiente para disminuir el número de microorganismos a una temperatura de abuso
extremo en materia de almacenamiento como lo son 32 ºC.
8
Log N (UFC/ml)
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
tiempo (h)
sin polvo de aceitunas
2,5% polvo de aceituna
Figura 6. 2. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus log N (UFC/ml) en la bebida
vegetal sin polvo de aceitunas y con una concentración del 2,5% almacenado a una
temperatura de 20 ºC.
73
8
Log N (UFC/ml)
7
6
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
tiempo (h)
sin polvo de aceitunas
2,5% polvo de aceituna
Log N (UFC/ml)
Figura 6. 3. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus Log N (UFC/ml) en la
bebida vegetal sin polvo de aceituna y con una concentración del 1,5% almacenado a
una temperatura de 32 ºC.
7,2
7,1
7,0
6,9
6,8
6,7
6,6
6,5
6,4
6,3
6,2
0
10
20
30
40
50
60
tiempo (h)
sin polvo de aceituna
1,5%polvo de aceituna
Figura 6. 4. Ejemplo de curva de crecimiento de B. cereus Log N (UFC/ml) en la
bebida vegetal sin polvo de aceituna y con una concentración del 1,5% almacenado a
una temperatura de 20 ºC.
74
Log N (UFC/ml)
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0
10
20
30
40
50
60
tiempo (h)
sin polvo de aceituna
1,5% polvo de aceituna
Figura 6. 5. Curva de crecimiento de fracción de B.cereus Log N (UFC/ml),
comparando con el control en presencia de 2.5% de polvo de aceituna a 32 ºC de
almacenamiento.
Los resultados del análisis ANOVA (Tabla 3) muestran que existen diferencias
significativas (p<0.05) con un intervalo de confianza del 95% entre las concentraciones de
polvo de aceitunas de 0, 1,5 y 2,5%, no obstante no hay diferencias significativas entre las
temperaturas de almacenamiento 20 y 32 ºC. Los recuentos correspondientes a la
temperatura 20 ºC en presencia de 1,5% de polvo de aceituna muestran una desviación
estándar mayor que en los demás experimentos pero aún así se aprecia un efecto de control
bajo estas condiciones.
75
Tabla 6. 3. Valores medios y desviación estándar de logaritmo de la fracción de
recuentos de B. cereus después de 24 horas de almacenamiento a diferentes
condiciones de estudio en sustrato vegetal
Temperatura de almacenamiento
% Polvo de
aceitunas
0
20ºC
7.389ª1± 0,020
32ºC
6,730ª1 ± 0,098
1.5
6.519b1± 0,051
6,568b1 ± 0,126
2.5
6.441c1 ± 0.069
4.852c1 ± 0.057
1-3
: valores con diferentes números indican diferencias significativas entre temperaturas de
almacenamiento a la misma concentración.
a-d:
valores con letras diferentes indican diferencias significativas entre concentraciones a la
misma temperatura.
Las propiedades antimicrobianas de extractos de olivas han sido investigadas, Serra y col
(2008) reportan que el contenido de polifenoles: quercetina, hidroxitirosal y oleuropeina
tienen efecto antimicrobiano frente a B. cereus, otras dos especies de bacterias como E.
coli, S. ponna y dos especies de levaduras S. cerevisiae y C. albicans. Una concentración de
500 mg/L de oleuropeina pueden inhibir considerablemente a B. cereus.
Otras investigaciones como la de Pereira et al (2007) utilizaron el extracto de olivas para
evaluar su actividad antimicrobiana. La capacidad antimicrobiana de los compuesto
fenólicos es conocida, pero la de los extractos pueden ser mas benéficos que los
constituyentes aislados se habla entonces de un efecto sinérgico de sustancias fitoquímicas
en frutas y vegetales es responsable de las propiedades bioactivas, lo cual explica porque un
solo antimicrobiano no puede inhibir o controlar diferentes microorganismos.
76
5. 2. Efecto de las Altas Presiones Hidrostáticas en medio de referencia y bebida
vegetal
Se estudió el efecto del tratamiento por APH sobre las esporas de B. cereus. Los resultados
obtenidos muestran que las presiones estudiadas no tienen un efecto significativo en cuanto
a la reducción del número de esporas presentes en la muestra y por tanto en la población de
microorganismos viables. Las figura 6,6, 6,7 y 6,8 muestra el efecto de las APH solas
sobre el número de microorganismos
1,40
1,20
1,00
N/N0
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
200
400
500
Presión (MPa)
MR
BV
Figura 6. 6. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre medio de
referencia bebida de vegetales a diferentes presiones sin polvo de aceitunas
200 MPa
1,00
0,90
0,80
0,70
N/N0
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0
1,5
2,5
COP (%)
MR
BV
77
Figura 6. 7. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre medio de
referencia y bebida vegetal a diferentes presiones en presencia de polvo de aceitunas
a 200 MPa
500 MPa
1,40
1,20
1,00
N/N0
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0
1,5
2,5
polvo de aceituna (%)
MR
BV
Figura 6. 8. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre medio de
referencia y bebida vegetal a diferentes presiones en presencia de polvo de aceitunas
a 500 MPa
En la tabla 6. 4 se resume el efecto de las altas presiones y la concentración de polvo de
aceituna sobre la población de B. cereus en los diferentes sustratos, medio de referencia y
bebida vegetal. En general, tanto en el medio de referencia como en la bebida vegetal, se
observan diferencias significativas (Anexos 9.1 y 9.2) debidas a la concentración de polvo
de aceituna (p<0,01) que indican una mayor supervivencia de las esporas a mayores
concentraciones de polvo de aceituna. En cuanto al efecto de la presión, también es
significativo (p<0,001) en ambos sustratos, observándose generalmente una menor
inactivación de las esporas de B. cereus a la presión de 400 MPa. Sin embargo, debido al
efecto de la interacción entre presión y concentración de polvo de aceituna (p<0,001) estos
78
efectos no se observan con claridad en todas las combinaciones de presión y polvo de
aceituna
Tabla 6. 4. Valores medios y desviación estándar de la población de B. cereus (N/N0),
en medio de referencia y bebida vegetal, sometidos a tratamiento por APH a 200, 400
y 500 MPa (10 min) y con diferentes concentraciones de polvo de aceitunas
% P.A
0
1.5
2.5
P
CPA
Px
CPA
Altas Presiones Hidrostáticas
Medio de referencia
Bebida vegetal
200
200
400
400
500
0,59 ±0,24
1,02ab1±0,14
0,73b12±0.28
0,54a2±0,15
0,84a1±0,05
0,901± 0,02
0,892± 0,02
0,84b2±0,01
1,13a1± 0,11
***
***
0,61b3±0,05
0,29b2±0,10
0,38ab2±0,12
0,30b2±0,06
0,68ab1±0,18
***
**
2
***
1,10
a1
±0,19
500
0,40b2±0,06
0,59a1±0,05
0,43b12±0,03
***
1-3
: valores con números diferentes indican diferencias significativas efecto de las diferentes
presiones a la misma concentración de polvo de aceituna y en el mismo substrato.
a-c
: valores con letras diferentes indican diferencias significativas defecto de las diferentes
concentraciones de polvo de aceitunas a la misma presión y en el mismo substrato.
P: efecto de la presión, CPA: efecto de la concentración de polvo de aceituna, PxCPA:
efecto de la interacción entre la concentración de polvo de aceituna y las altas presiones.
***: p<0.001, **: p<0.01.
Los resultados referentes al efecto de la presión obtenidos en este estudio coinciden con los
de otros autores que observaron que a presiones relativamente bajas se puede inducir la
germinación de las esporas (Rasso et al., 1998), así podría ser que la mayor inhibición
observada a 200 MPa pudiera ser debida a la germinación de las esporas que se
transformarían en células vegetativas, volviéndose más sensibles al tratamiento por APH.
Por otra parte, 500 MPa es una presión alta que sí puede afectar a las esporas y disminuir su
supervivencia, sin embrago estas disminuciones no garantizan la calidad microbiológica de
la bebida de vegetales ya que son menores de un ciclo logarítmico. En cuanto al efecto de la
concentración de polvo de aceituna, los resultados parecen indicar un posible efecto
protector en el tratamiento por APH, que podría ser debido al efecto inhibidor de la
germinación, anteriormente descrito para este ingrediente (Tassou et al., 1991). Sin
embargo, este efecto podría ser de interés durante la vida útil del producto, por tanto sería
79
necesario estudiar la evolución de los diferentes sustratos a lo largo del periodo de
almacenamiento.
La figura 6. 9. permite observar las diferencias en la población de B. cereus debidas a los
diferentes sustratos. En general, a todas las presiones se puede observar que, en ausencia de
polvo de aceituna no hay diferencias significativas entre el número de esporas viables en el
medio de referencia y la bebida vegetal, sin embargo al 1,5 y 2,5% de polvo de aceituna se
observa que la supervivencia de las esporas es mayor en el medio de referencia que en la
bebida vegetal. Esto pueda deberse probablemente a que el comportamiento de algunos
microorganismos en sustratos vegetales muestran que algunos alimentos pueden tener un
efecto protector propio innato contra microorganismos,
esto puede ser debido a los
componentes naturales como fitoatoalexinas presentes fluidos celulares y vasculares son
liberados a consecuencia del rompimiento de las células de zanahoria durante un
tratamiento como el de Altas Presiones (Pilavtepe-Çelik1 et al., 2008), estos resultados son
relevantes en comparación con los obtenidos en este estudio ya que las fitoalexinas están
presentes en la zanahoria del sustrato vegetal.
1,40
1,20
1,00
N/N 0
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
200
400
500
Presión (MPa)
0
1,5
2,5
BV 0%
BV 1,5%
BV 2,5%
80
Figura 6. 9. Efecto de la presión y la concentración de polvo de aceitunas sobre la
población de B. cereus en medio de referencia y bebida vegetal, sometidos a 10 min de
tratamiento con APH.
La temperatura de tratamiento en Altas Presiones es un factor importante así, con
temperaturas superiores a los 40 ºC pueden inactivar hasta un ciclo completo a 100 MPa
para esporas de B. cereus (Black et al., 2008).
El sustrato en el cual se realizan los tratamientos puede influir en la inactivación de los
microorganismos, en alimentos por ejemplo los microorganismos son más resistentes a la
presión que en sistemas de referencia como búferes (Alpas et al., 2003; Chen y Hoover
2003; Van, Opstal et al., 2005); así la composición del medio de referencia puede estar
relacionada con la resistencia del microorganismo a las APH, así algunos aminoácidos
como la glicina y la betaina (presente en el BHI) puede actuar como agente osmoprotector
impidiendo que la membrana de las células se vea afectada por las APH (Jofré et al., 2007).
La bebida de vegetales de este estudio tiene una composición sencilla (zanahorias y judías
verdes) presento un pH de 6.32 muy cercano a la neutralidad de tal manera que el pH del
sustrato no es una barrera extra contra microorganismos.
81
1,40
1,20
1,00
N/N 0
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
200
400
500
Presión (MPa)
0
1,5
2,5
BV 0%
BV 1,5%
BV 2,5%
Figura 6. 10. Comparación del logaritmo de recuento de B. cereus entre dos tiempos
de tratamiento con APH diferentes.
5. 3. Efecto del tiempo de tratamiento con APH en la bebida de vegetales
El tiempo y la temperatura son factores clave a la hora de aplicar cualquier tecnología para
disminuir carga microbiana. Otros autores han observado que un incremento del tiempo de
tratamiento con APH conduce a un aumento en la inactivación de células vegetativas
(Bellaterra, 2004). En este estudio se consideró alargar el tiempo de tratamiento a 25
minutos para ver si esto tendría un efecto mayor sobre las esporas de B. cereus. En la figura
6. 11. se pueden observar los resultados en la bebida vegetal tras tratarla con APH durante
10 y 25 min. Como se ve en la figura no se observaron diferencias significativas debidas al
tiempo de tratamiento.
82
1,20
1,00
N/N 0
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
200
400
Presión (MPa)
10 min, 0%
25 min, 0%
10 min, 1.5%
25 min, 1,5%
10 min, 2,5 %
25 min, 2,5%
Figura 6. 11. Efecto del tiempo de tratamiento con APH sobre la población de B.
cereus (N/N0) en bebida vegetal a las diferentes presiones y concentraciones de polvo
de aceitunas estudiadas
En la tabla 6.5 se pueden apreciar En general, tanto en el medio de referencia como en la
bebida vegetal, no se observaron diferencias significativas en respuesta al aumento del
tiempo de tratamiento a Altas Presiones ni
(p>0,001) y
a la concentración de polvo de aceituna
(p>0,01) respectivamente (anexo 9.3 ). Para esta experiencia se sigue
observando una leve disminución de la carga microbiana para la presión de 200 MPa
porque el polvo de aceitunas puede inhibir en algún grado la germinación de las esporas.
83
Tabla 6. 5. Valores medios y desviación estándar de Log N/No de B. cereus, después de
24 horas de almacenamiento en sustrato vegetal con APH con dos tiempos de tratamiento a
APH
Tratamiento 10 min
% P.A
Tratamiento 25min
200MPa
400Mpa
200MPa
400Mpa
0
0.59± 0.24
1.02± 0.14
0.20 ±1,09
1.06 ± 0.59
1.5
0.90± 0.02
0.84± 0.01
0.61 ±1,09
0.49 ± 0.11
2.5
0.89± 0.02
0.68± 0.12
0.22 ±1,09
0.66 ± 0.08
Esta tabla solo presenta datos de medias y desviaciones estándar, porque no hay diferencias
significativas.
6. CONCLUSIONES
Mediante los datos obtenidos para las diferentes concentraciones de polvo de aceitunas en
medio de referencia y en sustrato vegetal se puede decir que el polvo de aceitunas en
concentraciones de 1.5 % ó de 2.5%, se puede utilizar como aditivo en alimentos para
84
controlar B. cereus junto a otros sistemas de preservación físicos como almacenamiento a
bajas temperaturas.
A las temperaturas de almacenamiento 20 y 32ºC el polvo de aceitunas mostró una
capacidad de controlar poblaciones de B. cereus, lo cual es importante en caso de que se
interrumpa la cadena de frío de un alimento o bien hayan problemas durante el transporte
de la bebida de vegetales.
El tratamiento de APH no tuvo influencia importante sobre el número de reducciones de B.
cereus en medio de referencia y sustrato vegetal. En consecuencia, la tecnología de APH
sola o combinada con el polvo de aceituna no fue suficiente para garantizar la seguridad
microbiológica de la bebida de vegetales.
Un aumento en el tiempo de tratamiento tampoco mostró una disminución importante en el
número de microorganismos.
La temperatura de tratamiento del estudio fue para todo los ensayos 20 ºC, dicha
temperatura se considera baja, puesto que las esporas son termorresistentes, con lo cual se
indujo la germinación pero no la destrucción significativa de esporas de B. cereus
7. RECOMENDACIONES
Se considera necesario pensar en un efecto conjunto de las APH y el ingrediente, para
controlar al B. cereus durante el almacenamiento; es decir, estudiar la influencia de los
tratamientos con APH´s, una concentración de 2,5% de polvo de aceitunas y los
85
componentes de la bebida (sustancias fotoquímicas) a través del tiempo a diferentes
condiciones de almacenamiento.
Como se menciono en la discusión de resultados, la temperatura de tratamiento influye en
la reducción de microorganismos, un aumento de la temperatura de tratamiento junto con
las APH y la adición del polvo de aceitunas pueden inhibir el crecimiento de Bacillus
cereus o mantenerlo bajo niveles que no causen deterioro en la bebida vegetal ni nocivos
para el consumidor.
En materia de seguridad alimentaria es importante tener en cuenta la manipulación de los
alimentos durante su preparación,
sí se mantienen condiciones de higiene, Buenas
Prácticas de Manufactura se puede disminuir el riesgo de contaminación en los alimentos.
En muchas ocasiones se piensa que una tecnología muy avanzada garantiza seguridad
microbiológica, pero si no se manejan condiciones aptas durante el proceso de preparado de
un alimento cualquiera será más difícil garantizar calidad y alargar la vida útil de un
producto.
Con respecto al uso de antimicrobianos de origen natural, cabe mencionar que en el
mercado europeo y colombiano existen muchos condimentos y especias, permitidos por las
respectivas legislaciones y que pueden tener actividad antimicrobiana, por lo tanto las
investigaciones en el área de aditivos y antimicrobianos se debería tener en cuantos
aquellos ingredientes que ya son conocidos.
El mercado de las bebidas vegetales actualmente tiene demanda por sectores muy
específicos, en Colombia por ejemplo existe una gran variedad de hortalizas que pueden
combinarse para hacer bebidas refrescantes, por lo que se debería pensar en investigar más
9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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99
9. ANEXOS
9 .1 ANOVA SIMPLE ENTRE PRESIONES Y CONCENTRACIONES PARA
MEDIO DE REFERENCIA
Dependent variable: RECUENTO
Factor: CONCENTRACION
Selection variable: HHP=200
Number of observations: 7
Number of levels: 3
ANOVA Table for RECUENTO by CONCENTRACION
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
Between groups
0,155411
2
0,0777054
Within groups
0,168275
4
0,0420688
Total (Corr.)
0,323686
6
F-Ratio
1,85
P-Value
0,2703
Multiple Range Tests for RECUENTO by CONCENTRACION
Method: 95,0 percent LSD
CONCENTRACION
Count
0
4
2,5
1
1,5
2
Mean
0,5925
0,88
0,9
Homogeneous Groups
X
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
0 - 1,5
-0,3075
0,493175
0 - 2,5
-0,2875
0,636686
1,5 - 2,5
0,02
0,697454
•
denotes a statistically significant difference.
Dependent variable: RECUENTO
Factor: CONCENTRACION
Selection variable: HHP=400
ANOVA Table for RECUENTO by CONCENTRACION
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
Between groups
0,144171
1
0,144171
Within groups
0,0238
5
0,00476
Total (Corr.)
0,167971
6
F-Ratio
30,29
P-Value
0,0027
Multiple Range Tests for RECUENTO by CONCENTRACION
Method: 95,0 percent LSD
CONCENTRACION
Count
1,5
4
2,5
3
Contrast
Sig.
Difference
Mean
0,84
1,13
Homogeneous Groups
X
X
+/- Limits
100
1,5 - 2,5
*
-0,29
0,135455
* denotes a statistically significant difference.
Dependent variable: RECUENTO
Factor: CONCENTRACION
Selection variable: HHP=500
ANOVA Table for RECUENTO by CONCENTRACION
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
Between groups
0,382831
2
0,191415
Within groups
0,725462
12 0,0604552
Total (Corr.)
1,10829
14
F-Ratio
3,17
P-Value
0,0787
Multiple Range Tests for RECUENTO by CONCENTRACION
Method: 95,0 percent LSD
CONCENTRACION
Count
1,5
3
0
8
2,5
4
Mean
0,61
0,77625
1,0625
Homogeneous Groups
X
XX
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
0 - 1,5
0,16625
0,362684
0 - 2,5
-0,28625
0,32806
1,5 - 2,5
*
-0,4525
0,409163
* denotes a statistically significant difference.
Dependent variable: RECUENTO
Factor: HHP
Selection variable: CONCENTRACION=0
ANOVA Table for RECUENTO by HHP
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
Between groups
0,647009
2
0,323504
Within groups
0,769663
25 0,0307865
Total (Corr.)
1,41667
27
Multiple Range Tests for RECUENTO by HHP
Method: 95,0 percent LSD
HHP Count
Mean
200
4
0,5925
500
8
0,77625
0
16
1,0
F-Ratio
10,51
P-Value
0,0005
F-Ratio
217,33
P-Value
0,0000
Homogeneous Groups
X
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
0 - 200
*
0,4075
0,202011
0 - 500
*
0,22375
0,156477
200 - 500
-0,18375
0,221292
* denotes a statistically significant difference.
Dependent variable: RECUENTO
Factor: HHP
Selection variable: CONCENTRACION=1,5
ANOVA Table for RECUENTO by HHP
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
Between groups
0,341047
3
0,113682
Within groups
0,0068
13 0,000523077
101
Total (Corr.)
0,347847
16
Multiple Range Tests for RECUENTO by HHP
Method: 95,0 percent LSD
HHP Count
Mean
Homogeneous Groups
X
500
3
0,61
X
400
4
0,84
X
200
2
0,9
X
0
8
1,0
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
0 - 200
*
0,1
0,0390617
0 - 400
*
0,16
0,0302571
0 - 500
*
0,39
0,0334505
200 - 400
*
0,06
0,04279
200 - 500
*
0,29
0,0451046
400 - 500
*
0,23
0,0377372
•
denotes a statistically significant difference.
Dependent variable: RECUENTO
Factor: HHP
Selection variable: CONCENTRACION=2,5
ANOVA Table for RECUENTO by HHP
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
Between groups
0,063825
3
0,021275
Within groups
0,141075
12 0,0117562
Total (Corr.)
0,2049
15
Multiple Range Tests for RECUENTO by HHP
Method: 95,0 percent LSD
HHP Count
Mean
200
1
0,88
0
8
1,0
500
4
1,0625
400
3
1,13
Contrast
0 - 200
0 - 400
0 - 500
200 - 400
200 - 500
400 - 500
Sig.
F-Ratio
1,81
P-Value
0,1990
Homogeneous Groups
X
X
X
X
Difference
0,12
-0,13
-0,0625
-0,25
-0,1825
0,0675
+/- Limits
0,250571
0,159936
0,144667
0,272788
0,264125
0,180432
102
9. 2. ANOVA MULTIPLE ENTRE MEDIO DE REFERENCIA Y
BEBIDAVEGETAL (10 MINUTOS)
Dependent variable: recuento
Factors:
DISTINTIVO
Covariates:
CONCENTRACION=0
Selection variable: hhp=200
Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=0
0,00016309
1
0,00016309
MAIN EFFECTS
A:DISTINTIVO
0,410803
1
0,410803
RESIDUAL
0,580313
14 0,0414509
TOTAL (CORRECTED)
1,01917
16
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO
Method: 95,0 percent LSD
DISTINTIVO
Count
LS Mean
2
10
0,394294
1
7
0,722473
Contrast
1-2
•
Sig.
Difference
0,328179
LS Sigma
0,0654281
0,0787312
F-Ratio
P-Value
0,00
0,9509
9,91
0,0071
Homogeneous Groups
X
X
+/- Limits
0,447173
denotes a statistically significant difference
Dependent variable: recuento
Factors:
DISTINTIVO
Covariates:
CONCENTRACION=1,5
Selection variable: hhp=200
Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=1,5
0,00236612
1
0,00236612
MAIN EFFECTS
A:DISTINTIVO
0,437594
1
0,437594
RESIDUAL
0,57811
14 0,0412936
TOTAL (CORRECTED)
1,01917
16
All F-ratios are based on the residual mean square error.
F-Ratio
P-Value
0,06
0,8143
10,60
0,0058
Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO
Method: 95,0 percent LSD
DISTINTIVO
Count
LS Mean
2
10
0,395177
1
7
0,721211
LS Sigma
0,0642632
0,0768109
Homogeneous Groups
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
1-2
0,326034
0,464041
•
denotes a statistically significant difference
103
Dependent variable: recuento
Factors:
DISTINTIVO
Covariates:
CONCENTRACION=2,5
Selection variable: hhp=200
Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=2,5
0,00415365
1
0,00415365
MAIN EFFECTS
A:DISTINTIVO
0,427949
1
0,427949
RESIDUAL
0,576322
14 0,0411659
TOTAL (CORRECTED)
1,01917
16
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO
Method: 95,0 percent LSD
DISTINTIVO
Count
LS Mean
2
10
0,391244
1
7
0,72683
LS Sigma
0,0652555
0,0785494
F-Ratio
P-Value
0,10
0,7554
10,40
0,0061
Homogeneous Groups
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
1-2
0,335586
0,482242
•
denotes a statistically significant difference
Dependent variable: recuento
Factors:
DISTINTIVO
Covariates:
CONCENTRACION=0
Selection variable: hhp=400
Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=0
0,0796036
1
0,0796036
MAIN EFFECTS
A:DISTINTIVO
0,561718
1
0,561718
RESIDUAL
0,573182
17 0,0337166
TOTAL (CORRECTED)
1,29648
19
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO
Method: 95,0 percent LSD
DISTINTIVO
Count
LS Mean
2
9
0,632954
1
11
0,973861
LS Sigma
0,0616119
0,0556636
F-Ratio
P-Value
2,36
0,1428
16,66
0,0008
Homogeneous Groups
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
1-2
0,340907
0,382606
* denotes a statistically significant difference.
Dependent variable: recuento
Factors:
DISTINTIVO
Covariates:
CONCENTRACION=1,5
Selection variable: hhp=400
104
Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=1,5
0,332658
1
0,332658
MAIN EFFECTS
A:DISTINTIVO
0,672619
1
0,672619
RESIDUAL
0,320128
17 0,018831
TOTAL (CORRECTED)
1,29648
19
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO
Method: 95,0 percent LSD
DISTINTIVO
Count
LS Mean
2
9
0,617609
1
11
0,986416
LS Sigma
0,0457546
0,0413846
F-Ratio
P-Value
17,67
0,0006
35,72
0,0000
Homogeneous Groups
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
1-2
*
0,368807
0,271596
•
denotes a statistically significant difference
Dependent variable: recuento
Factors:
DISTINTIVO
Covariates:
CONCENTRACION=2,5
Selection variable: hhp=400
Analysis of Variance for recuento - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=2,5
0,0984018
1
0,0984018
MAIN EFFECTS
A:DISTINTIVO
0,714896
1
0,714896
RESIDUAL
0,554384
17 0,0326108
TOTAL (CORRECTED)
1,29648
19
All F-ratios are based on the residual mean square error
Multiple Range Tests for recuento by DISTINTIVO
Method: 95,0 percent LSD
DISTINTIVO
Count
LS Mean
2
9
0,608001
1
11
0,994278
LS Sigma
0,060741
0,0548528
F-Ratio
P-Value
3,02
0,1005
21,92
0,0002
Homogeneous Groups
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
1-2
*
0,386277
0,363104
* denotes a statistically significant difference.
9. 3. ANOVA MULTIPLE ENTRE 10 Y 25 MINUTOS DE TRATAMIENTO EN
BEBIDA VEGETAL
Dependent variable: RECUENTO
Factors:
TRATAMIENTO TIEMPO
Covariates:
CONCENTRACION=0
Selection variable: HHP=200
105
Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=0
1,68497
1
1,68497
MAIN EFFECTS
A:TRATAMIENTO TIEMPO
2,37258
1
2,37258
RESIDUAL
7,31913
19 0,385217
TOTAL (CORRECTED)
11,2392
21
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO
Method: 95,0 percent LSD
TRATAMIENTO TIEMPO
10
25
Count
10
12
LS Mean
0,384215
1,04416
LS Sigma
0,196338
0,179221
F-Ratio
P-Value
4,37
0,0502
6,16
0,0226
Homogeneous Groups
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
10 - 25
-0,659944
1,19001
* denotes a statistically significant difference.
Dependent variable: RECUENTO
Factors:
TRATAMIENTO TIEMPO
Covariates:
CONCENTRACION=1,5
Selection variable: HHP=200
Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=1,5
0,575187
1
0,575187
MAIN EFFECTS
A:TRATAMIENTO TIEMPO
2,3137
1
2,3137
RESIDUAL
8,42892
19 0,443627
TOTAL (CORRECTED)
11,2392
21
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO
Method: 95,0 percent LSD
TRATAMIENTO TIEMPO
10
25
Count
10
12
LS Mean
0,388709
1,04041
LS Sigma
0,210698
0,192329
F-Ratio
P-Value
1,30
0,2690
5,22
0,0341
Homogeneous Groups
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
10 - 25
-0,651704
1,27705
* denotes a statistically significant difference.
Dependent variable: RECUENTO
Factors:
TRATAMIENTO TIEMPO
Covariates:
CONCENTRACION=2,5
Selection variable: HHP=200
Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=2,5
3,97869
1
3,97869
F-Ratio
P-Value
15,04
0,0010
106
MAIN EFFECTS
A:TRATAMIENTO TIEMPO
2,65394
1
2,65394
RESIDUAL
5,02542
19 0,264496
TOTAL (CORRECTED)
11,2392
21
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO
Method: 95,0 percent LSD
TRATAMIENTO TIEMPO
10
25
Count
10
12
LS Mean
0,362801
1,062
LS Sigma
0,162845
0,148624
10,03
0,0051
Homogeneous Groups
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
10 - 25
-0,699202
0,95643
* denotes a statistically significant difference.
Dependent variable: RECUENTO
Factors:
TRATAMIENTO TIEMPO
Covariates:
CONCENTRACION=0
Selection variable: HHP=400
Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=0
0,706632
1
0,706632
MAIN EFFECTS
A:TRATAMIENTO TIEMPO
0,0251791
1
0,0251791
RESIDUAL
0,665523
18 0,0369735
TOTAL (CORRECTED)
1,4413
20
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO
Method: 95,0 percent LSD
TRATAMIENTO TIEMPO
10
25
Count
9
12
LS Mean
0,648093
0,718588
LS Sigma
0,0643698
0,0556865
F-Ratio
P-Value
19,11
0,0004
0,68
0,4200
Homogeneous Groups
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
10 - 25
-0,0704951
0,393202
* denotes a statistically significant difference.
Dependent variable: RECUENTO
Factors:
TRATAMIENTO TIEMPO
Covariates:
CONCENTRACION=1,5
Selection variable: HHP=400
Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=1,5
0,584107
1
0,584107
MAIN EFFECTS
A:TRATAMIENTO TIEMPO
0,069143
1
0,069143
RESIDUAL
0,788048
18 0,0437804
TOTAL (CORRECTED)
1,4413
20
All F-ratios are based on the residual mean square error.
F-Ratio
P-Value
13,34
0,0018
1,58
0,2249
107
Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO
Method: 95,0 percent LSD
TRATAMIENTO TIEMPO
10
25
Contrast
10 - 25
Sig.
Difference
-0,11595
Count
9
12
LS Mean
0,622118
0,738069
LS Sigma
0,0697459
0,0604017
Homogeneous Groups
X
X
+/- Limits
0,406984
Dependent variable: RECUENTO
Factors:
TRATAMIENTO TIEMPO
Covariates:
CONCENTRACION=2,5
Selection variable: HHP=400
Analysis of Variance for RECUENTO - Type III Sums of Squares
Source
Sum of Squares
Df Mean Square
COVARIATES
CONCENTRACION=2,5
0,0011904
1
0,0011904
MAIN EFFECTS
A:TRATAMIENTO TIEMPO
0,0662306
1
0,0662306
RESIDUAL
1,37096
18 0,0761647
TOTAL (CORRECTED)
1,4413
20
All F-ratios are based on the residual mean square error.
F-Ratio
P-Value
0,02
0,9019
0,87
0,3634
Multiple Range Tests for RECUENTO by TRATAMIENTO TIEMPO
Method: 95,0 percent LSD
TRATAMIENTO TIEMPO
10
25
Count
9
12
LS Mean
0,623109
0,737325
LS Sigma
0,0923339
0,0798898
Homogeneous Groups
X
X
Contrast
Sig. Difference
+/- Limits
10 - 25
-0,114217
0,52446
* denotes a statistically significant difference.
108
109