Teórica 6

01
Curso de Postgrado:
Histología animal comparada: técnicas básicas para
microscopía óptica y electrónica (marzo 2016).
Clase práctica: Histoquímica
Sexta Edición 2016
Temas: Introducción a la histoquímica.
Detección de Hidratos de carbono.
Detección de Proteínas.
Detección de Lípidos.
Histoquímica Especial: Amiloide.
Histoquímica Especial: Pigmentos.
Histoquímica Especial: Elementos químicos (calcio, cobre).
Estudio de la Neurosecreción.
Λ=Զ=Z
Índice de las pantallas al final
MATERIAL DE DOCENCIA PARA CONSULTA
No utilice este material didáctico fuera de contexto.
Si no es capaz de desarrollar algo semejante, cite la fuente.
.
02
Introducción a la Histoquímica:
Es la determinación de sustancias presentes en los tejidos, utilizando
reacciones y coloraciones específicas, que nos informan sobre un tipo de
fisiología especial que desarrollan las células. Estas técnicas sirven para
establecer cual es el desempeño de un tejido u órgano, y su funcionamiento
específico, pudiéndolas desarrollarlas en cortes histológicos, o en tejidos y
órganos enteros como una pieza.
Objetivos:
Objetivo corto:
Sustancias
Sustancias orgánicas:
Primer Nivel
Proteínas
Hidratos de Carbono
Lípidos
Segundo Nivel
Carácter:
Ácido
Básico
Sustancias orgánicas específicas: melanina
Tercer Nivel
Grupos ionógenos:
Carboxilo
Sulfatos
Fosfatos
Iones inorgánicos: calcio, hierro, cadmio
Objetivo largo:
Fisiología celular
Célula diferenciada o no diferenciada, de digestión, de reserva, secretora, etc.
En todos los casos cortes histológicos o piezas de tejidos, siempre es necesario la
fijación y el tratamiento específico para cada una de las sustancias a determinar.
En caso que el material biológicos sea piezas enteras, además de los cuidados y
técnicas utilizadas para los cortes histológicos, se deben implementar otras técnicas
como el cultivo organotípico y los procesos complicados de montado de la pieza.
.
En la bibliografía específica se podrán encontrar con los tratamientos previos que se le
deben dar al material biológico para proteger o resguardar las sustancias a determinar.
Introducción a la Histoquímica:
03
Fijación: para propósitos histoquímicos generales se recomienda el líquido de Baker.
Fijador formaldehído cálcico de Baker (para lípidos): formol, 10 ml; cloruro de calcio al
10 % (anhidro), 10 ml; agua destilada, 80 ml; agregar carbonato de calcio hasta
solución saturada. Para marinos cambiar por cloruro de calcio 40 ml y agua destilada
50 ml. Conservador: formol, 10 ml; cloruro de calcio al 10 % (anhidro), 10 ml; cloruro
de cadmio al 10 %, 10 ml y agua destilada a 70 ml; carbonato de calcio hasta solución
saturada. Fijar durante 2 o 3 días. Conserva muchas sustancias citoplasmáticas.
Citología no nuclear. Para lípidos seguir con cortes por congelación.
Fijador de Carnoy: alcohol 100 %, 6 volúmenes; cloroformo, 3 volúmenes; ácido
acético glacial, 1 volumen. Fijar por 3 horas. Pasar al alcohol, 90 o 100 %. Fijador
general, cromosomas, glucógeno.
Fijador de Hamazaki: A) agua destilada, 250 ml; cloruro de mercurio, 7,5 g; dicromato
de potasio, 5 g; ácido acético glacial, 2,5 ml. B) formaldehído al 4 %, con carbonato de
calcio a saturación. A) Durante 3 días. B) Durante 1 día. Propósitos histoquímicos
generales y especial para músculos.
Fijador de Lang: agua destilada, 100 ml; cloruro de mercurio, 7 g. (solución saturada);
ácido acético glacial, de 5 a 10 ml. Fijar hasta 6 horas, pasar al alcohol 70 %. Tejidos
glandulares y con colágeno.
Fijador de Zenker: Solución Madre: agua destilada, 100 ml; cloruro de mercurio, 5 g;
bicromato de potasio, 2,5 g; sulfato de sodio, 1 g. A la Solución Madre agregar 5 ml de
ácido acético glacial antes de usar. Fijar por 24 horas, lavar 24 horas, alcohol 70 %.
Propósitos histoquímicos generales.
.
Hidratos de carbono:
(*) También llamados
mucopolisacaridos nitrogenados.
Mucopolisacaridos =
Glucosaminoglucanos
04
Dentro de los hidratos de carbono o glúcidos encontramos a los polisacáridos que están
formados por más de diez moléculas de monosacáridos (azúcares simples). Se pueden
dividir en polisacáridos simples (glucógeno, galactógeno) o polisacáridos complejos
(mucopolisacaridos, mucoproteínas y mucolípidos). Fijación: Bouin, Carnoy, fríos.
Polisacáridos simples (glucógeno, galactógeno):
Reacción APS (PAS) o ácido peryódico – reactivo de Schiff y método del carmín de Best.
Polisacáridos complejos (mucopolisacaridos ácidos): (*)
Método de Hale y métodos del azul alcián.
Polisacáridos complejos (mucopolisacaridos neutros, mucoproteínas, mucolípidos): (*)
Reacción APS (+) y método del azul alcián (-).
Estudio de la glándula del albumen de Pomacea canaliculata:
Tricrómico de Masson modificado
Referencias: ga: subpoblación de células glandulares
azules; gb: subpoblación de células glandulares
blancas; c: conductos ciliados excretores.
Escalas 20 μm
métodos del azul alcián sin coloración de fondo,
mucopolisacáridos ácidos en células a (ga).
Se llaman glucoconjugados a los carbohidratos
(glucanos) unidos a proteínas (glucoproteínas) o a
lípidos (glucolípidos) en forma covalente.
.
05
Para metacromasia ver
Tabla completa de
apartado (pantalla 06)
determinaciones.
Otras técnicas empleadas para mucosustancias o mucopolisacáridos nitrogenados son:
1. método de Salazar (glicoproteínas y mucopolisacáridos ácidos y neutros);
2. método de Steedman con azul alcián (pH 7), variante de Mowry (pH 3,5) y de Spicer
(pH 2) (mucopolisacáridos ácidos);
3. método de Feyrter, deslipidizado con piridina, técnicas de Baker y de Keilig
(mucopolisacáridos ácidos);
4. método de Halmi y Davies o de la fucsina paraldehído sin oxidación
(mucopolisacáridos sulfatados y carboxilados);
5. azul de toluidina al 0,2 %, pH 4,4 con tampón cítrico fosfato montado en medio
acuoso y bálsamo de Canadá (radicales ionógenos: carboxilo, sulfatos y fosfatos) (la
metacromasia no resiste la deshidratación, especialmente en la mucopolisacáridos
ácidos sulfatados);
6. azul de toluidina al 0,2 %, pH 3,4 con tampón cítrico fosfato (radicales ionógenos:
sulfatos y fosfatos);
7. metilación (alcohol metílico – ácido clorhídrico) y metacromasia (obtención de
resultados negativos);
8. metilación, saponificación (alcohol etílico – hidróxido de potasio) y metacromasia
(radical ionógeno: carboxilos);
9. azul de toluidina al 0,01 %, pH 3,4 con tampón diluido cítrico – fosfato adicionado
con nitrato de uranilo N/1000 (radical ionógeno: sulfatos);
10. esterificación sulfúrica (ácido sulfúrico al 50 % en éter etílico) y metacromasia
(mucoides); y
11. método de Gomori o de la fucsina paraldehído con oxidación (mucinas).
Estas técnicas nunca debe ser utilizadas de manera aislada. El procedimiento es
detectar la naturaleza de un mucopolisacáridos ácido primero y luego ver que clase de
radicales ionógenos participan en la sustancia.
Hidratos de carbono:
.
06
Metacromasia:
Detección de la metacromasia para mucopolisacáridos:
La metacromasia es la propiedad de cambiar de color que ciertos colorantes tienen
frente a sustancias específicas, estas sustancias “polimerizan” el colorante, lo ordenan
en una secuencia, que cambia la propiedad del colorante a otro color distinto. En
general los componentes tisulares, hidratos de carbono, que son cromotropos, son
algunos mucopolisacáridos ácidos (carboxilados, C; sulfatados, S; y fosfatados, F) y las
nucleoproteínas (cromatina).
Método: 1. azul de toluidina al 0,2 %, pH 4,6 (todos son +, C, S y F) y 3,4 (S y F) de
tampón acetato;
2. metilación (alcohol metílico – ácido clorhídrico) y metacromasia (1) (todos son
negativos -, C, S y F); y
3. metilación, saponificación (alcohol etílico - hidróxido de potasio) y metacromasia (1)
(+ sólo C). Color rojo o púrpura, indica metacromasia positiva.
Resultados: azul, alfa metacromasia (ortocromasia); violeta, beta metacromasia; rojo,
gama metacromasia.
ortocromasia
beta
metacromasia
Célula con beta metacromasia
gama
metacromasia
Célula con gama metacromasia
.
Veamos un ejemplo: glucógeno
Realizar ajuste para
tejidos de invertebrados.
07
Detección del glucógeno en hígado: dos son los métodos más usados para su
revelación, reacción APS o ácido peryódico – reactivo de Schiff y método del carmín de
Best. Como el último puede tener falta de sensibilidad, indicaremos un control con APS.
Utilizar dos preparados con cortes homólogos. Tratar uno de ellos (control) con saliva
filtrada o pancreatina (amilasa, sacarasa o ptialina) al 2%, entre 37 y 40 °C durante
una hora. Luego proceder a la oxidación con peryódico y al revelado con el reactivo de
Schiff en ambos preparados. El glucógeno debería desaparecer al ser tratado con la
enzima, en el preparado control.
1000X
Reacción de APS
400X
Reacción de APS con artefacto
de técnica: reacción de fuga
500X
Reacción de APS – enzima.
Las sustancias APS positivas (+) son: los polisacáridos simples (glucógeno,
galactógeno), mucopolisacáridos neutros, mucoproteínas, glucoproteínas, glucolípidos,
fosfolípidos, lípidos insaturados, y pigmentos ceroides y lipofucsina. No colorea los
mucopolisacáridos ácidos salvo que tengan un tratamiento previo particular.
.
08
Proteínas:
Las proteínas son de fácil fijación ya que todos los líquidos fijadores actúan sobre ellas
destruyendo su estructura cuaternaria, haciéndolas precipitar.
Los procedimientos histoquímicos sobre las proteínas se pueden diferenciar en:
1. los generales que determinan el carácter proteico;
2. los que determinan familias o grupos de aminoácidos presentes; y
3. los que se centran en saber un determinado grupo (aminoácido).
El primer caso se puede determinan mediante la reacción de desaminación oxidativa
400X
con ninhidrina y luego una revelación de los grupos transformados mediante el
reactivo de Schiff.
También se puede determinar los grupos
electronegativos totales o acidofilia total mediante el
método de Deitch. Y para determinar la basofilia, los
métodos de: 1. tionina 0,5 %, pH 4,2 y 2. azul de
toluidina 0,2 %, pH 4,2.
Método de Deitch, con amarillo naftol S
Parénquima de hirudíneo marcando la
presencia de glándulas con proteínas ácidas.
400X
Intestino
de rata
Método de ninhidrina - Schiff
Como la proteína constituye toda la parte
estructural de los tejidos, generalmente las
coloraciones para detectar proteína, no dan buena
información debida a lo intenso de la coloración.
Con la metodología clásica para las preparaciones
histológicas la mayoría de las proteínas dan una
ligera eosinofilia.
.
Proteínas:
Tabla completa de
determinaciones.
09
Otras técnicas específicas son:
1. método de Hartig – Zacharias (proteínas "siderófilas“, señalización);
2. método de Salazar (proteínas combinadas "tanófilas");
3. método de Morel y Sisley, variante de Lillie (tirosina);
4. método de Chèvremont y Fréderic (grupos tioles, SH);
5. bloqueo de grupos tioles, por sublimado y por yodo, con posterior revelado
(obtención de resultados negativos);
6. reducción de grupos tioéteres (S-S) a tioles con sulfuro de amónio y posterior
revelado;
7. detección de grupos tioéteres por comparación entre revelado de grupos tioles (5) y
revelado de grupos tioles y tioéteres (6), siempre con verificación por bloqueo;
8. método de Adams y Sloper con azul alcián o APFAA (grupos tioéteres, S-S);
9. método de Adams y Sloper, variante de Lillie o APAAA (grupos tioéteres, S-S);
10. APYAT (ácido peryódico – azul de toluidina);
11. APAAT (ácido peracético – azul de toluidina);
12. APFAT (ácido perfórmico – azul de toluidina) (las oxidaciones seguidas por
metacromasia con azul de toluidina ponen de manifiesto sustancias con grupos tioles y
tioéteres);
13. método de Pearse o APAS (grupos tioéteres, S-S);
14. método de Pearse, variante de Lillie o APFS (grupos tioéteres, S-S) y
15. método de Gomori o fucsina parahaldeído con oxidación (grupos tioéteres, S-S y
grupos tioles, SH).
Definiciones: Señalización: indica que existe la sustancia, pero no es específica y
necesita de una comprobación adicional. No es histoquímica. Sensibilidad: la
posibilidad de que estando la sustancia a detectar, sea revelada por el método.
Especificidad: un método histoquímico que señala bien una sustancia, sin errores.
.
Estudio del ovotestis:
de Biomphalaria glabrata
10
Escalas: 40
micrones
“Esfera amarilla” en atrio
Espermátidas Oocito
“Esfera “Maza
Colas de espermatozoides amarilla” caótica” Espermatozoides foráneos
Parafina, método de Hale
Corte fino, azul de toluidina
(mucopolisacáridos ácidos, azul claro)
Las esferas amarillas están compuesta de
Esfera
Acino del Espermatozoides
proteínas ácidas recicladas y
amarilla
ovotestis
mucopolisacáridos ácidos, derivados de la
Atrio
“maza caótica” del fondo de los acinos del
ovotestis y quedan retenidas en el atrio del
órgano. En ellos se ubican los espermatozoides
foráneos y son mantenidos hasta que se liberen
Masa
los oocitos desde los acinos. La fecundación se
caótica
produce en el atrio de la gonada.
Epitelio germinal Trofocitos
Oocito
.
Lípidos: inclusiones 1
11
Como los procedimientos para la inclusión en parafina no conservan los
lípidos, se necesita una metodología especial, donde no exista el uso de
alcoholes.
Tres técnicas:
Agua y Congelación
A. Preparación para cortes por congelación.
1. La pieza luego se ser fijada se lava y se congela en agua destilada.
2. Se monta en un crióstato y se realizan cortes de menos de 5 micrones.
3. Se depositan los cortes en agua destilada.
4. Se montan en portaobjetos (puede ser en cubreobjetos chicos) muy bien
limpios y sacar el exceso de agua.
Sí no es necesario proteger a los lípidos, se recomienda el colodionado:
5. Secar con cuidado con papel de filtro fino.
6. Cubrir con solución de celoidina (colodión) (0,05 a 0,1 %) en éter y alcohol absoluto.
7. Sacar el exceso de celoidina y se deja algunos segundos al aire sin dejar secar.
Cuando la celoidina se ha fijado, sumergir en agua destilada por 1 a 2 minutos, para
arrastrar el alcohol absoluto y el éter contenidos en los cortes y colorear.
El crióstato es un micrótomo de tipo Minot,
debido a que ocupa menos lugar, montado en
una cámara de congelación. Los comandos de
regulación, la cuchilla y el mecanismo de avance,
se encuentran dentro de la cámara, que está a
unos 20 °C bajo cero, y el volante de inercia, que
efectúa los cortes, permanece en el exterior.
También, dentro de la cámara, existen placas de
congelamiento rápido, para tratar a las piezas.
Se colocan orientados en el portataco metálico y
se congelan en la placa.
.
Lípidos: inclusiones 2
Impregnación con Azúcar y Congelación
12
B. Se puede utilizar el método de Hamilton, para impregnar la pieza y hacerla
más duras, se sigue especialmente cuando los órganos no resiste la
temperatura.
Solución A: disolver 142,5 g. de azúcar de caña pura en 150 ml de agua
destilada. Disolver calentando, cuando frío filtrar a través de muselina y luego
añadir formol hasta 3 %.
Solución B: disolver 2,8 g. de goma arábiga en 150 ml de agua destilada.
Suspender la goma arábiga dentro de un trozo de muselina en agua destilada.
Cuando se disuelva filtrar por muselina. Añadir formol hasta 2 %.
Mezclar ambas soluciones y usar. Puede ser que se tenga que diluir para
incluir más despaciosamente.
Luego congelar. No forma taco, pero no cristaliza.
Si bien la obtención de cortes por congelación es un método rápido y bueno,
cuando se necesita proteger el tejido de los lavados con alcoholes, y es
también, un muy buen método para preparar cortes histológicos con
coloraciones extemporáneas en los quirófanos; NO es una técnica utilizada
cuando se trata de invertebrados, debido a que se “desarman” cuando se
descongelan. Los órganos se pierden, “vuelan” por efecto de las corrientes de
líquidos. Para solucionar este problema y proteger los lípidos, es necesario
seguir otra técnica.
.
Lípidos: inclusiones 3
Impregnación con Gelatina y Congelación
13
C. Inclusión en Gelatina y cortes por congelación. Tejidos con lípidos.
1. Gelatina al 25 %, humedecer durante 24 horas, disolver al calor y filtrar,
agregar siempre un grano de timol a la parte filtrada y a filtrar;
2. Calentar a 37 °C, colocar el animal desde el agua de lavado y dejarlo por 24
horas;
3. Poner en molde de papel metalizado con una base algo gelificada, de unos
5 milímetros, orientar la pieza y terminar de gelificar en heladera;
4. Hacer el taco (como el de parafina) y retallar;
5. Fijar la gelatina y conservar en el líquido de Baker por 24 horas;
6. Lavar con agua destilada por 4 horas;
7. Preparación de portaobjetos:
a. una parte de gelatina al 25 % y 9 de agua destilada llevar a 60 °C; y
b. Sumergir el portaobjetos hasta que se caliente, escurrir, limpiar atrás y
secar;
8. Cortar por congelación y dejar los cortes en agua destilada, de allí sacar los
cortes y colocarlos en los portaobjetos preparados;
9. Fijar con vapores de formol;
10. Sumergir en el líquido de Baker hasta coloración.
Luego de la coloración se monta en gelatina glicerinada o cemento de Apáthy
(ver anexo Montado de la teórica de Invertebrados) y ocluir si necesario.
Sacar fotos testigos lo más rápido posible; muchas coloraciones pierden sus
límites con el tiempo y se opacan.
.
Lípidos: coloraciones y controles
14
La aplicación de técnicas químicas y bioquímicas sobre los cortes histológicos de
invertebrados, siguen los lineamientos generales para los vertebrados.
A continuación se dará una guía, presuntamente completa, de las sustancias que más
usualmente, son requeridas en los estudios sobre lípidos.
Pared izquierda, postootecal del
Para los procedimientos de histoquímica de
oviducto de Biomphalaria glabrata
lípidos, fijar con Baker o Ciaccio (bicromato de
potasio al 10 %, 50 ml; ácido fórmico al 1 %, 50 Escala:
ml; formol, 20 ml; agua destilada, 5 ml).
50 μm.
Se deben seguir los procedimientos predichos
sobre cortes por congelación, con o sin inclusión
en gelatina.
También se puede incluir en parafina si luego de
la fijación se procede a la poscromización
(insolubilización de lípidos) con bicromato cálcico
de Baker (bicromato de potasio, 5 g; cloruro de
calcio anhidro, 1 g; agua, 100 ml), de 7 a 15 días.
Los lípidos se pueden encontrar solos o
combinados con proteínas y/o glúcidos, los
combinados se pueden desenmascarar por:
1. fenol al 1 %;
2. lavado abundante en agua;
Negro Sudan B, poscromización con
bicromato cálcico de Baker durante 10 días.
3. ácido acético al 25 % y
Positivo en bases de células columnares.
4. ácido oxálico al 10 %.
Todos los métodos son revelados con negro
Referencias: cc = célula columnar,
Sudan B. Conviene hacer controles.
cl = célula ciliada, hc = hemocele,
Los sudanes son colorantes que se diluyen en lípidos.
lu = lumen.
.
15
Tabla de
Oviducto preootecal: determinaciones.
de Biomphalaria glabrata
Las técnicas a utilizar son:
1. negro Sudan B a temperatura ambiente
(lípidos líquidos);
2. negro Sudan B a 60 °C (lípidos sólidos);
3. método de Feyrter o metacromasia por
montaje con tionina – ácido tartárico
(lípidos ácidos, sulfátidos y fosfolípidos);
4. método de Lison, por autoxidación
(lípidos no saturados);
5. método de Pearse o APAS (lípidos no
saturados);
6. método de Pearse, variante de Lillie o
APFS (lípidos no saturados, fosfolípidos y
cerebrósidos);
7. método de Hayes (lípidos con grupos
acetálicos) y
8. método de Lorrain - Smith, variante de
Cain (lípidos neutros y con grupos
electronegativos).
A
A: Lipoproteínas por desenmascaramiento;
B: Método de Feyrter, metacromasia.
Referencias: cc = célula columnar, cg =
célula globosa, hc = hemocele, lu = lumen.
B
Los controles se deben hacer por
eliminación de lípidos con una mezcla de
partes iguales de cloroformo y metanol,
durante 12 horas a 40 °C. Se trata un par de
preparados homólogos, uno se deslipidiza, y Escalas 50 μm.
ambos se tratan con negro Sudan B.
cc
cg
.
Tabla de Pared de la cápsula
Histoquímica Especial: Amiloide determinaciones.
Amiloide 16
Puesta de huevos de Biomphalaria glabrata
Los métodos utilizados son:
1. método de Lendrum con Dahlia;
2. método de Bancroft con violeta de metilo;
3. método de Bennhold con rojo Congo,
modificaciones de Highman y de Puchtler, y
4. método con rojo Congo y birrefringencia.
Por comparación se pueden utilizar
controles con tejido afectado con
amiloidosis (piel o córnea humana).
400X
Siempre es un depósito extracelular y tiene
significado biológico como aislante y por su Sustancia gelatinosa Cáscara del huevo
Vitelo
alta higroscopía favorece al balance hídrico,
Método de Bennhold con rojo Congo,
intercambio de solutos y mantiene la
modificación de Puchtler y birrefringencia
temperatura constante.
Detección de pigmentos: De los pigmentos naturales no respiratorios (no
hematogénicos), que encontramos en los tejidos animales veremos los de origen
lipídicos: cromolipoides (ceroides y lipofucsinas) y los no lipídicos: las melaninas.
Los ceroides no representan nada más que una fase precoz de la constitución de los
lípidos lipofucsínicos, caracterizados por una oxidación poco pronunciada.
Las lipofucsinas pertenecen a un grupo heterogéneo de sustancias pigmentadas y
representan productos de oxidación de precursores lipídicos o lipoproteínas, pero su
carácter histoquímico presenta variaciones en función del origen, del lugar y del modo
de formación del pigmento, así como también su grado de oxidación.
Todos los lípidos en su primer estadio de oxidación reaccionan como los pigmentos
ceroides. La oxidación final de los ceroides produce las lipofucsinas.
.
17
Tabla completa de
determinaciones.
Serie de métodos para la constatación de los pigmentos cromolipoides.
En blanco, en cortes por congelación (ocre),
Se basan en su naturaleza lipídica
En blanco, en cortes a la parafina (ocre),
combinada con proteínas y su
Decoloración por peróxido (ocre),
resistencia a la oxidación .
Decoloración por ácido crómico (ocre),
Decoloración por ácido peryodico (ocre),
Son de color ocre a pardo
Prueba para fluorescencia (de naranja a pardo dorado),
escuro, son pigmentos
Método para lípidos (temperatura ambiente) (negro),
intracelular, y derivan de la
Método para lípidos (a 60 °C) (negro),
oxidación de lípidos y
Método para lípidos (desenmascarado) (negro),
lipoproteínas.
Basofilia: tionina al 0,5 %, pH 4,2 (azul o celeste),
Basofilia: azul de toluidina al 0,2 %, pH 4,2 (azul),
Reacción argentafín clásica de Masson con el líquido de Fontana (negro),
Método de Schmorl (reducción del ferricianuro) (azul o celeste),
Método de Perls (azul de Prusia) (ocre, -; algo celeste, -+; azul, +),
Método de Lillie (hierro ferroso) (ocre),
Método de Lillie azul de Nilo A (hidratado) (azul),
Método de Lillie azul de Nilo A (deshidratado) (azul),
Método de Hueck con azul de Nilo sulfatado (azul o celeste),
Método de Gomori (hematoxilina al cromoalumbre) (azul),
Reactivo de Schiff (fucsia a rosado),
Método de Hayes o reacción plasmal con sublimado - reactivo de Schiff
(acetalfosfátidos o plasmalógenos) (púrpura o violáceo),
Método de Lison, autoxidación con oxígeno atmosférico – reactivo de
Schiff (lípidos no saturados) (púrpura), y
APS (peryódico), APAS (peracético), APFS (perfórmico) (púrpuras).
Cromolipoides:
.
Cromolipoides:
Se debe comprobar además, su naturaleza ácida:
1. Método de Ziehl – Neelsen con fucsina básica alcohol ácido (acidorresistencia) (violeta);
2. Método de Lorrain – Smith, variante de Cain
con azul de Nilo concentrado y diluido (lípidos
ácidos) (azul o violáceo); y
3. Método de Feyrter o coloración por montaje
(lípidos ácidos) (verdoso o violeta).
Además como existe la posibilidad de que
sean carotenoides hay que descartarlos por:
Líquido de Lugol (ocre, negativo),
Solución de ácido sulfúrico (ocre, negativo)
Lipofucsina:
Los métodos a utilizar serán:
1. tionina 0,5 %, pH 4,2,
2. azul de toluidina 0,2 %, pH 4,2
3. Método de Schmorl
4. Método de Lorrain – Smith
5. Método de Ziehl – Neelsen.
18
H–E
Hígado
(40X)
Método de
Schmorl
Método de Lorrain – Smith
Referencias: cb = cuerpo
basófilo (cromolipoides), ea
= esferas amarillas, hc =
hemocele, ls = lumen del
glabrata.
acino, mt = matriz.
Basofilia con
azul de toluidina.
"Masa caótica" de
Escala: 50 μm.
Biomphalaria
.
Pigmento ceroide y lipofucsinas:
19
Las diferencias entre el pigmento ceroide y las lipofucsinas serían:
1. La basofilia aumenta con el grado de oxidación (pigmento ceroide → (oxigeno) →
lipofucsina), como indican los métodos de la tionina y el azul de toluidina.
2. Los métodos de Lison, APAS y APFS, revelan un mayor resultado positivo para las
lipofucsinas que para los ceroides. Esto se puede deber a una acentuada concentración
de lípidos insaturados (fosfolípidos), cuando se presentan. Además, en los ceroides
existirá una acentuada reacción positiva del APS, que demuestra el estado intermedio
de oxidación de lípidos insaturados, cuando estos se presentan.
3. Los ceroides sometidos a la luz fluorescente toman un color pardo dorado y las
lipofucsinas, un color naranja.
4. Las lipofucsinas dan positivo con el método de Lillie con azul Nilo A, sólo en las
preparaciones hidratadas, y el método de Gomori.
Los pigmentos ceroides, se detectan por su leve reacción positiva mediante el método
de Feyrter para los lípidos ácidos; positiva la reacción plasmal (método de Hayes); y
ser negativos con el método de Ziehl – Neelsen.
Los ceroides se señalan, como sustancias derivadas de la oxidación de lípidos no
saturados y con una alta ácidorresistencia, que derivarían hacia lipofucsinas.
Método de Ziehl – Neelsen.
Método de Hayes.
"Masa caótica" de
Nada violeta (-) Biomphalaria glabrata.
Púrpura (+)
Ceroides y precursores
Referencias: cb =
cuerpo basófilo,
hc = hemocele,
ls = lumen del acino,
mt = matriz.
Escala: 50 μm.
.
Determinación de lipofucsina:
20
Existe un nuevo método que comienza a ser utilizado denominado Método AFIP, del
Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas de los Estados Unidos, para determinar
específicamente a la lipofucsina.
Procedimiento: Fijar en formol 10 %, incluir en parafina y cortar en 6 micrómetros.
Desparafinar e hidratar. Colocar en la Solución de carbolfucsina de Kinyoun (fucsina
básica, 4 g; fenol cristalizado (ácido carbólico), 8 g; alcohol etílico 95 %, 20 ml; agua
destilada, 100 ml), durante una hora. Enjuagar con agua destilada varias veces.
Diferenciar con una solución de alcohol 70 % al 1 % de ácido clorhídrico, sumergiendo
los preparados de 5 a 6 veces, o hasta que las secciones se tornen de color rosa pálido.
Lavar con agua corriente durante 5 minutos y luego enjuagar con agua destilada.
Contrastar con una solución de ácido pícrico al 2 %, durante 1 minuto
aproximadamente. Deshidratar y aclarar con alcohol etílico al 95 %, alcohol etílico
absoluto y xilol, 2 veces y por 2 minutos con cada uno. Resultados: lipofucsina, roja y
fondo, amarillo. Los pigmentos muestran un color parduzco fluorescente bajo luz
Hígado
(40X)
Baso
ultravioleta.
Las fotos son de la
publicación de I. Hernández
Melendi, E. Boix Valdez, A.
Govin Chávez, S. Suárez
Argüelles. Hospital Pediátrico
Docente, Juan Manuel
Márquez, CUBA
.
Melanina:
Tabla completa de determinaciones.
21
La melanina es un pigmento intracelular granuloso, de color amarillo, pardo o negro,
que proviene de la acción de la tirosinasa sobre la tirosina y sus derivados.
Las técnicas a utilizar son:
1. decoloración por permanganato de potasio al 0,1 % y al 0,25 %;
Estrategias para el estudio de la melanina:
2. decoloración por ácido peryódico;
1. Reducción por reacción de Schmorl;
3. decoloración por ácido peracético;
2. Reacción de Masson o argentafín clásica,
4. decoloración por ácido crómico;
con el líquido de Fontana;
5. decoloración por ácido nítrico;
3. Captura del ión ferroso, método de Lillie; y
6. decoloración por peróxido de hidrógeno;
4. Las técnicas de decoloración.
7. decoloración por el método de Gomori (mezcla permangánica – sulfúrica);
8. decoloración por el método de Mayer (cloro naciente);
9. basofilia con tionina al 0,5 %, pH 4,2;
Escala: 10 μm.
10. reacción de Masson o argentafín clásica, con el líquido de Fontana;
11. reacción de Schmorl (reducción del ferricianuro);
12. método de Perls (azul de Prusia);
13. método de Lillie, con el hierro ferroso;
14. método de Hueck con azul de Nilo sulfatado;
15. método de Lillie, con el azul de Nilo;
16. APS;
17. APAS y
18. APFS.
Hipodermis con
melanosomas.
Método de Lillie,
con el hierro
ferroso
Células de pigmento ocre
por fuera de los acino de
Biomphalaria glabrata
Reacción
de Schmorl
.
Calcio iónico como carbonatos, oxalatos y fosfatos.
22
El calcio iónico, común en invertebrados, es señalizado por la formación de lacas, quelación y
sustitución. Las lacas están basados en colorantes específicos (azul alcian, purpurina, azul Luxor
sólido, alizarina S), o mediante la utilización de metales pesados (cromo, mercurio, cobalto, plata).
Ejemplificaremos, con el método de plata de Von Kossa (según Gomori).
Fijación: alcohol absoluto 60 mL, cloroformo 40 mL o alcohol formolado (partes iguales de alcohol
absoluto y formol comercial neutralizado; puede bajarse la concentración de formol hasta 10 %.
Metodología con doble control:
1. 4 (A, B, C y D) preparados de cortes histológicos hidratados.
2. Tratar dos preparados (A y B) con alcohol ácido (alcohol absoluto con ácido clorhídrico al 0,5 %).
3. En todos los preparados sustituir el calcio con solución de nitrato de plata al 2 %, durante una
hora. A y C en oscuridad, y B y D bajo la luz.
La diferencia entre
4. Enjuagar con agua destilada, tres veces, 3 minutos.
con luz y sin luz
5. A y C reducir con solución acuosa de pirogalol al 1 %, durante 2 o 3 minutos.
sólo es para
6. Enjuagar A y C con agua destilada, tres veces, 3 minutos.
comparar
7. En todos los preparados fijar con hiposulfito de sodio al 5 % por medio minuto. reducciones.
8. En todos coloración de contraste, deshidratar y montar.
Reacción de
encapsulamiento
de huevos de
helmintos en
tejido de
vertebrados.
Sólo con
coloración
nuclear de
fondo.
Malacoplaquia en ilion humano y en riñón de oveja.
Von Kossa, H – E (malo)
.
23
Cobre:
Como ejemplo de la señalización de metales pesados, propondremos la relacionada con el cobre, ya
que es un metal contaminante que suele ser utilizado en estudios sobre contaminación y debe ser
señalizado, mediante cortes histológicos indicando el lugar de depósito, transitorio o permanente.
Si bien tiene importancia histórica el revelado mediante la coloración de ácido rubeánico o
ditioxamida, indicaremos el método con rodanina (DMAB rodanina).
Fijación: formaldehído al 4 % neutralizado es el mejor, eventualmente otro que no agregue cobre.
Soluciones: Madre: 1 diluir 0,2 mg de 5 – (p-dimetilaminobenzilida) rodanina en 100 mL de alcohol
absoluto hasta color sangre, es una solución saturada, pueden quedar cristales en el fondo.
Trabajo: 1,5 ml de madre en 50 mL de agua destilada.
Metodología:
1. Cortes histológicos hidratados.
2. Tratar con la solución de trabajo de rodanina, durante 3 horas a 60 °C. Revisar cada 30 minutos.
3. Enjuagar con agua destilada, tres veces, 3 minutos.
4. Coloración nuclear de fondo a la hematoxilina (cualquiera).
5. Azulado de la coloración nuclear en agua corriente, nunca soluciones amoniacales.
6. Deshidratar, aclarar y montar.
Acumulación
patológica
de cobre en
hígado de
humanos
Helix pomatia
(Gastropoda),
caracol de jardín,
contaminado.
Tejido conectivo
de la glándula
digestiva.
.
Detección de la neurosecreción:
24
Neurosecreción es el fenómeno que presenta el tejido nervioso de secretar sustancias
químicas, consideradas como neurohormonas. En los invertebrados estas sustancias
son evidentes en el mismo tejido nervioso, en los órganos neurohemales y en las
sinapsis, como mediador químico entre neuronas. Los sistemas nerviosos que
evidencian actividad neurosecretora, indican aumento del metabolismo, y asociado con
momentos de la vida del animal como la reproducción, la muda, la metamorfosis, etc.
Para asociar esta secreción con el sistema nervioso, necesitamos vincular mediante
estudios histológicos estos dos fenómenos, constatando que la supuesta
neurosecreción emana del sistema nervioso.
Para esto se propone dividir el estudio en cuatro pasos:
Primer paso: comprobación del tejido nervioso.
Segundo paso: comprobación de la extensión del sistema nervioso.
Tercer paso: constatación de la inervación en cortes histológicos.
azul de toluidina,
Cuarto paso: estudio de la neurosecreción.
pH 4,5
Primer paso: comprobación del tejido nervioso.
Las neuronas se determinan por la presencia
de los cuerpos de Nissl, que no son más que
unidades del retículo endoplasmático granular
diseminado en el citoplasma del cuerpo
neuronal. Cualquier colorante básico puede ser
usado para su detección como la tionina; pero
la más sencilla es la coloración ortocromática
del azul de toluidina, o coloración de Nissl,
seguida de la deshidratación mediante alcohol
etílico de los cortes histológicos.
15 micrómetros
.
Detección de la neurosecreción:
25
Segundo paso: comprobación de la extensión del sistema nervioso.
Son coloraciones en masa, en bloque o “in toto”, donde se puede apreciar la
conformación del sistema nervioso y la inervación de las neuronas, mediante la
visualización de las neurofibrillas que presenta. Los cuerpos de Nissl no están en toda
la neurona, sólo en el cuerpo neuronal.
Son técnicas que no siempre dan buenos resultados, pero que son altamente
necesarias para saber si estamos en presencia de un órgano neurohemal; o como esta
inervado un órgano en particular, especialmente si posee componentes musculares y
hay que saber de su dinámica; etc.
Ganglio nervioso de
Hirudo medicinales
Dos métodos son utilizados:
(1891). Azul de
1. Resulta de una modificación de la
metileno
técnica original de Ehrlich: la pieza de
tejido vivo, debe ser lo más chica posible;
puede ser un trozo de la pared del cuerpo,
una porción de órgano hueco, una glándula El método del azul de
metileno (variante de
en su totalidad, órganos reproductores,
la técnica original de
sistema nervioso aislado, ganglios, etc. La
Ehrlich fue utilizado
pieza es colocada en una solución al 1 %
por Ramón y Cajal
de azul de metileno en solución de cloruro
para demostrar la
existencia de las
de sodio isotónica (solución fisiológica
espinas dendríticas,
isoosmótica, entre 6 y 8 de salinidad por
con un método de
litro), durante una hora y exponer al aire
tinción diferente al
para su oxidación completa (hasta un día).
método de Golgi, con
El color se fija con una solución al 10 % de
plata. Células de
molibdato de amonio, durante 10 minutos.
Purkinje del cerebelo
Se lava bien, se deshidrata y se lo monta.
(método de Ehrlich).
.
26
Detección de la neurosecreción:
Segundo paso: comprobación de la extensión
del sistema nervioso. (continuación)
2. Modificación del método de Ramón y Cajal o
impregnación argéntica en bloque: fijar la pieza
en 50 ml de alcohol 96 % con el agregado de 4
gotas de amoníaco (hidróxido de amonio al 28 %,
solución saturada), durante 24 o 48 horas según
el tamaño de la pieza. Lavar rápidamente e
impregnar en una solución de nitrato de plata al 1
% a 40 °C, durante una semana. Reducir con
ácido pirogálico (hidroquinona) al 1 %, con 10 %
de formol, durante 24 horas, la última hora subir
la temperatura a 40 °C; lavar y virar al oro con
una solución de cloruro de oro al 0,2 %, durante 5
minutos y fijar el color con hiposulfito de sodio al
5 %, durante 2 minutos. Se necesita ajustar al
material utilizado.
Células sensitivas de la lombriz de tierra con
el cuerpo celular que reside en el epidermis
Epidermis
Ganglio
A
Técnica de
Ramón y
Cajal
Cerebelo
100X
A. Redes intersticiales situadas en
el sarcoplasma de las fibras
musculares de las alas de los
insectos.
B. Redes horizontales dobles en
los músculos de las patas.
B
.
Detección de la neurosecreción:
Tercer paso: constatación de la inervación en cortes histológicos.
1. Método de Klüver-Barrera:
Zona
(mielina y células nerviosas)
limítrofe
entre
Se puede aplicar sobre cortes desparafinados hasta
sustancia
de 20 micrómetros, fijados en formaldehído.
Procedimiento en la Guía de Trabajos Prácticos.
Resultados: La mielina y todo los fosfolípidos quedan desde
azul claro hasta verde y las células, de rosa a violeta.
2. Impregnación Argéntica de Tolivia:
Procedimiento en la Guía de Trabajos Prácticos.
Resultados: La plata (negro)
precipita en los axones, dendritas
y en la cromatina.
Sustancia gris de medula espinal
500X
gris y blanca
de medula
espinal
Cerebro, Neocórtex
(sustancia gris) con
sus 6 capas.
27
400X
400X
Meninges
Sustancia
blanca
.
Detección de la neurosecreción:
28
Cuarto paso: estudio de la neurosecreción.
Habiendo determinado la naturaleza nerviosa del tejido, se procede a una postfijación;
una oxidación permangánica; una determinación de la naturaleza basofílica o
acidofílica; y entonces se puede utilizar una coloración general para visualizarla.
La postfijación se realiza con el líquido de Bouin cromado (100 ml de Bouin con el
agregado de 4 g de alumbre de cromo), durante 24 horas a 40 °C. Oxidar con el
oxidante de Gomori (15 ml de permanganato de potasio al 2,5 %; 15 ml de ácido
sulfúrico al 5 %; 90 ml de agua destilada), tratado durante 30 a 60 segundos.
Decolorar con bisulfito de sodio al 5 %. Continuar con una determinación de basofilia.
Las coloraciones más utilizadas (luego de postfijar y oxidar) son:
1. producto de secreción es acidófilo
Tricrómico de Mallory (Azan de Heindenhain):
Procedimiento en la Guía de Trabajos Prácticos.
Resultados: secreción, roja o azul.
2. producto de secreción es basófilo
Fucsina paraldehído (solución comercial):
Dos tipos de
células
fucsinófilas del
ganglio óptico
del tentáculo,
botón terminal.
1. Cortes perfectamente hidratados luego de
haber sido refijados y oxidados.
2. Colorear durante 5 minutos por la solución
Centro del
de uso acidificada de fucsina paraldehído.
neuropilo del
3. Lavar con agua destilada.
nervio óptico
4. Aclarar el fondo con alcohol absoluto con
con secreción
0,5 % de ácido clorhídrico, 3 minutos.
5. Lavar por unos segundo con agua destilada
fucsinófila,
o alcohol 70 %.
indicando
6. Coloración de contraste (eosina acuosa o
neurosecreción.
alcohólica).
Caracol: Helix aspersa
7. deshidratar, aclarar y montar.
.
Ejemplos de Neurosecreción:
Casos de neurosecreción encontrados:
Cuidado: primero descartar la
presencia de lipofucsinas.
29
Basofilia
600X
Neuropilo del cordón nervioso
ventral de Trulliobdella capitis.
Tricrómico de Masson modificado
Tricrómico de Masson
modificado
400X
Basofilia
Estas paraneuronas muy posiblemente
estén relacionada con la descarga de
albumen al carrefour, en el momento en
que un oocito ya fecundado pasa por él.
Órgano sensorial epitelial de
Trulliobdella capitis un hirudíneo marino.
Referencias: al = albumen; el = epitelio;
flecha: paraneuronas
Epitelio del carrefour de
Biomphalaria peregrina.
Tri - APS.
Escala: 50 μm.
Se debe hacer notar que esta neurosecreción puede estar relacionada a un ciclo
secretor y que por lo tanto, no es constante en el tiempo.
.
30
Índice:
Temas:
Pantallas:
Introducción a la histoquímica.
02
Detección de Hidratos de carbono.
04
Detección de Proteínas.
08
Detección de Lípidos.
11
Histoquímica Especial: Amiloide.
16
Histoquímica Especial: Pigmentos.
16
Histoquímica Especial: Calcio.
22
Histoquímica Especial: Cobre.
23
Estudio de la Neurosecreción.
24
.
31
François Vincent Raspail
(1794 - 1878)
Padre de la Histoquímica
"Omnis cellula e cellula"
Λ=Զ=Z
MATERIAL DE DOCENCIA PARA CONSULTA
No utilice este material didáctico fuera de contexto.
Si no es capaz de desarrollar algo semejante, cite la fuente.
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