ABORTO ENZOÓTICO DE LAS OVEJAS (Clamidiosis ovina)

CAPÍTULO 2.4.7.
ABORTO ENZOÓTICO DE LAS OVEJAS
(Clamidiosis ovina)
RESUMEN
El diagnóstico del aborto enzoótico, también conocido como clamidiosis ovina o aborto clamidial de
las ovejas, depende del aislamiento e identificación del agente causal o de la detección del agente
o su ácido nucleico en los productos del aborto o en las secreciones vaginales de hembras recién
abortadas. Después del aborto se puede detectar una respuesta humoral de anticuerpos. Las
cabras y las ovejas, y en menor medida el ganado vacuno y los cérvidos, pueden resultar
afectados. La clamidiosis de los pequeños rumiantes es una zoonosis y el microorganismo debe
manejarse con precauciones de bioseguridad. Las mujeres embarazadas son particularmente
susceptibles. El microorganismo causante, Chlamydophila abortus, se designaba anteriormente
como inmunotipo 1 de Chlamydia psittaci.
Identificación del agente: Las bases para un diagnóstico positivo de la infección por C. abortus
dependen de la historia de abortos en las ovejas y las cabras (a menudo en las últimas fases de la
gestación), la evidencia de placentitis necrótica y la demostración de un gran número del
microorganismo en frotis teñidos de las placentas afectadas. También resultan útiles la lana aún
húmeda de los fetos y los frotis vaginales de las hembras que acaban de abortar. Se requiere
precaución para distinguir el daño a los cotiledones causado por Toxoplasma gondii y, en frotis
teñidos, ser consciente de las similitudes morfológicas entre C. abortus y Coxiella burnetii, el
agente causante de la fiebre Q.
El antígeno de la clamidia se puede detectar por enzimoinmunoensayo o por la prueba de
anticuerpo fluorescente, y el ADN de clamidia puede detectarse por la reacción en cadena de la
polimerasa. Las dos primeras pruebas están disponibles en forma de preparaciones
comercializadas.
Chalamydophila abortus sólo puede aislarse sobre células vivas; por tanto, se requiere disponer de
servicios para el cultivo en embriones de pollo y en cultivos celulares, con las correspondientes
medidas en cuanto a contención de biorriesgos.
Pruebas serológicas: Después del aborto o del nacimiento de la cría muerta es frecuente un
aumento del título de anticuerpos contra C. abortus, detectable por fijación de complemento (FC),
pero esto no ocurre siempre. Chlamydophila abortus comparte antígenos comunes con C. pecorum
y algunas bacterias Gram–negativas, de modo que la prueba de FC no es por completo específica
ni distingue entre respuestas a la vacunación o a la infección. Los títulos bajos de FC deben
interpretarse con precaución, sobre todo si corresponden a individuos o miembros de rebaños sin
historia precedente de aborto.
Se han desarrollado pruebas serológicas alternativas pero hasta la fecha ninguna se ha valorado lo
suficiente para su utilización en el campo. En ovejas infectadas se puede inducir una reacción de
hipersensibilidad retardada al antígeno de la clamidia, pero el procedimiento no es adecuado para
una utilización rutinaria.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se dispone de vacunas
inactivadas y de vacunas vivas que se han descrito capaces de evitar el aborto y reducir la
excreción. Ayudan en el control de la enfermedad pero no la erradican. El análisis serológico
durante el periodo post–parto facilita la identificación de rebaños infectados, sobre los que se
pueden aplicar a continuación medidas de control.
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Capítulo 2.4.7. — Aborto enzoótico de las ovejas (clamidiosis ovina)
A. INTRODUCCIÓN
El aborto por clamidias en la fase terminal de la gestación (aborto enzoótico de las ovejas, aborto enzoótico
ovino) provoca importantes pérdidas de producción en muchas áreas del mundo dedicadas a la cría ovina,
particularmente cuando los rebaños se juntan durante el período de partos (1,16). Los animales infectados no
muestran enfermedad clínica antes del aborto. La patogénesis se inicia sobre los 90 días de gestación,
coincidiendo con una fase de rápido crecimiento fetal, cuando la invasión de las placentas por las clamidias
produce una reacción inflamatoria difusa y progresiva, vasculitis trombótica y necrosis tisular. En el hígado fetal y
en los pulmones ocurren cambios menos drásticos y, en casos en que el daño placentario es grave, puede
presentarse daño cerebral debido a hipoxia (5). El aborto es probablemente el resultado de una combinación de
alteraciones en la alimentación materno–fetal y en el intercambio gaseoso, perturbaciones en la regulación
hormonal del embarazo y agresión inducida por citokinas (7).
El aborto ocasionado por clamidias también ocurre en cabras y, con menos frecuencia, en vacas y ciervos. En
ovejas, el aborto en la fase terminal de la gestación con expulsión de las membranas fetales necróticas
constituye un indicador clave del diagnóstico, aunque hay que tener cuidado en distinguir este tipo de necrosis
difusa de la causada por Toxoplasma gondii (que afecta sólo a los cotiledones). Mediante microscopía y/o por
cultivo se puede diferenciar de otras causas de aborto infeccioso, como brucelosis (ver Capítulo 2.4.2.),
coxiellosis (ver Capítulo 2.2.10.) y otros patógenos bacterianos (Campylobacter [ver Capítulo 2.10.8.], Listeria
[ver Capítulo 2.10.14.], Salmonella [ver Capítulo 2.10.3.]).
Taxonómicamente, la familia Chlamydiaceae se divide en dos géneros y nueve especies por el análisis de la
secuencia de los genes del ARNr 16S y 23S (9). El género Chlamydia incluye C. trachomatis (humanos), C. suis
(cerdos) y C. muridarum (ratón y hámster). El género Chlamydophila incluye C. psittaci (aves), C. felis (gato),
C. abortus (ovejas, cabras y vacas), C. caviae (cobayas), la antigua especie C. pecorum (ovejas y vacas) y
C. pneumoniae (humanos). Los dos géneros y las nuevas especies tienen entidad tanto en lo que respecta a
estructura molecular como en el rango de hospedadores y en la enfermedad clínica que producen. Las especies
muestran un notable grado de correlación con el hospedador, el síndrome que producen y la virulencia, lo que
ayuda a comprender la epidemiología de las distintas especies y serotipos que afectan a los mamíferos y a las
aves. Los términos “clamidiosis” y “clamidias” se emplean para referirse a miembros de cualquiera de los dos
géneros. Sin embargo, se utiliza una designación binomial de género y especie cuando se designa el nombre de
una especie particular de clamidia.
Las hembras infectadas excretan un gran número de C. abortus infectiva al tiempo del aborto o el parto, sobre
todo con las descargas placentarias y uterinas (20). La infección humana puede adquirirse de tales fuentes o de
cultivos de laboratorio manejados con descuido, con efectos que varían desde una infección subclínica a una
enfermedad aguda semejante a la gripe. Deben tomarse precauciones adecuadas cuando se manejan cultivos y
tejidos potencialmente infectados (ver Capítulo I.1.6. Seguridad humana en el laboratorio veterinario de
Microbiología). Casos reales de placentitis y aborto en humanos, causados por C. abortus de origen ovino,
indican que las mujeres embarazadas presentan un riesgo especial y no deben ser expuestas a las fuentes de
infección (6, 16),
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
a)
Frotis
Cuando la historia clínica del rebaño y el carácter de las lesiones de la placenta en el aborto sugieren un
aborto enzoótico, se puede realizar un diagnóstico por examen microscópico de frotis del vello coriónico o
de corion adyacente. Algunos procedimientos de tinción resultan satisfactorios, por ejemplo, el de
Machiavello modificado, el de Giemsa, el diferencial para Brucella, o la tinción de Ziehl–Neelsen modificada
(24). En casos positivos teñidos con el último método se pueden ver por examen microscópico con alta
resolución gran número de pequeños cuerpos elementales cocoides (300 nm) aislados o en grupo
destacando sobre un fondo azul de restos celulares. Bajo iluminación en campo oscuro, los cuerpos
elementales son de color verde pálido. Si no se dispone de material placentario se pueden realizar frotis de
las vaginas de hembras que han abortado en las últimas 24 horas o de la lana húmeda de un aborto
reciente o de un cordero nacido muerto que no haya sido limpiado por su madre. En general, tales
preparaciones contienen menos microorganismos que los frotis placentarios.
Por su morfología y propiedades tintoriales C. abortus se parece a la rickettsia Coxiella burnetii que, en
algunas circunstancias, puede provocar abortos y que, en humanos, origina la fiebre Q. Se debe tener
cuidado en diferenciar ambos organismos en casos en los que no exista una buena historia de evidencia de
patología placentaria inducida por clamidias. Las diferencias antigénicas entre C. abortus y Coxiella burnetii
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Capítulo 2.4.7. — Aborto enzoótico de las ovejas (clamidiosis ovina)
se pueden detectar serológicamente. Para la identificación de C. abortus en los frotis se pueden utilizar
pruebas de anticuerpo fluorescente (FAT) con un suero específico o un anticuerpo monoclonal.
b)
Detección del antígeno
Se dispone de varias pruebas comerciales para detectar antígenos de clamidias a nivel de género. Un
ensayo comparativo de tales pruebas, con material no ovino, indicó que aquellas que utilizan la metodología
del enzimoinmunoensayo son más sensibles que las preparaciones comercializadas que emplean FAT (29).
Bajos las condiciones de utilización usadas, se estimó que, de entre los sistemas rápidos basados en
ELISA que se investigaron, el más sensible fue un kit (Clearview, Unipath) que detecta el lipopolisacáido
(LPS) de las clamidias. Aunque en ocasiones originaba resultados positivos falsos, sobre todo con muestras
fecales de aves, el kit también dio resultados satisfactorios con muestras de placenta ovina (28).
c)
ADN
La amplificación del ADN de las clamidias por la reacción en cadena de la polimerasa representa una vía
alternativa para comprobar la presencia de clamidias en muestras biológicas sin recurrir al cultivo. La PCR
es muy sensible para estos fines (27) pero presenta el riesgo de contaminación cruzada entre las muestras,
de modo que se deben de tomar las medidas apropiadas para evitar que esto suceda (ver Capítulo I.1.8.).
Otro problema potencial es la producción de resultados negativos falsos por la presencia de substancias
inhibitorias de la PCR en las muestras. Se han descrito métodos para diferenciar entre secuencias de ADN
amplificadas a partir de C. abortus y C. pecorum (8, 14, 15). En la actualidad, estas técnicas son
fundamentalmente técnicas de investigación pero están comenzando a introducirse en los laboratorios de
diagnóstico.
d)
Secciones de tejidos
Mediante tinción con Giemsa de cortes finos (< 4 µm) de tejidos fijados adecuadamente en soluciones como
las de Bouin o Carnoy, se pueden evidenciar inclusiones intracelulares de clamidias. Se pueden obtener
resultados más llamativos por procedimientos de tinción inmunológica. El método directo de la
inmunoperoxidasa (10) es rápido y sencillo, mientras que el de la estreptavidina–biotina es más complejo
(25). Para diferenciar las clamidias de Coxiella burnetii también se puede utilizar microscopía electrónica
usando tinción negativa.
e)
Aislamiento del agente
Chamydiophila abortus se puede aislar en huevos embrionados de gallina o en cultivo celular. Éste último
es el método de elección para el aislamiento de cepas nuevas. El agente causal de la clamidiosis es
zoonósico (16) y por tanto los procesos de aislamiento e identificación deben realizarse bajo un nivel de
contención apropiado como se indica en el capítulo I.1.6. Seguridad humana en el laboratorio veterinario de
Microbiología.
Deben mantenerse en un medio de transporte adecuado las muestras de tejido, como cotiledones
infectados, membranas placentarias, pulmón o hígado fetal, o los frotis vaginales que puedan tener que
esperar antes de iniciar el proceso de aislamiento. El medio más satisfactorio es medio con
sacarosa/fosfato/glutamato suplementado con 10% de suero fetal bovino, antibiótico (estreptomicina y
gentamicina son adecuados, pero no penicilina) y un inhibidor fúngico (23). Normalmente se utiliza una
relación de 1:10 entre el tejido y el medio. Alternativamente, se homogeniza aproximadamente 1 g de tejido
con arena estéril en 8 ml de medio de transporte.
Embrión de pollo: Las muestras se preparan como suspensiones al 10% en caldo nutritivo con
estreptomicina (no penicilina) (200 µml); 0.2 ml de esta suspensión se inoculan en el saco vitelino de
embriones de 6–8 días de incubación, que se incuban entonces a 37°C. Los embriones infectados mueren
entre 4 y 13 días tras la inoculación. Las improntas preparadas a partir de sus sacos vitelinos
vascularizados revelan la presencia de gran cantidad de cuerpos elementales.
Cultivos celulares: Se puede aislar Chlamidophila abortus en muchos tipos celulares, pero las células
McCoy, BGM o de riñón de hámster neonato (BHK) son las que más se utilizan. Para diagnóstico
confirmativo, se suspenden en medio de crecimiento monocapas de células cultivadas a una concentración
de 2 x 105 células/ml. Porciones de 2 ml de la suspensión se depositan en botellas de fondo plano, cada
una de las cuales contiene un único cubre de 16 mm. Después de incubar durante 24 horas a 37°C se
obtienen monocapas confluentes sobre el cubre. Se elimina el medio de crecimiento y se sustituye por 2 ml
del inóculo de prueba, centrifugando a continuación a 2.500 g durante 30 minutos para favorecer la
infección sobre la monocapa del cubre. Después de incubar 2–3 días, las monocapas sobre el cubre se
fijan con metanol y se tiñen con Giemsa o se sigue el método de Giménez (3, 11). Después de la fijación
con metanol, los cultivos infectados contienen inclusiones intracitoplásmicas basófilas (Giemsa) o
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eosinófilas (Giménez). Para la preparación de antígeno se siguen procedimientos similares de cultivo de
C. abortus. Se pueden emplear también las técnicas FAT con igual eficacia.
La actividad de las clamidias puede aumentarse por tratamiento químico de las células cultivadas, antes o
durante la infección, favoreciendo el crecimiento de las clamidias. Entre las varias substancias que se han
descrito para incorporar al inóculo infectivo al que se exponen las monocapas sobre los cubres están:
cicloheximida (0.5 µg/ml) en el medio de mantenimiento, emetina (1µg/ml) durante 5 minutos antes de la
infección, y 5–yodo–2–deoxiuridina (80 µg/ml) durante 3 días antes de la infección. A menos que se
disponga de células preacondicionadas, el último procedimiento requiere mucho tiempo para un aislamiento
del agente con éxito.
2.
Pruebas serológicas
El procedimiento más empleado para la detección de la infección es la fijación de complemento (FC) (ovejas y
cabras se analizan generalmente en los tres meses que siguen al aborto o parto). La prueba también detectará
evidencias de vacunación. Principalmente, la infección se observa durante la invasión placentaria activa en el
último mes de la gestación y después de la bacteriemia que a menudo acompaña al aborto. Por consiguiente, los
sueros pareados recogidos al tiempo del aborto y después de 3 semanas pueden revelar un título de anticuerpos
FC que permita establecer un diagnóstico retrospectivo. Las reacciones antigénicas cruzadas entre C. abortus y
C. pecorum, así como con algunas bacterias Gram–negativas (por ejemplo, Acinetobacter) pueden originar
algunos resultados positivos falsos en la prueba FC. Por tanto, títulos menores que 1/32 en animales individuales
deben considerarse inespecíficos para C. abortus, aunque también pueden deberse a una infección de bajo
grado con C. abortus.
El antígeno se prepara de membranas del saco vitelino densamente infectadas, que se obtienen de embriones
de pollo inoculados de la misma manera que para el aislamiento del organismo a partir del material de campo. La
preparación del antígeno debe realizarse en cabinas de bioseguridad con las precauciones adecuadas para
evitar la infección humana (ver Capítulo I.1.6). Las membranas cortadas y homogenizadas se suspenden en
tampón fosfato, pH 7,6, a razón de 2 ml por membrana. Después de eliminar los restos, el sobrenadante se
centrifuga a 10.000 g durante 1 hora a 4°C, el precipitado se resuspende luego en un pequeño volumen de
solución salina y se examina un frotis de esta preparación para comprobar un alto contenido en clamidias. La
suspensión se mantiene 20 minutos en un baño con agua hirviendo o se autoclava y se añade como conservante
azida sódica (0,3%). El antígeno también se puede preparar de cultivos celulares infectados con C. abortus. Las
monocapas infectadas se suspenden en tampón fosfato, pH 7,6, y las células se lisan por homogenización o
ultrasonicación. Se eliminan los residuos y el proceso es similar al de la preparación del antígeno a partir de
sacos vitelinos infectados. En los dos casos, las pruebas FC con complemento y antisueros estándar
determinarán la dilución de trabajo óptima para cada lote de antígeno.
Las respuestas serológicas a C. abortus y C. pecorum se pueden evidenciar por microinmunofluorescencia
indirecta, pero el procedimiento es demasiado largo a los efectos de un diagnóstico rutinario. Las pruebas ELISA
desarrolladas independientemente por varios grupos de investigación no se han adaptado al trabajo del
diagnóstico general, debido en parte a las dificultades asociadas al uso de antígenos particulados. No obstante,
se ha utilizado con muestras experimentales y de campo un nuevo ELISA que incorpora un antígeno soluble y
estable y que ha dado resultados que, aunque carecen de especificidad de especie, presentan una mayor
sensibilidad que los de la prueba FC (2, 13). Hay que destacar el reciente desarrollo de la tecnología de los
anticuerpos monoclonales en una prueba ELISA competitiva (22) y de la tecnología de los antígenos
recombinantes en pruebas ELISA indirectas (4, 17, 18) para diferenciar entre anticuerpos contra C. abortus y
contra C. pecorum.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO
Las vacunas inactivadas pueden prepararse de sacos vitelinos infectados o de cultivos celulares (12) e
incorporan microorganismos completos o fracciones de los mismos (26), utilizando precauciones apropiadas de
bioseguridad para evitar la infección en humanos (ver Capítulo I.1.6.). Una vacuna recombinante para C. abortus
continúa siendo un objetivo futuro. Una aproximación alternativa ha sido el desarrollo por inducción química de
un mutante del microorganismo sensible a la temperatura (21). En la actualidad existen dos tipos de vacunas
disponibles comercialmente, que se administran intramuscular o subcutáneamente antes de la reproducción para
ayudar a evitar abortos. Cada una desarrolla un papel en el control de la enfermedad, pero ninguna confiere
protección total contra el estímulo natural. Una vacuna incorpora C. abortus inactivado en una suspensión de
aceite como adyuvante y se supone que protege al menos durante 2 años tras la vacunación primaria. La otra
utiliza un mutante vivo liofilizado sensible a la temperatura de C. abortus que se reconstituye en diluyente
inmediatamente antes de la administración. Los animales vacunados expuestos a la infección experimentan
menor frecuencia de abortos y una excreción reducida de clamidias durante al menos tres partos después de la
vacunación. Se resalta el cuidado que debe tener el operador en el manejo y administración de la vacuna viva.
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Se ha descrito que la vacuna viva reduce mucho la excreción de las clamidias y que evita el aborto, y se
considera que puede suponer una ayuda para la erradicación (19).
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo
Son adecuados uno o más aislados a partir de aborto ovino que crezcan repetidamente de modo productivo
en el substrato elegido y que permitan establecer un stock de inóculo con un número bajo de pases.
Alternativamente, se puede usar un aislamiento que se haya adaptado al embrión de pollo por muchos
pases (>100). Esto permite usar gran parte del embrión para la producción de vacuna. Aunque la
adaptación al embrión puede disminuir la virulencia del aislamiento para ovejas, no hay evidencia de que tal
cambio reduzca su eficacia protectora como vacuna inactivada.
b)
Método de cultivo
Para aislamientos con pocos pases, los procedimientos descritos para la preparación del antígeno FC se
pueden adaptar y amplificar de modo adecuado para la producción en masa. Una vez que se obtiene la
suspensión final, se toma una alícuota para la titulación de la infectividad. El resto se trata con formalina a
una concentración final de 0.4% y se almacena hasta que las pruebas de esterilidad confirmen que la
inactivación es completa.
c)
Validación como vacuna
Antes de inocular un gran número de embriones o cultivos celulares, debe comprobarse la viabilidad y la
ausencia de contaminación de los inóculos de siembra. Puede ser conveniente disponer la masa total en
lotes manejables separados. En este caso, debe titularse por separado la infectividad de una alícuota de
cada lote para asegurar que cada lote cumple los requisitos (ver sección C.2. más adelante). Se almacenan
en condiciones refrigeradas.
2.
Método de producción
La masa inactivada se centrifuga y se resuspende en solución salina tamponada con fosfato que contiene 0.2%
de formalina hasta un volumen que represente un título infectivo de preinactivación de aproximadamente
108 unidades infecciosas/ml. Normalmente la suspensión acuosa se mezcla con un aceite como adyuvante,
directamente o tras precipitación con sulfato de aluminio y potasio (AlK[SO4]2.12H2O). También se puede añadir
un conservante, como 0,01% de tiomerosal.
3.
Control del proceso
Los principales requisitos son asegurar un adecuado crecimiento de C. abortus, evitar las infecciones
indeseables del substrato del cultivo, completar la inactivación y concienciar del bioriesgo a quienes trabajan en
el proceso.
4.
Control de lotes
Cada lote individual de vacuna manufacturada debe probarse respecto a esterilidad, seguridad y potencia.
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación en los materiales biológicos se encuentran en el
Capítulo I.1.5.
b)
Inocuidad
La inoculación subcutánea de dos o más ovejas seronegativas con el doble de la dosis estándar de vacuna
manufacturada (normalmente 1,0 ml) no debe provocar reacciones sistémicas, pero las vacunas con
adyuvante de aceite pueden causar una inflamación indolora en el sitio de la inoculación.
c)
Potencia
En la actualidad, la potencia se estima por la aparición de una respuesta serológica en ovejas no
vacunadas previamente a las que se suministra subcutáneamente 1 ml de vacuna. Se comparan muestras
de sangre tomadas antes y 28 días después de la vacunación. Finalmente, la potencia se determina frente
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a una infección experimental o por comportamiento en condiciones de campo, pero no se ha establecido
todavía una correlación in vitro con la eficacia protectora.
d)
Duración de la inmunidad
No se dispone de fechas representativas, pero se recomienda la revacunación a los 1–3 años, según el
riesgo de exposición.
e)
Estabilidad
Las vacunas mantenidas en refrigeración (5+3°C) deben permanecer estables durante al menos 1 año.
Antes de su uso deben mantenerse a temperatura ambiente durante 24 horas y el envase debe agitarse
vigorosamente inmediatamente antes de extraer la vacuna.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Ver Sección C.4.b.
b)
Potencia
Ver Sección C.4.c.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
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