APLICACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS EN PLANTA DE

APLICACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS EN PLANTA DE
SACRIFICIO PARA LA DETECCIÓN DE Salmonella sp
EN CANALES PORCINAS
DIANA CAROLINA MEJIA WAGNER
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el titulo de
MICROBIÓLOGA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
Bogotá, D.C.
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar
la verdad y la justicia”
Este trabajo lo dedico a Dios, él me a permitido llegar donde me encuentro me dio
la vida y unos padres maravillosos, papitos Luz Mary Wagner y Pedro Pablo
Mejia, este trabajo es de ustedes por todo el amor, el esfuerzo y dedicación que han
puesto para que yo progrese, por la paciencia y cariño, los amo mucho.
AGRADECIMIENTOS
A Dios por la vida, la salud, por permitirme salir adelante y por dirigirme por el
mejor camino durante todo este tiempo.
A mis padres por sus esfuerzos, apoyo, entrega incondicional y paciencia.
A la Dra. Maria Antonia Rincón por su paciencia, exigencia y orientación.
A la Dra. Ivonne Hernández por compartir conmigo sus conocimientos y experiencia,
sin su ayuda las cosas hubiesen sido muy difíciles, por su paciencia y apoyo durante
toda mi permanencia en el laboratorio.
Al Dr. Gustavo Arbelaez quiero agradecer por su apoyo, excelente dirección,
paciencia, consejos y orientación.
A la Asociación Colombiana de Porcicultores por su apoyo económico y
colaboración, especialmente al Dr. Dario Mogollón.
Al Instituto Colombiano Agropecuario ICA. Grupo Diagnóstico Veterinario CEISA
por permitirme desarrollar mi trabajo de tesis en sus instalaciones.
Y a la Pontificia Universidad Javeriana, por la formación integral que recibí durante
estos años de carrera.
TABLA DE CONTENIDOS
Página
1. INTRODUCCION
8
2. REVISION DE LITERATURA
12
2.1. HISTORIA
12
2.2 ETIOLOGIA
13
2.2.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES
13
2.2.2 MORFOLOGIA
15
2.2.3 CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
17
2.2.4
19
ESTRUCTURA ANTIGENICA
2.2.4.1 Antígenos O
20
2.2.4.2 Antígenos flagelares H
21
2.2.4.3 Antígeno capsular Vi
22
2.2.5. NOMENCLATURA
22
2.3
PATOGENESIS, TRANSMISION Y VIRULENCIA
23
2.4
LESIONES Y CUADRO CLINICO
28
2.5
DIAGNOSTICO
34
2.5.1 AISLAMIENTO BACTERIOLOGICO
34
2.5.1.1Preenriquecimiento no selectivo
36
2.5.1.2 Enriquecimiento selectivo
36
2.5.1.3 Aislamiento diferencial sobre medios selectivos
37
2.5.1.4 Confirmación bioquímica de cepas sospechosas
40
2.5.1.5 Serotipificación
42
2.5.1.5.1 Esquema de Kauffmann – White
44
2.5.2 Metodologia Serologica
45
2.5.3 Diagnóstico Molecular
46
2.5.4 Consideraciones para el diagnóstico final
47
2.6 EPIDEMIOLOGIA
48
2.7 PREVENCION Y CONTROL
52
2.7.1 VACUNACION
54
2.8 TRATAMIENTO
54
2.8.1 Agentes Antimicrobianos y Resistencia
55
3. FORMULACION DEL PROBLEMA
58
4. OBJETIVOS
59
5. MATERIALES Y METODOS
60
5.1. DISEÑO DEL ESTUDIO
60
5.2 POBLACION DE ESTUDIO
60
5.3 SELECCIÓN Y TAMAÑO DE MUESTRA.
61
54. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
62
5.4.1. Procesamiento De Las Muestras
64
5.4.1.1. Pre-Enriquecimiento No Selectivo
65
5.4.1.2. Enriquecimiento Selectivo.
66
5.4.1.3 Siembra En Medios Selectivos
67
5.4.1.4. Pruebas Bioquímicas
69
5.4.1.5. Tipificación Serologica.
71
5.4.1.5.1 Prueba de aglutinación en lámina. para la determinación de
antígenos somáticos “O”.
71
5.4.1.5.2. Prueba de aglutinación en tubo para la determinación
del antígeno flagelar H (fase 1).
72
5.4.1.5.3. Prueba de aglutinación en lámina para la determinación
de antígenos somáticos “O” específicos por serogrupo.
73
5.4.1.5.4. Prueba de aglutinación en tubo tubo para la determinación
del antígeno flagelar H (fase 2).
74
5.4.1.5.5. Determinación de serotipo de las cepas aisladas
74
5.4.2. PRUEBA DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA.
74
6. RESULTADOS
70
6.1 CARACTERIZACION BACTERIOLOGICA
DE LOS AISLADOS
75
6.1.1 Pre-enriquecimiento no selectivo
75
6.1.2 Enriquecimiento selectivo.
75
6.1.3 Colonias presuntamente sospechosas en
medios sólidos selectivos.
76
6.1.4 Pruebas bioquímicas
77
6.2 AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN DE Salmonella sp.
78
6.2.1 Cepas de Salmonella sp confirmadas mediante
tipificación serológica.
78
6.2.2 Determinación de eficacia de las metodologías
para el aislamiento de Salmonella sp.
79
6.2.3 Relación metodologías de aislamiento y submuestra.
80
6.2.4 Serotipos del género Salmonella aislados a partir
de canales porcinas en planta de sacrificio.
83
6.3 ANTIBIOGRAMA
86
6.3.1 Sensibilidad de Salmonella sp frente a antibióticos.
86
7. DISCUSION
91
8. CONCLUSIONES
103
9. RECOMENDACIONES
105
10. LITERATURA CITADA
106
11. ANEXOS
114
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Características bioquímicas diferenciales de
las subespecies de Salmonella.
18
Tabla 2. Características bioquímicas de
Salmonella enterica subesp. enterica (I)
18
Tabla 3 Pruebas bioquímicas diferenciales entre
Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A y Salmonella sp.
19
Tabla 4. Protocolos para el aislamiento de Salmonella sp
a partir de canales porcinas.
69
Tabla 5. Aislamientos de serotipos del género Salmonella
de acuerdo a cada carcasa.
83
Tabla 6 .Sensibilidad de los serotipos de Salmonella sp
aislados en canales porcinas en planta de sacrificio.
89
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Microfotografía electrónica de
Salmonella Typhimurium invadiendo células humanas.
14
Figura 2. Morfología de Salmonella sp.
16
Figura 3. Población bajo estudio. Disposición de
las canales en el salón de oreo. Sitio de colección de muestras.
61
Figura 4. Toma de Submuestras. Hisopado de arrastre.
a) Hisopado de la cabeza. b) Hisopado del vientre
c) Hisopado del lomo. d) Hisopado de la pierna.
63
Figura 5. Condiciones de transporte de implementos
y materiales utilizados durante los muestreos.
64
Figura 6 .Procesamiento de las muestras en el laboratorio.
Empleo del mechero.
64
Figura 7. Procesamiento de las muestras en el laboratorio.
Empleo de la cabina de bioseguridad.
65
Figura 8. Métodos bacteriológicos para el aislamiento
de Salmonella sp a partir de carcasas porcinas.
Procesamiento del Pre-enriquecimiento no selectivo.
66
Figura 9. Métodos bacteriológicos para el aislamiento
de Salmonella sp a partir de carcasas porcinas.
Proceso de Incubación para el Pre-enriquecimiento
no selectivo de las muestras.
a) Incubación a 37ª C. b) Incubación a 43 ± 1° C.
67
Figura 10. Métodos bacteriológicos para el aislamiento de
Salmonella sp a partir de carcasas porcinas.
Siembra en medios selectivos a partir
de caldos de enriquecimiento selectivo.
Procedimiento de enriquecimiento selectivo.
68
Figura 11. Métodos bacteriológicos para el aislamiento
de Salmonella sp a partir de carcasas porcinas.
Batería de pruebas bioquímicas convencionales para
el genero Salmonella.
70
Figura 12. Salmonella sp en medios de cultivo.
a) Agar Xilosa Lisina Desoxicolato.
b) Agar Salmonella-Shigella. c) Agar Xilosa Lisina Tergitol.
76
Figura 13. Porcentaje de aislamientos de Salmonella sp
según submuestra considerando el total de canales porcinas.
78
Figura 14. Porcentaje de aislamientos de Salmonella sp
79
según metodología.
Figura 15. Porcentaje de aislamientos de Salmonella sp.
según submuestra y metodología de aislamiento.
82
Figura 16. Porcentaje de serotipos de Salmonella aislados
en canales porcinas.
85
Figura 17. Antibiograma de los serotipos aislados
en canales porcinas en planta de sacrificio
a) Salmonella Typhimurium b) Salmonella Derby
c) Salmonella Agona d) Salmonella Paratyphi B.
90
ABSTRACT
The microbiological analysis made in a plant of sacrifice of the city from Bogotá
D.C, Colombia to 156 pig from slaughterhouse have a percentage of the 37,82% of
isolations of Salmonella sp in pig carcases. By means of serological tipificatión of the
obtained stocks 16 serotypes of Salmonella were identified. The more representative
isolated serotypes were Salmonella Typhimurium in a 47%, Salmonella Derby in a
14% and Salmonella Agona in a 10%. Each carcase has subsampling, the greater
percentage of isolations was obtained from the skin of the head, followed of back, leg
and belly. One determined that the best area for the sampling in plant of sacrifice on
the skin of housings is the head. Through a nondestructive sampling was
demonstrated that the method of effective isolation for Salmonella on the pig skin of
the housing, is the Peptonada Water like Pre-enrichment broth, the broths of selective
enrichment Selenite and Tetrationato, and Xylose Lisina Desoxicolato and Xilosa
Lisina Tergitol like average solids of isolation differential. The evaluation of the
sensitivity of isolated of Salmonella sp obtained in front of 15 antibiotics,
demonstrated to a high variability between stocks and serotipes.
____________________________________________________________________
Key words: Average of culture selective, Bacterial Contamination, Pig Carcasses,
Slaughter house, Salmonella sp, Serotypes.
1. INTRODUCCION
Los miembros del género Salmonella constituyen una de las causas más importantes
de enfermedades gastrointestinales y zoonosis en el mundo, debido principalmente a
la habilidad de adaptación de este patógeno y su ubicuidad sobre cualquier hospedero.
Hasta el presente se han clasificado aproximadamente 2500 serotipos de Salmonella,
la patogenicidad de cada una de ellos varia en sus formas de manifestaciones clínicas
dependiendo de la especie hospedera implicada, por lo que su identificación es clave
desde el punto de vista epidemiológico y de salud publica. La salmonelosis se ha
catalogado como importante en países industrializados con altas cifras de morbilidad
y mortalidad.
Las infecciones causadas por este agente se adquieren en su mayoría por ingestión o
contacto con material
contaminado con materia fecal, especialmente agua y
alimentos, constituyendo estos últimos los principales factores de diseminación de
salmonelosis en la población humana. La mayor parte de los serotipos de Salmonella
son patógenos para los animales y solo afectan al hombre accidentalmente. Por esta
razón el control de la prevalencia de este agente en la producción porcina es
primordial por tres razones básicas: La gran importancia de salmonelosis como
zoonosis causante de la toxicó-infección alimentaría y la relevancia de su control en
planes de salud pública. En segundo lugar, por el incremento de su protagonismo en
seguridad alimentaria como hechos diferenciales en el comercio internacional, y
finalmente, por sus efectos sobre la sanidad animal y repercusiones económicas en
sistemas de producción porcina.
En el sistema de producción porcina enfermedades importantes son causadas por el
género Salmonella. Las dos principales fuentes de transmisión entre cerdos son los
afectados clínicamente y los portadores sin manifestaciones clínicas. Los portadores
de Salmonella son muy comunes en todas las especies de mamíferos, especialmente
cerdos, perros y el hombre
La salmonelosis humana se puede clasificar en dos grandes grupos, por un lado, las
debidas a serotipos estrictamente humanos, que causan habitualmente síndromes
tifoides con presencia de bacterias en la sangre y las debidas a serotipos ubicuos, que
producen diarrea, vómito y fiebre. La duración de esta enfermedad es variable,
dependiendo del estado general del huésped, pudiendo ocasionalmente causar
enfermedades generalizadas. Se debe considerar que los cerdos son un reservorio
importante de Salmonella sp para el hombre.
El control de Salmonella es primordial debido a
la existencia de barreras
comerciales de índole sanitarias en la importación de carne. Un mejoramiento en los
estándares de seguridad alimentaria aportaría mejor calidad del producto. El mejor
ejemplo de este enfoque es el
desarrollo de programas de control (monitoreo) de
Salmonella en Dinamarca (desde 1993) y Suecia, países netamente exportadores que
han disminuido los niveles de salmonelosis en la población porcicola.
En Colombia, se han detectado varios brotes de Salmonella en productos cárnicos
para consumo humano. En 1982,
Ariza y
colaboradores aislaron serotipos de
Salmonella: S. Enteritidis, S Agona y S. Manhattan entre otras en dos plantas de
sacrificio en Bogotá. El ministerio de Salud reportó el aislamiento entre noviembre
de 1996 y diciembre de 1997, 68 cepas de Salmonella sp, los serotipos encontrados
fueron: S. Enteritidis, S. Typhimurium y Salmonella grupo E1.
En la Costa Atlántica, en muestras de alimentos (carne, chorizo, queso, cerdo, pollo)
analizadas, se aisló Salmonella sp (Durango et al 2002). Hidalgo en 1999 realizó un
estudio en el cual se analizaron un total de 410 muestras, 260 de humanos y 150 de
aves. Como resultado 25 muestras de humanos fueron positivas (9,6%) y 36 aviares
(24%) fueron identificadas como Salmonella enterica. De las cepas que afectan a
humanos aisladas por Hidalgo, las tres se clasificaron como serotipo Enteritidis, las
dos fueron clasificadas como serovariedad Typhimurium, igual número fueron
determinadas como serotipo Typhi, una perteneció a la variedad Seremban y 17
fueron no tipificables.
Posteriormente en el
año 2003, Mora y colaboradores en un estudio sobre
la
prevalencia de Salmonella sp en jugos cárnicos de porcinos en plantas de beneficio de
Bogotá
evaluaron 173 muestras de diafragma encontraron un
27.2% de
seropositividad; y recientemente Escobar y colaboradores en el 2004, reportaron una
seroprevalencia de 65.5% para las madres multíparas y 41% para los cerdos de ceba
en un estudio realizado en granjas porcinas intensivas de Colombia evidenciando la
respuesta inmune frente a Salmonella Typhimurium, S. Choleraesuis y S. Infantis.
Existen numerosas formas de controlar la presencia y diseminación de Salmonella sp
en animales y subproductos. Estos incluyen la regulación de la importación de
animales vivos o sacrificados, el empleo de cerdos y alimentos libres de Salmonella y
buenas prácticas de manejo en frigoríficos. La educación de los consumidores y
manipuladores de alimentos en el manejo seguro de carnes, huevos y otros
ingredientes crudos potencialmente peligrosos es de gran importancia.
Teniendo en cuenta que existen antecedentes
del país de una alta prevalencia
serológica frente a este agente en las granjas porcinas intensivas del país, se
pretendió, a través de este estudio implementar una metodología diagnóstica para
evaluar la presencia de especies de Salmonella en canales porcinas con el propósito
de orientar las medidas sanitarias a nivel de planta de sacrificio. En esta investigación
se aplicaron algunos métodos microbiológicos diagnósticos
en planta de sacrificio
para la detección de especies de Salmonella sp en canales porcinas mediante un
muestreo no destructivo y caracterización de las
análisis bioquímico
cepas empleando aislamiento,
y tipificación. Este estudio permitió establecer la posible
asociación entre los hallazgos en planta de sacrificio con la problemática de campo,
aportando información sobre la dinámica de infección y para sugerir la disminución
del riesgo de diseminación de Salmonella sp a la población humana.
2. REVISION DE LITERATURA
La Salmonella en el ámbito mundial, está asociada con mucha frecuencia a las
enfermedades diarreicas en humanos y animales Las infecciones agudas del tracto
gastrointestinal están consideradas como una de las enfermedades más frecuentes en
Colombia.
2.1 HISTORIA
Su nombre se debe al veterinario y bacteriólogo Daniel E. Salmon quien aisló la
primera Salmonella a partir de intestino de un porcino en 1885, inicialmente este
autor y Smith lo consideraron el agente causal de la Peste Porcina Clásica (PPC),
pero posteriormente se comprobó el origen viral de la PPC. Salmonella enteritidis
serovar Choleraesuis (la cepa aislada) se consideró como una bacteria oportunista en
cerdos inmunosuprimidos por agentes infecciosos como el virus de la PPC. Hace
mas de cien años se descubrió el género Salmonella pero aún se considera como
patógena para cerdos, humanos y otras especies (Schwartz, 1991; Straw y col.,
1999). Las formas septicémica y enterocolítica de salmonelosis han sido reconocidas
desde 1880´s y la importancia en cerdos se debía a la dificultad de diferenciarla de la
PPC ya que con frecuencia aparecían simultáneamente estas enfermedades (Citado
por Perez, 2005).
La Salmonella enteritidis ser. Typhi, fue uno de los primeros miembros del género
Salmonella reconocido como patógeno en 1884 por Gaffky (Vadillo y col., 2000),
en 1892 Salmonella enteritidis ser. Typhimurium fue aislada por Loeffler (Escobar,
2004).
Entre otros eventos relacionados con este patógeno se encuentra el caso de “Maria la
Tifosa”, ejemplo claro de un portador crónico. Mary trabajaba en New York y en
Long Island a comienzos del siglo XX en casas de huéspedes e instituciones de
beneficio. En análisis realizados en las heces de esta mujer se halló un número
elevado de Salmonella Typhi, agente etiológico de la fiebre tifoidea. Mary se opuso a
recibir tratamiento y escapó de las autoridades sanitarias cuando determinaron que
constituía un foco de contaminación importante de Salmonella. Cambio su nombre y
siguió trabajando en hoteles, restaurantes eliminando el agente por donde se
movilizaba. Un tiempo después fue capturada, conducida a prisión y permaneció bajo
custodia en la isla North Brother en el río East de Nueva York durante 23 años.
Posteriormente falleció en 1938, 32 años después de que el Dr. George Soper en un
estudio epidemiológico descubriese que ella era un portador crónico de fiebre
tifoidea. (Brock, 1999)
2.2 ETIOLOGIA
2.2.1 Características Generales
Los
microorganismos
del
género
Salmonella pertenecen
Enterobacteriaceae, en ella se encuentran
bacterias
a
la
familia
gramnegativas aerobias o
anaerobias facultativas, en forma de bastón (bacilos) que pueden multiplicarse y
crecer fácilmente en medios de cultivo artificiales. Salmonella sp causa una serie de
enfermedades gastrointestinales en humanos y fiebre tifoidea en ratones (Goosney et
al., 1999), este microorganismo posee la característica de infectar un amplio rango de
hospederos siendo considerado un “patógeno universal” (Schwartz, 1999).
El hábitat principal de este microorganismo es el tracto intestinal de animales y
humanos (Funk, 2003). Los miembros del género Salmonella sp se destacan por su
capacidad para infectar a un amplio rango de hospederos (Kranker, 2003). (Figura 1).
La familia comprende una gran cantidad de bacterias antigenicamente relacionadas en
sus características bioquímicas, incluyendo
Salmonella, Escherichia, Shigella,
Citrobacter, Klebsiella y Proteus. Algunas de ellas son principalmente hospederos
intestinales de animales y se diseminan al ambiente. Muchas enfermedades de la
especie porcina importantes son causadas por miembros de los géneros Salmonella y
Escherichia (Hurd, 2001).
Figura 1. Microfotografía electrónica de Salmonella Thyphimurium invadiendo
células humanas.
Imagen
tomada de
“Salmonella”.
Illinois department
http://www.idph.state.il.us/public/hb/hbsam.htm
of Public Health. Dirección electrónica:
2.2.2 Morfología
La envoltura externa de la Salmonella está compuesta por 3 capas: La membrana
interna (cercana al citoplasma), el peptidoglicano y la membrana externa (Brock,
1999) (Fig. 2), esta última, ampliamente estudiada, está compuesta por 2 tipos de
lípidos (lipopolisacáridos o LPS y fosfolípidos), así como proteínas características.
La membrana externa es la interfase entre la bacteria y el medio que la rodea;
constituyendo una importante barrera contra compuestos químicos,
tóxicos,
antibióticos y detergentes. Esta membrana es poco permeable al flujo de compuestos
altamente lipofílicos y se ha constatado que moléculas hidrofílicas de masa molecular
no mayor a 700 daltons la atraviesan en forma pasiva e inespecífica. La explicación a
este fenómeno se debe a las proteínas presentes, denominadas porinas con capacidad
de formar poros de difusión transmembranosos (Brock, 1999). Esta membrana
comprende entre 10 y 20 proteínas de cualidades distintas, tales como la proteína
OmpA (outer membran protein A) de aproximadamente 35 kD , y las porinas clásicas
OmpF (~ 37 kD), OmpD (~ 38 kD) y PhoE (~ 36 kD), todas se han identificado en
S.Typhimurium.
El lipopolisacárido (LPS) esta compuesto de un lípido A embebido en la membrana
externa, una región central
y una región antigénica O (cadena lateral O), el cual
consta de unidades oligosacaridicas (Franco, 1990).Consta de un núcleo polisacárido
formado por cetodesoxioctonato, heptosas, glucosa, galactosa, ramnosa y manosa.
Los azucares del polisacárido O están conectados en secuencias de cuatro a cinco
azucares que se repiten para formar la molécula completa. El lípido A no es un
lípido de glicerol normal, sino son ácidos grasos interconectados por un enlace ester
al N-acetilglucosamina. Los ácidos grasos que se hallan en el lípido incluyen los
ácidos β hidroximirístico, láurico, mirístico y palmítico. La purificación de las
fracciones del LPS ha demostrado que el complejo del lípido A, es el responsable de
la toxicidad y que la acción principal del polisacárido es hacer el lípido hidrosoluble.
Sin embargo, los estudios en animales han mostrado que para lograr una respuesta
inmune
se necesita el complejo endotoxico completo que contiene a la vez el
polisacárido y el lípido.
En condiciones normales se producen en medio de cultivo solo las porinas OmpF y
OmpC (además de OmpD en S. Typhimurium) son producidas. Su abundancia
relativa está regulada eficientemente por señales medioambientales, tales como la
osmolaridad. Todos estos datos soportan
el rol que jugarían las proteínas de
membrana externa en la patogenicidad y virulencia de las bacterias.
Figura 2. Morfología de Salmonella sp. “Salmonella”.
Imagen tomada de
“Salmonella”. Instituto de Salud Pública de Chile. Dirección electrónica:
http://www.ispch.cl/lab_amb/img/salmonella_2.gif
2.2.3 Características Bioquímicas
Entre las características morfológicas y bioquímicas se puede afirmar que Salmonella
es un grupo homogéneo de bacilos gramnegativos, no formadores de espora,
anaerobios facultativos, su tamaño oscila de 0,3 a 1 µm x 1,0 a 6,0 µm. Son móviles
debido a la presencia de flagelos perítricos, a excepción de S. Gallinarum y S.
Pullorum (Linder 1995).
Las pruebas bioquímicas utilizadas para identificar las cepas sospechosas como
Salmonella son catalasa (positiva, salvo raras excepciones), oxidasa ( carecen de
citocromo oxidasa, negativa), son ureasa negativa, posee un metabolismo oxidativo y
fermentativo. Produce ácido y a menudo gas durante la fermentación de la glucosa u
otros hidratos de Carbono, no des-amina fenilalanina, y es tetrationato reductasa
positiva (Linder 1995) (Tablas 1 y 2).
Entre otras características bioquímicas se destacan: reducción de nitratos a nitritos,
metabolismo del citrato como única fuente de carbono, producción de H2S, actividad
lisina-decarboxilasa, no produce indol, etc. (MacFaddin, 2003).
La Salmonella sp se
inactiva a pH ácidos, por debajo de 5, y a temperaturas
superiores a 60 ªC. Los fenoles, yodados y clorados son desinfectantes comunes y
eficientes contra este microorganismo.
La mayoría de los serotipos de Salmonella aislados del hombre y de los animales de
sangre caliente pertenecen a Salmonella enterica subesp. enterica (99,8%) y tienen
propiedades bioquímicas características siendo excepciones los serotipos S. Typhi y
S. Paratyphi A (Caffer y col, 2001)
Tabla 1.
Características
bioquímicas diferenciales de las subespecies de
Salmonella.
Tabla tomada “Manual de procedimientos para la caracterización de Salmonella. Instituto Nacional de
Enfermedades
Infecciosas.
Buenos
Aires,
Argentina.
Dirección
electrónica:
http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/gss/publications/documents/ArgentinaLevelI/Manual_procedimientos_Salmonella.pdf
Tabla 2. Características bioquímicas de Salmonella enterica subesp. enterica (I)
Tabla tomada
Enfermedades
“Manual de procedimientos para la caracterización de Salmonella ”Instituto Nacional de
Infecciosas.
Buenos
Aires,
Argentina
http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/gss/publications/documents/ArgentinaLevelI/Manual_procedimientos_Salmonella.pdf
Dirección
electrónica:
Tabla 3 Pruebas bioquímicas diferenciales entre Salmonella Typhi, Salmonella
Paratyphi A y Salmonella sp.
Tabla tomada “Manual de procedimientos para la caracterización de Salmonella” Instituto Nacional de
Enfermedades
Infecciosas.
Buenos
Aires,
Argentina.
Dirección
electrónica:
http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/gss/publications/documents/ArgentinaLevelI/Manual_procedimientos_Salmonella.pdf
2.2.4 Estructura Antigénica
La estructura antigénica de Salmonella es similar a la de otras Enterobacterias, con
dos clases de antígenos principales presentes; antígenos O somáticos y antígenos H
flagelares (Fase I y Fase II). Se considera que el 99% de los aislamientos en clínica
corresponden al subgrupo I. En algunas cepas se encuentra un tercer tipo de antígeno
de superficie, siendo análogo funcionalmente a los antígenos K de otros géneros,
anteriormente se pensó, que se relacionaba con la virulencia, éste antígeno se
denominó antígeno VI (Parra, 2002). Aunque todos los miembros de las especies de
Salmonella se consideran patógenos en potencia, los diferentes serotipos tienen una
amplia variedad de huéspedes y producen síndromes patógenos distintos.
2.2.4.1 Antígenos O
Los Antígenos O somáticos se encuentran en la pared bacteriana, de naturaleza
polisacárida. Están compuestos por complejos de fosfolípidos y polisacáridos; su
composición es aproximadamente: 60% polisacáridos, 20-30% lípidos y 3,5-4%
hexosamina. Son cadenas laterales de polisacáridos del lipopolisacárido de envoltura
(LPS) que se encuentra en todos los microorganismos gramnegativos.
La cadena de polisacáridos del Ag O es un polímero de unidades repetidas de
oligosacáridos (de 3 a 5 azúcares) lineales o ramificados. La naturaleza de los grupos
terminales y el orden en que se encuentran las unidades repetidas de la cadena
determina la especificidad antigénica somática de la bacteria. Como esta estructura
difiere ampliamente entre las distintas serotipos, hay diferencias en la especificidad
antigénica O. Estos antígenos son termoestables y resistentes a ácidos diluidos y
alcohol.
La estructura somática se denomina con la letra O seguida de números arábigos
separados por comas, que corresponden a sus factores, por ej. S. Typhimurium
O:1,4,5,12; S. Enteritidis O:1,9,12. Según en el esquema de Kauffman-White existen
numerosos antígenos O que sirven para caracterizar los diferentes tipos antigénicos,
(Por ejemplo O4: grupo B, O9: grupo D), se emplean para la organización en
serogrupos de Salmonella a partir de sus principales antígenos somáticos mediante la
numeración arábiga en orden sucesivo del 1 al 64; los serogrupos van de la A-Z, este
último posee antígeno 50.
2.2.4.2 Antígenos flagelares H
Son antígenos constituidos por una proteína, la flagelina, cuya composición en
aminoácidos es constante para un tipo antigénico determinado. El flagelo es una
estructura compleja que consiste en un cuerpo basal, un segmento de unión “gancho”
y un filamento. El cuerpo basal ancla el flagelo a la envoltura de la célula y el
“gancho” une el cuerpo basal con el filamento. En la serotipificación flagelar de
Salmonella se usa solamente la especificidad antigénica del filamento. Este esta
constituido por flagelina, proteína de alto peso molecular. En Salmonella se han
encontrado más de 60 serotipos antigénicos flagelares. Las diferencias antigénicas se
deben a variaciones en la estructura primaria (contenido en aminoácidos y orden de
ubicación) de las distintas moléculas de flagelina. Estos antígenos son sensibles al
calor.
Los genes estructurales, determinan la expresión de la fase 1 y la fase 2. La mayoría
de las cepas del género Salmonella pueden expresar las dos especificidades de su
antígeno H (difásicos), sin embargo, existen algunas que pueden expresar solamente
una sola (monofásicas). En el esquema de Kauffman-White estos antígenos se
identifican con letras minúsculas, también se ha usado el sistema numérico arábigo
para identificar algunos antígenos H. Unos pocos serotipos de Salmonella poseen una
sola fase flagelar, por ejemplo: Salmonella Enteritidis (9,12:g,m:-), Salmonella Typhi
(9,12 [VI]:d:-).
Por el contrario la gran mayoría de los serotipos
tienen dos
especificidades en su antígeno flagelar, son cepas difásicas; por ejemplo Salmonella
Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) y Salmonella Hadar (6,8:z10:e,n,x), que expresan la
fase 1 (identificada en los ejemplos por las fases: i ó z10 ) y la fase 2 ( por las fases:
1,2 y e,n,x respectivamente).
El fenómeno de variación de fase, comprende la inversión de un segmento de DNA
de una orientación a otra. Cuando el segmento esta orientado en una dirección se
expresa un gen particular, en tanto que cuando está orientado en la dirección opuesta,
se expresa un gen distinto (Broca 1991). Como resultado de la variación de fase, la
proteína flagelar puede ser de uno o de dos tipos diferentes (Brock 1991). Cada célula
de Salmonella tiene dos genes H1 y H2, que codifican para las dos diferentes
proteínas flagelares, pero solo se expresa uno de los dos en un momento dado. Así
una célula bacteriana individual fabricará un flagelo del tipo H1 o un flagelo del tipo
H2 (Brock 1991).
2.2.4.3 Antígeno capsular Vi
Entre los antígenos capsulares de las Enterobacterias, el Vi es el más importante en el
género Salmonella. Los antígenos somáticos no se expresan cuando este antígeno se
encuentra presente, por ello se debe eliminar este cuando se tipifica una cepa
específica
Los Antígenos k, son los únicos de este tipo que se conocen, solo los poseen los
serotipos de Salmonella Typhi, Paratyphi c y Dublin. La presencia de este antígeno
hace posible la aglutinación de sueros anti O. La expresión de este factor depende de
dos genes (ViA + ViB), deben existir ambos en la bacteria para que dicha expresión
tenga lugar (Linder 1995).
2.2.5. Nomenclatura
El genero Salmonella tiene aproximadamente 2436 serotipos actualmente (Brenner y
col, 2000). En 1989, Reeves y col. proponen su división en dos especies: S. enterica
y S. bongori, la primera se su subdivide en seis subespecies: S. enterica subesp.
enterica, S. enterica subesp. salamae, S. enterica subesp. arizonae, S. enterica
subesp. diarizonae, S. enterica subesp. houtenae, S. enterica subesp. indica.
(Brenner y col, 2000).
La mayoría de los serotipos se clasifican dentro de la especie S. enterica, los
serovares restantes se ubican dentro de la especie S. bongori. Las fórmulas
antigénicas de los serotipos o serovares se han definido y mantenido por el centro
de colaboración de la Organización Mundial de la Salud (WHO) para referencia e
investigación sobre Salmonella en el Instituto Pasteur, París-Francia, los nuevos
serotipos se enumeran en actualizaciones anuales en el esquema Kauffmann- White
(Popoff et al, 2000; Popoff et al 1997). (Anexo 9).
Le Minor y col, en 1987, con el fin de agilizar la nomenclatura de los serotipos
propusieron que al identificar un serotipo se debe escribir la inicial en mayúscula y
no cursiva, por ejemplo Salmonella enterica subesp. enterica serotipo Typhimurium
se abrevia en Salmonella serotipo Typhimurium o sencillamente
Salmonella
Typhimurium. Los serotipos pertenecientes a otras subespecies son nominados por su
formula antigénica (Popoff et al, 2003).
2.3 PATOGENESIS, TRANSMISION Y VIRULENCIA
Con respecto a infección, patogénesis y factores de virulencia del género Salmonella
se caracteriza por ser un grupo de bacterias que ocasionan enfermedad severa pero
casi nunca la muerte y existen diferencias en cuanto a la especificidad del hospedero,
siendo capaces de producir enfermedades con diversas características en distintas
especies animales y en el hombre, algunos serovares sí son específicos, como S. ser.
Gallinarum para las aves o S. ser. Typhi en el caso del hombre (Perez, 2005).
La ingestión de productos contaminados y los aerosoles son las vías principales de
infección (Davies y Funk, 1999). Este género ingresa al organismo vía oral, a través
de la faringe, tracto respiratorio y conjuntiva. En el tracto digestivo el aumento de pH
gástrico, la disminución del peristaltismo y la alteración de la flora intestinal
favorecen la colonización del intestino, invadiendo finalmente los enterocitos.
Inicialmente se creía que la infección por Salmonella empezaba con la unión de la
bacteria al ileon y luego penetraba al intestino a través de la célula M, sin embargo
estudios recientes muestran que la infección se produce en el intestino delgado y en
parte del colon, especialmente en la región cercana al recto. En estudios con monos
Rhesus, todo parece indicar que la entrada del microorganismo se asocia más con las
microvellocidades de los enterocitos que con las células M. La bacteria se puede
encontrar en los enterocitos varios días después de la infección lo cual demora la
entrada de la bacteria al torrente sanguíneo, permitiendo la acción de los macrófagos
(Salyers 2002).
La Salmonella produce proteínas que se fijan a las superficies, les permite adosarse
a las células epiteliales del intestino, la adherencia esta regida por las fimbrias tipo I
en combinación con una hemaglutinina específica que permite que las células
bacterianas aglutinen los glóbulos rojos sanguíneos.
A través de los enterocitos, los microorganismos pasan hacia la lámina propia, donde
se produce el estímulo de la respuesta inflamatoria (alto número de leucocitos
polimorfonucleares en lumen e intestino) y son ingeridos por macrófagos y
neutrófilos. El paso a través del epitelio intestinal conlleva a daño moderado y
transitorio de los enterocitos. Los microorganismos que sobreviven en la lámina
propia se multiplican dentro de las células fagocíticas.
Entre el intestino delgado y el grueso se encuentran las células blanco de Salmonella
sp donde se adhieren, las cepas que producen diarrea segregan toxinas e invaden las
células. En el interior de la célula el genero Salmonella segrega citotoxinas que
provocan su muerte y desprendimiento de la mucosa intestinal. El número de células
blanco infectadas determina el grado de enfermedad (Biberstein y Zee, 1994).
La adherencia es un factor muy importante en la patogénesis de Salmonella, y esta
se lleva a cabo gracias a que produce varios tipos de adhesinas, por ejemplo las
Fimbrias tipo1, codificadas en el gen fim, sin embargo su acción es poco conocida
hasta hoy. Salmonella enterica ser Typhimurium produce estas adhesinas, que son
codificas en plásmidos denominados pSLT por el gen de 90 Kpb pef. Otros genes
productores de fimbrias son Ipf, que codifican para las fimbrias polares largas,
también están los genes agf, que codifican para las fimbrias “curli” de adhesión
(Salyers y Whitt, 2002).
Por otro lado la Salmonella sp produce lipolisacaridos como parte de la membrana
externa de su pared celular, estas endotoxinas se liberan cuando las células del
hospedero se lisan. Una propiedad biológica importante de la membrana externa de
Salmonella sp es que resulta toxica para el hospedero, lo cual la hace responsable de
algunos síntomas de infección. Estas propiedades toxicas se asocian a una parte de la
capa de lipolisacarido, más concretamente al lípido A (Brock, 1999)
En procesos de salmonelosis se presenta producción de exotoxinas, tipo citosina,
asociadas con la membrana celular externa, que inhiben la síntesis de proteínas del
hospedador y que aparentemente son las responsables de los efectos citopáticos
relacionados con la gastroenteritis. Las enterotoxinas, son exotoxinas, responsables
de la secreción masiva de líquido en la luz intestinal (diarrea) por el mecanismo de
hipersecreción. Estas toxinas
son
termolábiles y su actividad biológica es
neutralizada por anticuerpos anti-toxina colérica.
La enterotoxina de la Salmonella Typhimurium consta de dos subunidades: A y B,
esta ultima se une al gangliosido GM1 de la membrana de las células del epitelio
intestinal, y la subunidad A se internaliza conduciendo a la activación de AMPc
intracelular y prostaglandina E2. Estos cambios causan incremento en la secresión de
electrolitos y movimiento de agua en el lumen por efectos osmóticos (Papoff ald Le
Minor, 1992).
Otros mecanismos de virulencia de Salmonella sp incluyen, una endotoxina
(lipolisacárido, lípido A) y la habilidad de la bacteria para vivir a nivel intracelular en
las células huésped. Esta característica dificulta el diagnostico y la vacunación y es
responsable de la capacidad de generar un estado portador en el cerdo (Roof, 1992;
Schwartz, 1999 citados por Mora, 1993).
En el momento de la infección de las células eucariotas producen un re-arreglo de
actina, produciendo pseudópodos que atrapan la bacteria, terminando en la
internalización de la misma (Salyers 2002). La adhesión de Salmonella a las células
epiteliales se produce por la adhesina no fimbrial, manosa resistente (Galán, 1992).
Los diseminadores sistémicos de Salmonella a los nódulos linfáticos mesentéricos
son los macrófagos que llevan como parasito intracelular facultativo al
microorganismo, la diseminación se produce después de 24 horas de la ingestión
oral y dos horas post adhesión intestinal. (Schwartz,1999)
Se ha sugerido que el proceso de invasión comprende dos etapas: Inicialmente las
bacterias se adhieren a un receptor no identificado sobre la célula epitelial,
posteriormente esta activa las funciones celulares a través del receptor para el factor
de crecimiento epidérmico. La invasión de células en tejidos titulares induce la
fosforilación de la tirosina del receptor , el cual conduce a incrementar los niveles de
calcio, depolarización de microvellocidades e internalización del microorganismo.
La Salmonella es la única especie que tiene dos sistemas de secreción tipo III,
codificados por islas de patogenicidad distintas SPI-1, SPI-2, SPI-4 y SPI-5, de las
últimas dos se conoce poco. (Salyers 2002).
Los sistema de secreción son un grupo de organelos especializados de los
microorganismos gramnegativos, cuya finalidad es la de introducir al citosol de las
células eucariotas proteínas efectoras que desequilibran la función celular y poseen
una variedad de genes que codifican para procesos invasivos al huésped, (Hueck
1998).
Cada uno de los sistemas juega papeles diferentes pero importantes en la
patogénesis, el sistema SPI-1 esta implicado en la penetración inicial de la bacteria,
mientras que SPI-2 es importante para los siguientes estadios de la infección (Hueck
1998).
Los genes de invasión inv, spa, prg y org se encargan de expresar las proteínas del
sistema de secreción, mientras que los genes sptP son codificantes para una tirosina
fosfatasa junto con SipAy SipE que se encargan del re-arreglo de los filamentos de
actina. En el proceso invasivo de órganos como hígado y bazo los plasmidos a traves
de los genes de virulencia (pef ) potencializan la tasa de crecimiento de los
microorganismos.
Los genes que codifican al sistema SPI-2 se relacionan con la fase sistémica de la
enfermedad.
El sistema SPI-3 produce un transportador de alta afinidad de
Magnesio, importante en la supervivencia bacteriana dentro del fagosoma.
Los sistemas de secreción tipo III en Salmonella producen otros efectos como el de
inyectar las proteínas necesarias para producir diarrea al interferir en la función
celular y como consecuencia de esta interrupción en el metabolismo, las células
infectadas producen citoquinas que atraen monocitos polimorfonucleares (PMNs).
Estos liberan prostaglandinas que tiene acción en el metabolismo de la adenilato
ciclasa, incrementando los niveles de AMPc dando como consecuencia final, la
interrupción de la absorción de sodio y el aumento de la secreción de cloro, lo que
produce una perdida de agua por parte de la célula, (Salyers 2002).
Fields, y col en
1986 mediante
experimentos
“en vivo” demostraron que la
supervivencia intracelular de la bacteria dentro de los macrófagos (especialmente los
CD11b+) en el hígado y el bazo es mayor que en el entorno extracelular (Matsui, et
al 2000; Richter, 1997 & Salcedo et al,2001) ya que a traves de Salmonella a través
de mecanismos de inhibición de la fusión fagosoma-lisozoma es capaz de resistir a
los sistemas destructivos por parte de estas celulas (Wood, 1992). Este
microorganismo es un organismo intracelular que se replica dentro de un fagosoma
espacioso, después de modificar y acidificar el endosoma (Alpuche et al, 1994).
2. 4 LESIONES Y CUADRO CLINICO
La diarrea, la fiebre y los dolores estomacales severos son síntomas comunes en el
caso de salmonelosis humana, estos síntomas se presentan entre 6 a 72 horas después
de haber ingerido algún alimento contaminado con la bacteria (Parra y col. 2002). El
cuadro clínico, se caracteriza por náusea y vómito los cuales cesan en unas pocas
horas, seguidos por cólico abdominal y diarrea que puede llegar a ser sanguinolenta ,
variar en volumen e intensidad y suele contener leucocitos PMN (Salyers 2002). La
enfermedad se presenta en niños con mayor frecuencia y los síntomas son más
severos. Tanto animales como humanos de edad avanzada pueden padecer
salmonelosis crónica, presentando periodos intermitentes de diarrea, fiebre y
temblores musculares. La sintomatología de la salmonelosis es producida
básicamente por la producción de enterotoxinas y citoxinas de Salmonella, que
provocan un cuadro clínico caracterizado por diarrea intensa, cianosis, fiebre elevada
y potencialmente muerte por septicemia. Las lesiones típicas corresponden a colitis y
gastritis acompañadas por esplenomegalia y aumento del tamaño de los ganglios
mesentéricos (Escobar, 2005).
La salmonelosis porcina se caracteriza por presentar un período de incubación de de
3 a 5 días y la dosis infectante es de 108 a 1011 células bacterianas (algunos serotipos).
Las tres formas clinicas de esta enfermedad que se presentan son: Portadores
asintomáticos, septicemica y enterocolitis. La salmonelosis asintomática no causa
ningún problema como enfermedad en cerdos, sin embargo es altamente relevante
debido a que es una fuente de diseminación en carne de cerdo y de infección entre
otros cerdos. La diseminación es frecuente debido a que ciertos animales pueden
encontrarse contaminados sin sintomatología clínica, permanecer durante el ciclo
productivo como portadores asintomáticos excretando el patógeno en sus heces en la
piara, pasar al proceso de sacrificio aparentemente sanos, contaminar otros canales
y finalmente infectar al hombre cuando este consume la carne.
La
salmonelosis septicémica
microorganismo
es causada por Salmonella Cholerasuis, este
es invasivo y se localiza principalmente en el colon
y en la
superficie luminar de las células M ileales de las Placas de Peyer. Se presenta
principalmente en cerdos destetos de menos de cinco meses de nacido, pero se puede
presentar en cerdos listos para ser llevados al sacrificio.
La sintomatología común es inapetencia, tos, estados febriles disnea, letargia e
inmovilidad, cianosis, diarrea amarillenta 4 días posteriores a la infección, además de
ictericia. La mortalidad es alta y la morbilidad variable. Los animales que se
recuperan se convierten en portadores (Gray, 1999). En los casos producidos por S.
Cholerasuis, la enfermedad tiende a presentarse más frecuentemente con hemorragias
generalizadas y muerte (Darwich et al., 1999).Los brotes con alta mortalidad son
comúnmente asociados a condiciones de estrés, los lechones que mueren presentan un
color violáceo característico (cianosis) en las extremidades, orejas, nariz y abdomen.
En animales muertos es común encontrar pulmones edematosos con las periferias
congestionadas de color rojo púrpura. El hígado y el riñón, turbios e hinchados y
esplenomegalia sin claridad en folículos. Histológicamente, además de observarse
nódulos tifoideos en hígado, se presentan lesiones en vasos sanguíneos, trombosis
fibrinoide en pulmón, riñón y cerebro.
La
salmonelosis
enterocolítica
es ocasionada
por
Salmonella enterica ser.
Typhimurium, esta bacteria tiene poca tendencia a invadir la mucosa enterica y no
tiene predilección para ubicarse en una porción específica del intestino, se requieren
de mas de 107 UFC para que la enfermedad se evidencie. En cerdos se presenta desde
el destete hasta los cuatro meses de edad y puede ser aguda o crónica.
La sintomatología clínica que involucra a Salmonella Typhimurium inicia con una
diarrea acuosa amarillenta, observándose una recuperación entre 3 a 7 días, pero al
complicarse con otras enfermedades como la enteropatía proliferativa porcina (EPP)
la diarrea se presenta con sangre y puede persistir por varias semanas. Sin embargo se
presentan recaídas y llega a alargarse por algunos meses. Dependiendo de la gravedad
y período de la diarrea, pueden perder el apetito o deshidratarse, e incluso producir la
muerte. La mayoría de porcinos se recuperan, pero algunos se vuelven portadores y
en un período de 5 meses se observan manifestaciones esporádicas. Las lesiones
observadas en lechones muertos son principalmente enteritis necrótica difusa, y en
casos crónicos ulceras con necrosis periférica. (Biberstein, 1990)
Respecto a la sanidad animal la salmonelosis suele presentarse principalmente en
cerdos de engorde con un proceso diarreico acompañado de fiebre elevada. En casos
muy agudos puede producirse muerte súbita de los animales sin signos previos de la
enfermedad. El resultado final es un posible aumento de mortalidad, un incremento
en gastos de medicación, un retraso en salida a matadero y una menor homogeneidad;
lo que en definitiva se traduce en un mayor costo económico. Por tanto, el control de
la prevalencia de Salmonella en porcinos resulta en un menor costo de producción y
una mayor rentabilidad de la explotación.
La Salmonella sp al ser trasmitida a los seres humanos puede causar tres tipos de
enfermedades: Fiebre entérica causada por S. Typhi, en esta enfermedad el organismo
es ingerido y entra al torrente sanguíneo, La forma septicemica es causada por S.
Cholerasuis en la cual el microorganismo causa intoxicación en la sangre. Y la
gastroenteritis causada por la ingestión de grandes cantidades de S. Typhimurium y S.
Enteritidis, las cuales afectan algunas partes del tracto digestivo pero no entran al
torrente sanguíneo (Penner, 1997).
Los serovares Typhi y Paratyphi causan fiebre tifoidea y paratifoidea,
respectivamente, y colonizan solamente a seres humanos. Por lo tanto, son adquiridos
por el contacto cercano con una persona que sea colonizada o infectada con estos
organismos o, más comúnmente, por la ingestión del alimento o del agua
contaminada por la materia fecal de las personas infectadas.
En los seres humanos, las infecciones gastrointestinales se encuentran frecuentemente
asociadas con el consumo de productos alimenticios de origen animal preparados
inadecuadamente, incluyendo la carne, las aves de corral, los huevos, y los productos
lácteos, aunque una variedad de otros alimentos también han sido implicados. La
fiebre entérica (tifoidea o la fiebre paratifoidea) es una enfermedad sistémica severa
caracterizada por estados febriles. Después de un período de incubación de 5 a 21
días se presentan diarreas de varios días que pueden aparecer antes de la fiebre. Los
síntomas no específicos son
dolor de cabeza, anorexia, tos, debilidad, garganta
dolorida, vértigos, y dolores musculares. Además de dolor de cabeza se presentan
manifestaciones del SNC en forma de manifestaciones neurosiquiatricas incluyendo
la confusión y psicosis, esto le ocurre a un 5 al 10% de los pacientes. Se estima que
hay por lo menos 16 millones de casos nuevos de fiebre tifoidea global cada año, con
600.000 muertes (Ivanoff et al, 1995). Tanto humanos como animales son
susceptibles a salmonelosis, el proceso infeccioso causa signos clínicos variados
dependiendo del serotipo presente.
De los 500 casos fatales de salmonelosis en humanos que ocurren anualmente, un
pequeño número de personas puede llegar a desarrollar dolor en las articulaciones,
irritación en los ojos y dolor en la micción (Síndrome de Reiter) y en la mayoría de
especies se pueden observar cuadros septicémicos, náuseas, fiebres entericas, vomito,
diarrea, dolor abdominal, gastroenteritis aguda, con cefalalgia y dolores abdominales
súbitos. La deshidratación puede ser grave sobre todo en menores de 1 año, ancianos
e inmunocomprometidos.
La salmonelosis humana puede clasificarse en dos grandes grupos, por un lado, las
debidas a serotipos estrictamente humanos, que causan habitualmente síndromes
tifoides con presencia de bacterias en la sangre, y las debidas a serotipos ubicuos, que
provocan diarrea, vómitos y fiebre. La duración de esta enfermedad es variable,
dependiendo del estado general del huésped, pudiendo ocasionalmente causar
enfermedades generalizadas.
El síndrome de fiebre entérica se encuentra asociado con Salmonella Typhi (fiebre
tifoidea), Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi C y Salmonella Paratyphi B
(fiebre paratifoidea). Los tres primeros microorganismos son patógenos exclusivos
del hombre S. Paratyphi B se puede encontrar también en animales. La relación entre
los casos de fiebre tifoidea y paratifoidea es 10:1, según informes de la Organización
Mundial de la Salud. Estos serotipos causan un cuadro febril prolongado con
septicemia y compromiso del tejido linfático. El período de incubación de la fiebre
tifoidea es de 1 a 3 semanas, con un rango de 3 a 56 días, dependiendo de la dosis
infectante. Debido a que este síndrome puede cursar con graves complicaciones como
hemorragia y perforación intestinal, estado tóxico, miocarditis, complicaciones
supurativas y con menor frecuencia meningitis es importante diagnosticar los agentes
causales con certeza y rapidez.
Aunque la morbilidad por salmonelosis es elevada, la mortalidad es baja, excepto, en
niños de corta edad, ancianos e inmunocomprometidos. La infección que comienza
con una diarrea aguda puede continuar hacia una infección focal o septicemica. Esta
enfermedad tiene un período de incubación de 6 a 72 horas, generalmente entre 12 a
36 horas y la gastroenteritis persiste de 24 a 72 horas. La dosis infectiva es de 105 a
108 microorganismos. La transmisión puede ocurrir
entre varios días a varias
semanas, mientras la evolución a la infección. El estado de portador temporal puede
persistir varias semanas, especialmente en lactantes y es raro el de portador crónico.
El patógeno se transmite por la ingestión de alimentos provenientes de animales
infectados, incluye huevos crudos o parcialmente cocidos y sus productos; carnes y
sus derivados; leche cruda y productos lácteos; agua contaminada; aves de corral
(especialmente pollo y pavo). Otra fuente de contaminación son las mascotas
(tortugas, iguanas y pájaros) y los productos farmacéuticos de origen animal no
esterilizados (polvo de tiroides, hormonas pancreáticas, sustancias corticoadrenales,
etc.).La infección también se transmite a los animales de granja a través de sus
alimentos y de fertilizantes elaborados con harinas de carne, de pescado y de huesos
contaminados. Es importante la transmisión de persona a persona por la vía fecaloral, en especial cuando existe diarrea.
2.5 DIAGNOSTICO
Los signos clínicos, hallazgos en la necropsia, exámenes de laboratorio (aislamiento,
serologia, PCR, etc.) son herramientas diagnósticas. Existen gran variedad de
procedimientos para el aislamiento de Salmonella, de acuerdo a las condiciones de
las muestras, de la enfermedad y el tipo de investigación se debe elegir un método
diagnóstico.
En caso de infección intestinal en animales vivos se colectan heces y en casos de
enfermedad sistémica se recolecta muestras de sangre y medula ósea. En animales
muertos la necropsia y el aislamiento del microorganismo de tejidos como bazo,
ganglio, intestino delgado y grueso, hígado, medula ósea y bilis resultan útiles para
determinar la presencia de Salmonella.
2.5.1 Aislamiento Bacteriológico
El aislamiento microbiológico de Salmonella sp mediante la utilización de medios de
cultivo y la posterior identificación por pruebas bioquímicas han sido los métodos
mas para el diagnostico de la salmonelosis y siguen siendo los métodos de más
usados para su detección. El aislamiento bacteriológico a partir de muestras de
pulmón, hígado, bazo o ganglios linfáticos mesentéricos, integrado a la información
aportada por la evaluación clínica y epidemiológica así como los hallazgos macro y
microscópicos
permiten obtener el diagnóstico definitivo. Las muestras más
utilizadas son: Bazo, hígado, pulmón, ganglios linfáticos, contenido intestinal,
materia fecal y bilis. En plantas de sacrificio tanto los tejidos mencionados
anteriormente como el hisopado sobre carcasa se usan para el aislamiento y
monitoreo de Salmonella sp.
Una variedad amplia de medios selectivos se ha desarrollado para este propósito.
Estos medios se fundamentan en características bioquímicas simples de los
microorganismos tales como la producción del sulfuro del hidrógeno o la ausencia de
fermentación de la lactosa.
En un estudio realizado por Sisbley y sus colaboradores se determinó que el uso de
medios de cultivo
microbianos de doble-enriquecimiento, además de un pre-
enriquecimiento, aumenta la sensibilidad y permite la detección de animales positivos
que la prueba de Elisa no detecta.
La Salmonella sp pueden aislarse utilizando varias técnicas, una de las cuales es preenriquecimiento para recuperarlas con daño subletal, medios de enriquecimiento que
contienen sustancias inhibidoras para evitar microorganismos competitivos y medios
sólidos selectivos en placa para diferenciar
este microorganismo
de otras
Enterobacterias.
La Salmonella
crece de muestras poco contaminadas en medios de aislamiento
primario y en muestras muy contaminadas en caldos de enriquecimiento y medios
selectivos, crece en medios como MacConkey, agar sulfito-bismuto, verde brillante,
Salmonella-Shigella (S.S),
Xilosa. Lisina Desoxicolato (XLD), Xilosa. Lisina
Tergitol (XLT4) sin factores especiales de crecimiento. En muestreos en plantas de
sacrificio se usan para evitar que los procesos de desinfección enmascaren los
microorganismos latentes.
Dusch y Alttwegg en 1995, compararon seis medios de cultivo para el aislamiento de
Salmonella spp y encontraron que el Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis
Médium (MSRV) fue el medio mas sensible y especifico.
De forma general, el método microbiológico utilizado con mayor frecuencia por su
alta sensibilidad para detectar animales infectados, como secretores asintomáticos y
muestras de tejidos en general, incluyen:
2.5.1.1 Preenriquecimiento no selectivo
Se utiliza en muestras donde el número de Salmonella es muy bajo o las células
pueden no estar viables, en planta de sacrificio es muy útil debido a los proceso de
desinfección a los que son sometidas las carcasas. Se utiliza el agua peptonada
tamponada (APT) con gran capacidad de tampón y sin un azúcar fermentable, el
caldo universal UB y el medio M9 son otros caldos utilizados. Juven y col, en 1984
describieron que el APT y M9 son mejores que el medio CL, el pH de la APT es
básico, suprime el crecimiento de muchas otras bacterias intestinales promoviendo
el crecimiento de Salmonella (Hoffar y Mortensen, 2000).
2.5.1.2 Enriquecimiento selectivo
Se caracteriza por suprimir la microflora competitiva y promover el enriquecimiento
selectivo de Salmonella sp. En el mercado se comercializan gran variedad de caldos
de enriquecimiento pero son el caldo Rappaport-Vassiliadis (RVS), Caldo
Tetrationato (TTO) y el caldo Selenito (SC) los más utilizados (Walkman, 2000).
Después de inocular la muestra a partir del caldo de pre-enriquecimiento (APT), la
cepa se agrega en el caldo de enriquecimiento selectivo.
El caldo RVS fue
propuesto por Vassiliadis, es una modificación del mismo
propuesta por Rappaport. Este caldo es muy selectivo especialmente a 41ªC por 24
horas, la concentración de malaquita y cloruro de magnesio son bajas para promover
el crecimiento de Salmonella. El caldo TTO a partir del tiosulfato presente en el
medio se forma tetrationato al añadir el yodo, que inhibe el crecimiento de coliformes
y otras bacterias intestinales. Por el contrario el caldo SC inhibe el crecimiento de
coliformes intestinales y enterococcus, principalmente en las primeras 6 a 12 horas de
incubación. El medio contiene: peptona o triptona, lactosa, sales. No son inhibidas
Proteus ni Pseudomonas. Si se observa color rojo ladrillo de selenito precipitado, el
medio no debe utilizarse. El material sólido se inocula directamente en el caldo; el
material líquido se debe mezclar en una relación 1:1 con caldo a doble concentración.
Se incuba 24 horas a 37º C o a 34º
Se han propuesto medios semi-sólidos selectivos como una alternativa de los caldos
de enriquecimiento como el Rappaport-Vassiliadis modificado para destacar las
características de movilidad de la mayoría de los serotipos de Salmonella.
2.5.1.3 Aislamiento diferencial sobre medios selectivos
Esta metodología se desarrolla en medios selectivos sólidos basados en el principio
de la selectividad por medio de una sustancia inhibidora de otras enterobacterias, y
diferenciación mediante la adición de sustancias que caracterizan visualmente las
colonias de Salmonella frente a otros microorganismos. Los caracteres mas utilizados
son la incapacidad de fermentar la lactosa y la producción de acido sulfhídrico.
Los medios de agar sólido deben ser juzgados no solo por su capacidad para permitir
el crecimiento de Salmonella, sino por la facilidad de diferenciar visualmente a este
microorganismo de otras bacterias, pues al presentarse falsos positivos el tiempo de
análisis de las muestras se incrementaría y la eficacia de la prueba disminuiría.
o Agar XLD
La selectividad de este medio es de moderada a alta. La degradación de xilosa,
lactosa y sacarosa produce acidez que hace virar el indicador al amarillo. El tiosulfato
y la sal de hierro ponen en evidencia la producción de sulfhídrico. La decarboxilación
de la lisina a cadaverina se visualiza por la presencia de un color rojo púrpura por
aumento del pH.
El
desoxicolato
inhibe
bacterias
grampositivas.
La
diferenciación
de
Salmonella/Shigella de otras enterobacterias se basa en tres reacciones: fermentación
de xilosa, decarboxilación de lisina y producción de sulfhídrico. La lisina diferencia
Salmonella de los fermentadores de xilosa no patógenos. La lactosa y la sacarosa en
exceso evitan que los coliformes lisina positiva reviertan la condición alcalina de los
microorganismos consumidores rápidos de xilosa/lisina. La producción de ácido
sulfhídrico ocurre en condiciones alcalinas produciendo colonias con centro negro; en
condiciones ácidas la precipitación negra se inhibe.
El medio contiene: extracto de levadura, xilosa, lactosa, sacarosa, lisina, desoxicolato,
tiosulfato, citrato de hierro amoniacal, rojo fenol, sales. El precipitado que
ocasionalmente presenta el medio no perjudica su rendimiento, puede eliminarse por
filtración. Las colonias de Salmonella spp se observan trasparentes, ocasionalmente
con centro negro.
o Agar XLT4
La selección de nutrientes y vitaminas (peptonas, extracto de levadura) permiten el
crecimiento óptimo de Salmonella. El compuesto NIAPROOF-4 inhibe en gran
parte la flora acompañante. La composición es proteasa peptona, extracto de
levadura, L-lisina, xilosa, lactosa, sucrosa, citrato del amonio-Hierro (III); tiosulfato
de sodio; cloruro de sodio, rojo de fenol.
La Salmonella, produce a H2S (tiosulfato y Iones de Hierro), se pueden detectar
fácilmente como colonias negras en un fondo rojo-violeta , las colonias son fáciles de
distinguir de los demás microorganismos
Las colonias de Salmonella se observan de color negro o rojo con o sin centro
negro. El borde o margen de la colonia podría permanecer amarillo dentro de las 24
horas, posteriormente debería virar a rojo.
o Agar S.S
Medio selectivo para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir de materia fecal,
alimentos y animales. La presencia de verde brillante, bilis de buey, alta
concentración de tiosulfato y el citrato inhiben la microflora competitiva. El tiosulfato
y la sal de hierro ponen en evidencia la formación de sulfuro de hierro. La
degradación de la lactosa a ácido provoca el viraje del indicador rojo neutro a rojo. El
medio contiene: extracto de carne, peptona, lactosa, citrato de hierro amoniacal,
tiosulfato, verde brillante, rojo neutro. Las colonias de Salmonella son trasparentes
con centro negro, el medio presentara un viraje del medio a amarillo.
2.5.1.4 Confirmación bioquímica de cepas sospechosas.
Se utilizan para el diagnostico presuntivo de Salmonella sp.
o Citrato de Simmons
Determina si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono
y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo,
provocando una alcalinización del medio. Este medio contiene citrato de sodio y
fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de
bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el
citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con
la eliminación del citrato (ácido), generará una cambio de pH a básico que será
aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.
o Agar Triple Azúcar-Hierro (TSI)
Este medio determina si un microorganismo utiliza de hidratos de carbono en su
metabolismo, contiene glucosa al 0.1% y la lactosa y sacarosa al 1%. Algunas
especies de Salmonella fermentan solo la glucosa, otros todos los azucares. La
fermentación se produce aeróbicamente (en el pico de flauta) y anaeróbicamente
(profundidad). La Fermentación de la glucosa solamente (alcalino/ácido) se observa
cuando el medio se torna alcalino (rojo), 18-24 horas. después de
incubación.
Luego del consumo de la glucosa el microorganismo comienza a utilizar peptonas y
se produce el catabolismo de las peptonas con producción de amoníaco que alcaliniza
el medio dando un color rojo.
Cuando la capa profunda es ácida (amarilla) se ha producido degradación anaeróbica
de la glucosa. Luego de 18-24 hs. de incubación es degradada anaeróbicamente la
glucosa, pero se forman productos terminales ácidos.
La Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (ácido/ácido) se observan debido a
que las dos últimas están en una proporción 10 veces mayor que la glucosa en el
medio, en un período de 18-24 horas la concentración de la lactosa y sacarosa, aún no
se han consumido y todavía existiendo una condición ácida (amarilla).
Cuando no hay fermentación de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino) se
trata por lo general de bacilos gramnegativos no entéricos. Como son incapaces de
obtener sus nutrientes de los hidratos de carbono, lo obtienen de las peptonas. Cuando
las peptonas son degradadas liberan amoníaco y alcalinizan el medio.
De acuerdo a la producción de gas se clasifican los microorganismos en aeróbicos
con producción de CO2 y H2, pueden presentarse en forma de una sola burbuja,
burbujas en el medio y desplazamiento del medio. Los anaeróbicos no presentan
producción de gas.
o Agar Lisina-Hierro (LIA)
La decarboxilación de la lisina a cadaverina produce una alcalinización del medio y
un viraje al violeta del indicador púrpura de bromocresol. Como la reacción tiene
lugar en medio ácido, es necesaria la fermentación previa de la glucosa. Los
microorganismos que no decarboxilan lisina, pero fermentan la glucosa producen un
viraje al amarillo en todo el medio. La formación de H2S produce una coloración
negra debido al sulfuro de hierro producido.
o Urea
Este medio indica si los microorganismos poseen la enzima ureasa, encargada de la
hidrólisis de la urea, cuando esta enzima esta presente se libera amonio y se produce
un cambio de color amarillo a fucsia en el medio. Inicialmente la superficie inclinada
se torna roja porque la reacción alcalina, que resulta de la dispersión de pequeñas
cantidades de urea, aumenta a causa de las aminas provenientes de la decarboxilación
oxidativa de los aminoácidos en la región del medio expuesta al aire. La Salmonella
es ureasa negativa (Koneman, 1992).
o Sulfuro de Hidrogeno-Indol-Motilidad (SIM)
Es un medio que se usa para determinar la formación de sulfuro de hidrógeno, la
producción de indol y la movilidad en el diagnóstico de Enterobacterias.
Un
microorganismo
que
produce
sulfuro
de
hidrógeno
puede
mostrar
ennegrecimiento en SIM pero no en TSI por la presencia de sacarosa en este último.
La utilización de la sacarosa puede suprimir los mecanismos enzimáticos
responsables de la producción del sulfuro de hidrógeno.
1.5.1.5 Serotipificación.
Para obtener una confirmación definitiva de la cepa aislada, se pueden aplicar varias
pruebas bioquímicas y serológicas en cultivos puros. La identificación serológica se
basa en la determinación de los componentes antigénicos mediante la utilización de
antisueros monovalentes y polivalentes. La serotipificación constituye un importante
complemento de la identificación bioquímica y desde el punto de vista
epidemiológico permite determinar la prevalencia de un serotipo en distintas zonas
geográficas y también es de utilidad para el estudio de brotes y para conocer la
fuente de infección y las vías de transmisión.
El uso de reacciones antígeno – anticuerpo para la serotipificación de las bacterias se
basa en que los microorganismos presentan diferencias en su constitución antigénica,
aún entre grupos de microorganismos relacionados. Los microorganismos expresan
una gran variedad de antígenos (Ag): componentes estructurales de la célula (pared,
cápsula, fimbrias) y productos de excreción (exotoxinas, enzimas extracelulares).
Químicamente, los antígenos pueden ser proteínas, hidratos de carbono y complejos
de polipéptidos y carbohidratos. Como son moléculas complejas tienen más de una
subestructura que puede servir como determinante antigénico. Debido a esto en los
sueros inmunes se encuentran anticuerpos que reaccionan contra distintos
determinantes antigénicos de la misma molécula.
La identificación de los antígenos somáticos (O), flagelares (H) y en circunstancias
especiales el antígeno de virulencia
(Vi) se realiza por aglutinación directa en
portaobjetos para determinar los diferentes serotipos; estos antígenos
pueden
identificarse por antisueros específicos de tipo, y después puede determinarse el
serotipo por referencia a la formula antigénica del esquema de Kauffman -White.
Los antisueros polivalentes detectan el antígeno somático “O” determinando el
género Salmonella, los antisueros monovalentes somáticos determinan el grupo al
que pertenece cada cepa (Dickinson, 1998).En caso de organismos bifásicos, es
necesario identificar ambas fases por inversión de fase, lo que implica el pase por
medio semisólido (Caldo BHI) que contenga antisuero contra la fase conocida.
La detección se facilita por la disponibilidad de antisueros dirigidos contra varios
factores y puede mejorarse utilizando sueros monovalentes de tipificación. Los
serotipos de Salmonella surgen como consecuencia de una asociación particular de
factores antigénicos somáticos O y flagelares H.
2.5.1.5.1 Esquema de Kauffmann - White
Tomando como base de los componentes antigénicos somáticos O y flagelares H se
ha establecido lo que se denomina el Esquema de Kauffmann-White, que agrupa a
todas los serotipos conocidos (Anexo 8) del genero Salmonella, las características de
la nomenclatura son las siguientes:
o
Primera columna: indica el nombre del serotipo, si el mismo pertenece a S.
enterica subesp. enterica (I) ó las siglas S. II, S. IIIa, S. IIIb, S. IV, S. V, S. VI;
indicando que la serovariedad considerada pertenece a la subespecie II ó III a, etc
o
Segunda columna: Antígenos somáticos (O). Los números indican el ó los
factores del antígeno O y se escriben, separados por una coma. Los serotipos son
agrupadas en grupos somáticos, cada uno de ellos caracterizado por un factor O
mayor. Así se determinan los grupos A, B, C, etc. Por ej. el grupo O:2 (A) está
integrado por S. Paratyphi A (1,2,12:a:-) entre otras, el grupo O:4 (B) por S.
Typhimurium
(1,4,5,12:i:1,2);
S.
Agona
(1,4,12:f,g,s:-
);
S
Saintpaul
(1,4,5,12:e,h:1,2), entre otras, etc. El Esquema de Kauffmann-White presenta 67
grupos O, desde el grupo A hasta el Z y luego continúa con números, desde el O:51
hasta el O:67
o
Tercera y cuarta columna: Antígenos flagelares (H). Se indican los factores de
las fases 1 y 2, del antígeno H, respectivamente. Para la fase 1 los factores se
denominan con letras minúsculas, seguidas algunas veces por un número que figura
como subíndice y para la fase 2 se emplean en general números arábigos, aunque
también se utilizan letras minúsculas.
Un signo "negativo" indica que la fase
considerada está ausente y por lo tanto el serotipo es monofásico. _Los símbolos para
los factores somáticos determinados por conversión fágica están subrayados (por ej.
1,2,12)
[ ] = los factores O o H entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes o
ausentes sin relación con la conversión fágica. Por ej. factor [5] del grupo O:4 (B).
Cuando los factores H están entre corchetes significa que se encuentran
excepcionalmente en cepas silvestres.
Algunos ejemplos de las fórmulas antigénicas son los siguientes: Salmonella
Enteritidis 1,9,12:g,m:- [Ag O 1, 9,12; Ag H (fase 1) g,m; Ag H (fase 2) es -; la fase 2
está ausente, por lo tanto la serovariedad es monofásica], Salmonella Typhimurium
1,4,5,12:i:1,2 [Ag O 1,4,5,12 ; Ag H (fase 1) i ; Ag H (fase 2) 1,2; las dos fases
flagelares están presentes, por lo tanto el serotipo es difásico]. Salmonella Hadar
6,8:z10:e,n,x , y, Salmonella Typhi 1,9,12[Vi]:d:-.
2.5.2 Metodología Serológica
El análisis serológico es una metodología diagnóstica indirecta que evalúa la
presencia de anticuerpos específicos frente a un determinado microorganismo y se
fundamenta en reacciones inmunoenzimáticas.
El principio de la identificación serológica, se basa en la mezcla de microorganismo
(antígeno) con el suero inmune (anticuerpo). Si el suero posee aglutininas frente al
antígeno, se presenta aglutinación de por lo menos 3+ (Reacción homologa).Otras
ocasiones puede reaccionar el suero hiperinmune con otras especies de Salmonella
debido a que comparten antígenos (Reacción heterologa) (Schneider, 2001).
Este método es rápido y permite evaluar gran cantidad de muestras en corto tiempo y
es económico para detectar anticuerpos en suero o en jugos cárnicos en cerdos. La
detección de anticuerpos es importante para estimar la prevalencia de la enfermedad
en una granja detectando animales expuestos a la infección (Muñoz, 2001).
La técnica mas utilizada para el diagnóstico serológico de salmonelosis es ELISA
(Enzyme
Linked
Inmunosorbent
Assays),que
detecta
la
presencia
del
microorganismo patógeno o la respuesta inmune humoral del organismo
(anticuerpos).
Dentro de los kits comerciales
utilizados para la evaluación serológica
de
salmonelosis en cerdos esta el Covalent mix-ELISA (SVANOIR), Danish mixELISA (DME) y el IDEXX HerdChek® Swine Salmonella,
anticuerpos específicos para
estos kits detectan
S. Typhimurium, S. Cholerasuis, S. enteritidis, los
cuales detectan anticuerpos directos contra epítopes de los lipolisacaridos de los
antígenos 0, 1, 4, 6, 7 y 12; detectan anticuerpos frente a Salmonella pertenecientes a
los serogrupos B, C1, C2 y D (Citado por Perez, 2005).Los anticuerpos que se
detectan son IgG cuando las concentraciones no son muy bajas, esto representa una
desventaja pues podría emitirse un resultado falsamente negativo.
2.5.3 Diagnostico Molecular
Entre las ultimas metodologías desarrolladas se encuentra la técnica
molecular
basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica rápida (1-3
días de diagnostico)y efectiva pero entre las desventajas se encuentra su elevado
costo, la sensibilidad de la técnica a ser afectada por sustancias inhibidoras que
acompañan la muestra y la inhabilidad de detectar menos de 10 UFC en muestras sin
preenriquecimiento.
2.5.4 Consideraciones para el diagnostico final
Para realizar el diagnóstico se deben integrar varios aspectos la historia de la granja y
la clínica orientan sobre el origen del problema, se debe utilizar la información
generada a partir de los hallazgos macroscópicos de la necropsia (principalmente
enteritis necrótica, colitis y linfoadenopatía mesentérica),
el aislamiento de la
bacteria (aunque las muestras deben tomarse de órganos menos contaminados como
ganglios linfáticos mesentéricos) y la histopatología para llegar al diagnóstico
definitivo y establecer el plan de control especifico.
En el diagnóstico diferencial se deben incluir otros patógenos como: Erysipelotrix
rhusiopathiae, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae ó Actinobacillus
suis, el agente causal de la Peste Porcina Clásica, disentería Porcina, EPP, rotavirus,
coronavirus, Colibacilosis postdestete, trichuriasis y coccidiosis.
Al realizar la necropsia es habitual observar congestión de la mucosa fúndica gástrica,
esplenomegalia, hepatomegalia (menos severa), linfoadenopatia mesentérica y
gastrohepática, pulmones congestivos, bronconeumonía craneoventral, hemorragias
petequiales en riñón y si la enfermedad alcanza la cronicidad se observan lesiones
intestinales características de la enterocolitis, incluyendo la típica “ulcera en botón”
en el colon.
La histopatología muestra nódulos paratifoideos en hígado (septicemia), hiperplasia
de las células reticulares del bazo y nódulos linfáticos, así como inflamación
generalizada del endotelio y células histiocíticas típicas de sepsis por bacterias
gramnegativas, a nivel de intestino se observa
necrosis de las criptas y de la
superficie de los enterocitos que involucra la mucosa y submucosa (ulceras en colon)
así como
de los ganglios linfáticos en los casos crónicos se pueden observar
hipertróficos.
Un aspecto, en el que sin duda se debe investigar más, es el de las interacciones entre
ciertos virus como el causante del Síndrome Respiratorio y Reproductivo del Cerdo
(SRRP) o el virus de la enfermedad de Aujeszky con bacterias del genero Salmonella
sp. Pfeifer (1994) reportó la asociación entre aflatoxicosis y Salmonella sp. en un
brote que coincidió con el uso de maíz con altos niveles de aflatoxinas.
2.6 EPIDEMIOLOGIA
La salmonelosis es una zoonosis de distribución mundial. Se notifica con mayor
frecuencia en los países desarrollados, ya que poseen mejores sistemas de
notificación. Es una enfermedad de origen alimentario, porque los alimentos
contaminados constituyen el principal modo de transmisión. Durante las últimas dos
décadas, Salmonella enteritidis ha sido reconocida como uno de los principales
agentes etiológicos que causa infecciones gastrointestinales a nivel mundial
(Rodríguez y col, 1992 y Silva y col, 2000).En Sudamérica, los primeros hallazgos en
que se describieron infecciones por este microorganismo ocurrieron a mediados de la
década de 1990-99, originando brotes epidémicos en Argentina, Brasil y Chile (Irino
y col, 1996 y Fica y col, 1997).
En Chile, S enteritidis emergió con características epidémicas en 1994, afectando a
un gran número de personas, con tasas de ataque que aumentaron en 3.000 por ciento
con respecto a años anteriores (Silva y col, 2000). Durante el período epidémico,
1994-1996, 90% de las notificaciones de casos con infecciones por este
microorganismo provinieron de África y Antofagasta (Fica y col, 1997), gran parte de
estas infecciones alimentarias fueron atribuidas al consumo de huevos.
Posteriormente, S enteritidis se ha diseminado por todas las regiones de Chile,
constituyéndose en un patógeno humano endémico y, por consiguiente, en un
importante problema de salud pública (Fica y col, 2001).
Desde el punto de vista epidemiológico, las infecciones por Salmonella pueden
causar pequeños brotes en la población en general, sin embargo el 60 - 80% de los
casos son esporádicos; a veces se producen grandes brotes en hospitales, jardines
maternales, geriátricos y restaurantes. La fuente más frecuente de infección son los
alimentos contaminados en su origen, o con menor frecuencia durante su
manipulación por un portador; es también importante la transmisión de persona a
persona (Caffer y col, 2001). La contaminación por Salmonella puede producirse en
cualquier etapa de la cadena cárnica: desde las materias primas para alimentación
animal, la fabricación de pienso, la granja, la planta de sacrificio, la sala de desposte,
los centros de elaboración hasta la conservación y preparación del producto cárnico
por el consumidor en el hogar.
Algunos estudios (Davies y Funk, 1999) realizados sobre la
epidemiología de
Salmonella en cerdas indican una alta prevalencia (entre un 20 y 85%).La
importancia de entrar animales libres de Salmonella es primordial en granjas de ciclo
cerrado. Sin embargo, la importancia se reduce en sistemas de producción en
diferentes fases. Se ha demostrado que existe una fuerte asociación entre las
seroprevalencias de granjas de cerdas, destete y engorde (Kranker y Dahl, 2000; Dahl
et al., 2000).En Colombia los primeros reportes se hicieron por Bohórquez en 1947
a partir de cepas aisladas de cerdos enfermos, los serotipos hallados fueron:
Salmonella Cholerasuis y Salmonella Typhi (Gonzáles el al., 1997).
A partir de muestras provenientes de cerdos aparentemente sanos al sacrificio en los
Centros de Diagnostico del Instituto Zooprofilactico de Colombia entre 1959 y 1961,
se aisló Salmonella Manhattan, S. Javiana, S. Typhimurium y S. Give (Mora, 2003
citando a Roquerbert y Perdomo, 1964).
En 1963 a partir de muestras de alimentos embutidos como chorizos y longanizas se
aisló S. Muenchen y otra del grupo Ballerup, con un porcentaje del 2%. (Mora, 2003
citando a Bravo et al., 1963).
En los años 1980 hasta 1986, en Bogotá se realizo un estudio epidemiológico de
zoonosis
en hospitales, en el cual se encontró que Salmonella representa un
porcentaje significativo de zoonosis con 73 casos reportados (8.2%) (Pastrana, 2001).
A partir de alimentos concentrados para animales se aisló S. enteritidis S.
Thomasville, S. Thompson y S. Weterdale (Manrique et al., 1970).
También se han presentado varios brotes de Salmonella en productos cárnicos para
consumo del hombre. En 1982, Ariza y
colaboradores aislaron serotipos de
Salmonella: S. Enteritis, S Agona y S. Manhattan entre otras en dos mataderos de
Bogotá.
El ministerio de Salud reportó que entre noviembre de 1996 y diciembre de 1997 se
recibieron 68 cepas de Salmonella sp; provenientes de casos de gastroenteritis
aislados de coprocultivos, los cuales se remitieron desde distintas regiones así:
Amazonas 1, Antioquia 15, Caldas 4, Huila 2, Risaralda 1, Santander 16, Santafé de
Bogotá 26 y Tolima 3. Los serotipos encontrados fueron: S. Enteritidis 44 muestras
(64,4 %), S.
Typhimurium 20 muestras (29,4 %), y Salmonella grupo E1 en 4
muestras (5,9%).
En la Costa Atlántica de 636 muestras de alimentos analizadas se aislaron 47
Salmonella spp, lo cual equivale al 7,4% de las muestras. Los alimentos
contaminados con el microorganismo fueron: carne de res (40%), chorizo (25%),
queso (13%), cerdo (13%), pollo (4.2%) y arepa de huevo (4.2%); el 66%
correspondieron a alimentos crudos y el 34% cocidos (Durango y col, 2002).
Hidalgo en 1999 realizó un estudio en Bogotá con el ICA y la Universidad Javeriana,
en el cual se analizaron un total de 410 muestras, 260 pertenecientes a humanos y 150
pertenecientes a aves. Se obtuvó como resultado 25 muestras humanas positivas
(9,6%) y 36 aviares (24%) identificadas como Salmonella enterica. De las cepas que
afectan a humanos aisladas por Hidalgo, 3 se clasificaron como serotipos Enteritidis,
2 fueron clasificadas como ser. Typhimurium, igual número fueron determinadas
como ser. Typhi, una perteneció a la variedad Seremban y un total de 17 muestras
fueron no tipifícables.
Mora, 2003 en un estudio reciente de la prevalencia de Salmonella spp en jugos
carnicos de porcinos en plantas de beneficio de Bogotá, determinaron que
la
seroprevalencia encontrada a partir de 173 muestras de diafragma para la detección
de anticuerpos contra Salmonella fue de 27.2%; y recientemente por su parte, Escobar
y col (2004) encontraron una seroprevalencia de 65.5% para las madres multíparas y
del 41% para los cerdos de ceba en un estudio realizado en granjas
intensivas
porcinas
de Colombia; se evidenció la respuesta inmune frente a Salmonella
Typhimurium, S. Choleraesuis y S. Infantis.
Las intoxicaciones alimentarias constituyen un importante problema de salud pública
mundial (OMS, 1988). Entre las principales fuentes de contagio en humanos se
encuentran productos de origen animal contaminados,
el género Salmonella se
encuentra como uno de los patógenos más frecuente a nivel mundial. Los errores
cometidos en la cadena alimentaria transforman el riesgo potencial en una verdadera
multiplicación bacteriana (Linder 1995).El control de la prevalencia de este
microorganismo en el canal es importante para evitarla diseminación del agente en
los seres humanos.
En países desarrollados las toxi-coinfecciones alimentarias por zoonosis con
Salmonella son las más importantes. Los casos declarados en Europa son 73 por
cada 100.000 habitantes con importantes variaciones entre países en función del
método de diagnóstico, la comunicación de datos y también de los hábitos culinarios
de cada país. Posiblemente, las estadísticas minimizaron la incidencia real de la
enfermedad ya que los casos más leves no se declaran.
En la mayoría de casos se tratan de gastroenteritis acompañadas de un cuadro febril,
pero en algunos casos (5%) puede cursar en septicemia e incluso causar la muerte
(0,1% de los casos). Se estima que la incidencia real de salmonelosis en la Unión
Europea puede rondar los 450 casos anuales por cada 100.000 habitantes con 3
muertos por cada millón (Berends et al., 1998). Estas estimaciones coinciden con
datos reales de Estados Unidos donde se declaran anualmente entre 400 y 800
muertes por salmonelosis (CDC, 2001). La mortalidad es más elevada en las
poblaciones de riesgo: niños, personas de avanzada edad o población con el sistema
inmune debilitado. Por estos motivos la salmonelosis, junto a las otras toxiinfecciones
alimentarias importantes (Campylobacter y Yersinia), se ha convertido en una
cuestión prioritaria de salud pública para la Unión Europea (Libro Blanco sobre
Seguridad Alimentaria, 2000) y en objeto de normativa, monitorización y control.
Actualmente, la legislación establece una serie de controles sobre la presencia del
patógeno en el producto cárnico (Directiva 64/433/CEE, 71/118/CEE y 94/65/CEE),
así como sobre la epidemiología, comunicación y evaluación de la enfermedad en una
red europea de laboratorios (Enter-net) equivalente a FoodNet en Estados Unidos
(Directiva 92/117/CEE). A corto plazo, es previsible que las normativas sobre
presencia de Salmonella se extiendan a otros segmentos de la cadena alimentaria.
2.7 PREVENCION Y CONTROL
El plan de control de Salmonella requiere una presión constante en cada uno de los
eslabones de la cadena productiva. La regulación debe estar concentrada sobre la
planta de sacrificio (desposte) y en la distribución de productos cárnicos y
establecimientos de venta. Sin embargo, el control de las toxi-coinfecciones
alimentarias debe pasar por una reducción de la prevalencia de los patógenos en la
población animal. Por este motivo, es importante conocer los mecanismos
epidemiológicos que actúan en la introducción y control de la transmisión de
Salmonella en granjas porcinas.
En caso establecer la presencia de la enfermedad, es vital realizar un control de la
transmisión. Desde esta óptica, tan importante es el control de la enfermedad clínica
como la identificación serológica y control de las granjas con portadores subclínicos
que no muestran ninguna sintomatología de enfermedad.
La alimentación de los animales juega un papel crítico en el control de Salmonella no
sólo por ser un posible vector y foco de infección sino también por ser una
herramienta utilizada para controlar la transmisión del patógeno. Por un lado, se debe
realizar un control de Salmonella en materias primas y piensos para evitar la
introducción del patógeno a través de la alimentación del animal. Por otro lado,
determinados sistemas de alimentación afectan beneficiosamente el ecosistema
microbiológico en intestino y contribuyen a la disminución en la prevalencia de
Salmonella.
Un punto critico en control de Salmonella es la higiene microbiológica del alimento
es importante controlar la contaminación de las materias primas, aplicar medidas de
descontaminación (tratamientos químicos y/o térmicos) y prevenir la recontaminación
en fases posteriores del proceso productivo manteniendo la higiene microbiológica de
equipos e instalaciones en la fábrica de alimentos concentrados y en el transporte.
Para abordar de una forma global estos aspectos es importante evaluar la integridad
del proceso e implementar el análisis de peligros y puntos de control critico (APPCC
ó HACCP en inglés: Hazard Analysis and Critical Control Points) en las distintas
etapas: recepción de materias primas, fabricación de alimentos concentrados y
transporte
La contaminación por Salmonella se puede producir por otros múltiples vectores:
roedores, insectos, pájaros y el propio personal. Por lo tanto, es prudente pensar que
todas las materias primas pueden estar potencialmente contaminadas por Salmonella.
Algunas materias primas son más susceptibles de contaminación que otras, las
proteínas de origen animal han sido tradicionalmente identificadas como ingredientes
críticos con gran variabilidad en su grado de contaminación, los productos de
oleaginosas pueden mostrar tasas importantes de contaminación debido a la posible
presencia del patógeno en el proceso industrial de obtención. Los tratamientos
químicos para el control de Salmonella se basan en la sensibilidad a pH ácidos.
2.7.1 VACUNACION
La utilización de vacunación para el control de Salmonella tiene una utilidad muy
limitada desde un punto de vista de seguridad alimentaria (Davies y Funk, 1999). La
limitación de las prácticas vacúnales radica en su falta de especificidad para
determinados serotipos. La vacunación difícilmente crea inmunidad contra serotipos
no-propios del animal hospedador, además, su utilización previene básicamente la
invasión de tejidos, con poca efectividad sobre la colonización del tracto intestinal,
siendo esta última de gran importancia desde una óptica de seguridad alimentaria. Sin
embargo, en algunos casos se ha demostrado una disminución en la excreción fecal
de cualquier tipo de Salmonella al vacunar con vacunas vivas atenuadas de un
serotipo concreto (Charles et al., 1999).
2.8 TRATAMIENTO
Cuando se presentan casos de salmonelosis la primera estrategia de minimización de
daños es disminuir la severidad de la enfermedad, prevenir la propagación de la
infección y prevenir la recurrencia de la enfermedad.
2.8.1 Agentes Antimicrobianos y Resistencia
Los antibióticos son sustancias químicas sintetizadas parcial o totalmente en
laboratorio que inhiben el crecimiento e impiden el desarrollo y actividad de ciertos
microorganismos. Walkman en 1942 definió los antibióticos como sustancias
químicas producidas por microorganismos, que inhiben o destruyen otros
microorganismos (Foley y col., 1999).
Los ensayos de susceptibilidad están indicados para apoyar la quimioterapia
antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las que la
identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable su
susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el
organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes
antimicrobianos más comúnmente usados. Los mecanismos de resistencia incluyen la
producción de enzimas inactivantes de la droga, que alteran el objetivo, o alteran la
acción .El rango de actividad de un antimicrobiano se denomina espectro, término
usado para definir los géneros y especies frente a los cuales a demostrado ser activo.
Desde el punto de vista práctico existen distintos tipos de antimicrobianos. Los
antimicrobianos de uso sistémico
que reducen y controlan la presencia de
microorganismos que han invadido los tejidos, se puede clasificar según su origen,
naturales a partir de hongos, bacterias, etc.; sintéticos que se obtienen totalmente por
síntesis química y semisintéticos.
Los efectos de un antimicrobiano pueden ser bacteriostáticos o bactericidas, los
primeros
la máxima concentración no tóxica que se alcanza en suero y tejidos
impide el desarrollo y multiplicación de los microorganismos, sin destruirlos,
pudiendo éstos multiplicarse nuevamente al desaparecer el agente antimicrobiano.
Algunos bacteriostáticos son: tetraciclinas, cloranfenicol, macrólidos y sulfamidas.
(Rodríguez y col, 1992).Los bactericidas ejercen
acción
letal sobre los
microorganismos, por lo que éstos pierden irreversiblemente su viabilidad o son
lisados. Algunos de ellos son: penicilina, cefalosporinas, aminoglucósidos,
vancomicina, polimixina, rifampicina.
Los mecanismo de acción de los antimicrobianos son importantes y diversos algunos
inhiben la síntesis de la pared celular, otros alteran la permeabilidad celular, otros
inhiben la síntesis proteica y por ultimo otros actúan como inhibidores de la síntesis
de ADN y ARN.
La medicación de animales sólo es efectiva en aquellos animales con sintomatología
clínica. Además su utilización en portadores subclínicos no es aconsejable ya que no
reduce la prevalencia, ni la magnitud ni el periodo de excreción del patógeno (Dahl et
al., 1997) e incluso puede contribuir notablemente a la aparición de multiresistencias
(Mateu, 2001).El género Salmonella posee resistencia natural a la penicilina.
Para la medición de la actividad antimicrobiana, se utilizan pruebas de sensibilidad de
carácter manual, para determinar la resistencia o sensibilidad de un antibiótico
específico se determina la actividad inhibitoria del antimicrobiano ante determinada
cepa.
La resistencia bacteriana puede ser natural, causada por la incapacidad del
antimicrobiano de atravesar la pared celular del microorganismo, ausencia de una
célula diana especifica para el antimicrobiano, capacidad del microorganismo para
superar una vía metabólica bloqueada, producción de una enzima que activa el
antimicrobiano y resistencia de tipo cromosomal o plasmática (Perez, 2004). En
ocasiones los microorganismos desarrollan resistencia adquirida que es de carácter
mutacional, intercambio genético con otra bacteria (transformación, transducción o
conjugación) debido al uso indiscriminado de antibióticos.
Cada casa comercial distribuidora de antibióticos en sensidiscos (especiales para uso
en laboratorio) mediante tablas de parámetros de resistencia y sensibilidad provee
información necesaria para determinar si un antibiótico afecta el microorganismo en
estudio.
Existen dos metodologías para evaluar la eficacia de un microorganismo frente aun
antibiótico: Difusión en caldo y Difusión en gel agar. La metodología desarrollada
por la
técnica de Kirby-Bauer es un tipo de prueba de sensibilidad en la cual se
utilizan discos de papel filtro impregnado con varios agentes antimicrobianos y
colocados sobre la superficie de una caja de Petri con agar Mueller-Hilton,
previamente inoculada con la bacteria. El antibiótico contenido en el disco crea un
gradiente de concentración de antimicrobiano en el agar alrededor del disco., después
de la
incubación, las zonas de inhibición
alrededor del disco son medidas e
interpretadas como sensible, intermedio o resistente (basada en criterios preestablecidos).
3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION
Las intoxicaciones alimentarias causadas por productos de origen animal
contaminados constituyen un importante problema de salud pública a nivel mundial.
Entre los principales contaminantes el género Salmonella es uno de los patógenos
mas frecuentes. Las fallas sanitarias en la cadena alimentaria contribuyen a la
diseminación del agente y por ello es importante el control de la prevalencia de este
microorganismo en canales porcinas.
Con el fin de instaurar normas sanitarias para el manejo de canales en matadero,
evitar malas manipulaciones y teniendo en cuenta los antecedentes
de la alta
prevalencia serológica frente a este agente en las granjas porcinas intensivas del país,
se pretende, a través de este estudio implementar una metodología para evaluar la
presencia de especies de Salmonella en canales porcinas y establecer su posible
asociación con la problemática de campo.
Esta investigación pretende aplicar los métodos microbiológicos de evaluación en
planta de sacrificio para la detección de Salmonella sp en canales porcinas, mediante
la implementación de una metodología diagnostica para la detección del patógeno
mediante el muestreo no destructivo. Posteriormente se determinará la presencia de
especies de Salmonella sp
tipificación serológica.
y se caracterizaran mediante análisis bioquímico y
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Aplicar métodos de aislamiento microbiológicos y serológicos en una planta de
sacrificio con el fin de confirmar la presencia de Salmonella sp en canales porcinas
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Evaluar metodologías bacteriológicas para la detección de Salmonella sp. en
canales porcinas mediante el muestreo no destructivo.
Determinar la presencia de especies de Salmonella sp. mediante la aplicación de
técnicas de aislamiento.
Caracterizar las especies de Salmonella detectadas mediante análisis bioquímico y
tipificación serológica.
Discutir aspectos epidemiológicos que contribuyan a la prevención y control de
la salmonelosis en plantas de sacrificio.
5. MATERIALES Y METODOS
5.1. DISEÑO DEL ESTUDIO
La investigación consistió en determinar la presencia de Salmonella sp en las
canales porcinas, mediante una metodología
diagnóstica microbiológica y el
desarrollo de un muestreo no destructivo. Esta investigación pretendió determinar la
presencia de especies y serotipos de Salmonella sp mediante perfiles bioquímicos y
la tipificación serológica respectiva.
5.2 POBLACION DE ESTUDIO
El desarrollo del muestreo de este estudio se realizó en la planta de sacrificio
Guadalupe de la ciudad de Bogotá, Colombia. El muestreo se desarrolló entre los
meses mayo y julio del 2006. Se muestrearon cerdos en canal, provenientes de
diferentes regiones del país.
Las pruebas de laboratorio, el análisis microbiológico y serológico se realizaron en
el Laboratorio
Nacional de Diagnostico Veterinario (CEISA) del Instituto
Colombiano Agropecuario (ICA) en Bogotá.
La toma de muestras se realizó
transcurrida media jornada de sacrificio durante el oreo y antes de someter la carne a
desinfección (Figura 3). También se realizaron tres muestreos en corrales de
cuarentena ubicados en planta de sacrificio.
Figura 3. Población bajo estudio. Disposición de las canales en el salón de oreo.
Sitio de colección de muestras.
5.3. SELECCIÓN Y TAMAÑO DE MUESTRA.
En la planta de sacrificio, donde se llevo a cabo esta investigación, se sacrificaron
mensualmente en promedio 15478 cabezas de ganado porcino. De acuerdo con la
prevalencia estimada del 27.2% de Salmonella sp. según el estudio realizado en
Colombia por Mora en el 2003 y con un nivel de confianza del 90 %, se calculó el
tamaño total de la muestra fue 624 submuestras distribuidas de la siguiente manera:
Cada semana se seleccionaron
al azar 13
carcasas, cada una
a su vez fue
submuestreada en las siguientes áreas: Cabeza, vientre, lomo y pierna; lo que indica
que se tomaron doscientas ocho (208) muestras mensuales durante 12 semanas (3
meses). Semanalmente se tomaron cincuenta (52) muestras. En total se muestrearon
156 carcasas y 624 submuestras (Anexo 1).
5.4. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
-Método no destructivo sobre carcasa:
Para el muestreo y colección de las muestras en las canales porcinas se empleo el
método no destructivo de arrastre sobre la piel de las carcasas con hisopos estériles
(dos por muestra). Los hisopos se humedecieron durante cinco segundos antes de la
toma de muestras empleando una solución estéril de Agua Peptonada Tamponada
(APT).
Posteriormente con una plantilla en acrílico estéril de 10 cm. x 10cm, de cada canal
2
seleccionada se tomaron cuatro muestras superficiales en un área de 100 cm (10 x10
cm), la cual se delimito por la plantilla estéril. Se aplicó la mayor presión posible y
se frotó en el área delimitada por la plantilla 10 veces verticalmente (de arriba hacia
abajo) y luego 10 veces horizontalmente (derecha a izquierda). Las cuatro áreas de
donde se obtuvieron las muestras fueron: cabeza, vientre, lomo y pierna (Fig. 4). Las
plantillas de acrílico fueron utilizadas solamente una vez pues se descartaban al
finalizar el muestreo.
Las muestras anteriormente mencionadas se recogieron en tubos falcón con 10 ml
de APT y
a continuación se homogenizaron mediante agitación. (Anexo 2). El
transporte se realizó en una nevera de icopor con hielo seco hasta el momento de
llegada al laboratorio donde luego fueron procesadas (Figura 5.)
a)
b)
c)
Figura 4. Toma de Submuestras. Hisopado de arrastre.
a) Hisopado de la cabeza. b) Hisopado del vientre c) Hisopado del lomo.
d) Hisopado de la pierna.
Figura 5. Condiciones de transporte de implementos y materiales utilizados
durante los muestreos.
5.4.1 Procesamiento de las muestras
El proceso se realizó en condiciones de completa esterilidad en el laboratorio de
microbiología (Fig. 6 y 7).Las asas fueron desinfectadas en cada proceso para evitar
contaminaciones ambientales.
Figura 6 .Procesamiento de las muestras en el laboratorio. Empleo del mechero.
Figura 7. Procesamiento de las muestras en el laboratorio. Empleo de la cabina
de bioseguridad.
5.4.1.1 Pre-enriquecimiento no selectivo
Inicialmente en el laboratorio cada espécimen se dividió en dos, con un volumen final
de 5 ml. con su respectivo hisopo.
A continuación cada tubo se identificó como “tubo A” el cual se incubo a 37 ± 1°
C durante 18-24 horas y el
(Fig. 8).
“tubo B” se incubo a 41 ± 1° C durante 18-24 horas
Figura 8. Métodos bacteriológicos para el aislamiento de Salmonella sp a partir
de carcasas porcinas. Procesamiento del Pre-enriquecimiento no selectivo.
5.4.1.2 Enriquecimiento selectivo.
Posteriormente, se transfirió del tubo B, 1 ml de la solución a un tubo con 9 ml de
Caldo de enriquecimiento Rapapport Vassiliadis (RVS), y un (1) ml a otro tubo
con nueve (9) ml de Caldo de enriquecimiento Selenito-Cistina (SC) y luego se
incubaron a 43 ± 1° C durante 18 – 24 horas
De otro lado, a partir del tubo A se extrajo un (1) ml y se deposito en un tubo con
nueve (9) ml de Caldo Tetrationato (TTO), al cual previamente se le había
adicionado 0.4 ml de Yodo, posteriormente se incubó a 37 ± 1° C durante 18 – 24
horas. (Figura 9).
a)
b)
Figura 9. Métodos bacteriológicos para el aislamiento de Salmonella sp a partir
de carcasas porcinas. Proceso de Incubación para el Pre-enriquecimiento no
selectivo de las muestras. . a) Incubación a 37ª C. b) Incubación a 43 ± 1° C.
5.4.1.3 Siembra en medios selectivos
Una vez se finalizó el enriquecimiento se procedió a la agitación de los tubos de
RVS, S-C, TTO, se introdujo el asa de aro en el interior de estos tubos y tomando
abundante inóculo se sembró por agotamiento sobre Agar Xilosa Lisina Desoxicolato
(XLD), Agar Salmonella-Shigella (S.S) y Agar Xilosa Lisina Tergitol (XLT4)
(Figura 10).
Figura 10. Métodos bacteriológicos para el aislamiento de Salmonella sp a partir
de carcasas porcinas.
Siembra en medios selectivos a partir de caldos de
enriquecimiento selectivo. Procedimiento de enriquecimiento selectivo.
Se compararon las metodologías de aislamiento, (1-9), por muestra y submuestra
para establecer cual fue la mas efectiva para aislar Salmonella sp a partir de canales
porcinas en planta de sacrificio, según las sugerencias de la literatura. Cada muestra
fue sometida a nueve metodologías de aislamiento las cuales se categorizaron como
se indica en la tabla 4 de la siguiente manera.
Tabla 4. Protocolos para el aislamiento de Salmonella sp a partir de canales
porcinas.
MEDIOS DE AISLAMIENTO
Nª
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Caldo de Pre-
Caldo de enriquecimiento
enriquecimiento
selectivo
Agua Peptonada
Tamponada
Agua Peptonada
Tamponada
Agua Peptonada
Tamponada
Agua Peptonada
Tamponada
Agua Peptonada
Tamponada
Agua Peptonada
Tamponada
Agua Peptonada
Tamponada
Agua Peptonada
Tamponada
Agua Peptonada
Tamponada
Rapapport Vassiliadis
Selenito-Cistina
Caldo Tetrationato
Rapapport Vassiliadis
Selenito-Cistina
Caldo Tetrationato
Medio selectivo
Agar Xilosa Lisina
Desoxicolato
Agar Xilosa Lisina
Desoxicolato
Agar Xilosa Lisina
Desoxicolato
Agar Xilosa Lisina
Tergitol
Agar Xilosa Lisina
Tergitol
Agar Xilosa Lisina
Tergitol
Rapapport Vassiliadis
Agar Salmonella-Shigella
Selenito-Cistina
Agar Salmonella-Shigella
Caldo Tetrationato
Agar Salmonella-Shigella
5.4.1.3 Pruebas bioquímicas
Las
colonias típicas o sospechosas provenientes
de los
medios de cultivo
mencionados anteriormente fueron repicadas en XLD . Cuando se seleccionaron las
colonias características y puras de Salmonella sp se analizaron con la batería de
pruebas bioquímicas.
Luego cada colonia se inoculó en: Medio citrato de simmons, agar triple azúcarhierro (TSI), agar lisina-hierro (LIA), UREA y en el medio Sulfuro de HidrogenoIndol-Motilidad (SIM). Para ello, se tomó suavemente la superficie y el centro de la
colonia sospechosa con el asa de platino y a continuación se sembró en cada medio.El
citrato se inoculó mediante una estría suave sobre la superficie, luego en TSI en
profundidad y estría en superficie. La urea fue
inoculada mediante una estría
superficial y el tubo de Agar LIA se inoculó picando dos veces en profundidad y
estría en superficie. Posteriormente se inoculó el medio SIM con asa recta picando
el medio por el centro y dos terceras partes de profundidad, procurando sacar el asa
por el mismo orificio. Finalmente se incubaron todos los medios utilizados a 37 ± 1°
C por 24 ± 2 hrs. (Figura 11).En general se utilizaron los métodos convencionales
descritos en la literatura para identificación bioquímica del genero Salmonella.
Figura 11. Métodos bacteriológicos para el aislamiento de Salmonella sp a partir
de carcasas porcinas. Batería de pruebas bioquímicas convencionales para el
genero Salmonella.
5.4.1.4. Tipificación Serológica.
Para establecer el género y la especie de los microorganismos aislados se utilizaron
los antisueros polivalentes y monovalentes (Difco, USA) comerciales y disponibles
en el país. El método utilizado a sido ampliamente utilizado en la literatura disponible
Cada aislamiento se sembró por duplicado en Agar Infusión Cerebro Corazón para
realizar la tipificación somática y flagelar.
a. Prueba de aglutinación en lámina para la determinación de antigenos somáticos
“O”.
Las colonias positivas para Salmonella sp confirmadas con los perfiles bioquímicos
se repicaron en Agar Infusión Cerebro Corazón
(BHI) en tubo inclinado y se
incubaron a 37 ± 1° C por 18- 24 ± 2 hrs.
Posteriormente se adicionaron 2.5 ± 1 ml de solución salina formolada (Anexo 8) al
tubo con el microorganismo crecido y se emulsionó. Este proceso inactivó las cepa y
después de una (1) hora de reposo a temperatura ambiente, se adicionó 10 µl de la
suspensión bacteriana en un portaobjetos y se agregó 10 µl de antisuero polivalente
con el fin de determinar el género de los aislamientos [“Salmonella O antisero Poly
A-I and Vi” (Difco, ref. 224751)]. Después de mezclar durante dos (2) minutos se
observo la presencia de flóculos con luz blanca directa, indicando la positividad.
Al lado de la muestra con su respectiva gota de antisuero siempre se utilizó un control
negativo, el cual, consistió en 10 µl de una gota de la suspensión bacteriana y 10 µl
de solución salina formolada con el fin de descartar la posibilidad de que la cepa
autoaglutinara y se emitiera un resultado falso positivo.
Si la muestra aglutinaba con los sueros polivalentes se procedió enfrentar con
antisueros polivalentes del grupo “Salmonella O antisuero poly A” (Difco, ref.
224722), el cual contiene los grupos somáticos A, B, D, E1, E2, E3, E4 y L.
b. Prueba de aglutinación en tubo para la determinación del antígeno flagelar H (Fase
1).
A partir de uno de los cultivos de la cepa en Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI),
se inoculó con una punción de 1 cm. en agar motilidad el cual se incubó a 37 ± 1° C
por 18- 24 ± 2 hrs. En caso de observarse movilidad, se tomaba una alícuota y se
inoculaba en Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) a 37 ± 1° C por 18- 24 ± 2
hrs.; si en el tubo con agar motilidad no se observaba un desplazamiento evidente se
repicaba en otro tubo con el mismo medio y si fuese necesario este proceso se repetía
varias veces hasta que la bacteria indujera flagelos, con algunas cepas se realizaron
hasta 3 pases.
En el caldo BHI se evidenció el crecimiento por la presencia de turbidez y a
continuación se adicionó solución salina formolada hasta llevar la suspensión a un
concentración de 6 x 108 bacterias /ml de la escala 0.5 Mac Farland. Luego se dejó en
reposo la suspensión durante una hora a temperatura ambiente.
Posteriormente, se adicionaron 500 µl de la suspensión de BHI anteriormente
descrita y 500 µl de cada antisuero H Flagelar (Disco, USA) previamente diluido
según la recomendación de la casa comercial. (8.23 ml de solución salina y 100 µl del
antisuero). El Kit Spicer Edwards contiene cuatro tubos 1, 2 ,3 4 (Anexo 7), para la
detección del antígeno flagelar de cada aislado.
En el tubo control se agregaron 500 µl de solución salina formolada y 500 µl de la
cepa para evitar autoaglutinaciones. Luego se llevó a incubación en baño serológico a
50± 1ª C durante 1 hora, evitando cualquier agitación.
Transcurrido este tiempo se realizó la lectura con luz blanca directa determinando
positividad con
la presencia de flóculos en el fondo de la suspensión y la
aglutinación se registró mediante la tabla de “Reacciones de los Salmonella H
Antisera Spicer Edwards” (Anexo 7) para identificar la Fase flagelar 1 de cada
aislamiento
c. Prueba de aglutinación en lámina para la determinación de antígenos somáticos
“O” específicos por serogrupo.
A partir de la identificación del serogrupo y la determinación de los antígenos
específicos en el esquema de Kauffman-White (Anexo 9) se seleccionaron
los
antisueros con los que se debía enfrentar el aislado para ubicarlo en un serotipo
mediante su evaluación frente a los
antisueros monovalentes
con el fin de
determinar la presencia de un antígeno especifico y la especie de las cepas aisladas.
Para ello, se adicionaron 10 µl
de la suspensión bacteriana (cepa en agar BHI
inactivada con solución salina formolada) en un portaobjetos y 10 µl de antisuero
monovalente (Difco) y después de mezclar durante dos (2) minutos con luz blanca
directa se observo la presencia de flóculos.
d. Prueba de aglutinación en tubo para la determinación del antígeno flagelar H (Fase
2).
A partir de la suspensión inactivada suspendida en BHI se tomaron
500 µl y se
adicionaron 500 µl del antisuero H (Difco), posteriormente se incubó en baño
serológico a 50± 1ª C durante 1 hora, evitando cualquier agitación.
e. Determinación de serotipo de las cepas aisladas
A partir de los resultados obtenidos del grupo y antígenos somáticos “O” (Fase
somática), Fase flagelar 1 y Fase flagelar 2 de cada cepa aislada mediante el
esquema de Kauffman-White (Anexo 9)
se determino la formula antigénica
especifica para cada cepa.
5.4.1.6 PRUEBA DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA.
A partir de las colonias que cumplieran con las pruebas bioquímicas características
para
Salmonella sp. se realizó una resuspensión en solución salina fisiológica,
ajustándose visualmente a una turbidez equivalente a 0,5 en la escala de Mac Farland.
En el anexo 11., se presentan los quince (15) antibióticos empleados en este estudio.
Mediante los parámetros de resistencia y sensibilidad de Salmonella sp frente a cada
antibiótico se determino la eficiencia de cada uno.
En agar mueller-hinton, se dispusieron los antibióticos (en forma de sensidiscos)
mediante el dispensador automático
en ángulos opuestos
de 60° aprox. A
continuación cada placa se incubó a 37° C durante 18 -24 horas, la lectura se hizo
midiendo el halo de inhibición de crecimiento (mm) y revisando la tabla de
comparación entre los resultados obtenidos con los datos de la casa productora
(Anexo 11).
6. RESULTADOS
6.1. CARACTERIZACION BACTERIOLOGICA DE LOS AISLADOS.
6.1.1 Pre-enriquecimiento no selectivo
Las muestras procedentes de la planta de sacrificio fueron sometidas a incubación,
después de cumplido este periodo solamente los tubos que presentaban turbidez
como indicador de crecimiento se sometían al siguiente proceso. El agua peptonada
viraba de amarillo claro a un tono más opaco.
6.1.2 Enriquecimiento selectivo.
Después del tiempo de incubación el viraje de los caldos de enriquecimiento así como
la turbidez que se observó, indicaron la presencia de bacterias y por consiguiente la
posible presencia de Salmonella sp en cada muestra.
El tubo con Caldo de enriquecimiento Rapapport Vassiliadis (RVS) viraba de color
azul oscuro a blanquecino, el Caldo de enriquecimiento Selenito-Cistina (S-C) preincubación presentaba una coloración transparente, post-incubación se observaba
color ladrillo, y finalmente el último Caldo de enriquecimiento utilizado fue
Tetrationato (TTO) viro de transparente a blanco opaco.
6.1.3 Colonias presuntamente sospechosas en medios sólidos selectivos.
Las colonias sospechosas de Salmonella sp, se confirmaron por las características
establecidas por la casa comercial distribuidora de cada medio de cultivo como se
indica en la figura 12.
Figura 12. Salmonella sp en medios de cultivo. a) Agar Xilosa Lisina
Desoxicolato. b) Agar Salmonella-Shigella. c) Agar Xilosa Lisina Tergitol.
En el Agar Xilosa Lisina Tergitol (XLT4) las colonias presentaron tonalidades
negras o rojas con o sin centro negro. El borde o margen de la colonia podría
permanecer amarillo dentro de las 24 horas, posteriormente en ocasiones viró a rojo.
El Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) revelaba colonias trasparentes,
ocasionalmente con centro negro. Las colonias aparentemente del genero Salmonella
en el Agar Salmonella-Shigella fueron
trasparentes con centro negro, el medio
presentó viraje a amarillo (Figura 12).
6.1.4. Pruebas bioquímicas
Las colonias sospechosas presentaban las siguientes características en los medios:
En el medio Citrato de Simmons en ocasiones producían cambio en el color del agar.
Este variaba de azul a verde.
En el medio Sulfuro de Hidrogeno-Indol-Motilidad (SIM) las colonias de Salmonella
viraban el medio a color negro después de la incubación debido a la producción del
sulfuro de hidrógeno
En el agar Lisina-Hierro (LIA) la presencia de Salmonella de determinaba con el
viraje del medio a negro, gracias al
sulfuro de hierro producido por este
microorganismo. También se observó la intensificación del color púrpura en todo el
tubo por la decarboxilación de la lisina
En la urea las colonias no ocasionaron viraje del medio, debido a la ausencia de la
enzima ureasa, encargada de la hidrólisis de la urea.
En el Agar Triple Azúcar-Hierro (TSI), en el fondo del tubo se observó viraje del
indicador debido a la fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se
observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación
de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra
a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfhídrico.
6.2 AISLAMIENTO Y TIPIFICACIÓN DE Salmonella sp.
6.2.1 Cepas de Salmonella sp confirmadas mediante tipificación serológica.
Las cepas solo se identificaron como Salmonella sp solamente al ser confirmadas
mediante la aglutinación con el antisuero Poly A and Vi (Difco), con el fin de
determinar el género Salmonella. De las 156 carcasas examinadas en 60 se obtuvo
aislamientos de Salmonella sp con un porcentaje de positividad de 37.8% de canales
porcinas contaminadas.Cuando se hizo el análisis del número de aislamientos según
es sitio de muestreo se observo un alto porcentaje de aislamientos a partir cabeza 44.7
%, seguido por pierna 23,5%, vientre 17,6% y Lomo 14,1 %, con 38, 20, 15 y 10
cepas aisladas respectivamente (Figura 13).
Figura 13. Porcentaje de aislamientos de Salmonella sp según submuestra considerando
el total de canales porcinas.
6.2.2 Determinación de eficacia de las metodologías para el aislamiento de
Salmonella sp.
La evaluación de los diferentes procedimientos de aislamiento demostró que el mayor
porcentaje de eficiencia se obtuvo mediante la metodología 2, compuesta por Agua
Peptonada Tamponada (Caldo de pre-enriquecimiento no selectivo), Selenito-Cistina
(Caldo de enriquecimiento selectivo) y Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (Medio
selectivo) con 37 de aislamientos (22.6%).
Las metodologías SC-XLT4 y TTO-XLT4 respectivamente, ocuparon el segundo
lugar en efectividad, con un porcentaje de 18.9% y un total de 31 aislados. (Figura
14).
Figura 14. Porcentaje de aislamientos de Salmonella sp según metodología.
6.2.3 Relación metodologías de aislamiento y submuestra.
Los
resultados obtenidos a partir de los
aislamientos
de Salmonella sp.
relacionando la zona de submuestreo y metodología de aislamiento demostraron que
a partir de la metodología 2 compuesta por Agua Peptonada Tamponada (preenriquecimiento
no
selectivo),
Caldo
de
enriquecimiento
Selenito-Cistina
(enriquecimiento selectivo) y Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (medio sólido de
enriquecimiento selectivo), (APT-SC-XLD), fue la mas eficiente para el aislamiento
de Salmonella sp a partir de cabeza (7.9 %), seguido por Pierna (7.3%), lomo (5.5%)
y con el menor porcentaje el vientre (1.81%). Esta metodología fue la más eficaz para
aislar Salmonella sp en esta investigación. (Figura 15).
La metodología 5 compuesta por el Agua Peptonada Tamponada, combinada con
Caldo de enriquecimiento Selenito-Cistina y Agar Xilosa Lisina Tergitol, (APT-SCXLT4) ocupó el segundo lugar en eficiencia para aislar el microorganismo en estudio.
Por el contrario mediante el uso de APT-RVS-SS (metodología 7) no
se aisló
ningún microorganismo del genero Salmonella.
De los 55 aislamientos de Salmonella sp obtenidos a partir de las cabezas de las
canales porcinas, la mayor cantidad de aislamientos (7.9%) se obtuvo por medio de
la metodología de Caldo de enriquecimiento Selenito-Cistina
y Agar Xilosa Lisina
Desoxicolato (SC-XLD). Utilizando el Caldo Rapapport Vassiliadis y Agar Xilosa
Lisina Desoxicolato, (RVS-XLD) se obtuvo un 7.3%. La metodología menos efectiva
fue la compuesta por el Caldo Rapapport Vassiliadis y el Agar para Salmonella y
Shigella.
En vientre, la mayor cantidad de aislamientos se obtuvo a partir de
TTO- XLT4
(3.7%), seguido por la metodología SC- XLT4 (3.0%). A partir de RVS- XLT4 no
se aisló ninguna cepa de Salmonella sp.
En el lomo, a partir de Caldo de enriquecimiento Selenito-Cistina y Agar Xilosa
Lisina Desoxicolato (SC- XLD) se obtuvo mayor porcentaje de aislamiento de
Salmonella (5.5%) en comparación con los demás métodos de asilamiento utilizados.
TTO- XLT4 arrojo un porcentaje del 4.9%, De igual manera el menor porcentaje de
aislamiento (0.6%) se obtuvo con Caldo Rapapport Vassiliadis
y Agar Xilosa
Lisina Tergitol (RVS-XLT4).
Y en pierna el porcentaje de asilamientos mas elevado fue de 7.3% mediante la
metodología compuesta por Caldo de enriquecimiento Selenito-Cistina y Agar
Xilosa Lisina Desoxicolato como medio de enriquecimiento selectivo, (SC-XLD).
Con la metodología TTO- XLT4 se obtuvo un resultado del 6.1%.
Lo anterior muestra que el método de aislamiento más efectivo para Salmonella sp
con un muestreo no destructivo sobre la piel de las carcasa porcinas, es el Agua
Peptonada como caldo de Pre-enriquecimiento, los caldos de enriquecimiento
selectivo Selenito-Cistina y Tetrationato, y los agares Xilosa Lisina Desoxicolato y
Xilosa Lisina Tergitol como medios sólidos de aislamiento diferencial.
Figura 15. Porcentaje de aislamientos de Salmonella sp. según submuestra y
metodología de aislamiento.
Convenciones. Tetrationato seg. Muller-Kauffman (TTO), Caldo de enriquecimiento Selenito-Cistina
(SC), Caldo Rapapport Vassiliadis (RVS), Agar para Salmonella y Shigella (SS), Agar Xilosa Lisina
Desoxicolato (XLD), Agar Xilosa Lisina Tergitol (XLT4).
6.2.4 Serotipos del género Salmonella aislados a partir de canales porcinas en
planta de sacrificio.
A partir de
60 carcasas de 168 se obtuvó 168 aislamientos de Salmonella sp
distribuidas en 16 diferentes serotipos.
En la mayoría de las carcasas se logro obtener solo un serotipo de Salmonella, sin
embargo en seis canales se obtuvo 2 serovares y en una (Nª 68) se identificaron 4
serotipos (Tabla5).
Tabla 5. Aislamientos de serotipos del género Salmonella de acuerdo a cada carcasa.
Nº de
carcasa
SEROTIPO
Nª de
Nº de carcasa
aislamientos
S.. Typhimurium
5
5
S. Derby
4
7
S. Typhimurium
3
S. Derby
2
1
8
S. Typhimurium
2
14
S. Derby
1
16
S. Augustenborg
1
19
S. Travis
1
20
S. Typhimurium
24
41
74
75
76
SEROTIPO
S. Typhimurium
Nª de
aislamientos
10
S. Typhimurium
1
S. enterica subs. salamae
1
S. Typhimurium
3
S. Derby
1
S. Typhimurium
2
78
S. Typhimurium
1
79
S. Typhimurium
1
1
82
S. Typhimurium
6
Salmonella GRUPO E1
2
95
S. Typhimurium
1
S. Typhimurium
2
96
S. Typhimurium
4
46
S. Typhimurium
1
105
S. Paratyphi B
2
47
S. Derby
6
106
S. Vellore
1
48
S. Typhimurium
1
107
S. Sandiego
1
50
S. Derby
4
112
S. Typhimurium
1
51
S. Derby
1
115
S. Typhimurium
1
56
S. Typhimurium
3
117
S. Lagos
1
57
S. Typhimurium
1
118
S. Gloucester
1
59
S. Typhimurium
1
119
S. Gloucester
1
60
S. Tennyson
2
121
S. Gloucester
2
66
S. Typhimurium
3
123
S. enterica subs. salamae
2
77
Nª de
aislamientos
Nº de carcasa
SEROTIPO
Nª de
aislamientos
S. Derby
1
124
S. Gloucester
2
S. Typhimurium
7
125
S. Gloucester
1
S. Altendorf,
1
122
S. Chester
1
S. enterica subs. Salamae
2
127
S. enterica subs. salamae
1
Nº de
carcasa
SEROTIPO
67
S. Farsta,
1
134
S. Typhimurium
4
68
S. Typhimurium
2
135
S. Typhimurium
1
69
S. Typhimurium
9
138
S. Typhimurium
2
S. Typhimurium
1
139
S. Derby
3
70
Salmonella Chester
1
146
S. Agona
2
71
S. Typhimurium
3
147
S. Agona
4
S. Chester
2
148
S. Agona
7
72
S. Typhimurium
3
149
S. Agona
7
73
S. Typhimurium
5
150
S. Agona
2
152
S. Agona
1
TOTAL DE AISLAMIENTOS
168
La distribución porcentual de las cepas aisladas fue la siguiente: Salmonella
enteritidis subespecie enterica ser. Typhimurium 47% (32 aislados), Salmonella
enteritidis subespecie enterica ser. Derby 14 % (9 aislados), Salmonella enteritidis
subespecie enterica ser. Agona 10 % (6 aislados), Salmonella enteritidis subespecie
enterica ser. Gloucester 7 % (5 aislados), Salmonella enteritidis subespecie enterica
ser.
Chester 4 % (3 aislados), Salmonella enteritidis subespecie enterica ser.
Altendorf 1 %, Salmonella enteritidis subespecie enterica ser. Farsta 1 % (1 aislado),
Salmonella enteritidis subespecie enterica ser. Lagos 1 % (1 aislado), Salmonella
enteritidis subespecie enterica ser. Paratyphi 1 % (1 aislado), Salmonella enteritidis
subespecie enterica ser. Sandiego 1 % (1 aislado), Salmonella enteritidis subespecie
enterica ser. Tennyson 1 % (1 aislado), Salmonella enteritidis subespecie enterica
ser. Travis 1 % (1 aislado), Salmonella enteritidis subespecie enterica ser. Vellore 1
% (1 aislado) y Salmonella enteritidis subespecie salamae 6% (4 aislados).
A partir de una carcasa se aisló Salmonella del GRUPO E1 (1 %) (1 aislado)y no se
pudo identificar con los antisueros disponibles en el laboratorio (Figura 15).
Lo anterior indica que el serotipo predominante en plantas de sacrificio de Colombia
es S. Typhimurium seguido por S. Derby.
α
*
Figura 16. Porcentaje de serotipos de Salmonella aislados en canales porcinas.
* A excepción de esta cepa, los demás serotipos pertenecen a Salmonella enterica
subespecie enterica.
α Este aislamiento se realizo a partir de una sola carcasa, esta cepa no se pudo
tipificar con los sueros disponibles durante el estudio.
6.4 ANTIBIOGRAMA
6.3.1 Sensibilidad de Salmonella sp frente a antibióticos.
Mediante la técnica de Kirby-Bauer se observó la sensibilidad de las cepas aisladas
al hacer una evaluación de los promedios de sensibilidad de los 16 serotipos
encontrados en canales porcinas frente a 14 antibióticos.
Mediante el estudio de sensibilidad antimicrobiana de los 16 serotipos evaluados se
determinó que el antibiótico mas eficaz contra las cepas de Salmonella sp aisladas en
planta de sacrificio fue amoxicilina (81 %); por el contrario la tetraciclina (0% de
sensibilidad) no ocasiono ningún efecto sobre las cepas de Salmonella sp evaluadas
(Tabla 6).
El porcentaje de sensibilidad de Salmonella frente a fosfomicina, enrofloxacina y
norfloxacina fue del 75%; mientras que con Gentamiciana, Ciprofloxacina
y
Kanamicina se obtuvo un 69% de sensibilidad; Ceftazidime 63%, Amikacina 56%;
Florfenicol
50
%;
Trimetoprim-Sulfametoxazol
38%,
Ampicilina
38%;
Oxitetraciclina 31% y neomicina 25%.
De igual manera a cada serotipo se le realizó un antibiograma, con el fin de
determinar la sensibilidad de cada cepa a los quince antibióticos evaluados (Figura
16). En la tabla 6 se resume la sensibilidad de cada uno de los serotipos identificados
en el estudio.
Salmonella enteritidis subespecie Typhimurium fué muy resistente a la acción de los
antibióticos que se emplearon especialmente a la tetraciclina, y a la Oxitetraciclina,
ante el único antibiótico que se observo sensibilidad fue Fosfomicina.
Salmonella Derby fue sensible
a Ampicilina, Amoxicilina, Gentamicina,
Enrofloxacina y Fosfomicina.
Salmonella enteritidis subespecie Agona fué sensible a Amikacina, Ciprofloxacina,
Enrofloxacina y Norfloxacina, por el contrario este microorganismo
es muy
resistente a Oxitetraciclina. Salmonella Vellore es sensible a antibióticos Amikacina,
Amoxicilina, Ampicilina, Ceftazidime, Gentamicina, Ciprofloxacina, Florfenicol
Fosfomicina, Kanamicina, Oxitetraciclina, Norfloxacina
Salmonella Sandiego
a antibióticos fué sensible a Amikacina, Amoxicilina,
Gentamicina, Ciprofloxacina, Enrofloxacina, Florfenicol, Fosfomicina, Kanamicina,
Neomicina, Norfloxacina. Salmonella Lagos es sensible a Amikacina, Amoxicilina,
Ceftazidime, Ciprofloxacina, Enrofloxacina, Florfenicol, Fosfomicina, Gentamicina,
Kanamicina, Norfloxacina.
Salmonella Gloucester fué
sensible a amikacina, amoxicilina,
ceftazidime,
ciprofloxacina, enrofloxacina, fosfomicina, kanamicina y norfloxacina. Salmonella
Altendorf
es sensible a amikacina, ampicilina, amoxicilina,
ceftazidime,
ciprofloxacina, enrofloxacina, florfenicol, fosfomicina, kanamicina, norfloxacina y
trimetropin-sulfametoxazol.
Salmonella enterica subs. Salamae fué sensible a amikacina, amoxicilina,
ciprofloxacina, enrofloxacina, florfenicol, fosfomicina, gentamicina, kanamicina,
neomicina
y norfloxacina. Salmonella Tennyson fué sensible a amoxicilina,
ampicilina
ceftazidime, enrofloxacina, florfenicol, gentamicina, kanamicina,
neomicina, norfloxacina, oxitetraciclina y trimetropin -sulfametoxazol.
Salmonella Farsta fué sensible a amikacina, amoxicilina, ampicilina
Ceftazidime,
ciprofloxacina, enrofloxacina, fosfomicina, gentamicina, kanamicina, norfloxacina y
trimetropin-sulfametoxazol. Salmonella GRUPO E1 fué sensible a Amoxicilina,
Ampicilina
Ceftazidime, Ciprofloxacina, Enrofloxacina, Florfenicol, Fosfomicina,
Gentamicina, Norfloxacina, Oxitetraciclina, Trimetropin Sulfametoxazol.
Salmonella Chester fué sensible a amikacina, amoxicilina, ceftazidime, florfenicol,
gentamicina y kanamicina. Salmonella Travis fué sensible a amoxicilina, ceftazidime,
ciprofloxacina, enrofloxacina, fosfomicina, gentamicina, kanamicina,
neomicina,
norfloxacina, oxitetraciclina, trimetropin-sulfametoxazol. En contraste Salmonella
Parathyphi
B, no fué sensible a ningún antibiótico. Y finalmente Salmonella
Augustenborg fué sensible a amoxicilina, ceftazidime, ciprofloxacina, enrofloxacina,
fosfomicina, gentamicina, kanamicina, norfloxacina, oxitetraciclina y trimetropinsulfametoxazol.
Tabla 6 .Sensibilidad de los serotipos de Salmonella sp aislados en canales porcinas en
planta de sacrificio.
a)
c)
b)
d)
Figura 17. Antibiograma de los serotipos aislados en canales porcinas en planta de
sacrificio a) Salmonella Typhimurium b) Salmonella Derby c) Salmonella Agona d)
Salmonella Paratyphi B.
7. DISCUSION
Para el aislamiento de Salmonella en el presente estudio, el mejor rendimiento de las
metodologías usadas se obtuvo a partir de Caldo de enriquecimiento Selenito-Cistina
y Agar Xilosa Lisina Desoxicolato, en contraste con los resultados reportados por
Bager en 1991; Mollet y col en 2001, quienes obtuvieron mejores resultados con el
Caldo Rapapport Vassiliadis a partir de muestras de materia fecal. Esta diferencia
podría asociarse al tipo de muestra, este concepto es compartido por Hurd y col
(2001), quienes aducen que la sensibilidad de un cultivo bacteriológico puede variar
entre un 10 y 80% dependiendo del muestreo y protocolo de procesamiento.
Waltaman (2000), menciona que las principales desventajas del selenito son su
toxicidad y capacidad inhibitoria de Salmonella Cholerasuis. Según Hoorfar y col
(2000), Salmonella Derby no puede detectarse en protocolos que utilicen RVS como
caldo de preenriquecimiento.
Dusch y col en 1995, determinaron una especificidad cercana al 100% y mayor
sensibilidad en Agar Xilosa Lisina Tergitol (usado también en este estudio) frente a
otros medios selectivos sólidos para el aislamiento de Salmonella. Michael et al, en
1999 mencionan que la eficiencia del medio depende del caldo de enriquecimiento.
Mediante los resultados se puede deducir que el uso de los caldos Selenito-Cistina y
Tetrationato junto con los medios Agar Xilosa Lisina Desoxicolato y Agar Xilosa
Lisina Tergitol ofrecen una alta eficacia en el aislamiento de Salmonella, La
combinación de estos medios de aislamiento y el hisopado de arrastre no destructivo
sobre las carcasas provee la información adecuada sobre es estado de Salmonella en
planta de sacrificio.
Con relación al número de aislamientos de Salmonella sp según el sitio de muestreo,
el análisis bacteriológico mostró un alto porcentaje de aislamientos a partir de las
muestras de cabeza (44.71 %), seguido por pierna (23,53%), vientre (17,65%) y
lomo (14,12 %). El mayor aislamiento de Salmonella a partir de cabeza se atribuye a
la disposición vertical de la canal, con la cabeza hacia el suelo, permitiendo que por
gravedad todos los fluidos (agua, sangre) se depositen allí creando un microhábitat
para microorganismos oportunistas además de Salmonella, en ocasiones la cabeza
de los cerdos queda en contacto con el suelo exponiéndose a la contaminación por
arrastre con residuos y desechos del suelo. El menor porcentaje de Salmonella se
encontró en el lomo y vientre,
debido a que durante el proceso de sacrificio y
faenado son las zonas más expuestas a procesos de lavado, flameado y raspado.
Para obviar estos inconvenientes los Daneses establecieron desde 1995 algunos
mecanismos de control, monitoreo, y vigilancia para evitar la contaminación de
carcasas, con estas medidas lograron disminuir notoriamente
la prevalencia de
Salmonella en las carnes de origen porcino
El proceso de sacrificio y las condiciones en las cuales se realice determinan el nivel
de contaminación de las carcasas (Alban y col, 2003). Un ejemplo de ello fueron los
hallazgos de Fablet y col, quienes al evaluar factores de riesgo en Francia,
determinaron que la higiene en matadero es un factor muy importante para reducir la
contaminación por Salmonella y que el material de las paredes es importante para
lograr un buen proceso de desinfección. Según sus resultados determinaron que se
debe evitar el concreto ya que este material es difícil de limpiar por la porosidad que
presenta facilitándose el depósito de materia orgánica y contribuyendo de esta
manera a la supervivencia de microorganismos como Salmonella y facilitando la
infección de las canales cuando entran en contacto con paredes y pisos (Dahl y col,
1997; Thomas, 1982).
Es importante considerar la contaminación cruzada entre carcasas contaminadas y
limpias facilitada por el sacrificio al azar de lotes provenientes de granjas con alta y
baja prevalencia Salmonella.La ausencia de un programa de monitoreo y control para
salmonelosis a nivel de granja, durante la faena de sacrificio facilita la contaminación
cruzada entre lotes de animales infectados y no infectados.
El riesgo de contaminación por mala manipulación es alto, ya que es común en los
mataderos de nuestro medio que en el área de oreo las canales queden suspendidas,
las cadenas de transmisión no son mecánicas, los operarios con sus manos empujan
los animales para que se desplacen a lo largo de los rieles, la falta de desinfección de
guantes de protección facilitan la transmisión de agentes infecciosos entre carcasas.
Este problema se agrava en el proceso de extracción de vísceras e intestinos pues no
hay desinfección de herramientas y elementos de protección como cuchillos, guantes,
etc. Otros factores de riesgo asociados con la prevalencia de Salmonella son: higiene
del personal del matadero, estado de los pisos, flujo de animales, contaminación de
instalaciones, insectos, roedores, aves silvestres, temperatura, densidad de animales y
el estado de salud de los mismos (Funk y col, 2004).
Es importante que la inspección que es realizada por el personal de salud pública
deba cambiar y exigirles que limpien constantemente los implementos de trabajo para
no convertirse en fuentes diseminadoras de Salmonella entre porcinos.
La probabilidad de contaminación de los animales durante el transporte, cuarentena
sacrificio se incrementa debido a eliminación de la bacteria por la vía fecal la cual
aumenta en estados de estrés del cerdo. Esto se agrava ante la deficiencia en las
prácticas de lavado, desinfección, desinfección y descanso de camiones y corrales. En
Colombia es común la permanencia de cerdos durante varios días en los corrales de
cuarentena antes del sacrificio aumentando las condiciones de estrés y facilitando la
contaminación oro-fecal por enterobacterias.
De las 156 muestras de carcasas analizadas en el presente estudio, en 60 se aisló
Salmonella sp, obteniéndose un porcentaje de 37.8 % de carcasas positivas. Este alto
porcentaje constituye un riesgo de infección en los procesos alimenticios derivados
de la carne porcina; este criterio es compartido por otros autores (Rossi y col, 2001;
Berendens, 1999; Mora, 2003), quienes reportaron altos porcentajes de aislamientos
de Salmonella en productos cárnicos de origen porcino.
La infección con Salmonella puede explicarse como un proceso aleatorio donde los
animales no infectados tienen la probabilidad de infectarse
cada vez que son
expuestos a la bacteria. Por esta razón, en la conferencia llamada “ Conferencia de
enfermedades porcinas para los médicos de los cerdos”,
llevada
a cabo en la
Universidad de Veterinaria en Iowa en el 2001, se determinó que la seguridad
alimentaria es más importante que la productividad y beneficio de la industria
porcicola, por ello
se deben desarrollar programas de control de Salmonella,
incluyendo estrategias de monitoreo, prevención y tratamiento.
Mediante la técnica de Kirby-Bauer se determinó la sensibilidad de las cepas
aisladas, se observó que el antibiótico mas eficaz contra las cepas de Salmonella sp
fue Amoxicilina (81.25%); por el contrario Tetraciclina (0% de sensibilidad) no
ocasionó ningún efecto sobre el microorganismo en estudio.
La Salmonella frente a fosfomicina, enrofloxacina
y norfloxacina presentó un
porcentaje de sensibilidad del 75%; Gentamiciana, ciprofloxacina y kanamicina un
69%; Ceftazidime 63%; Amikacina 56%; Florfenicol 50 %;
Trimetoprim-
Sulfametoxazol 38%; Ampicilina 37,5%; Oxitetraciclina 31% y neomicina 25%.
En las investigaciones recopiladas por Schwartz en 1998, se recomiendan
antibióticos como amikacina, gentamicina, neomicina, apramicina, ceftiofur y
trimetropin sulfonamida pero de acuerdo a este estudio estos antibióticos no son
muy eficientes para las cepas aisladas en carcasas.
Perez (2005), en un estudio realizado a nivel de granja identificó que las cepas
aisladas de campo son fueron susceptibles a fosfomicina y norfloxacina de igual
manera a lo encontrado en el presente estudio donde la mayoría de cepas fueron
susceptibles a estos antibióticos, igualmente ambos trabajos determinan la alta
resistencia de Salmonella sp a la tetraciclina.
Los resultados de Colombia difieren mucho de los obtenidos en la Republica de
Cuba, las cepas allí aisladas no presentan porcentajes elevados de resistencia a
antibióticos, de hecho, han encontrado porcentajes de sensibilidad altos, por ejemplo
100% de efectividad de la gentamicina, 93% de sensibilidad a kanamicina y 90% a
cloranfenicol. En contraste los resultados obtenidos en este estudio fueron de 69%
de sensibilidad a la gentamicina y a la kanamicina.
Esto podría asociarse al uso indiscriminado de antibióticos sin considerar el
microorganismo y su sensibilidad antimicrobiana. La medicación de animales para
eliminar a Salmonella
sólo es efectiva en aquellos con sintomatología clínica.
Además su utilización en portadores subclínicos no es aconsejable ya que no reduce
la prevalencia, ni la magnitud ni el periodo de excreción del patógeno (Dahl et al.,
1997) e incluso puede contribuir notablemente a la aparición de multiresistencias
(Mateu, 2001) como lo ocurrido en este ensayo. Por tanto los objetivos en el control
de la salmonelosis van orientados a disminuir la dosis de exposición de los animales
a la bacteria y a maximizar la resistencia de los cerdos.
Al comparar el porcentaje de aislamiento de Salmonella en el presente estudio con el
estudio serológico realizado por Mora en el 2003 en el cual encontró una
seroprevalencia del 27.2% a partir de jugos cárnicos de porcinos sacrificados en dos
plantas de beneficio de Bogotá D.C., se puede deducir que existe correlación entre
los hallazgos serológicos y bacteriológicos a nivel de matadero.
Estudios realizados en Brazil por Schwarz y col (1998), llegaron a la conclusión de
que la prevalencia de aislamientos de Salmonella en heces en cerdos de sacrificio y
la seroprevalencia en matadero son los
diseminación de Salmonella.
indicadores críticos para evaluar
El proceso de sacrificio
la
tiene un alto riesgo de
contaminación de las carcasas de cerdo con bacterias zoonoticas como Salmonella
(Bessa, 2004) por tanto la identificación de las granjas infectadas permite reducir el
nivel de Salmonella y consecuentemente el número de porcinos positivos en el
momento del sacrificio (Kranker y col, 2003).
Los hallazgos del presente investigación ilustran el grave problema sanitario que
existe en Colombia, comparado con otros países desarrollados como Dinamarca, en
donde la prevalencia de Salmonella era del 5-7% y después de la modificación
Programa de Control Nacional bajó al 0.5% (Harris y col, 2003; Stege y col, 1998).
Los resultados de prevalencia de Salmonella sp en granjas es muy alto en Colombia
(57.8%) comparado con países desarrollados como USA (28 %), España (39%),
Alemania (3.5%), (Damman y col, 1998; Ganter y col, 1998; Creus y col, 2004).
La alta prevalencia del patógeno en Colombia podría atribuirse a las condiciones de
estrés de los animales,
a sistemas de producción, suministro de alimento
contaminado, insectos y roedores diseminadores. Sin embargo se debe aclarar que la
estimación de la prevalencia es afectada por la estrategia de muestreo, las condiciones
de producción y la efectividad de la prueba diagnóstica utilizada (Funk, 2003). Según,
Proescholdt y col (1999), la contaminación por Salmonella en cerdos de matadero
ocurre con alta frecuencia, según un estudio realizado en granjas desde el destete
hasta el sacrificio de los animales. Otros autores compartieron esta afirmación
(Kampelmacher y col, 2003; Williams & Newell 1968; Morgan y col,. 1987;
Berendens y col, 1997).
En un estudio en Colombia realizado por Escobar en el 2004, en animales con
sintomatología clinica, se analizaron muestras de materia fecal y tejidos y se obtuvo
una prevalencia del 30.3% y el estudio serológico realizado por la misma autora
arrojó una prevalencia del 57.8%. A partir de analisis bacteriológico realizado se
aislaron Los serotipos S. Typhimurium y S. Dublin Estos resultados concuerdan con
la alta prevalencia obtenida en esta investigación, esto evidencia la importancia de
mejorar las condiciones sanitarias a nivel de matadero y granja por los riesgos que
implica en salud publica.
Igualmente Perez y col en el 2005 en otro estudio realizado a nivel de granja con
antecedentes de salmonelosis en Colombia, aislaron Salmonella en un 7.8% a partir
de muestras fecales, los serotipos aislados fueron S. Ugada (76.4%) y S. Aderike
(11.8%) principalmente, serotipos que en el presente estudio no se encontraron. al
parecer la diversidad de serotipos en granjas no es tan alta como los encontrados en
planta de sacrifico.
En Italia durante el periodo de Diciembre del 2004 hasta Septiembre del 2005, se
realizó un muestreo a nivel de granja (heces, nódulos linfáticos), planta de sacrificio
(carcasas) y en camiones. Los resultados
determinaron que los serotipos (S.
Bovismorbificans, S. Hadar y S. Bredeney) aislados en camiones y en carcasas eran
los mismos, pero diferentes a los detectados a nivel de granja. Por el contrario S.
Derby se aisló de carcasas y granjas y S. Infantis solo se recuperó de carcasas. Los
cerdos pueden infectarse por cualquier serotipo siendo S. Cholerasuis y S. Typhisuis
los más adaptados, y S. Typhimurium y S. Derby los más frecuentes, los dos primeros
serotipos no fueros aislados en este estudio.
Las cepas aisladas en este trabajo
Typhimurium (47%),
pertenecían en su mayoría a los serotipos
Derby (14 %) y Agona (10 %). Se aislaron con poca
frecuencia serotipos como Gloucester, Chester, Altendorf, Farsta, Lagos, Paratyphi,
Sandiego, Tennyson, Travis y Vellore.
Algunos serotipos de Salmonella enteritidis subespecie enterica son reconocidos
como importantes contaminantes de alimentos incluyendo derivados del cerdo, en
este estudio se aislaron 16 diferentes serotipos de este grupo
y solo uno
perteneciente a la subespecie salamae. Estos hallazgos concuerdan con los datos
obtenidos en Brazil donde S. enterica es muy importante (Rostagno y col, 2006).
Ariza y col en 1982 citan a Araujo y col quienes reportaron la frecuencia de serotipos
de Salmonella aislados de cerdos en América latina, siendo estos S. Typhimurium
(13, 74%), S, Derby (11.34%), S. Sandiego (4.46%), S. Paratyphi (3.43%). Los
anteriores serotipos también se encontraron en este estudio, de los demás serotipos
aislados en plantas de sacrificio de Colombia no se encontró reportes en otro país.
En Estados Unidos y Colombia la diversidad de serotipos es muy amplia en contraste
con los hallazgos en Dinamarca. En este último país, se aisló con mayor frecuencia a
partir de carcasas S. Typhimurium y S. Derby (Sorenser, 2004) , lo cual concuerda
con los resultados obtenidos en este estudio. Este hecho podría explicarse por la
habilidad de la S. Typhimurium de invadir rápidamente la mucosa intestinal
alcanzando lo nódulos linfáticos en un corto periodo de tiempo, convirtiéndose en una
bacteria de fácil diseminación. Igualmente Rostagno y col (2006), afirman que estos
serotipos son frecuentemente aislados en la mayoría de estudios desarrollados en
plantas de sacrificio.
El Instituto Nacional de Salud de Colombia en sus reportes epidemiológicos publica
que el porcentaje de distribución de los aislamientos de Salmonella sp por serotipo
desde 1997 hasta el 2006, a partir de muestras humanas, es de 34.1% para
S.Typhimurium, 29.4% para S. Enteritidis, 7,0 % para S. Typhi y 29.5% para otros
serotipos. En el presente estudio a partir de carcasas porcinas se aisló S. Typhimurium
en un 47% y S. Paratyphi B en un 1%, serotipos patógenos para humanos.
Además, se ha observado que el serotipo Typhimurium es el más prevalente y más
aislado en humanos (Hals & Wegener, 1999; Darwich y col, 1999). En la mayoría de
países, S. enteritidis es el primer responsable de la infección
en humanos en los
últimos años detectadondose un aumento en la frecuencia y gravedad de los casos
producidos por S. Typhimurium (Hald y Wegener, 1999; Darwich et al., 1999).
En función de sus características antigénicas, más de 200 serotipos se han aislado en
personas infectadas. Actualmente, S. Typhimurium, S. enteritidis, S. Infantis, S.
Cholerasuis y S. Heidelberg son algunos de los serotipos más frecuentemente aislados
en personas y animales Sin embargo, aunque el género Salmonella sea
geográficamente difundido, los serotipos predominantes pueden variar notablemente
a lo largo del tiempo y en distintas zonas. Actualmente en Europa, S. Typhimurium es
el serotipo aislado con mayor frecuencia en granjas de porcino con sintomatología
clínica de salmonelosis. En cambio, S. choleraesuis es el serotipo prevalente en los
casos diagnosticados en Estados Unidos.
En Francia entre 2003 y 2004 Fablet y col, aislaron varios serotipos de Salmonella en
granjas en la sección de parto y finalización, siendo más frecuentes S. Derby y S.
Typhimurium y en menor proporción S.Anatum, S. Infantis y S.Lamberrhurst.
El hallazgo de serotipos como Typhimurium, causante de la forma enterocolítica de la
salmonelosis en humanos y porcinos, y Paratyphi B patógeno para los animales y
humanos, deben alertar a las autoridades sanitarias sobre la importancia del control
de Salmonella en plantas de sacrificio y en granjas mediante el mejoramiento de los
programas de control, establecer estrategias y protocolos de monitoreo y normas
sanitarias estrictas tanto para los trabajadores de mataderos como los de las granjas.
Existe gran diversidad de serotipos con relevancia epidemiológica en función de la
especie infectada, ubicación geográfica y
tipo de muestreo (granja, planta de
sacrificio, ambiental, etc.), por ejemplo en Midwest USA, Bahnson y col (2006),
reportan al serotipo Derby (23.2%) como el más frecuente en matadero seguido por
12.1% de prevalencia de S. Typhimurium,
S. Brandesburg (10.5%), S. Uganda
(5.7%), S. Anatum (4.8%), S. London, S. Mbandaka, S. Worthington.
Los serotipos S. Tennesse, S. Mbandaka, S. Cubana, S. Livingstone, S. Anatum son
algunos de los aislados frecuentemente en materias primas o concentrados. De igual
manera, prácticamente nunca se aísla S. Typhimurium en la monitorización de
materias primas y pienso llevada a cabo dentro del programa danés de control de
Salmonella (Mousing et al., 2001). Por tanto, la prevalencia de Salmonella
Typhimurium en granja probablemente no está tan relacionada con la presencia de
Salmonella en pienso.
Un estudio realizado a nivel de granjas porcinas intensivas por Perez y col (2005) en
Colombia, indicó la ausencia de Salmonella en muestras de alimentos de cerdos, lo
cual llevo a descartar esta como una fuente de contaminación de este
microorganismo, que por el contrario si se aisló de materia fecal en los cerdos.
Determinar las causas exactas de la presencia de Salmonella en plantas de beneficio
es una tarea ardua y requiere de un estudio de monitoreo y vigilancia mediante
estrategias como: seguimiento
de animales desde granja (seroprevalencia de
Salmonella) hasta el proceso de sacrificio (prevalencia de Salmonella), toma de
muestras en camiones, corrales, agua, muestras ambientales en granja y matadero,
determinación de seroprevalencias en jugos cárnicos de los mismos cerdos de las
granjas entre otros.
Para disminuir los riesgos, Alsop (2005) mediante la observación de un brote de
salmonelosis en Ontario, Canadá,
propone que los animales que han presentado
episodios clínicos de la enfermedad no sean enviados a sacrificio hasta que sean
analizados clínicamente y se identifique el foco de contaminación en la granja. Sin
embargo Kampelmacher y col
(1963),
aducen que los cerdos portadores de
Salmonella no excretan un número elevado de este microorganismo ya que el sistema
inmune inhibe su proliferación pero se corre el riesgo de que algunos factores de
estrés como ayuno, cargas, transporte, parto, infecciones concurrentes, tratamiento
con corticoides y aumento de la densidad poblacional en corrales, pueden inducir
supresión del sistema inmune con una proliferación de Salmonella y por consiguiente
el aumento en la excreción fecal.
La seroprevalencia en cerdos de ceba es importante por razones de salud pública,
debido a que en plantas de sacrificio, estos animales tienen un mayor flujo comercial
en comparación con cerdas de cría que permanecen durante largos períodos de tiempo
dentro de las granjas. (Perez, 2005).
Dahl et al. (1997), demostraron que el traslado de animales de 10 semanas de edad
procedentes de granjas afectadas por S. Typhimurium a instalaciones limpias, con
aplicación de prácticas de manejo adecuadas, era una medida efectiva en la
prevención de la infección en el momento del sacrificio.
Las cerdas reproductoras constituyen una parte importante de la carne porcina que se
comercializa siendo importante aplicar el programa de control de Salmonella en el
parque de reproductoras tanto por su efecto indirecto sobre la prevalencia en cerdos
de engorde como por su efecto directo al tratarse de animales que potencialmente se
destinan a consumo humano (Kranker y Dahl, 2000; Dahl et al., 2000).
Durante un congreso realizado por
Daneses y Estadounidenses llegaron a la
conclusión que la dinámica de infección varía entre regiones o países según los
factores de riesgo, según los valores de prevalencia y observaciones obtenidas en sus
países de origen,
de cada país es diferente y los factores de riesgo varían. En
Dinamarca, se estableció que uno de los principales puntos críticos se encuentra en la
contaminación a nivel de granja, por el contrario, en Estados Unidos se determinó que
la manipulación de canales por parte de los trabajadores, la presencia de roedores y el
mal manejo de instrumentos, son los principales factores de riesgo (Stärk y col,
2002).
Los resultados obtenidos en este estudio demuestran la problemática actual de
Salmonella porcina en Colombia pero teniendo en cuenta que el muestreo se realizó
al final del sacrificio no fue posible determinar la fuente de contaminación, ni los
factores de riesgo asociados a la alta prevalencia, pero se asume que puede ocurrir en
cualquier etapa de la cadena (granja, transporte, corrales de cuarentena en matadero,
faena, disposición vertical de los cerdos en salón de oreo)
Se deben utilizar antibióticos eficaces que no generen resistencias en los
microorganismos, lo cual es un factor esencial para evitar la diseminación del agente
cuando los cerdos sean sometidos a estrés antes del proceso de sacrificio.
Este estudio es un llamado de atención sobre la necesidad de trabajar en programas de
control para la salmonelosis en porcinos que involucre toda la cadena productiva, así
como la vigilancia activa en cada granja sobre el estado de salmonelosis así como la
susceptibilidad de las cepas a antibióticos.
8. CONCLUSIONES
1. El análisis microbiológico realizado en una planta de sacrificio de la ciudad
de Bogotá D.C, Colombia a 156 carcasas porcinas arrojo un porcentaje del
37.82% de aislamientos de Salmonella sp en canales porcinas.
2. Se identificaron 16 serotipos de Salmonella en carcasas porcinas. Los serotipos
aislados más representativos fueron Salmonella Typhimurium en un 47%,
Salmonella Derby en un 14% y Salmonella Agona en un 10%. El mayor
porcentaje de aislamientos se obtuvo de la piel de la cabeza, seguida de lomo,
pierna y vientre. Se determinó que la mejor área para el muestreo en planta
de sacrificio sobre la piel de carcasas es la cabeza.
3. El mayor porcentaje de aislamientos se obtuvo de la piel de la cabeza, seguido
de lomo, pierna y vientre. Se determinó que la mejor área para el muestreo
en planta de sacrificio sobre la piel de carcasas es la cabeza.
4. Se demostró que el método de aislamiento mas efectivo para Salmonella sp
con un muestreo no destructivo sobre la piel de las carcasa porcinas, es el
Agua Peptonada como caldo de Pre-enriquecimiento, los caldos de
enriquecimiento selectivo Selenito-Cistina y Tetrationato, y los agares Xilosa
Lisina Desoxicolato y
aislamiento diferencial.
Xilosa Lisina Tergitol como medios sólidos
de
5. La evaluación de la sensibilidad de los aislados de Salmonella sp obtenidos
frente a 15 antibióticos, demostraron una alta variabilidad entre cepas y
serotipos.
6. Los resultados obtenidos indican la importancia de evaluar
las carcasas
porcinas para determinar la presencia de Salmonella sp a nivel de plantas de
sacrificio como una medida de seguridad alimentaria.
9. RECOMENDACIONES
1. Aplicar a nivel de plantas de sacrifico métodos bacteriológicos para determinar
la calidad microbiológica de las carcasas porcinas frente a la Salmonella sp y
otras microorganismos contaminantes.
2. Es necesario desarrollar en planta de sacrificio, estudios que determinen los
puntos críticos
en donde se puede producir
la contaminación
por
Salmonella sp con el fin de disminuir factores de riesgo.
3. Establecer a nivel nacional, un programa de control para Salmonelosis que
integre toda la cadena cárnica porcina. Por lo tanto se deben emprender
acciones prácticas que minimicen el riesgo desde la producción primaria,
proveedores de concentrados, transportadores, plantas de de sacrificio,
distribuidores, comercializadores y consumidores.
4. Realizar programas de capacitación en todos los niveles del sector porcino
sobre estrategias dirigidas al control de la salmonelosis porcina para
garantizar la seguridad alimentaría del producto.
10. LITERATURA CITADA
Alban, L., Stege, H., Dahl, J. 2002. The new classification system for slaughter-pig
herds in the Danish Salmonella surveillance-and-control program. Preventive
Veterinary Medicine. Pp. 133-146.
Alpuche-Aranda, C. M., E. L. Racoosin, J. A. Swanson, and S. I. Miller. 1994.
Salmonella stimulate macrophage macropinocytosis and persist within spacious
phagosomes. J. Exp. Med. 179:601-608.
Alsop, E. 2005. An outbreak of salmonellosis in a swine finishing barn. Journal of
Swine Heath and production. Volume 13, Number 5.
Ariza F, Ariza L. Prevalencia de Sallmonella sp en cerdos aparentemente normales
traidos a dos matadero de Bogota D.C.. Trabajo de grado. Universidad Nacional de
Colombia. 1982.
Baggesen, D., Christensen, J. 1997. Distribution of serotypes and phage typesof
Salmonella in a cross-sectional study and routine submission to a diagnostic
laboratory. Salmonella ans Salmonellosis. Ploufragan, pp.415-417.
Bahnson P, Damman D, Isaacson R, Millar G, Weigel R, Troutt F. Prevalence of
serovars of Salmonella enterica isolated from ileolic lymph nodes of market pigs
reared in selected Midwest US swine herds.2006. Journal of swine Health and
Production. July and August. pg 182.
Benhe K, Procesamiento de productos balanceados de origen animal. Departamento
de ciencias e industrias de los granos. Universidad Estatal de Kansas, Kansas; USA.
2000.
Biberstein, Ernst y Zee L 1994 . Tratado de microbiología veterinaria. Editorial
Acribia. Zaragoza España.119-124.
Blanco, Luz P. et al; Salmonella typhi Ty2 OmpC porin induces bacterial activity on
U937 monocytes. 1997, Microbiology and Inmunology 41 (12): 999-1003
Bravo A. Procedimiento para el muestreo microbiológico en carnes faenadas en
mataderos de exportación. Santiago, Chile. 2003
Brenner, F. W * R. G. Villar,† F. J. Angulo, R. Tauxe, And B. Swaminathan.
Salmonella Nomenclatura Ournal Of Clinical Microbiology,July 2000, P. 2465–2467
Vol. 38, No. 7
Berends, BR., Urlings HAP., Snijders JMA., Van Knapen F. 1997. Identification and
quantification of risk factors in animal management and transport regarding
Salmonella spp. in pigs. International Journal of Food Microbiology. pp. 37-73
Berends, B.R. 1998 A risk assessment approach to the modernization of maet safety
assurance.Tesis Doctoral, Universidad de Utrecht, Holanda.
Berends, B.R., Van Knapen, F., Mossel, C.Da., Burta, S.A. Y Snijders, J.M.A. 1998.
Int. J. Food Microbiol. 44: 219-229.
Brock T, Madigan M. Microbiología. Sexta edición. Prentice Hall Hispanoamericana
S.A. Naucalpan De Juarez. Mexico; 1991; p 287-290,
Caffer, M.; Terragno, R. 2001. Manual de Procedimientos para la Caracterización de
Salmonella. Instituto Nacional De Enfermedades Infecciosas. Buenos Aires,
Argentina
Charles, s., trigo, e., settje, t., abraham, a. Y jonson, p. 1997. En: Proc. of the 3rd
international symposium on the epidemiology and control of Salmonella in pork.
Washington, USA. pp: 293-295.
Dickinson. B and company.1998. DIFCO. Laboratories. Sparks, Maryland USA
Dush. H, Altwegg.M:1994. Evaluation of Xilose-Lisine Tergitol agar and Modified
semisolid Rappaport Vassilidians medium for the isolation of non-typhoid Salmonella
fron stool samples. Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. C5:557
Dorman, Charles J. et al; Characterizations of Porin and ompR Mutants of virulent
straint of Salmonella typhimurium: ompR Mutants are attenuated in vivo. July, 1989,
Infect. Inmun. 57 (7): 2136-2140.
Escobar B, Mogollon J, Rincón M, Peña N, Hernandez I, Preciado P. Prevalencia
serologica de la salmonelosis en granjas porcinas intensivas de ColombiaTrabajo de
grado. Pontificia Universidad Javeriana, 1999
Davies, P.R. y FUNK, J.A. (1999) En: Proc. of the 3rd international symposium on
the epidemiology and control of Salmonella in pork. Washington, USA. pp: 1-11.
Dahl, J. (1997) En: Proc. of the BIT Intern. Symp. On Vet. Epid. And Econ. pp 14-23.
Dahl, J., Wingstrand, A, Kranker, S. Y Nielsen, B. (1997) Vet. Rec. 140: 679-681.
Dahl, J., Kranker, S. Y Wingstrand, A. (2000) En: Proc. of 16th International Pig
Veterinary Society Congress. Melborne, Australia. pp: 203.
Eley A. Intoxicaciones alimentarias de etiología microbiana. Editorial Acribia,
Zaragoza (España). 1994; 17:p.p 1-17.
Fablet, C., Jolly, JP., Madec, F., Fravalo, P., Salmonella enterica in farrow to finís
faros: The different sections are concernid. Proceedings of the 19th IPVS Congress.
Copenhagen, Denmark, 2006. Volumen 2. pp 363.
Fablet, C.,Robinault, C., Eono, F., Dorenlor, V., Labbé, A., Fravalo, P., Madec,
F.2006. Factors associated with Salmonella contamination of finishing facilities
following cleaning and disinfection procedure. . Proceedings of the 19th IPVS
Congress. Copenhagen, Denmark, 2006. Volumen 2. pp. 366.
Ferris, K,. Aalsburg E, Palmer A. 2003. Salmonella serotypes from animals na related
sources reported during July 2002- June 2003. In Proceedings of the 17th Annual
Meeting of the United States Animal Health Association. pp. 463-469.
Fica A, Fernández, A, Prat P, Figueroa O, Gamboa R, Tsunekawa I, Heitman I.
Salmonella enteritidis, un patógeno emergente en Chile. Rev Méd Chile 1997; 125:
pp 544-51.
Fica A, Alexandre M, Prat S, Fernández A, Fernández O, Heittmann G. Cambios
epidemiológicos de las salmonelosis en Chile. Desde Salmonella typhi a Salmonella
enteritidis. Rev Chil Infect 2001; 18: 85-93
Fields, P. I., R. V. Swanson, C. G. Haidaris, and F. Heffron. 1986. Mutants of
Salmonella typhimurium that cannot survive within the macrophage are avirulent.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5189-5193.
Franco D. 1990. Salmonelosis prevention. Journal Enviromental Health. 53:34-42
Funk, J., Harris, I., Davies. 2005.Comparison of fecal culture and Danish Mix-Elisa
for determination of Salmonella enterica subsp. enterica prevalence in growing
swine. Veterinary Microbiology, 107.pp 115-126
Gray, J.T., Fedorka-Cray, P.J., Stabel, T.J. and Ackermann, M.R. (1995) Influence of
inoculation route on the carrier state of Salmonella Cholerae-suis. Veterinary
Microbiology 47, 43-59.
Gray, J.T., Stabel, T.J. and Fedorka-Cray, P.J. (1996) Effect of the dose on the
immune response and persistence of Cholerae-suis infection in swine. American
Journal of Veterinary Research 57, 313-319.
Gobierno de Chile. Instructivo Técnico de Análisis/Ensayo para Salmonella mediante
método tradicional de cultivo MLG 4.02 USDA/FSIS.
Hald , T. y Wegener, H.C. (1999) En: Proc. of the 3rd international symposium on
the epidemiologyand control of Salmonella in pork. Washington, USA. pp: 200-205.
Hald, T., Wingstrnad, a., swanenburg, m., altrock, a.v., limpitakis, n. ythorberg, b.m.
(1999) en: proc. of the 3rd international symposium on the epidemiologyand control
of salmonella in pork. washington, usa. pp: 273-276.
Hoofar. J and Mortensen V. 2000. Improved culture methods for isoliation of
Salmonellaorganism from swine feces. Americal Journal Veterinary.61: 1426-1429
Irino K, Fernnandes SA, Tavecchi AT, Neves BC, Díaz AM. Progression of
Salmonella enteritidis paghe type 4 strains in Sao Paulo State. Rev Inst Med Trop Sao
Paulo 1996; 38: 193-6.
Ivanoff, B. 1995. Typhoid fever: global situation and WHO recommendations.
Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 26:1-6
Jette, C., Mats, R. 1998. Multiple change-point analysis applied to the monitoring of
Salmonella prevalence in Danish pigs and pork. Preventive Veterinary Medicine 36.
pp. 131-143.
Kampelmacher, EH., Guinee, PAM., Hoestra, K., Van, Keulen., 1963. Further
studies on Salmonella in slaughterhouses and in normal slaughter pigs. Zbl. Vet.
Med. Reihe B. 10 (1):1-27.
Koshi Yamamoto, DVM, PhD, Asesor principal de PRODIVET. Salmonelosis
porcina.
Linder, E. Toxicología de los alimentos. Editorial Acribia. Zaragoza España. 1995;
p53-65.
MacFaddin, 2003 Pruebas bioquímicas para la identificación de Bacterias de
importancia Clínica.
Matsui, H., M. Eguchi, and Y. Kikuchi. 2000. Use of confocal microscopy to detect
Salmonella typhimurium within host cells associated with Spv-mediated intracellular
proliferation. Microb. Pathog. 29:53-59.
Mateu. E. 2001 En. IV Jornadas de porcino de la UAB. CRESA. Barcelona, Spain
Mejía, W. 2002.Epidemiología de la salmonelosis porcina en Granjas de Cataluña y
determinación de los Factores de Riego de la Infección.
Mejía, W., Zapata, D., Mateu, E., Martin, M. 2005. Lack of specificity of a
combination of Rappaport-Vassiliadis broth and XLT4 agar for the isolation of
salmonella from pig faeces. The Veterinary Record, January 29,2005. pp. 150.
Merck. Manual de Medios de Cultivo, 1990.
Meyer, Paul N. et al; Virulence of a Salmonella typhimurium OmpD mutant. Jan,
1998, Infect. Inmun. 66 (1): 387-390.
Miller, S. I., and D. A. Pegues. 2000. Salmonella species, including Salmonella typhi,
p. 2344-2363. In G. L. Mandell, J. E. Bennett, and R. Dolin (ed.), Mandell, Douglas,
and Bennett's principles and practice of infectious diseases, 5th ed. Churchill
Livingstone, Philadelphia.
Mora A. Evaluación de la prevalencia de Salmonella spp en jugos carnicos de
porcinos sacrificados en las plantas de beneficio de Bogota D:C. Trabajo de grado.
Universidad Nacional de Colombia. 2003
Mora L., G; Porinas en enterobacterias. 1988, Acta Microbiol. 1(2): 9-20.
Morgan, IR., Krautil, FL., Craven, JA.1987. Effect of time in lairage on caecal and
carcasses Salmonella contaminatiom of slaughter pigs. Epidemiol Infect 98: 323-330.
Mousing, J., Jensen, P.T., Halgaard, C., Bager, F., Feld, N. Nielsen, J.P. Y
Bechnielsen,B. (2001) Pig International 31, 6: 15-16.
Mumma GA, Griffin PM, Meltzer MI, Braden CR, Tauxe RV. Evidence of
Effectiveness of Egg Quality Assurance Programs, Mandatory Refrigeration, and
Traceback Investigations To Mitigate Egg-Associated Salmonella e nteritidis
Infections in the United States. International Conference on Emerging Infectious
Diseases, Atlanta, 2002
Negm, R.; Pistole, T.; The porin OmpC of Salmonella typhimurium mediates
adherence to macrophages. Aug, 1999, Canadian Journal of Microbiology 45 (8):
658-669.
Nielsen, B., Dahl, L., Sorensen, L.2005. Salmonella serotype distribution in Danish
swine herds and pork, 1998-2004. In: Proceedings of the 6th International Symposium
of the Epidemiology and Control of Foodborne Pathogens in Pork. Pp. 76-79
Nikaido, H. 1996 Outer membrane, pags. 29.47 en F. C. Neidhardt et al. Escherichia
coli and Salmonella: celular and molecular biology. ASM Press, Washington, D.C.
OMS. Control de la salmonelosis: importancia de la higiene veterinaria y de los
productos de origen animal, 1988.
Ovalle, Y; Reyes, Y. Aislamiento y serotipificación de Salmonella spp a partir de
alimentos obtenidos en diferentes zonas de Santafé de Bogotá, D.C. Trabajo de grado.
Pontificia Universidad Javeriana, 1999.
Parra, Microbiología, Patogénesis, Epidemiología, Clínica y Diagnostico de las
Enfermedades producidas por Salmonella.2003. MVZ-CÓRDOBA 2002; 7:(2), 187200
Penner, K. P. 1997. Microorganisms and Foodborne Illness. Kansas State University
Agricultural Experiment Station and Cooperative Extension Service. MF 2269.
Popoff, M. Y., J. Bockemuhl, and F. W. Brenner. 2000. Supplement 1998 (no. 42) to
the Kauffmann-White scheme. Res. Microbiol. 151:63–65.
Popoff, M. Y., and L. Le Minor. 1997. Antigenic formulas of the Salmonella
serovars, 7th revision. World Health Organization Collaborating Centre for Reference
and Research on Salmonella, Pasteur Institute, Paris, France.
Proescholdt, T., Turkson, P., McKean, J., Funk, J.,Hurd, S., Beran,
G.1999.Salmonella
in commercial swine from weaning through slaughter.
Proceedings of the 3rd International Symponsium of the Epidemiology and Control of
Salmonella in por.August 5 1999 Washington DC. Pp. 161-4 .
Richter-Dahlfors, A., A. M. J. Buchan, and B. B. Finlay. 1997. Murine salmonellosis
studied by confocal microscopy: Salmonella typhimurium resides intracellularly
inside macrophages and exerts a cytotoxic effect on phagocytes in vivo. J. Exp. Med.
186:569-580.
Rodríguez DC, Cameron DN, Phur ND, Brenner FW, St Louis ME, Wachsmuth KI,
Tauxe RV. Comparison of plasmid profiles, phage types and antimicrobial resistance
patterns of Salmonella enteritidis isolates in United States. J Clin Microbiol 1992; 30:
854-7.
Rosendal, T., Friendship, R. 2006. American Association Of Swine Veterinariusn. pp:
435-37.
Roof, M. 1993. Porcine salmonelolsis : An Inmune paradox.Lemna Swine conference
Rossi, M,. Ballagi, A. 2006 Proceedings of the 19th IPVS Congress. Copenhagen,
Denmark, 2006. Volumen 2. pp: 381.
Rostagno M, Hurs S, McKean J. 2006 American Association of Swine Veterinarians,
pg 439.
Sadeleer, L., Maes, D., Dewulf, J., Daube, G., Delhalle, L., Houf, K., Zutter, L.
Critical points for Salmonella contamination during slaughter process in Belgian
slaughterhouses. . Proceedings of the 19th IPVS Congress. Copenhagen, Denmark,
2006. Volumen 2. pp 369.
Salcedo, S. P., M. Noursadeghi, J. Cohen, and D. W. Holden. 2001. Intracellular
replication of Salmonella typhimurium strains in specific subsets of splenic
macrophages in vivo. Cell Microbiol. 3:587-597.
Salyers A, Whitt D. Bacterial Patogénesis: a molecular approach. ASM press,
Washinton. Second edition 2002; p 681-695.
Stârk, K., Wingstrand, A., Dahl, J., Mogelmose, V., Lo Fo Wong, D.. 2002. Preventive
Veterinary Medicine. p,p 7-20.
Sibley Jennifer, Yue Binbin, Huang Fei, Harding John, Kingdon Jill, Chirino-Trejo
Manuel, and D Greg . Appleyard.1993 Comparison of bacterial enriched-broth
culture, enzyme linked immunosorbent assay, and broth culture-polymerase chain
reaction techniques for identifying asymptomatic infections with Salmonella in
swine. Can J Vet Res. 2003 July; 67(3): 219–224
Silva J. Salmonella enteritidis un patógeno emergente de origen aviario. Rev Cs Salud
2000; 4: 25-36
Schwartz K, 1996. La salmonelosis en el cerdo.Pigs Misset.18-21
Schwartz K, 1998. Diseases of saines. 8th. Iowa State University Press. USA. 535547
Schwartz, P., Borowsky., Walber, EA., Kunrath., Barcellos, DES., Cardoso, M.
2006. Use of an attenuated vaccine for control of Salmonella enterica infection in a
swine herd in southern Brazil. Proceedings of the 19th IPVS Congress. Copenhagen,
Denmark, 2006. Volumen 2. pp 377.
Schwartz, P., Hirose, F., Kolb., Calveyra, J., Barcellos, DES., Cardoso, M. 2006.
Longytudinal study of Salmonella enterica infection in a swinw herd in southern
Brazil. Proceedings of the 19th IPVS Congress. Copenhagen, Denmark, 2006.
Volumen 2. pp 376.
Sorensen, L., Alban, L., Nielsen, B., Dahl. 2004. The correlation betwen Salmonella
serology and isolation of Salmonella in Danish pigs at slaughter. Veterinary
Microbiology 101 (2004) .p.p. 131-141.
Straw. B.E, Dewey. C.R and Wilson. M.L. 1999. Differential diagnostic of swine
diseases. Diseases of swine. 9th Edition. Taylosr Editors. Iowa. State. University
Press.
Vadillo S, Perez y Mateus S. 2000Manual de Microbiologia Veterinaria. Editorial Mc
Graw Hill. Mexico D.F. 327-347
Wood. R. 1982. Populations of Salmonella Thyphimuruim in internal organs of
experimentally infected carrier swine. American Journal of Veterinary Research.
53:653-657
.
.
11. ANEXOS
ANEXO 1. CALCULO TAMAÑO DE MUESTRA EN PLANTA DE
SACRIFICIO.
N = 15478 (promedio de cabezas sacrificadas mensualmente)
Nivel de confianza = 90%
Nivel de significancia =10%
Proporción de animales infectados = 27.2%
z2 * p*q
n=
 z* p*q
Ep 2 + 
 N 
n=
n=
1.652 * 0.272 * 0.728
1.65 * 0.272 * 0.728 
0.10 2 + 

15478

0.5390
0.01 + 1.1887 x10 − 4
n=
2.7225 * 0.1980
 1.840 
0.01 + 
15478 
n=
0.5390
0.010
n = 53.9 ≈ 54muestrasmensuales
54muestrasmensuales
* 7días = 12.6 ≈ 13
30dias (1mes)
13carcasas * 4submuestras = 52muestrassemanales * 12semanas = 624
Cada semana se seleccionaron
al azar 13
carcasas, cada una
a su vez fue
submuestreada en las siguientes áreas: Cabeza, vientre, lomo y pierna; lo que indica
que se tomaron doscientas ocho (208) muestras mensuales durante 12 semanas (3
meses). Semanalmente se tomaron cincuenta (52) muestras. En total se muestrearon
156 carcasas y 624 submuestras.
ANEXO 2. FLUJOGRAMA DE MÉTODO NO DESTRUCTIVO SOBRE
CARCASA
ANEXO 3. FLUJOGRAMA DE PRE-ENRIQUECIMIENTO NO
SELECTIVO
ANEXO 4. FLUJOGRAMA DE PRE-ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO.
ANEXO 5. FLUJOGRAMA DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
ANEXO 6. FLUJOGRAMA DE TIPIFICACION SEROLOGICA.
ANEXO 7. REACCIONES DE Salmonella H ANTISERA SPICER-EDWARDS
CON LOS ANTIGENOS H.
ANEXO 8. PREPARACION SOLUCION SALINA FORMOLADA.
ANEXO 9. IDENTIFICACION DE FORMULAS ANTIGENICAS DE
Salmonella sp. SEGÚN EL ESQUEMA DE KAUFFMAN-WHITE
De acuerdo a los resultados obtenidos en la tipificación utilizando los antisueros
correspondientes mediante el esquema de Kauffman-White se identificó el serotipo
de cada cepa aislada.
ANEXO 10. ESQUEMA DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS DE
Salmonella sp (Antibiograma)
ANEXO 11. PARAMETROS DE RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD DE
Salmonella sp FRENTE A LOS ANTIBIOTICOS EMPELADOS EN ESTE
ESTUDIO.
ANTIBIOTICO
Amikacina
CONCENTRACION
CASA
SENSIBILIDAD
RESISTENCIA
SENSIDISCO (µg)
COMERCIAL
(mm)
(mm)
30
OXOID
≤14
≤17
10
OXOID
≤ 13
≤ 18
10
OXOID
≤ 12
≤ 15
30
OXOID
≤ 14
≤ 18
5
OXOID
≤ 15
≤ 21
5
OXOID
≤
≤
30
BRITANIA
≤ 16
≤ 21
50
OXOID
≤ 12
≤ 15
10
OXOID
≤ 12
≤ 15
30
OXOID
≤ 13
≤ 18
30
OXOID
≤ 12
≤ 17
10
OXOID
≤ 12
≤ 17
30
OXOID
≤ 14
≤ 19
30
OXOID
≤ 14
≤ 19
25
OXOID
≤ 10
≤ 16
(AK)
Amoxacilina
(AMX/AML)
Ampicilina
(AMP)
Ceftazidime
(CAZ)
Ciprofloxacina
(CIP)
Enrofloxacina
®
Baytril
(ENR)
Florfenicol
(FFC)
Fosfomicina
(FOS)
Gentamicina
(CN)
Kanamicina
(K)
Neomicina
(N)
Norfloxacina
(NOR)
Oxitetraciclina
(OT)
Tetraciclina
(TE)
TrimetoprimSulfametoxazol
(SXT)
ANEXO 12. PORCENTAJE DE SEROTIPOS DE Salmonella sp AISLADOS
EN CANALES PORCINAS.
SEROTIPO
Salmonella Agona
Salmonella Altendorf
Salmonella Augustenborg
Salmonella Chester
Salmonella Derby
Salmonella Farsta
Salmonella Gloucester
Salmonella GRUPO E1
Salmonella enterica subs. Salamae
Salmonella Lagos
Salmonella Paratyphi B
Salmonella Sandiego
Salmonella Tennyson
Salmonella Thyphimurium
Salmonella Travis
Salmonella Vellore
TOTAL DE AISLAMIENTOS
Porcentaje de
Aislamientos (%)
8,70
1,45
1,45
4,35
13,04
1,45
7,25
1,45
5,80
1,45
1,45
1,45
1,45
46,38
1,45
1,45
100,00
Todos los serotipos descritos anteriormente, pertenecen a : Salmonella enterica subsp. enterica , excepto Salmonella enterica
subsp. Salamae, el cual tuvo un 6% de prevalencia.
ANEXO 13.
AISLAMIENTOS DE Salmonella sp SEGÚN SUBMUESTRA.
SUBMUESTRAS
CABEZA
VIENTRE
LOMO
PIERNA
Total
N° DE
AISLAMIENTOS
38
15
12
20
85
PORCENTAJE DE
AISLAMIENTOS (%)
44.71
17,65
14,12
23,53
100
ANEXO 14. AISLAMIENTOS DE Salmonella sp SEGÚN SUBMUESTRA Y
TRATAMIENTO EN CANALES PORCINAS
RVS-XLD
RVS-XLT4
RVS-SS
TTO-XLD TTO- XLT4
TTO- SS
SC- XLD
SC- XLT4
SC- SS
AREAS DE
SUBMUESTREO
Nª
%
Nª
%
Nª
%
Nª
%
Nª
%
Nª
%
Nª
%
Nª
%
Nª
%
CABEZA
5
3
2
1.2
1
0.6
5
3
7
4.3
2
1.2
13
7.9
12
7.3
8
4.9
VIENTRE
4
2.4
0
0
1
0.6
3
1.8
6
3.7
4
2.4
3
1.8
5
3
3
1.8
LOMO
3
1.8
1
0.6
2
1.2
2
1.2
8
4.9
2
1.2
9
5.5
6
3.7
3
1.8
PIERNA
3
1.2
4
2.4
1
0.6
2
1.2
10
6.1
3
1.8
12
7.3
8
4.9
2
1.2
TOTAL
14
8.5
7
4.3
5
3
12
7.3
31
18.9
11
6.7
37
22.6
31
18.9
16
9.8
CONVENCIONES
Tetrationato seg. Muller-Kauffman (TTO)
Caldo de enriquecimiento Selenito-Cistina (SC).
Caldo Rapapport Vassiliadis (RVS)
Agar para Salmonella y Shigella (SS)
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)
Agar Xilosa Lisina Tergitol (XLT4)