Secuencia parcial del gen 16S rRNA de cepas constituyentes de un

Secuencia parcial del gen 16S rRNA de cepas constituyentes
de un fermento para la elaboración de Queso Artesanal de Corrientes
Vasek, Olga M.1 - Hebert, E. M.2 - S. de Giori, G.2 - Raya, R.2 - Fusco, A. J. V.1
1.Laboratorio de Bromatología - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura - UNNE.
Campus Universitario - Av. Libertad 5600 - (3400) Corrientes - Argentina.
Teléfono/Fax: +54 (3783) 457996
E-mail: [email protected]
2.CERELA.
Chacabuco 145 - S. M. de Tucumán - Tucumán - Argentina.
ANTECEDENTES
Las cepas destinadas al diseño de un fermento iniciador deben estar ampliamente identificadas y clasificadas
taxonomicamente. Los métodos fenotípicos son altamente dependientes del ambiente en el cual crecen los
microorganismos, sin embargo el genotipo es un camino seguro de mapeo de interrelaciones y es independiente
de las condiciones de crecimiento ambiental. La secuencia de la pequeña subunidad (30S) del gene RNA
ribosomal que posee una sola molécula de rRNA 16S, es altamente conservada. En las bacterias, este gen posee
alrededor de 1,5 kilopares de bases (kbp). Se ha propuesto que procariotas cuyo rRNA 16S tenga un 97% o más
de secuencias idénticas es muy probable que pertenezcan a la misma especie. Por amplificación selectiva de esta
secuencia a partir del DNA genómico y comparando los resultados de bases de datos, los microorganismos
pueden ser caracterizados como filotipos y puestos en el árbol filogenético.
El objetivo de este trabajo fue secuenciar en forma parcial el gen 16S rRNA de tres cepas tipo entre las
constituyentes de un fermento destinado a la elaboración de Quesos Artesanales de Corrientes, categorizadas
como tal en base a los estudios fenotípicos y quimiotaxonómicos previos.
MATERIALES Y METODOS
Microorganismos: Se usaron las cepas: Lactococcus lactis subsp. lactis Q2c (199cVCOR), Lactobacillus
plantarum 77bVCOR y 14cVCOR que por sus caracterizadas fenotípicas no pudo ser clasificada
taxonomicamente, y que fueron seleccionadas como cepas tipo entre las constituyentes de un fermento diseñado
para la elaboración de Queso Artesanal de Corrientes.
Medios de cultivo y condiciones de crecimiento: Caldo LAPTg10 (Raibaud y col., 1961) se usó para la
propagación de los microorganismos. Cada cultivo láctico, crecido en el medio mencionado a 30°C durante 14
hs, fué cosechado por centrifugación a 5.000 x g durante 15 min.
Aislamiento de ADN cromosómico. Se siguió la metodología de De los Reyes-Gavilán et al., 1992. El pellet
celular proveniente de 5ml de caldo crecido de cada cepa a estudiar fué resuspendido en 1,7ml de buffer SETlisozima (NaCl 75mM, EDTA 25mM, Tris 20mM, pH 7,5, lisozima 10mg/ml), incubado a 37ºC durante
90min, sometidas a la acción de 170µl de SDS (10%) y digeridas con 50µl de proteinasa K (15mg/ml).
Luego de ser incubadas a 55ºC durante 2h con movimientos circulares periódicos, se agregaron 700µl de NaCl
5M, extrayendo el DNA cromosómico con solvente orgánico (2,7ml de cloroformo:alcohol isoamílico, 24:1),
dejando reaccionar 30min a temperatura ambiente y cosechando por centrifugación a 12.000rpm por 10min.
La fase orgánica fué tratada con isopropanol (1:1, v/v), para precipitar el ADN, separándolo por centrifugación
(12.000rpm durante 10min) y recuperándolo con tubo capilar. El ADN fué lavado con 1ml de etanol (70%),
separado por centrifugación (12.000rpm durante 10min), secado a temperatura ambiente y resuspendido en
100µl de buffer TE (Tris 10mM, EDTA 1mM, pH 8,0).
Amplificación de la región 16s por reacción de polimerasa en cadena (PCR).
Para amplificar la región variable (V1) del gen 16S ribosomal del RNA, se usaron como cebadores específicos
para flanquear la secuencia a amplificar los oligonucleótidos: PLB16, 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ y
MLB16, 5’-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3’ sintetizados por The Great American Gene Company
(Ramona, CA) para amplificar aproximadamente una región de 500 nucleótidos.
0,3mg/ml de ADN templado de cada cepa fueron amplificados en un volumen total de 50µl de mezcla de
reacción PCR (2,5mM de cada dATP, dCTP, dCTP y dTTP, 25mM MgCl2, 10µM de cada cebador, buffer 10X
(50mM Kcl, 10mM Tris-ClH, pH = 8,3), 5U/µl de Taq DNA polimerasa (Promega, Madison, WI).
La amplificación fué llevada a cabo en un Termociclador de DNA (PTC-150, Mini CyclerTM-Hot Bonnet, MJ
Research), con un programa de proceso iniciado por desnaturalización durante 5min a 94ºC, seguido de 30
ciclos a 94ºC durante 15seg, unión del cebador a 50ºC durante 30seg y extensión a 72ºC durante 45seg. Una
incubación adicional durante 10min a 72ºC fué empleada para completar la extensión del primer después del
último ciclo.
Los productos PCR fueron analizados por electroforesis sobre gel de agarosa (1,2%) en buffer TAE 1X a 70V
durante 2hs, seguido de 30min de coloración en 0,5 µg de solución de bromuro de etidio y 15min de
decoloración en agua destilada, con visualización final y fotografía bajo luz UV (DyNA Light. Dual Intensity
UV Transluminator Labnet. National Labnet Company).
Purificación de los amplicones evidenciados en el gel. Las bandas escindidas del gel fueron pesadas
(asumiendo que 1g de gel=1ml), resuspendidas en tres volúmenes de buffer de extracción (6M NaClO4, 50mM
Tris (pH = 8,0), 10mM EDTA (pH = 7,5)), y disueltas por tratamiento a 50ºC durante unos pocos minutos.
Luego de agregar 5 µl de matriz de adsorción (capacidad de super-enrollamiento: 0,2µg DNA/µl), se separó el
buffer por microcentrifugación durante 1min.
El pellet de productos PCR fué enjuagado con el buffer de extracción (25 veces la matriz agregada: 25 x 5 =
125µl), eliminándolo por microcentrifugación durante 1min. El producto resultante fué lavado dos veces con
buffer de lavado (400mM NaCl, 20mM Tris (pH = 7,5), 2mM EDTA (pH = 7,5), 50% etanol), usando 25 veces
la matriz agregada (25 x 5 = 125µl ), separado por microcentrifugación durante 1min., eliminando todo resto
de buffer y secando a temperatura ambiente.
Loa amplicones purificados fueron eluídos dos veces con 15 µl de H2O bidestilada (45ºC durante 10min) y
separados por microcentrifugación (1min).
Evaluación del proceso de purificación. Fué realizado por electroforesis en gel de agarosa (1%), que posee un
rango de eficiencia de separación lineal de moléculas de DNA de 0,4-6 kb.
2µl de muestra con 2µl de Solución colorante y 5µl de buffer de muestra Tris-acetato (TAE) 1X (0,04M Trisacetato, 0,001M EDTA, pH = 8,0) fueron usados como inóculo de siembra.
Se aplicaron 75V durante 2h, usando un buffer de corrida TAE 50X (242g Tris base, 57,1ml ácido acético
glacial, 100ml 0,5M EDTA (pH = 8,0) / l) en una cuba horizontal (BioRad, Wide Mini SubTM Cell)
El gel fué teñido en solución 0,5µg/ml de bromuro de etidio durante 30min y desteñido en H2O destilada
durante 15min, con visualización final (Dual Intensity-UV Transiluminator Labnet , National LabNet
Company) y fotografía (Polaroid MP-4 Land Camera D1C, DF Polaroid Corporation, Cambridge, USA) bajo
luz UV.
Secuenciamiento de los amplicones purificados. Los productos purificados fueron resuspendidos en 20µl de
buffer TE (10mM Tris, 1mM EDTA; pH 8,0) y secuenciados en el National Center for Biotechnology
Information (NCBI),Bethesda, MD. La homología del DNA fué llevada a cabo con el programa BLAST
(Altschul et al., 1990).
DISCUSION DE RESULTADOS
En la Fig.1 se muestran los productos PCR de amplificación. En la misma se observa que la cepa 14c muestra
características diferenciales, con un plásmido mas chico que la cepa Q2c y el bacilo 77b evidencia dos
plásmidos: uno ubicado sobre y otro debajo del cromosoma.
En la Fig. 2 se muestran los amplicones purificados, usando un marcador de pesos moleculares DNA ladder
(Promega), corroborando que se obtuvo un peso aproximado de 500bp y que la purificación fue efectiva al
mostrar en el gel la revelación de una sola banda.
1
2
3
Fig.1. Gel de agarosa (1,2%), mostrando los amplicones PCR. Línea 1: cepa 14cVCOR, línea 2: cepa Q2c
(199cVCOR), línea 3: cepa 77bVCOR.
1
2
3
4
1.500bp
1.000bp
500bp
Fig.2. Gel de agarosa (1%) de los amplicones PCR purificados. Línea 1: cepa 14cVCOR, línea 2: cepa Q2c
(199cVCOR), línea 3: cepa 77bVCOR, línea 4: Marcador de PM.
Con el secuenciamiento remitido por NCBI y, usando métodos computacionales se realizaron los alineamientos
correpondientes.
Los 505 pares de bases (bp) secuenciados de la cepa 14c, mostraron un recuento de bases de: 145 adenina (A),
106 citocina (C), 151 guanina (G), 103 timina (T), el alineamiento se realizó contra la secuencia referencia 16S
rRNA DNA de Leuconostoc mesenteroides NRIC 1541 (Nº de acceso ABO23243), taxon: 1245, que permitió
clasificarla taxonomicamente como: Bacteria; Firmicutes; Bacillus/grupo Clostridium; Lactobacillaceae;
Leuconostoc especie mesenteroides.
La cepa Q2c con 516 bp secuenciados, mostró un recuento de bases de 151 A, 106 C, 154 G y 105 T,
alineándola con la secuencia de referencia 16S rRNA DNA, Lactococcus lactis N4 (Nº de acceso AF270792),
taxon:1358, homología: 99%, correspondiéndose con Bacteria; Firmicutes; Bacillus/grupo Clostridium;
Streptococcaceae; Lactococcus especie lactis y permitiendo corroborar la clasificación fenotípica previa.
De la cepa 77b se secuenciaron 543 bp, recuento de bases de 148 A, 118 C, 157 G y 120 T, el alineamiento se
homologó con la secuencia de referencia 16S rRNA DNA Lactobacillus plantarum HSW36 (Nª de acceso
AJ272031), taxon:1590, con un 99% de homología, clasificándola como: Bacteria; Firmicutes; Bacillus/ grupo
Clostridium; Lactobacillaceae; Lactobacillus especie plantarum, de conformidad con el fenotipo estudiado
previamente.
Las secuencias parciales 16S rRNA de Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus
plantarum fueron remitidas al banco de datos GenBank (Nº de acceso AF323179, AF323676 y AF323677),
respectivamente.
BIBLIOGRAFIA
Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool.
J. Mol.Biol. 215:403-410.
De los Reyes-Gavilán, C.G., Limsowtin, G.K., Tailliez, P., Sechaud, L., Accolas, J.P. (1992). A
Lactobacillus helveticus-specific DNA probe detects restriction fragment length polymorphisms in
this species. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3429-3432.
Raibaud, P., M.Caulet, J.V.Galpin and G.Mocquot.(1961). Studies on the bacterial flora of the alimentary
tract of pigs. II.Streptococci: Selective enumeration and differentiation of the dominant group.
Appl.Bacteriol. 24:285-291.