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UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOANALISIS
E
INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGIA
ESTUDIO
INMUNOFENOTlPICO COMPARAT1VO DE
SUBPOBLACIONES HEMATOPOYtTICAS PROVENIENTES DE
SANGRE
DE
CORDON
C t L U L A S MOVILIZADAS
QUE
UMBILICAL
A LA
PARA OBTENER
UCENCIADO
VANIHAMIN
EN
HUMANO
(SCUH)
Y
SANGRE PERIFERICA (CMSP)
EL GRADO ACADEMICO DE
QUIMICA
DOMfNGUEZ
CLINICA
MEL&IDEZ
DIRECTOR DE TESIS: DR. ALEJANDRO MARCH£ COVA
APOYADA POR EL PROYECTO CONACYT 36873-M
MEXICO, D.F.
ENERO DEL 2004
COMITE TUTORAL:
PRESIDENTE:
Dr. RAFAEL GUERRERO GARCIA
SECRETARIO:
Q.C JORGE SIGFRIDO GONZALEZ HERNANDEZ.
VOCAL
Dra. MA. LUISA SOLANO GARCIA.
SUPLENTE:
M en C. MARIA LOPEZ HERNANDEZ
DIRECTOR DETESIS:
DR ALEJANDRO MARCHE COVA.
A medida que vamos creciendo nuestras metas profesionales, se vuelven mas
importantes y la mayoria de las veces mas dif idles. este es un proceso que a algunos
nos cuesta mas y a otros menos. pero finalmente, es el caracter de cada persona
el que lo impulsa a terminar
dichas metas, cada vez que uno logra una meta ya sea
profesional o personal quiere estar rodeado de los seres a los que mas ama o que de
alguna manera han dejado huella en el para compartir su felicidad. En este caso es
una meta profesional se que no me bastaria una o dos hojas para poder poner a
todas las personas que mi mente llegue a recordar y que
de alguna manera son
importantes para mi pero deben saber que aunque no lleguen a aparecer en estas
hojas, estan en mi corazon.
Este momento se lo dedico a los cimientos y pilares de mi vida.
A mis queridos padres Victor y Ruth y a mi hermano Victor:
a ustedes, a los cuales dedico este t r i u n f o y debo todo lo que llegue a realizar
en el f uturo por que ustedes son los cimientos de vida gracias por tocarme en esta
vida, ya que son maravillosos ya que siempre me han dado lo necesario para poder
vivir feliz y su regalo mas grande, personalmente, siempre, siempre me han hecho
sentir su apoyo y eso t r a e como consecuencia la seguridad que tengo, la cual me
ayuda a salir adelante siempre, GRACIAS Mami chula y GRACIAS viejo eres el
mejor padre del mundo. Y a t i hermano simplemente no tengo palabras para poder
explicar
lo que significas para mi, pero debes saber que siempre estas en mi
corazon y me das fuerzas en mis momentos diffciles y creeme no son pocos. Se que
algun dfa, en algun momento o en algun lugar tendre la oportunidad de decfrtelo
personalmente pero por ahora sera de esta manera, nos vemos y t e quiero mucho.
A M I S HERMANOS
A mi querida hermana Ruth, gracias por todo t u apoyo y por hacerme sentir
protegido.
A mi hermano Daneskiu, a t i quiero agradecerte t u apoyo amistad, y gracias
por sor un ejemplo para mi, t e quiero mucho hermano.
A mi hermanita Ihulema, gracias por estar conmigo, y por ser mi compinche,
t u sabes en realidad cuanto vales para mi.(nooooo, mucho hermanita... mucho)
A mis pequenas hermanas Yharos y Ihoana, a ustedes por ocupar una gran
parte de mi corazon, y por ser mis pequenas.
A mis tios Isaac y mi super
tia
Celia, mi abuelita
Anita
a
ustedes
principalmente por que de alguna y o t r a manera han dejado huella en mi vida o me
han dado apoyo y algun consejo, los quiero y respeto mucho.
AGRADECIMIENTOS
I N S T I T U T O N A C I O N A L DE CANCEROLOGI-A.
Dr. Pedro Sobrevilla Calvo
J e f e del Departamento de Hematologia.
Dra. Rita Rivas Gonzales.
J e f a del Banco de Sangre.
Q.F.B. Alejandro Enrique Velasco Escobar.
J e f e de seccion del Laboratorio clinico
Q.F.B. Aurora Acosta Barreda.
Biol.. Rocio Susana Mendez Martinez.
Esp. M.E Maria del Pilar Ramos Godines.
Por su apoyo y colaboracion para la realizacion de esta tesis.
HOSPITAL GENERAL MANUEL GEA GONZALEZ
Dra. Ana Flisser.
Directora de investigacion.
Dr. Luis A l b e r t o Villanueva Egan
Subdirector de ginecologfa y obstetricia.
Por todo el apoyo brindado y su valiosa colaboracion para la realizacion de esta
tesis.
FACULTAD DE B I O A N A L I S I S .
Sobre todo a aquellos maestros que personalmente dejaron huella en mi me
ayudaron y me inspiraron a terminar mi carrera.
Q.C Jorge Sigfrido Gonzalez, Q.C Sandra Luz Gonzalez Herrera. Q.F.B Patricia
Silvia Rosales Pastrana, Q.C. Francisco Solis Paez., Dra. Ma Luisa Solano Garda.
Dr. Rafael Guerrero Garcia, M en C. Maria Lopez Hernandez.
CONACYT
Agradecimientos especiales a CONACYT por la beca N ° 4 8 8 0 otorgada para el
apoyo a esta tesis, la cual esta comprendida dentro del proyecto N ° 3 6 8 7 3 - M
"Estudio I n t e g r a l de la Enfermedad Minima Residual en pacientes con Leucemia
Mieliode Cronica Alotransplantados"
DR ALEJANDRO MARCHE COMA
Gracias principalmente por compartir un poco de su gran
conocimien+o
conmigo, asi mismo por soportarme y por reafirmar mis valores eticos dentro de
este mundo cientifico, tambien por ensenarme a hacer las cosas bien (aunque a
veces me cueste mas). Gracias Doctor personalmente es un gran investigador.
"ESTUDIO
INMUNOFENOTIPICO
HEMATOPOYETICAS
COMPARATIVO
PROVENIENTES
DE SANGRE
DE
SUBPOBLACIONES
DE CORDON
UMBILICAL
HUMANO (SCUH) Y CELULAS MOVILIZADAS A LA SANGRE PERIFERICA (CMSP)."
INDICE
GENERAL
Pag.
ABREVIATURAS
i
RESUMEN
ii
1.- I N T R O D U C C I O N
1.1.-HEMATOPOYESIS
1
1
1.1.1.-Ontogenia Hematopoyetica
2
1.1.2.-Subpoblaciones Celulares
3
1.1.3.-Estroma Celular
6
1.1.4.- Factores de Crecimiento y Citocinas
1.2.- ANTIGENOS DE DIFERENCIACION CELULAR EN
LA HEMATOPOYESIS
7
11
1.3.-ANTICUERPOS MONOCLONALES
14
1.4.- FUENTES DE CELULAS TALLO Y SUBPOBLACIONES
CELULARES
14
1.4.1.- Medula Osea
15
1.4.2.- Celulas Movilizadas a la Sangre Periferica (CMSP)
17
1.4.3.- Sangre de Cordon Umbilical Humano (SCHU)
19
1.5.- MICROSCOPIA DE EPIFLUORESCENCIA
22
1.6.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
25
2.-OBJETIVOS
27
3.-HIPOTESIS
27
Pag.
4.-MATERIALES Y METODOS
4.1.- OBTENCION DE MUESTRAS
28
28
4.1.1.-Muestras de SCUH
28
4.1.2.-Muestras de CMSP de alodonadores
28
4.2.-FASE DE ESTANDARIZACION
29
4.2.1.- Procesamiento de las muestras de SCUH
29
4.2.2.- Obtencion de la SCUH
29
4.2.3.- Concentrado leucocitario pobre en plaquetas (buffy-coat-lp)
30
4.3.- FASE DE ANALISIS
31
4.3.1.- Estudio inmunofenotipico de las muestras
31
4.3.2.- Procedimiento
31
5.- R E S U L T A D O S
32
6.- D I S C U S I O N Y C O N C L U S I O N E S
50
7.- B I B L I O G R A F I A
54
...
INDICE
DE
FIG U R AS
Y
TABLAS
Pag.
Figura 1. HEMATOPOYESIS
5
Tabla 1. PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE FACTORES DE
CRECIMIENTO E INTERLEUCINAS
9
Figura 2. ANTIGENOS DE DIFERENCIACION DE LAS CELULAS
PROGENITORAS Y PRECURSORAS
13
Tabla 2. FLUOROFOROS MAS COMUNES EN MICROSCOPIA DE
EPIFLUORESCENCIA
24
Figura 3. CASO REPRESENTATIVO DE LA SECUENCIA DE OBTENCION
DEL CORDON UMBILICAL HUMANO
33
Figura 4. CASO REPRESENTATIVO DE LA SECUENCIA DE OBTENCION
DE LA SANGRE DE CORDON UMBILICAL HUMANO (SCUH)
34
Figura 5. CASO REPRESENTATIVO DE LA FORMA EN LA QUE SE ION
REALIZA LA AFERESIS DE FLUJO CONTINUO
35
Tabla 3. DATOS GENERALES SOBRE LAS CMSP
36
Tabla 4. DATOS GENERALES SOBRE LOS CORDONES UMBILICALES
37
Tabla 5. PORCENTAJES DE LAS DIFERENTES SUBPOBLACIONES
ESTUDIADAS EN LAS MUESTRAS DE CMSP
38
Tabla 6. PORCENTAJES DE LAS DIFERENTES SUBPOBLACIONES
ESTUDIADAS EN LAS MUESTRAS DE SCUH
39
Tabla 7. CANTIDAD DE LAS DIFERENTES SUBPOBLACIONES EN EL
VOLUMEN TOTAL DE SCUH DE LOS CORDONES ANALIZADOS .. 40
Tabla 8. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS CELULAS
CD34+/CD45RA+, CD34+/CD71 Y CD34+ TOTALES EN CMSP
DE ALODONADORES
Tabla 9. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS CELULAS
CD45RA+/CD71 + Y CD45RA+ TOTALES EN CMSP DE
ALODONADORES
42
43
Pag.
Tabla 10. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS CELULAS
CD71+ TOTALES DE CMSP DE ALODONADORES
44
Tabla 11. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS
SUBPOBLACIONES CD34+/CD45RA+, CD34+/CD71+ Y
CD34+ TOTALES EN SCUH DE NEONATOS A TERMINO
45
Tabla 12. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS
SUBPOBLACIONES CD45RA+/CD71+ Y CD45RA+
TOTALES EN SCUH DE NEONATOS A TERMINO
46
Tabla 13. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS
CELULAS CD71+TOTALES EN SCUH DE NEONATOS
A TERMINO
47
Tabla 14. COMPARACION FINAL DE LOS VALORES DE REFERENCIA
DE LAS SUBPOBLACIONES DE CMSP VERSUS SCUH
48
Figura 6. CASO REPRESENTATIVO DE CELULAS CD34+ (ROJA) Y
CD34+/ CD45RA+ (ROJA-VERDE) DE UNA MUESTRA DE SCUH
49
ABREVIATURAS
UFC, unidad formadora de colonias; UFC-E, unidad formadora de colonias eritrociticas;
UFC-GM , unidad formadora de colonias granulo-monociticas; UFC-GEMM, unidad
formadora de colonias mixtas (granulocitos, eritrocitos monocitos y megacariocitos);
UFC-Meg, unidad formadora de megacariocitos; UFC-L , unidad formadora de la serie
linfoide; CD, cluster of direntation; UFB-E, unidad formadora de bursas eritroides; MO,
medula osea; SCUH, sangre de cordon umbilical humano; CMSP, celulas movilizadas
a la sangre periferica; CHT = celula totipotencial hematopoyetica.;L,linfoide.; EG ,
eritrocitos y granulocitos; M , monocitos; G, granulocitos; Bas, basofilos; Eo, eosinofilos;
LB linfocitos B; LT , linfocitos T; LGG, linfocitos grandes granulares; FC, factores de
crecimiento; FEC, factor estimulante de colonias; IL, interleucina; AcMs, anticuerpos
monoclonales; FITC, isotiocianato de fluoresceina; rpm = revoluciones por minuto; nm,
nanometro; pL, microlitro.
RESUMEN
En la actualidad para poder obtener celulas CD34+ se hace a traves de su movilizacion
de la medula osea a la sangre periferica (CMSP) por medio de factores de crecimiento,
recientemente una fuente alternativa de gran impacto es la sangre de cordon umbilical
humano (SCUH). La SCUH esta aun bajo estudio para poder observar sus ventajas y
desventajas respecto a las CMSP. Existe una gran diversidad entre ambas muestras en
cuanto a los resultados reportados tanto en la cantidad de celulas CD34+ totales como
de las diferentes subpoblaciones celulares, como las CD34/CD45RA+, CD34+/CD71+ y
CD45RA+/CD71+.
Por tal motivo y considerando ademas que en la actualidad en
nuestro pais existe muy poca informacion reportada sobre el tema, en el presente
trabajo, mediante el estudio comparativo de las subpoblaciones existentes en SCUH y
CMSP obtuvimos datos estadisticos que pueden servir como valores de referenda. De
tal forma, para la SCUH fueron: CD34+, 1.1- 2.3%, CD45RA+, 84.9-97.3%; CD71+, 1.31.7%; CD34/CD45RA+, 0.5-1.7%; CD34+/CD71+, 0.4-1.2%; CD45RA+/CD71+, 0.61.4%. Y para las de CMSP: CD34+, 0.5-1.3%; CD45RA+, 72.4-85.8%; CD71+, 0.71.1%; CD34/CD45RA+, 0.3-1.1%; CD34+/CD71+, 0.2-0.6%; CD45RA+/CD71+, 0.20.8%.
Nuestro estudio es el primero que muestra y aporta valores de referencia para
las diferentes subpoblaciones estudiadas tanto para muestras de SCUH como para
muestras de CMSP, que si bien fueron obtenidos por microscopia de epifluorescencia,
marcan la pauta para conocer datos estadisticamente significativos en futuros estudios
relacionados con el tema.
1.- I N T R O D U C C I O N
1.1.-HEMATOPOYESIS
La hematopoyesis es definida como el proceso mediante el cual las celulas
pluripotenciales se autoperpetuan y diferencian. Estas celulas pluripotenciales tambien
conocidas como celulas madre, tallo, progenitoras o "stem" son las que dan origen a las
distintas series celulares cuando se van diferenciando. Esto es, la celula pluripotente
puede dar origen a una celula similar o bien a otra celula mas diferenciada, a esta
celula se le conoce como precursora o unidad formadora de colonias (UFC), la cual
puede tener diferentes destinos: UFC-E que es la que da origen a la serie eritroide, la
UFC-GM que produce la granulo-monocitica, las UFC-GEMM que originan la mixta, las
UFC-Meg que producen la megacariocitica, y las UFC-L, que son las que dan origen a
la serie linfoide. La progenie derivada de cada una de estas UFC se le conoce como
subpoblacion celular. Estas subpoblaciones celulares continuan con su proceso de
diferenciacion, hasta llegar a una celula terminalmente diferenciada y por lo tanto
comprometida a una linea especifica (1- 3).
Las celulas hematopoyeticas tanto progenitoras como precursoras son incapaces
de distinguirse por medio de microscopia de campo claro. Estas celulas solo pueden
estudiarse mediante tecnicas de cultivo in vitro asi como mediante el marcaje de sus
antigenos de diferenciacion, conocidos como "cluster of diferentiation" (CD), por
anticuerpos monoclonales. Estos antigenos estan presentes en la superficie de la
membrana celular y conforman el inmunofenotipo especifico (4).
1.1.1.- Ontogenia Hematopoyetica
Alrededor del comienzo de la tercera semana, las celulas mesodermicas situadas
en el mesodermo visceral de la pared del saco vitelino se diferencian en celulas,
llamadas
Hemangioblastos,
formando
grupos
y
cordones
aislados
(cumulos
angiogenicos celulares) que gradualmente se van canalizando por confluencia de las
hendiduras intercelulares. Las celulas centrales dan origen a las celulas primitivas, en
tanto las de la periferia se aplanan y forman las celulas endoteliales que revisten los
islotes sanguineos.
La hematopoyesis hepatica se desarrolla a partir de la sexta semana hasta el
nacimiento, a pesar de que la eritropoyesis predomina se pueden empezar a detectar
celulas de la serie granulocitica y megacariocitica. La actividad del higado disminuye
gradualmente en los dos ultimos meses de la vida intrauterina y en el momento del
nacimiento solo restan ya pequenos islotes hematopoyeticos.
La hematopoyesis
esplenica se desarrolla en el mismo periodo que la hepatica aunque su contribution es
menor, ambos organos son importantes para el desarrollo de la linfopoyesis.
A partir de la onceava semana se establece la hematopoyesis medular que es el
organo hematopoyetico definitivo. Durante los dos primeros anos de vida la medula
osea activa (medula roja) se localiza en todos los huesos y gradualmente es
remplazada por tejido medular inactivo (medula amarilla o grasa). Este proceso se inicia
en la diafisis de los huesos largos y en los adultos jovenes la medula roja se localiza en
la epifisis de los huesos largos, esternon, costillas, craneo, las vertebras y pelvis. La
expansion del tejido hematopoyetico finaliza en la infancia. En situaciones de necesidad
de incremento de hematopoyesis se produce una expansion de la medula roja hacia la
medula grasa e inclusive se Neva a cabo extramedularmente como en el bazo y el
higado.
En el adulto la hematopoyesis se desarrolla en la medula osea (MO). Las celulas
hematopoyeticas hallan en la medula osea el microambiente adecuado para su
desarrollo y diferenciacion hacia las celulas maduras.
La medula osea es un tejido blando contenido en el interior de los huesos, el
tejido hematopoyetico se situa en los espacios intravasculares, donde los distintos tipos
celulares adoptan una distribution topografica muy constante en funcion de su
capacidad de desplazamiento. Asi por ejemplo, los eritroblastos tienden a acomodarse
cerca del sinusoide y se agrupan en islotes alrededor de los macrofagos, la
granulopoyesis se desarrolla en la parte mas central de los espacios intersinusoidales,
las celulas linfoides se distribuyen de manera irregular por todo el tejido hematopoyetico
y los megacariocitos se localizan en la proximidad de los sinusoides de la medula osea.
El microambiente medular engloba a un conjunto de substancias quimicas, hormonales,
diversos tipos celulares asi como otros factores menos conocidos. Ademas, interviene
en el proceso de diferenciacion celular y ofrece a la celula hematopoyetica soporte fijo y
adhesion (5, 6).
1.1.2.- Subpoblaciones Hematopoyeticas
Los progenitores
hematopoyeticos
son celulas
mononucleadas
pequenas,
agranulares, semejantes a linfocitos T, no se les encuentra en sangre periferica a gran
escala sino una por cada dos mil elementos nucleados. Como antes se comento, estas
celulas solo pueden estudiarse mediante tecnicas de cultivo in vitro asi como mediante
el marcaje de sus antigenos de diferenciacion por anticuerpos monoclonales. Gracias a
estas tecnicas actualmente se sabe que existe una celula madre o "stem" pluripotente
tambien
conocida
como
celula
CD34+CD90+,
con
capacidad
de
proliferation,
diferenciacion y autorenovacion.
La celula pluripotente estimulada por su microambiente da lugar a otras celulas
que se iran diferenciacion paulatinamente hasta que se comprometeran a las diferentes
lineas celulares existentes en
sangre periferica. A estas celulas se les denomina
unidades formadoras de colonias (UFC), ademas de las mencionadas en la section 3.1
se conocen tambien las UFC-Eo que producen eosinofilos y las UFC-Bas que dan
origen a los basofilos (Figura 1).
En estudios comparativos previos entre muestras de MO y sangre de cordon
umbilical humano (SCHU) se identificaron por citometria de flujo los inmunofenotipos de
las tres subpoblaciones principales existentes en ambas muestras: las UFC-GM
presentan el inmunofenotipo CD34+/ CD45Ra low / CD71 low, las UFC-E el CD34+/
CD45Ra low / CD71+ y las UFC-GEMM el CD34+/ CD45RA+ / CD71 low (7, 8).
yFC^GEfilM
x.
X
IS
UFC'I
/ UFC-GM
UFC-Eyeg
I
UFB-E
UFC-y
i
UFC^i
*
UFB-iieg UF&Bm UFG-Eo
UFC-1
m
ftoeritiDbiatlo UMfeteto MMobt^io
MtatoWasta Mitloblasio
LM^ato LirvfetoT LiifaoGG
t
I.
Eritrcdto
Mopoeito
Hsr
Basfiio Eosinfifilo
Neuttfftla iPiaqueta
UnteciteS LinfeciloT OnfocHoGG
Mastocito
Maaofago
Figura 1. HEMATOPOYESIS.
d e colonias.
eritrocitos,
UFB-E
monocitos,
= unidad
C T H = c e l u l a totipotencial h e m a t o p o y e t i c a . U F C = u n i d a d f o r m a d o r a
formadora
megacariocitos..
EG
de
b u r s a s eritroides.
L = linfoide.
= eritrocitos y granulocitos,
Meg
GEMM
=
granulocitos,
= megacariocitos.
M
-
monocitos. G = granulocitos. M e g = m e g a c a r i o c i t o s . B a s = basofilos. Eo = eosinofilos. LB = linfocitos B.
L T = linfocitos T . L G G = linfocitos g r a n d e s g r a n u l a r e s .
1.1.3.- Estroma Celular
El estroma celular se considera como un soporte que esta compuesto por celulas
que tienen la capacidad de unirse y formar una especie de red a la cual las celulas
hematopoyeticas se adhieren y llevan acabo sus funciones.
Junto a los efectos mediados por las citocinas, las interacciones directas de
celula-celula tienen un papel importante en la hematopoyesis medular. Las celulas del
estroma medular ejercen su action pro-hematopoyetica mediante el contacto directo
con los progenitores, junto a la action de las citocinas y de las proteinas moduladoras
de la matriz extracelular, secretadas por ellas. Si este proceso falla la hematopoyesis
tambien fracasa.
Entre las celulas del estroma celular se incluyen a los fibroblastos, las celulas
reticulares, osteoblastos, adipocitos, celulas endoteliales, celulas dendriticas y los
macrofagos.
Las celulas del estroma secretan proteinas que forman la matriz extracelular:
como la fibronectina, laminina y colagena entre las mas representativas, asi como
glucosaminoglucanos. Algunos de estos componentes, como la fibronectina y la
hemonectina, proporcionan el sustrato esencial al que se adhieren los progenitores
eritroides y mieloides durante su desarrollo.
Durante la hematopoyesis las celulas del estroma pueden actuar por action
directa de los Factores de Crecimiento (FC) localizados en su membrana celular o por
action de los FC localizados en la matriz extracelular. Estos mecanismos configuran el
concepto de pequenos microambientes anatomicos, donde se localizan FC que ejercen
una action de forma preferente hacia cada una de las lineas celulares (5, 9).
El crecimiento y maduracion de las celulas hematopoyeticas pueden ser
modulados, en parte por los factores de crecimiento, aunque no son los unicos
componentes de su regulation. Las moleculas de adhesion y las de asentamiento
pueden ser moduladas por citocinas, estas tambien tienen un papel en la determination
de las interacciones entre las celulas del estroma y las celulas hematopoyeticas.
1.1.4.- Factores de Crecimiento y Citocinas
La supervivencia, autorrenovacion, proliferation y diferenciacion de las celulas
stem
esta
controlada
por
glucoproteinas
especificas
denominadas
factores
de
crecimiento hematopoyeticos, los cuales desempenan una funcion importante para
regular la production celular sanguinea a traves de la supresion de la apoptosis o
referida tambien como muerte celular programada (10).
Como ya se comento previamente, las celulas sanguineas se originan de celulas
progenitoras pluripotenciales en la medula osea bajo la influencia de factores de
crecimiento hematopoyeticos especificos, que favorecen que las celulas stem se
autoperpetuen, proliferen y se diferencien en todos los tipos hematopoyeticos. Los
factores de crecimiento hematopoyeticos incluyen factores estimulantes de colonias
(FEC) e interleucinas (IL) estas interactuan sobre su celula bianco mediante receptores
celulares transmembrana unicos. Despues de la union del factor de crecimiento a su
receptor, su serial se envia a lo largo de la membrana celular al citoplasma y por ultimo
al nucleo. Estos factores tienden a ejercer su funcion en el microambiente de la medula
y junto con el estroma desempenan una funcion vital en la proliferation y diferenciacion
celular. Se conoce que basta un bajo nivel de receptores a los que se una el factor para
que este tenga efecto en la celula. En la Tabla 1 se muestran algunos de los factores
de crecimiento mas importantes y su funcion.
Las citocinas son proteinas solubles, polipeptidos o glicoproteinas con un peso
molecular entre 6000 y 60,000 Daltones, que trasmiten senales de una celula emisora
a otra celula receptora, la cual por lo general esta cercana de la primera, pero no
necesariamente unida a ella. Esta ultima caracteristica las hace diferentes a las
hormonas, las cuales pueden actuar en una forma sistemica porque se distribuyen por
todo el cuerpo a traves de la circulation sanguinea. En cambio, el efecto de las
citocinas generalmente es local, salvo el caso de IL-1, IL-6 y TNFa que pueden actuar a
distancia cuando son producidas en grandes cantidades por celulas no linfoides (11,12).
Los primeros estudios sobre estas proteinas comenzaron en los anos 50-70, la
etapa de los anos 70 se caracterizo por la purification parcial de muchas citocinas
individuales, se conocio que diferentes efectos estudiados eran provocados por la
misma molecula. La edad de oro de las citocinas la constituyo la decada de los 80 que
se caracterizo
individuales,
por la transfeccion genetica y la expresion de moleculas de citocinas
asi
como
la
sfntesis
de
anticuerpos
monoclonales
espetificos
neutralizadores, en este periodo nuevas citocinas salieron a la luz. Se continuo
investigando en los 90, los efectos particulares de cada citocina in vivo
(13).
Actualmente se han encontrado mas de 40 citocinas que se han agrupado en 1)
«
factores de crecimiento, 2) interleucinas, 3) interferones, 4) quimiocinas y 5) otras,
dependiendo del tipo celular que la secreta. Y de acuerdo a su action en: 1)
Mediadores de la inmunidad natural, 2) Mediadores de la actividad de los linfocitos,
crecimiento y diferenciacion, 3) Reguladores de la inflamacion inmune y 4) Citocinas
que estimulan la hematopoyesis (14).
15-20
14-30
15-19
21.5
21 - 2 8
25
8
JL-2
IL-3
IL-4
IL-5
IL-6
IL-7
IL-8
4
8q12-13
7p15
5q31
5q31
5q23-31
4q
2q
LOC.
CROM
PRODUCTORA
Monocitos, LT, fibroblastos,
celulas endoteliales, epiteliales,
queratinocitos,
hepatocitos,
condrocitos, neutrofilos.
LT,
monocitos,
fibroblastos, hepatocitos,
celulas endoteliales y
neuronales.
Celulas del estroma de medula
osea, leucocitos.
LT, celulas del epitelio timico,
queratinocitos,
celulas
del
estroma de medula osea.
LT, macrofagos, bas6filos, LB,
celulas del estroma de medula
osea, mastocitos.
LT, mastocitos
Celulas endoteliales, piteliales,
gliales y neuronales,monocitos,
macrofagos,
fibroblastos,
queratinocitos.
LT
CtLULA
BLANCO
LT, neutrofilos,
LB.
LT y B, U F C - G M , U F C - G E M M ,
UFB-E,
hepatocitos, celulas
neuronales.
LTy'B, UFC-GEMM, UFC-GM
LT y B, mastocitos.
LT
LT
Timocitos, celulas endoteliales,
hipotalamo, higado, musculo,
adipocito.
CELULA
BIOL6GICA
Estimula el crecimiento y diferenciacion de eosinbfilos
Posee efecto quimiotactico y activador de eosin6filos.
Activa
progenitores
hematopoyeticos,
induce
crecimiento y diferenciacion de LT, LB, hepatocitos y
celulas. del sistema nervioso, estimula la produccion
de proteinas de fase aguda.
Favorece la diferenciacion de L. pre B y LB. Estimula
la proliferacion y la actividad citotbxica de LT y
favorece la produccion de c6lulas Killer
Actividad quimiotactica para neutrofilos, basofilos y LT.
. Induce la adhesion de neutrofilos a celulas
endoteliales
Estimula la proliferacion y diferenciacion de LT.
Favorece la action citolitica de NK y la Produccion de
cel. LAK. Promueve la proliferacion y la secretion de
IgG, de LB activados y ayuda a la sintesis de citocinas.
Estimula la produccion y diferenciacion de macrbfagos,
neutrofilos,
eosinofilos,
basofilos,
mastocitos,
megacariocitos y eritrocitos.
Induce a la diferenciacion de Lth2, induce a la
proliferacion y diferenciacion de los LB.
Estimula la expresion de factores de crecimiento
mediante otras cel. intervienen en la inflamacion,
coagulation
ACCI6N
kDa, kilo Dalton; EPO, eritropoyetina; TPO, trombopoyetina; LOC C R O M , localization cromosomica ; FCH-G, factor de crecimiento hematopoyetico de granulocitos;
FCH-GM, factor de crecimiento hematopoyetico granulo-monocitico; FCH-M, factores de crecimiento de monocitos; LT, linfocitos T; LB , linfocitos B: U F C - E , unidades
formadoras de colonias eritroides; U F C - G E M M , unidad formadora de colonias mixtas; U F C - G M unidad formadora de colonias granulo-monciticas; UFB-E, unidad
formadora de bursas eritroides.
PESO
MOL. (kDa)
17.5
INTERLEUCINA
IL-1
Tabla 1. PRINCIPALES CARACTERISTICAS DE FACTORES DE CRECIMIENTO E INTERLEUCINAS
23
35 - 40
15
53-54
14
22 kD
18-22
45-70
IL-11
IL-12
1L-13
IL-14
1L-15
FCH-GM
FCH-G
FCH-M
4
--
--
--
--
--
-
—
--
LOC.
CROM
5q31
--
-
LT, macrofagos, neutr6filos,
eosinofilos, fibroblastos, placenta,
eel endoteliales, monocitos.
Cel endo, mono, fibroblastos,
macrofagos, neutro, LT.
Medula osea, cel del estroma
Macr6fagos, LT, eel endoteliales,
mastocitos, neutrofilos,
eosinofilos, fibroblastos.
Cel endoteliales, musculares,
placenta
LT
LT
Macrofagos, LB
Fibroblastos, trofoblastos,
macrbfagos.
LT.
LT, macrofagos, queratinocitos
CELULA P R O D U C T O R A
Cel progenitoras,
Basofilos, eosinofilos,
neutrofilos, cel endoteliales,
fibroblastos, blastos leucemicos
Monocitos
Eosinofilos, basofilos,
neutr6filos, eritrocitos, cel
progenitoras y leucemicas
LB, U F C - G E M M ,
U F C - G M , UFC-E, UFB-E,
megacariocitos, blastos leuc.
LT, NK.
UFB-E, U F C - G E M M
Lin B , monocitos
CELULA BLANCO
Promueve el crecimiento y desarrollo de macrofagos.
promueve el crecimiento y diferenciacion de cel.
"stem"
estimula todas las cel. del linajes granulocitico y a los
macrofagos
Favorece la diferenciacion y activacion de neutrofilos.
Activa Lth 1.
Estimula el crecimiento y la actividad de NK.
Inhibe la produccion de citocinas inflamatorias.
Induce el crecimiento y diferenciacion de Lb.
Induce la proliferacion y la activacion de LB en reposo.
Inhibe la secrecidn de Inmunoglobulinas
Estimula la proliferacion y diferenciacion de LT.
Favorece la action citolitica de cel NK y la producci6n
de cel. LAK
Favorece la hematopoyesis.
Inmunosupresor de la actividad del macrofago.
Promueve la proliferacion y la secretion de la Ig'G de
LB activados.
Favorece la megacariocitosis.
Estimula la sintesis de proteinas de fase aguda.
ACClON BIOL0GICA
Activacion de progenitoras primitivas.
Sinergiza con Fac. de crecimiento para estimular la
formation de colonias en las etapas tempranas de la
hematopoyesis
EPO
Rinon,
Eritrocitos
Promueve la produccion de eritrocitos, UFB-E.
TPO
Megacariocitos
Estimula la maduracion de megacariocitos.
Influye en la produccion de plaquetas.
kDa, kilo Dalton; EPO, eritropoyetina; TPO, trombopoyetina; L O C C R O M , localization cromosomica ; F C H - G , factor de crecimiento hematopoyetico de granulocitos;
FCH-GM, factor de crecimiento hematopoyetico granulo-monocitico; FCH-M, factores de crecimiento de monocitos; LT, linfocitos T; LB , linfocitos B: U F C - E , unidades
formadoras de colonias eritroides; UFC-GEMM, unidad formadora de colonias mixtas; U F C - G M unidad formadora de colonias granulo-monciticas; UFB-E, unidad
formadora de bursas eritroides
c-KIT
ligando
IL-9
IL-10
PESO
MOL. (kDa)
32 - 39
19
INTERLEUCINA
Tabla 1 (CONTINUACION)
Es muy importante senalar que recientes estudios han demostrado que el destino
que
han
de
tomar
las
celulas
progenitoras
hematopoyeticas
depende
de
la
manipulation de las citocinas y de los factores de crecimiento que estan en el medio, de
ahi la gran importancia del conocimiento de los mismos.
1.2.- ANTIGENOS DE DIFERENCIACION CELULAR EN LA HEMATOPOYESIS
Estos antigenos se encuentran en la superficie externa de la membrana de las
celulas hematopoyeticas y son especificos de acuerdo a la etapa de diferenciacion en la
que se encuentre la celula, por lo que sirven como marcadores de las mismas.
Las celulas pueden presentar mas de uno de estos antigenos. Se sabe por
ejemplo que las progenitoras mas indiferenciadas estan englobadas dentro de una
pequena poblacion medular muy heterogenea que se caracteriza por tener los
antigenos CD34 y CD90, a medida de que las celulas stem se van diferenciando hacia
celulas precursoras estas van presentando otros antigenos los cuales conformaran asi
su inmunofenotipo especifico, comentado anteriormente en la section 1.1.2.
Otros de los marcadores que podemos encontrar en la membrana de las celulas
y tambien puede formar parte de su inmunofenotipo, es el HLA (Human leukocyte
antigen). Los genes del HLA estan situados en el cromosoma 6. un conjunto de estos
genes, los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C regulan el rechazo o aceptacion de
trasplantes a traves de las proteinas HLA clase I. Esta es la base de la designation de
genes en este cromosoma como parte del HLA. La primera description de estas
proteinas de histocompatibilidad como antigenos leucocitarios humanos explica su
designation como proteina HLA.
Un seg'undo conjunto de genes de este mismo cromosoma regulan la capacidad
de respuesta inmunitaria de un individuo. Estos son los genes de respuesta inmunitaria,
los cuales determinan las proteinas de clase II productos de genes humanos DP, DQ y
DR. El gen DR tiene cuatro subgenes que codifican para peptido beta y para peptido
alfa. Es posible una considerable variation en el gen DR debido a que el peptido alfa
puede acoplarse como cualquiera de los cuatro peptidos beta. El numero total de
especificidades DP, DQ y DR todavia no se conoce por completo (5).
La diferenciacion hacia las celulas HLA+ va asociada a la perdida de CD34 y al
initio de la expresion de otros antigenos caracteristicos de estadios de diferenciacion
mas avanzados.
La Figura 2 ilustra los antigenos mas conocidos de las celulas progenitoras y
precursoras.
•f
90
34*
w123
45 R A
33
GlyC
L
/»
34
45 RA
w123
DR
Figura 2.- ANTIGENOS
DE
PROGENITORAS Y
DIFERENCIACION
PRECURSORAS.
DE
LAS
CELULAS
1.3.- ANTICUERPOS MONOCLONALES
Hace aproximadamente un siglo, Erlich (15) estudio el sistema inmune y postulo
la potencial actividad de los anticuerpos (Acs) frente al cancer, denominandolos
"magicbullets"
(balas magicas).
Los anticuerpos
monoclonales
(AcMo)
son Acs
producidos por una clona unica de celulas B, a diferencia de los Acs policlonales, los
AcMs son monoespecificos y homogeneos, siendo muy eficaces para el desarrollo de
nuevas terapias y metodos diagnosticos. En 1975, Kohler y Milstein (16) desarrollaron
la tecnica de los hibridomas, que permitio la obtencion de AcMs frente a un antigeno
(Ag) determinado en grandes cantidades. Demostraron que, aun siendo imposible
cultivar linfocitos productores de Acs (obtenidos del bazo de ratones previamente
inmunizados con el Ag) fuera del cuerpo humano, estos se podian inmortalizar
mediante la hibridacion con lineas celulares de mieloma, obteniendo los hibridomas. La
inmunizacion de ratones, primer paso en la via anteriormente descrita, actualmente ya
no es necesaria al disponer de tecnicas de inmunizacion de linfocitos o esplenocitos in
vitro, por lo cual se les concedio el Premio Nobel de Medicina y Fisiologia en 1984.
Actualmente los AcMs pueden obtenerse mediante tecnicas de ingenieria genetica (17).
1.4.- FUENTES DE CELULAS TALLO Y SUBPOBLACIONES CELULARES
La obtencion tanto de las celulas tallo como de las diferentes subpoblaciones
celulares derivadas de ellas, puede ser de tres fuentes: la medula osea, movilizandolas
de la medula osea hacia la sangre periferica (CMSP) mediante factores de crecimiento
y de la sangre de cordon umbilical humano. Es importante mencionar que en nuestro
estudio solamente utilizamos CMSP y celulas de SCHU.
1.4.1-Medula Osea
El tejido productor de la sangre localizado entre las trabeculas del hueso
esponjoso se conoce como medula osea. En el humano, este importante tejido ocupa
un volumen de 30 a 50 mL/Kg de peso corporal y esta compuesto por dos principals
compartimentos,
el
hematopoyetico
y
el
vascular,
donde
el
compartimiento
hematopoyetico es el sitio de formation y maduracion de celulas sanguineas, aqui se
encuentran tambien las celulas estromales. Las celulas hematopoyeticas son solo
residentes pasajeros de la medula y cuando maduran, se movilizan hacia los senos,
estas celulas maduras atraviesan la barrera celular endotelial del seno y al cabo del
tiempo logran llegar a la sangre periferica por medio del compartimiento vascular (5).
La medula osea esta compuesta por medula roja hematopoyeticamente activa y
la medula amarilla grasa hematopoyeticamente inactiva. La primera se encuentra
adyacente al endocito; contiene tanto precursores mieloides como eritroides, con una
relation normal mieloide: eritroide de 1.5:1 a 4:1 la medula amarilla grasa ocupa la
cavidad central, rodea los vasos sanguineos y esta compuesta por adipocitos.
La celularidad de la medula osea hematopoyetica se mide en terminos relativos
como el porcentaje de medula roja hematopoyetica de la celularidad total de la medula
osea. En los adultos aproximadamente la mitad de la medula es roja y la otra mitad es
amarilla. Por lo tanto, la celularidad normal es del 50%. Durante los primeros cuatro
anos de vida, casi todas las cavidades medulares estan compuestas por medula roja
hematopoyetica. Despues de esa edad, la medula roja en la cavidad de huesos largos
se reemplaza de manera gradual por tejido graso amarillo.
La irrigation vascular de la medula osea es proporcionada por una arteria
nutriente y una vena Jongitudinal central, la cual atraviesa el hueso a traves de la
foramina osea y abarca la cavidad medular. La arteria nutriente se ramifica y se curva
alrededor de la vena longitudinal central. Las arteriolas irradian hacia fuera, desde la
arteria nutriente hacia el endocito. Otra fuente de sangre arterial para la medula son los
capilares periostiales. Estos capilares periostiales y las ramificaciones de la arteria
nutriente forman una union con los senos venosos, en el momento en que los capilares
regresan a la medula. Los senos, delineados por celulas endoteliales unicas, se reunen
dentro de senos colectores mas amplios, los cuales entran en la vena longitudinal
central; esta vena continua a lo largo de la medula osea y sale a traves de la foramina,
donde ingresa la arteria nutriente, la vena central se conoce como vena concomitante.
Aun se desconoce el mecanismo por el cual la celula hematopoyetica madura
realiza su viaje desde los cordones hematopoyeticos mas alia de la barrera de la pared
sinusal dentro del seno ganando asi acceso hacia la sangre.
La utilization de los factores de crecimiento en combination apenas empieza a
evaluarse. La terapeutica con lnterleucina-3 (IL-3) y el factor estimulador de coloniasgranulo-monociticas (FEC-GM) produce un aumento espectacular de las celulas
progenitoras en la sangre periferica, por tanto, este podria utilizarse para aumentar las
celulas progenitoras de los pacientes despues de una quimioterapia muy intensa a altas
dosis.
El examen de la medula osea es importante en el diagnostico y la vigilancia de
una amplia variedad de trastornos hematologicos que incluyen la leucemia aguda, los
sindromes mielodisplasicos y otros trastornos proliferativos.
El aspirado de la medula osea con uso de una aguja de Jamshidi o de una aguja
de Illinois o ambas.(19 ,31,97) en el adulto y en la mayoria de los ninos, asi como la
biopsia de la medula
osea se pueden obtener facilmente de
la cresta
iliaca
posterosuperior. De manera alterna, en el adulto se puede obtener aspirado de medula
osea del esternon con el uso de la aguja de Illinois, aunque no puede obtenerse una
biopsia de medula osea de este lugar. En los ninos hay dos sitios adicionales de donde
puede obtenerse un aspirado de MO, de la tibia en los menores de dos anos de edad o
de las apofisis espinosas de los segmentos vertebrales mas prominentes (18,19).
La preparation de la medula osea para su donation en transplantes es mediante
factores de crecimiento. El uso de los factores de crecimiento logra acelerar la
recuperation de los neutrofilos en pacientes sometidos a transplante autologo o
alogenico de medula osea, con lo cual reduce la morbilidad que acompana a la
neutropenia. La eritropoyetina tambien esta bajo estudio para el tratamiento de estos
pacientes. Parece ser
que el uso clinico de factores de crecimiento hematopoyetico
permitira manipular y regular todo el sistema hematopoyetico.
1.4.2.- Celulas Movilizadas a la Sangre Periferica (CMSP)
El adulto tiene en promedio aproximadamente 3 Kg (de 1.5 a 4 Kg) de medula
osea, la cual es el organo mas grande dentro del cuerpo superando al higado tanto en
peso como en volumen. Cerca de la mitad de la medula osea es hematopoyeticamente
activa. La medula llena por completo la diafisis de los huesos largos y es divisible en
dos porciones distinguibles la medula blanca o amarilla y la medula roja.. La medula
blanca consiste en principalmente en celulas grasas y tiende a estar colocada en una
position mas central. En la medula roja los percusores de eritrocitos estan mezclados
junto con celulas
precursoras de linfocitos, granulocitos y monocitos. Los factores
estimuladores de colonias provenientes de los macrofagos, fibroblastos, linfocitos T y
otras celulas son necesarios para la maduracion y diferenciacion de estas celulas. La
actividad de 'estas sustancias fue observada por primera vez en cultivos celulares.
Estos estimulan a la medula osea para que las celulas aun en estadio inmaduro salgan
a la sangre periferica (5).
Dado que la mayoria de las formas de fracaso de la medula osea o de los
trastornos neoplasicos son trastornos de celulas madre, existe un gran interes por los
mecanismos fisiologicos que regulan la proliferacion y diferenciacion de las celulas
progenitoras. En estos procesos participan tanto factores solubles como las celulas del
estroma de la medula osea. Entre los factores de crecimiento hematopoyetico, el factor
de las celulas madre, tambien conocido como c-kit ligando, actua sobre la celula madre
progenitora. Otros como el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos
actuan sobre la CFU-GM. Debido a que se han clonado los genes de la mayoria de los
factores
de
crecimiento,
pueden
generarse
grandes
cantidades
de
proteinas
recombinantes. Algunos factores recombinanates se utilizan en la actualidad para
estimular la hematopoyesis, en este grupo se incluyen la eritropoyetina, el GM-CSF y el
G-CSF (20).
La medula osea no es solo un reservorio de celulas madre si no que proporciona
un microambiente unico en el cual tiene lugar la proliferacion y diferenciacion ordenada
de las celulas precursoras. Ademas regula la liberation de celulas completamente
diferenciadas a la circulation. La medula osea parece ser una basta red de sinusoides
de pared fina revestido de una monocapa de celulas endoteliales. Existe una membrana
basal, y celulas de la adventicia, pero forma una capa discontinua fuera del endotelio.
Entre la red de los sinusoides se situan celulas hematopoyeticas y adipositos. Las
celulas sanguineas diferenciadas entran en los sinusoides por migration transcelular a
traves de las celulas endoteliales y posteriormente pasar a la circulation general (21).
Los concentrados de CMSP y SCUH son de gran utilidad clinica debido a que
estos contienen una gran cantidad de celulas progenitoras hematopoyeticas las cuales
tienen la capacidad para diferenciarse y autoperpetuarse,
suma importancia en el campo clinico ya que
esa cualidad las hace de
incrementan la hematopoyesis en el
individuo que ha sido expuesto a una quimioterapia, asi mismo para curar desordenes
hematologicos de pacientes.
Las CMSP son obtenidas de pacientes normales mediante la aplicacion de un
factor de crecimiento el cual induce a una hematopoyesis acelerada dando como
resultado la salida de celulas en estadio inmaduro a sangre periferica, la recoleccion de
estas celulas se hace mediante aferesis de flujo continuo, obteniendo asi un paquete de
CMSP.
Los factores de crecimiento logran acelerar la estimulacion de la medula osea,
se ha utilizado la IL-3
para la insuficiencia de la medula osea, asi mismo la
eritropoyetina esta bajo estudio para el tratamiento.
La terapeutica con IL-3 y FEC producen un aumento espectacular de las celulas
progenitoras de la sangre periferica (2).
1.4 3.- Sangre de Cordon Umbilical Humano (SCUH)
La linea de reflexion entre el amnios y el ectodermo embrionario es ovalada y se
denomina anillo umbilical primitivo. En la quinta semana de desarrollo pasan por este
anillo las siguientes estructuras: a) el pediculo de fijacion que incluye a la alantoides y
los vasos umbilicales que consisten en dos arterias y una vena b) el pediculo del saco
vitelino acompanado por los vasos vitelinos y c) el conducto que comunica las
cavidades celomicas intraembrionaria y extraembrionaria.
Durante el desarrollo ulterior la cavidad amniotica crece rapidamente a expensas
de la cavidad corionica y el amnios comienza a envolver a los pediculos de fijacion y del
saco vitelino, agrupandolos y formando el cordon umbilical primitivo. En sentido distal el
cordon comprende entonces el pediculo del saco vitelino y los vasos umbilicales. En
sentido proximal incluye algunas asas intestinales y el resto de la alantoides. Estas
asas intestinales forman la llamada hernia umbilical fisiologica.
El cordon umbilical mide aproximadamente entre 30 y 60 cm de largo pero se
han llegado a encontrar algunos que miden 150 cm de longitud. Se inserta en la cara
fetal de la placenta en situation central o excentrica. Su diametro es de 1 a 1.5 cm, de
color blanquecino mate, generalmente retorcida en espiral y con pliegues en forma de
nodulos llamados Hoboken. Posee dos arterias y una vena de gran calibre que se
aprecian por transparencia, de un color azul oscuro, posee una muscular propia, que se
halla incluida en un tejido mesenquimatOso llamado Gelatina de Wharton. Entra las dos
arterias hay una anastomosis, cerca de la superficie placentaria conocida como Dyrtl.
La cubierta externa delgada y rigida que le proporciona el amnios facilita la circulation
sanguinea.
La sangre de cordon umbilical despliega las caracteristicas de la sangre fetal, la
cual provee la nutrition para el desarrollo del feto durante el embarazo. Durante los
ultimos dias de la gestation un gran numero de celulas progenitoras hematopoyeticas
estan presentes, no solo en la medula osea sino en la circulation del feto. La sangre de
cordon umbilical
despliega las caracteristicas de la sangre fetal, la cual provee la
nutrition para el desarrollo del feto durante el embarazo. Durante los ultimos dias de la
gestation un gran numero de celulas progenitoras hematopoyeticas estan presentes, no
solo en la medula osea sino en la circulation del feto (22, 23)
Hace algunos anos, los cientificos se percataron que en un sistema animal de
experimentation,
concentraciones
la
sangre
de
los
animates
recien
nacidos
contenia
altas
de celulas que al ser transplantadas eran capaces de regenerar la
hematopoyesis. Este trabajo se extendio a la sangre de cordon umbilical humano, y se
observo que las celulas de cordon tenian un potential substantial para ser utilizadas en
transplante (24)
La presencia de celulas progenitoras hematopoyeticas en la SCUH se demostro
por primera vez en los anos 70's (25) diez anos mas tarde se demostro la presencia de
celulas progenitoras hematopoyeticas primitivas. Sin embargo no fue hasta el ano de
1988 cuando Gluckman realizo el primer transplante de estas celulas de SCUH entre
hermanos HLA identicos, para tratar a uno de ellos con anemia de Fanconi (26). Desde
entonces, el conocimiento de las caracteristicas biologicas de las celulas progenitoras
en la SCUH ha aumentado y las ventajas de su utilization para el transplante son cada
vez mayores. El exito del transplante de progenitores hematopoyeticos de SCUH initio
un campo nuevo de posibilidades en el dominio de los transplantes de progenitores
hematopoyeticos alogenicos, ademas la SCUH
contiene una cantidad suficiente de
progenitores hematopoyeticos para reconstituir el comportamiento linfohematopoyetico
del receptor. La principal desventaja de esta fuente es su bajo volumen de muestra de
una unidad de SCUH. Esto ha dificultado su uso en adultos, sin embargo, la expansion
celular ex vivo y el empleo de varias unidades en un mismo receptor parece constituir
alternativas viables (27- 30).
1.5.- MICROSCOPIA DE EPIFLURESCENCIA
Se define como luminiscencia a la emision de luz que no es causada por el
aumento de temperatura del objeto que la emite. Un ejemplo es la fotoluminiscencia
que aparece en especimenes vivos o no, organicos o inorganicos que absorben la luz y
luego la emiten. Cuando esta emision persiste por un tiempo luego de interrumpir la
iluminacion, por el fenomeno es conocido como fosforescencia, termino derivado del
fosforo, elemento que presenta este fenomeno. Si la emision cesa al interrumpirse la
iluminacion, el fenomeno es conocido como fluorescencia, palabra acunada en 1852 y
que proviene de la fluorita (fluoruro de calcio, CaF2) que exhibe este fenomeno.
La microscopia de epifluorescencia se basa practicamente en un procedimiento
similar al de la microscopia optica convencional, excepto por que la luz incidente,
procedente de una lampara de gran intensidad de iluminacion, atraviesa dos o mas
series de filtros-uno intercepta la luz antes de que llegue ala muestra y el otro filtra la luz
obtenida a partir de la muestra-. El primer filtro (llamado de excitation) se selecciona
para permitir solo el paso de la luz con longitudes de onda que excitan a un
determinado fluoroforo, el segundo filtro (llamado de barrera), bloquea esta luz esta luz
y permite el paso de las longitudes de onda emitidas por el fluoroforo excitado. El
fluoroforo absorbe la luz de una determinada longitud de onda (espectro de excitation)
y la emite a otra longitud de onda mas larga (su espectro de emision), .por lo tanto,
cuando es iluminada a su longitud de onda de excitation y observada a traves de un
filtro que solo permite pasar la luz con la longitud de onda emitida, la sustancia
aparecera brillante sobre un fondo obscuro generando asi una imagen de alto
contraste. La intensidad y el color de la luz emitida son caracteristicos de la molecula
fluorescente.
Frecuentemente, la microscopia de epifluorescencia se utiliza para detectar
moleculas a las que se les ha unido quimicamente un fluoroforo. Por ejemplo, ciertos
fluoroforos pueden asociarse con anticuerpos. Lo que permite que se asocien
selectivamente a otras macromoleculas
Habitualmente,
de las celulas, tornandolas fluorescentes.
se utilizan con esta finalidad la fluoresceina, que cuando es excitada
por la luz azul emite fluorescencia amarillo-verdosa intensa y la rodamina, que cuando
>
es excitada con luz verde-amarilla emite fluorescencia de color rojo intenso. Acoplando
la fluoresceina a un anticuerpo monoclonal y la rodamina a otro, puede determinarse la
distribution de dos antigenos diferentes en la misma celula, ya que las dos marcas son
detectadas separadamente en el microscopio, cambiando las dos series de filtros de
modo de hacerlos especificos para cada fluorocromo (31). En el presente trabajo los
fluoroforos utilizados fueron la rodamina y el isotiocianato de fluoresceina (FITC) estos
fluoroforos presentan diferentes niveles de excitation y de emision (Tabla 2).
Tabla 2. FLUOROFOROS
MAS
EPIFLUORESCENCIA.
COMUNES
EN
MICROSCOPIA
DE
Fluoroforo
Excitacion
(nm)
Emision
(nm)
Fluoroforo
Excitacion
(nm)
Emision
(nm)
Fluor de Alexa
346
442
Azulcascada
372
456
lndo-1
350
405/480
BFP
380
440
Amarillo
diabolico
430
535
GFP
488
507
CFP
433/455
475/501
FITC
490
520
Naranja de
acridina
490
530/640
TRITC
541
572
Calceina
495
520
Dil
550
565
Rodamina
500
540
Fluoresceina
500
520
Verde de calcio
506
526
Cy3
552
565
YFP
513
527
Rojo Texas
596
620
Azul de Evans
550
675
Cy5
650
667
nm, nanometres.
1.6.- PLAtiTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Mayani et al (8) realizaron un estudio funcional cuantificando y caracterizando
diferentes
subpoblaciones
con
anticuerpos
especificos
por
citometna
de
flujo,
observando asi tres diferentes precursores: CD34+/ CD45RA low / CD71 low para la
serie mixta, CD34+/ CD45RA+/CD71 low para la serie mieloide y CD34+/ CD45RA low /
CD71+ para la eritroide.
Kinniburgh D et al (32) realizaron un estudio comparativo por citometna de flujo
entre SCHU y MO cuantificando la expresion de celulas CD34+ y CD34+/ CD45RA+,
encontrando un mayor porcentaje de ambas en las muestras de SCUH respecto a las
de MO.
G. Fritsch et al (33) efectuaron un estudio comparativo utilizando los marcadores
CD34+/ CD45RA+ entre las muestras de CMSP movilizadas con diferentes factores de
crecimiento, MO y SCUH, encontrando un mayor indice de estas celulas en la CMSP
versus MO y en contraste un menor numero de UFC-GM en CMSP versus SCUH.
Mayani y Lansdorp (34) realizan un estudio de celulas de SCUH en el cual
identifican diferentes antigenos para diferentes subpoblaciones hematopoyeticas y
posteriormente las expanden en un cultivo a largo plazo observando su capacidad de
expansion,
entre
las
principales
subpoblaciones
encontradas
fueron,
CD34+/
CD45RA+/ CD71 low, CD34+/CD45RA low / CD71 + y CD34+/ CD45RA low / CD71 low.
Fritsch et al (35) realizaron un estudio comparativo entre MO, CMSP y SCUH
mediante citometna de flujo con los antigenos CD34 y el CD45RA. Encontrando
diferencias cuantitativas entre las muestras, como un mayor porcentaje de CD34+
totales en MO y menor proportion de estas en CMSP y SCUH, pero un mayor
porcentaje de celulas CD34+/CD45RA+ en SCUH respecto a las de MO y CMSP.
D'Arena Giovanni et al (36) evaluaron el perfil fenotipico de los progenitores
CD34+ en SCUH en base a los antigenos CD33, CD13, CD71, CD45RA, CD117, CD14,
CD15 and CD41.
Si
bien
encontraron
un
elevado porcentaje (40%) de celulas
CD34+ CD45RA+, concluyeron que al igual que en MO y CMSP el fenotipo de celulas
CD34+ es absolutamente heterogeneo.
.Al comparar los reportes previos podemos observar resultados discordantes
\
respecto a las cantidades de las subpoblaciones hematopoyeticas entre las muestras
de SCUH y CMSP. Por tal motivo y considerando ademas que en la actualidad en
nuestro pais existe muy poca information reportada sobre el tema, en el presente
trabajo, mediante el estudio comparativo de las subpoblaciones existentes en SCUH y
CMSP pretendemos obtener datos estadisticos que puedan servir como valores de
referencia y puedan ser utilizados para futuros estudios relacionados con el tema.
2.- O B J E T I V O S
2.1.- OBTENER VALORES
DE REFERENCIA PARA LAS
CD34+, CD45RA+ Y CD71+, ASI COMO PARA
CELULAS TOTALES:
LAS SUBPOBLACIONES:
CD34+/CD45RA+, CD34+/CD71+ Y CD45RA+/CD71+ CUANTIFICADAS EN
LAS MUESTRAS DE CMSP Y SCUH.
2.2.-COMPARAR
OBTENIDOS
ESTADISTICAMENTE
EN AMBAS
LOS VALORES
DE
REFERENCIA
MUESTRAS IDENTIFICANDO ASI LA MUESTRA
MAS ADECUADA PARA FUTUROS ESTUDIOS RELACIONADOS CON LAS
SUBPOBLACIONNES HEMATOPOYETICAS.
3.- H I P O T E S I S
3.1.-EXISTE UNA
MAYOR CANTIDAD DE SUBPOBLACIONNES CELULARES
HEMATOPOYETICAS EN LAS MUESTRAS DE SCUH, COMPARADAS CON
LAS DE CMSP.
3.2.-LA SCUH ES LA OPTIMA PARA FUTUROS ESTUDIOS RELACIONADOS
CON LAS SUBPOBLACIONES HEMATOPOYETICAS
4.- M A T E R I A L E S Y M E T O D O S
4.1. - OBTENCION DE MUESTRAS
4.1.1.- Muestras de SCUH
Se emplearon un total de 60 muestras de sangre de cordon umbilical humano
de productos sanos. Las muestras fueron obtenidas del area de Ginecologia del
Hospital General Dr. Manuel Gea Gonzalez, los criterios de exclusion para las muestras
fueron:
a ) Madres no clinicamente sanas
b ) Productos no clinicamente sanos
c ) Productos no a termino de gestation
Los cordones
fueron
obtenidos
con el consentimiento
de la madre
y bajo
los
lineamientos del Comite de Etica de la Institucion.
4.1.2.- Muestras de CMSP de alodonadores.
Se emplearon un total de 15 muestras de celulas movilizadas a sangre
periferica de alodonadores. Las muestras
fueron obtenidas del Instituto Nacional de
Cancerologia bajo los criterios de la Unidad de Transplante. Este numero de muestras
se considero en base a que en el Instituto se hacen un promedio estimado de 15
transplantes al ano.
Las muestras
Institucion.
fueron obtenidas
bajo los lineamientos
del Comite
de Etica de la
4.2.- FASE DE ESTANDARIZACION
4.2.1.- Procesamiento de las muestras de SCUH
Para esta fase se emplearon 30 cordones con los cuales se estandarizo lo
siguiente:
a ) Obtencion de la SCUH: No obstante que el "metodo cerrado" (obtencion de
la sangre por medio de puncion y recoleccion en bolsas de alodonador) es
el mas citado, nosotros optamos por el "metodo de goteo" debido a que al
querer sangre exclusiva del cordon, el primer metodo no es el mas
adecuado debido a que se mezclan tanto la sangre de cordon como la
materna, mientras que por goteo se obtiene exclusivamente sangre de
cordon.
b ) Concentrado leucocitario pobre en plaquetas (buffy-coat-lp): Se estandarizo
la centrifugacion mas conveniente para la obtencion de una poblacion mas
heterogenea y un volumen mayor de leucocitos libre de plaquetas, para
obtener frotis mas adecuados.
c ) Cantidad de pL por frotis: En esta fase comparamos diferentes volumenes
(pL) de buffy-coat-lp en frotis separados para elegir el mas conveniente, de
acuerdo a la distribution celular mas adecuada en el frotis.
4.2.2.- Obtencion de la SCUH
a)
Seleccionar a la madre.
b ) Una vez que el medico extrae la placenta con el cordon pinzado se
procede a:
c)
Pinzar el cordon umbilical en la parte mas proxima a la placenta
d)
Limpiar el cordon umbilical con agua destilada y esterilizada.
e)
Seccionar el cordon por la parte mas proxima a la placenta.
f ) Extraer la sangre del cordon por gravedad y mediante goteo, depositar 4.5
ml_ de la SCUH en tubos de 13 x 100 mm con anticoagulante EDTA.
g ) Procesar la muestra en los primeros 60 min para obtener el buffy-coat-lp.
4.2.3.- Concentrado leucocitario pobre en plaquetas (buffy-coat-lp)
Este procedimiento fue necesario ya que al principio se observaba un gran
numero de plaquetas en los frotis y lo que podia alterar los resultados al propiciar un
pegado inespecifico de los anticuerpos. Nosotros quisimos mantener nuestros frotis lo
mas limpios posibles.
Procedimiento:
a)
Centrifugar la muestra de SCUH a 600 rpm por 5 min, para la obtencion del
plasma rico en plaquetas y el buffy-coat-lp.
b)
Centrifugar el plasma rico en plaquetas por 5 min a 3000 rpm
c)
Separar el plasma libre de plaquetas
d ) Tomar el buffy-coat-lp y centrifugarlo a 3000 rpm por 10 min en tubo de
Wintrobe a 2500 rpm.
e)
Lavar el buffy-coat-lp con solution de cloruro de amonio al 3% - EDTA al
0.05% para eliminar la presencia de eritrocitos.
f ) Resuspender el buffy-coat-lp en el plasma libre de plaquetas para el frotis.
g ) Realizar frotis con 12 pL de buffy-coat-lp en cubre objetos de 1 8 x 1 8 mm.
4.3.- FASE DE ANALISIS
4.3.1.- Estudio inmunofenotipico de las muestras
Se analizaron 15 muestras de CMSP y 30 de SCUH por microscopia de
epifluorescencia. Utilizando en cada caso 10 pL por frotis de anticuerpos monoclonales
marcados con FITC (BECTON-DICKSON) dirigidos contra los antigenos CD45RA y
CD71,
asi como el AcMo marcado con ficoeritrina (PE) dirigido contra el CD34. Para
identificar adecuadamente a las celulas negatives se utilizo el fluorocromo nuclear DAPI
y para controlar la fluorescencia inespecffica se utilizo la mezcla de AcMo y1-FITC / y2PE. En todos los casos se realizaron dobles marcajes, esto es, se busco identificar los
siguientes inmunofenotipos:
•
CD34+/45RA+. Para observar celulas precursoras de la serie granulocitica.
•
CD34+/CD71+.Para observar celulas precursoras de la serie eritroide.
•
CD45RA+/CD71+. Para observar celulas precursoras de la serie mixta.
Asi como sus correspondientes combinaciones negativas
4.3.2.- Procedimiento
1. - Realizar el frotis de paquete leucocitario (12 pL de muestra).
2. - Agregar 10 pL del anti-CD34-PE (primer Ac) en camara humeda por 40 min.
3. - Lavar el frotis con agua bidestilada.
4. - Agregar 10 |jL del anti-CD45RA-FITC o del anti-CD71-FITC (segundo Ac) en camara
humeda por 40 min.
5. - Lavar el frotis con agua bidestilada
6. - Agregar 0.5 pL de DAPI y dejarlo 2 H en camara humeda.
7. - Lavar el frotis y montarlo. .
8.- Leer las muestras con el microscopio de epifluorescencia con el objetivo de 100x,
contando 500 celulas / frotis en todos los casos.
5.- R E S U L T A D O S
La forma en la que se obtuvo el cordon umbilical humano asi como su
correspondiente SCUH, se ejemplifica en las Figuras 3 y 4 respectivamente.
La manera en que se concentran las celulas por aferesis de flujo continuo se
ejemplifica en la Figura 5.
Los resultados de las 30 muestras de SCUH y de las 15 de CMSP analizadas, se
muestran en las Tablas 3 a 14.
Finalmente, en la Figura 6 se muestra un caso
representative con celulas CD34+ y CD34+/CD45RA+.
A)
B)
Figura 3. CASO REPRESENTATIVO DE LA SECUENCIA DE OBTENCION DEL
CORDON UMBILICAL HUMANO.
A)
B)
Figura 4. CASO REPRESENTATIVO DE LA SECUENCIA DE OBTENCION DE LA
SANGRE DE CORDON UMBILICAL HUMANO (SCUH).
Figura 5. CASO REPRESENTATIVO DE LA FORMA EN QUE SE R E A U Z A LA
AFERESIS DE FLUJO CONTINUO.
Tabla 3. DATOS GENERALES SOBRE LAS CMSP
MUESTRA
ft
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
LEU-PRE
(x 10%L)
35.5
35.9
45.1
40.8
30.8
63.0
44.6
39.1
35.3
28.4
32.8
34.2
37.4
16.2
48.1
LEU-POS
(x 10%L)
38.2
29.9
49.8
35.9
21.1
50.1
28.9
29.2
28.2
21.0
25.5
27.1
11.3
44.5
COSECHA
(x 10 9 /L)
314
370
381
314
346
303
774
381
406
329
422
192
352
425
66
VIABILIDAD
(%)
92.7
95
97
98
98
96
100
99
100
98
96
88
VT
(mL)
60
100
60
60
58
30
60
56
55
77
58
58
70
70
9
.EU-PRE, leucocitos precosecha; LEU-POS, leucocitos postcosecha; C O S E C H A , C M S P x 10 /L movilizadas con FEC-G y
ecolectadas por aferesis de flujo continuo; VIABILIDAD, porcentaje de leucocitos vivos; V T , volumen total obtenido de la
nuestra en mililitros.
Tabla 4. DATOS GENERALES SOBRE LOS CORDONES UMBILICALES
CORDON
#
LONGITUD
(cm)
VT
(ML)
1.2.3.4.5.6.78.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.1920.21.22.2324.25.26.27.28.29.30.-
10
12
10
9
15
8
12
12
10
15
15
12
8
7
10 .
09
10
13
14
8
5
15
8
12
8
10
9
10
10
14
10
12
9
9
14
8
11
12
10
15
15
15
8
7
10
9
10
12
14
8
5
15
8
10
8
10
10
9
10
14
L O N G I T U D , longitud del cordon umbilical.
LT x 10 3 /
ML
12.6
20.1
14.1
17.2
24.5
7.48
24.5
8.37
10.4
24.5
11.7
12.2
11.3
10.5
15.3
7.68
12.8
13.2
15.9
14.5
9.90
11.8
11.4
17.4
17.3
17.4
18.0
18.2
14.1
13.4
GESTACION
(semanas)
PARTO
(N o C)
EDAD*
(anos)
40.0
40.3
37.4
38.5
39.3
38.6
38.0
40 0
38.0
40,1
41.0
39.4
38.6
38.0
40.0
41.0
41.3
40.0
41.1
40.0
41.0
40.2
41.0
38.5
38.0
39.1
40.0
38.3
40.0
41.5
N
N
N
N
C
C
C
N
C
N
N
N
N
N
C
N
C
N
N
C
N
N
N
N
C
N
N
N
N
N
19
26
37
36
15
32
38
34
21
18
26
26
19
22
32
30
30
29
38
35
35
21
19
18
20
20
23
20
18
27
VT, volumen total de S C U H obtenido por goteo;
itotales cuantificados en las muestras de SCUH;
N. normal;
LT, leucocitos
C, cesarea. * corresponde a la edad de la madre.
Tabla 5. PORCENTAJES DE LAS DIFERENTES
EN LAS MUESTRAS DE CMSP.
tA
SUBPOBLACIONES ESTUDIADAS
CD34+
CD45RA-
CD34+
CD45RA+
CD45RA+
CD34-
CD34CD45RA-
CD34+
CD71-
CD34+
CD71+
CD71+
CD34-
CD34CD71-
CD45RA+
CD71-
CD45RA+
CD71+
CD71 +
CD45RA-
0.2
0.4
0.4
0.4
0.6
0.2
0.2
0.2
0.4
0.4
0.2
0.4
0.6
0.4
0.6
0.8
0.6
1.0
0.4
0.4
0.8
0.6
0.8
0.8
0.4
0.4
0.8
1.0
0.8
0.4
82
82
83
78
81
80
80
74
73
78
80
77
84
78
80
7.0
7.0
15.6
21.2
18.0
19.0
19.2
25.0
25.8
21.2
19.4
21.8
14.4
20.8
19.0
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.2
0.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.2
0.4
0.4
0.6
0.4
0.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.2
0.4
0.4
0.6
0.8
0.4
0.4
0.6
0.4
0.8
0.4
0.4
0.4
0.6
0.6
0.4
0.4
98.8
98.2
98.4
99.0
98.8
98.6
99.0
98.6
98.8
98.8
98.8
98.6
98.4
99.2
98.8
83
81
82
77
80
80
79
73
72
77
80
78
83
77
79
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.6
0.8
0.4
0.4
0.8
0.4
0.8
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
.
CD45R
CD71
16.2
18.0
17.2
22.2
19.0
19.2
20.2
26.0
27.0
21.8
19.2
21.2
15.8
22.2
19.8
Tabla 6. PORCENTAJES DE LAS DIFERENTES SUBPOBLACIONES ESTUDIADAS
EN LAS MUESTRAS DE SCUH
•N
CD34+
CD45RA-
0.6
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
• 0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
1.2
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
1.2
1.2
0.8
0.8
0.8
CD34+
CD45RA+
1.6
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
1.6
1.21.2
1.2
1.6
0.8
1.6
0.8
0.8
1.2
0.8
1.6
1.2
1.2
0.8
1.6
0.8
1.2
1.2
1.2
1.2
0.8
1.2
0.8
CD45RA+
CD34-
92
90
88
86
90
87
91
78
91
90
90
88
84
88
88
. 86
88
84
87
90
80
84
85
89
87
90
92
89
86
88
CD34CD45RA-
CD34+
CD71-
CD34+
CD71+
CD71+
CD34-
CD34CD71-
CD45RA+
CD71-
CD45RA+
CD71+
5.8
8.4
10.4
12.4
8.4
10.6
6.6
20.4
7.0
8.0
7.6
10.6
13.6
10.4
10.4
12.0
10.8
13.6
0.6
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.6
1.0
0.4
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
1.2
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
1.2
0.6
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8 .
0.8
0.4
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
1.0
0.8
0.8
0.8
0.8
0.6
1.2
0.8
0.8
0.4
0.4
0.6
0.8
0.6
0.8
0.4
1.0
0.8
1.2
0.8
0.8
0.4
0.8
0.4
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
0.8
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.8
0.8
0.6
0.4
98.0
97.6
97.4
97.8
98.0
97.2
97.6
97.6
97.6
97.6
98.4
98.0
98.0
98.2
97.6
97.6
98.4
97.8
97.8
97.2
98.0
98.0
98.0
98.0
98.2
97.4
97.2
97.6
98.2
98.6
93
92
89
85
88
85
92
80
83
91
88
86
87
87
85
87
86
84
84
88
78
85
86
88
82
91
91
89
85
89
0.8
1.2
0.8
0.4
1.0
0.8
1.2
0.8
1.2
0.8
0.4
1.0
1.2
0.6
0.8
0.8
1.2
0.8
1.0
0.8
0.8
1.2
0.8
0.8
1.0
0.8
1.2
0.8
0.8
0.8
11.0
7.6
18.8
13.6
13.4
9.0
11.2
7.6
5.6
9.4
12.0
10.4
CD71 +
CD45RA-
0.8
0.6
0.4
0.8
0.6
0.8
0.8
0.8
0.6
0.6
0.6
0.8
.0.6
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
0.6
0.6
0.4
0.6
0.6
0.8
0.8
0.4
0.8
0.6
0.8
0.6
CD45RACD71-
5.4
6.2
9.8
13.8
10.4
13.4
6.0
18.4
15.2
7.6
11.0
12.2
11.2
12.0
13.4
11.4
12.0
14.6
14.4
10.6
20.8
13.2
12.6
10.4
16.2
7.8
7.0
9.6
12.4
9.6
Tabla 7. CANTIDAD DE LAS DIFERENTES SUBPOBLACIONES EN EL VOLUMEN TOTAL
DE SCUH DE LOS CORDONES ANALIZADOS.
*DON
#
1.2.3.4.5.-
•6.7.-
0.1.2.34.5.-
-6.7.-
89->0.-
-11.12•24-25•26.-27.-28?9 -30-
VI
<mL>
10
12
9
9
14
8
11
12
10
15
15
15
8
7
10
9
10
12
14
8
5
15
8
10
8
10
10
9
10
14
C D 4 5 R A + Total
PROMED
x 10
x !0 6
/jiL
en VT
(%)
93.7
1181
11810
92.0
1849
22188
89.4
1260
11340
86 1
1480
13320
89.9
2202
30828
86.8
649.2
5193.6
92.7
2271
24981
80.0
669.6
8035.2
84 7
880.8
8808
91.5
2241
33615
90.0
1053
15795
87.9
1072
16080
1007
89.2
8056
6482.7
882
926.1
87.3
1335
13350
87.5
672.0
6048
88.0
1126
11260
1124
13488
85.2
19264
86.6
1376
90.0
1305
10440
79.8
790.0
3950
85.9
15195
1013
983 8
86.3
7870.5
1494
14940
85 9
11840
85.6
1480
91.5
15920
1592
92.7
1668
16680
1634
89.8
14706
86 5
1219
12190
1196
16744
89.3
C D 7 1 + Total
PROMF.D
x 10*
x I0 6
/\iL
en V T
(%)
C D 3 4 + Total
PROMED
x!0J
x 106
<%)
/*iL
en VT
1.5
18.90
189.0
1.8
22.68
226.8
1.7
34.17
410.0
1.6
32.16
385.9
1.5
21.15
190.3
1.8
25.38
228.4
1.3
22 36
201.2
1.5
25.8
232.2
1.4
34.30
480.2
1.6
39.2
548.8
137.6
.
1.7
12.71
101.7
2.3
17.20
1.8
44.10
485.1
2.2
53.9
592.9
1.8
15.06
180.7
1.4
11.71
140.6
1.7
17.68
176.8
1.8
18.72
187.2
1.5
36.75
551.2
1.6
39.2
588.0
0.9
10.53
157.9
1.8
21.06
315.9
1.7
20.74
311.1
1.3
15.86
2379
1.5
16.95
1356
2.0
22.6
180.8
0.8
8.40
58.8
1.5
15.75
110.2
1.6
24 48
244 8
1.6
2448
244.8
1.6
12.28
110.5
1.8
13 8 2
124.4
1.6
20.48
204.8
1.0
12.8
128.0
1.4
18.48
221.7
2.0
26.4
316.8
1.6
25.44
356.1
1.7
27.03
3784
1.6
23.2
185.6
2.2
31.9
255.2
1.4
13.86
69.3
1.2
11.88
59.40
1.5
17.7
265.5
2.0
23.6
354.0
1.3
14.82
118.5
1.6
18.24
146 0
1.4
24 36
243.6
1.6
27.84
278.4
1.4
24.22
193 7
1.6
27.68
221.4
1.4
24.36
243.6
2.3
40.02
400.2
1.8
32.4
324 0
22
39.6
396.0
1.5
27.3
245 7
1.2
21.84
196.5
1.3
18.33
183.3
1.2
16.92
169.2
1.1
14 7 4
206 3
1.3
17.42
243.8
.
volumen total de la muestra en mililitros; PROMED, porcentaje promedio de las celulas con el inmunofenotipo indicado, obtenido
•artir de la Tabla 6;
x10 3 / pL, concentraci6n de leucocitos con el inmunofenotipo indicado, obtenida multiplicando los valores de
3MED con los de los leucocitos respectivos mostrados en la Tabla 4;
-I volumen total de la muestra.
x10 6 en VT, cantidad de c6lulas con el inmunofenotipo respectivo
Tabla 7 (CONTINUACION).
CD34+/45RA+
CD34+/CD71+
CD45RA+/CD71 +
6
3
)RDON VT CELULAS
x 10
CELULAS
x 10
x 10
x 10^ C E L U L A S
*10J
x 106
#
(%)
(mL)
/jiL
en VT
(%)
/nL
en V T
/yL
en VT
(%)
1.-
10
12
9
9
14
8
11
12
10
15
15
15
8
7
10
9
10
12
14
8
5
15
8
10
8
10
10
9
10
14
2.3.4.5.67.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.1819.2021.2223.24.25.2627.28.29.30.-
16
20.16
201.6
0 8
10 08
100 8
0.8
10.08
100.8
0.8
16 08
192.9
08
1608
192 9
1.2
2412
289 4
0 8
11.28
101.5
1.2
16 92
152.2
0.8
11.28
101.5
0.8
13 76
123 8
0.6
10.32
92.88
0.4
6.88
61.92
08
19.60
2744
0.8
1960
2744
1.0
24.50
3430
1.2
8 97
71.80
08
598
47.87
0.8
5.98
47 87
16
39 20
431.2
08
1960
215.6
1.2
29.40
323.4
1.2
10.04
120.5
0.8
669
80.35
0.8
6.69
80.35
1.2
12.48
124 8
08
8.32
83.20
1.2
12.48
124 8
08
19.60
2940
08
1960
294 0
0.8
19.60
2940
1.6
18 72
280 8
0.4
468
7020
0.4
4 68
70 20
08
9 760
146 4
0 8
9.76
146.4
1.0
1220
1830
1.6
18 08
144 6
0.8
9 04
72.32
1.2
13.56
1084
0 8
8 40
58 80
0.6
630
44.10
0.6
6 30
44.10
08
12.24
122.4
08
1224
122 4
0.8
12.24
122 4
1.2
9.21
82 94
0.8
6.14
55 29
0.8
6.14
55 29
153.6
0 8
10 24
102.4
04
5 12
51.20
1.2
15.36
1.6
21.12
2534
08
10.50
126.7
08
10.56
126.7
1.2
19.08
267.1
08
12.70
1780
1.0
15 90
222.6
92 80
1.2
17.40
139.2
10
14 50
116.0
0 8
11 60
0.8
7 920
39.60
08
792
39.60
0 8
7.92
39 60
16
18 88
2832
08
944
141.6
1.2
14 16
212.4
08
9.120
72.96
08
9.12
72 96
0 8
9.12
72.96
0.8
13.92
1392
0 8
13.90
139.2
0.8
13 92
139.2
1.2
20.76
166 0
06
1040
83 04
1.0
17.30
138 4
1.2
20 88
208 8
1.2
20 80
208.8
0.8
13 92
1392
216 0
12
21 60
216 0
08
1440
144 0
0.8
14.56
131.0
08
1450
131.0
1.2
16.92
169.2
04
5.64
0.8
10 72
150 0
0 4
5 36
volumen total de la muestra en mililitros;
•la 6,
•
1.2
21.60
0 8
14.56
131.0
56.40
0.8
11.28
1128
75.04
0.8
10.72
150 0
'
CELULAS, porcentaje de las c6lulas con el inmunofenotipo indicado, obtenido a partir de la
x10 I pL, concentracibn de leucocitos con el inmunofenotipo indicado, obtenida multiplicando los valores de CELULAS con los
DS leucocitos respectivos mostrados en la Tabla 4;
•a muestra.
x10 6 en VT, cantidad de c6lulas con el inmunofenotipo respectivo en el volumen total
0.4
0.4
0.1
• 25:0
0.2-0.6
M
X
S
CV
X ± 2S
0.8
0.7
0.2
25
0.3-1.1
CD34+/CD45RA+
0.8
0.6
1.0
0.4
0.4
0.8
0.6
0.8
0.8
0.4
0.4
0.8
1.0
0.8
0.4
-
-
-
-
-
Fa
1.0
1.0
1.4
0.8
1.0
1.0
0.8
1.0
1.2
0.8
0.6
1.2
1.6
1.2
1.0
0.4
0.4
0.1
25.0
0.2-0.6
CD34+
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.2
0.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
• 0.2
0.4
0.4
0.4
0.1
25.0
0.2 - 0.6
CD34+/CD71+
0.4
0.6
0.4
0.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.2
0.4
0.9
0.9
0.2
22.2
0.5-1.3
_
-
-
-
-
CD34+ TOT
0.9
1.0
1.1
0.7
0.9
0.9
0.7
0.8
1.0
0.8
0.7
1.0
1.3
0.8
0.9
Fb
0.8
1.0
0.8
0.6
0.8
0.8
0.6
0.6
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
0.4
0.8
ME, microscopia de epifluorescencia; CMSP, celulas movilizadas a sangre periferica; Fa, suma de los porcentajes de las celulas C D 3 4 + y CD34+/ CD45RA+
en los frotis de las muestras respectivas; Fb, suma de los porcentajes de las celulas C D 3 4 + y C D 3 4 + / C D 7 1 + en los frotis de las muestras respectivas.
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variacion.
CD34+
0.2
0.4
0.4
0.4
0.6
0.2
0.2
0.2
0.4
0.4
0.2
0.4
0.6
0.4
0.6
MUESTRA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
. 14
15
Tabla 8. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS CELULAS CD34+/CD45RA+,
CD34+/CD71 Y CD34+ TOTALES EN CMSP DE ALODONADORES.
80.0
79.3
3.0
3.9
73.1 - 8 5 . 5
83
78
81
80
80
74
73
78
80
77
84
78
80
82
82
CD45RA+
0.8
0.8
0.2
25
0.3 - 1.1
1..0
0.4
0.4
0.8
0.6
0.8
0.8
0.4
0.4
0.8
1.0
0.8
0.4
0.6
0.8
CD34+/CD45RA+
-
-
84.0
78.4
81.4
80.8
80.6
74.8
73.8
78.4
80.4
77.8
85.0
78.8
80.4
82.6
82.8
Fa
79 0
78.7
3.2
4.1
72.3 - 8 5 . 1
82
77
80
80
79
73
72
77
80
78
83
77
79
81
83
CD45+
LAS
04
05
02
40 0
0.1-0.9
- '
Fb
83.4
81.4
82.4
77.4
80.6
80.4
79.4
73.4
72.6
77.8
80.4
78.4
83.8
77.4
79.8
CD45RA+/CD71+
CD45RA+/CD71 +
CELULAS
80.1
79.6
3.1
3.9
73.4 - 85.8
CD45RA+ TOT
83.1
82.0
83.2
77.9
81.0
80.6
80.0
74.1
73.2
78.1
80.4
78.1
84.4
78.1
80.1
Y CD45RA+
Xc"lC1TCOpia
de
fP ifluorescencia ; C M S P , celulas movilizadas a sangre periferica; Fa, suma de los porcentajes de las celulas CD45RA+ y CD34+/ CD45RA+ en los
frotis de las muestras respect,vas;
Fb, suma de los porcentajes de las celulas C D 4 5 R A + y C D 4 5 R A + / C D 7 1 + en los fro^s de las muestras resDect,vas
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variacion
respect,vas.
M
X
S
CV
X±2S
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
MUESTRA
Tabla 9. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA
TOTALES EN CMSP DE ALODONADORES.
0.4
0.5
0.1
20.0
0.3 - 0.7
M
X
s
CV
X ± 2S
0.4
0.4
0.1
25.0
0.2-0.6
CD34+/CD71+
.0.4
0.6
0.4
0.2
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.2
0.4
-
-
-
-
_
Fa
0.8
1.2
1.2
0.6
0.8
1.0
0.8
1.2
0.8
0.8
0.8
1.0.
1.0
0.6
0.8
0.4
0.4
0.1
25.0
0.2-0.6
CD71+
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.5
0.2
40.0
0 . 1 - 0 . *9
CD45RA+/CD71+
0.4
0.4
0.4
0.4
0.6
0.4
0.4
0.4
0.6
0.8
0.4
0.4
0.8
0.4
0.8
_
_
Fb
0.8
1.0
0.8
0.8
1.0
0.8
0.8
1.0
1.0
1.2
0.8
0.8
1.2
0.8
1.2
0.9
0.9
0.1
11.0
0vF». 7/ - 1JL«. 1J.
CD71+ TOT
0.8
1.1
1.0
0.7
0.9
0.9
0.8
1.1
0.9
1.0
0.8
0.9
1.1
0.7
1.0
M E , microscopia de epifluorescencia; CMSP, celulas movilizadas a sangre periferica; Fa, suma de los porcentajes de las celulas CD71+ y C D 3 4 + / C D 7 1 + en los
frotis de las muestras respectivas; Fb, suma de los porcentajes de las celulas C D 7 1 + y C D 4 5 R A + / C D 7 1 + en los frotis de las muestras respectivas.
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variation.
^
CD71+
0.4
0.6
0.8
0.4
0.4
0.6
0.4
0.8 .
0.4
0.4
0.4
0.6
0.6
0.4
0.4
MUESTRA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Tabla 10. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS CELULAS CD71+TOTALES DE CMSP DE
ALODONADORES.
0.8
0.8
0.2
25.0
0.4—1.2
M
X
0.8
1.1
0.3
27.3
0.5 — 1 . 7
CD34+/CD45RA+
1.2
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
1.2
1.6
1.6
1.6
0.8
0.8
0.8
1.2
-
-
-
-
.
Fa
2.4
1.6
1.6
1.6
1.6
1.6
2.4
1.8
.2.4
2.4
2.4
1.2
1.6
1.6
2.0
0.8
0.8
0.1
12.5
0.6—1.0
CD34+
1.0
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
0.8
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
0.2
25.0
0.4 — 1 . 2
CD34+/CD71+
1.2
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
1.0
0.6
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
1.6
1.7
0.3
17.6
1.1—2.3
_
-
-
-
-
CD34+ T O T
2.3
1.6
1.6
1.6
1.6
1.8
2.2
1.6
2.0
2.0
2.0
1.0
1.6
1.6
1.7
Fb
2.2
1.6
1.6
1.6
1.6
2.0
2.0
1.4
1.6
1.6
1.6
0.8
1.6
1.6
1.4
Se seleccionaron 15 muestras al azar de S C U H para poder realizar la comparacion final (Tabla 14) con las 15 de CMSP, el numero en parentesis indica el
numero correspondiente de cordon en la Tabla 4
ME, microscopia de epifluorescencia; S C U H , sangre de cordon umbilical humano; Fa, suma de los porcentajes de las celulas CD34+ y C D 3 4 + / CD45RA+
en los frotis de las muestras respectivas; Fb, suma de los porcentajes de las celulas C D 3 4 + y C D 3 4 + / C D 7 1 + en los frotis de las muestras respectivas.
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variation.
CV
X ± 2S
s
CD34+
1.2
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
0.6
0/8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
MUESTRA
1 (26)
2 (24)
3 (28)
4 (15)
5 (10)
6 (3)
7 (20)
8 (25)
9 (7)
10 (22)
11 (13)
12 (17)
13 ( 2 )
14 (5)
15 (19)
Tabla 11. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS SUBPOBLACIONES CD34+/CD45RA+,
CD34+/CD71+ Y CD34+ TOTALES EN SCUH DE NEONATOS A TERMINO.
1.2
' 1.1
0.3
27.3
0.5-1.7
CD34+/CD45RA+
1.2
1.2
0.8
0.8
1.2
0.8
1.2
1,2
1.6
1.6
1.6
0.8
0.8
0.8
1.2
-
-
-
-
-
Fa
91.2
90.2
89.8
88.8
91.2
88.8
91.2
88.2
92.6
85.6
85.6
88.8
90.8
90.8
88.2
88
87.8
3.0
3.4
81.8-93.8
CD45RA+
91
88
89
85
91
89
88
82
92
85
87
86
92
88
84
1.0
1.0
0.2
20.0
0.6-1.4
CD45RA+/CD71+
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.0
1.0
-
-
_
Fb
91.8
88.8
89.8
85.8
91.8
89.8
88.8
83.0
93.2
86.2
88.2
87.2
93.2
89.0
85.0
89.8
89.3
2.2
2.5
84.9 - 93.7
CD45RA+ T O t
91.5
89.5
89.8
87.3
91.5
89.4
90.0
85.6
92.9
85.9
90.2
88.0
92.0
89.9
86.6
Y
Se seleccionaron 15 muestras al a z a r d e S C U H para poder realizar la comparacion final
numero correspondiente de cordon en la Tabla 4
(Tabla 14) con las 15 de CMSP, el numero en parentesis indica el
M E , microscopia de epifluorescencia; SCUH, sangre de cord6n umbilical humano; Fa, suma de los porcentajes de las celulas CD45RA+ y C D 3 4 + / CD45RA+ en los
frotis de las muestras respectivas;
Fb, suma de los porcentajes de las celulas CD45RA+ y C D 4 5 R A + / C D 7 1 + en los frotis de las muestras respectivas.
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variation.
CV
X ± 2S
x
s
89
88.3
2.1
'2.4 :
84.1 - 9 2 . 5
M
.
CD45RA+
90
89
89
88
90
88
90
87
91
84
84
88
90
90
87
MUESTRA
1 (26)
2 (24)
- 3 (28)
4 (15)
5 (10)
6 (3)
7 (20)
8 (25)
9 (7)
10 (22)
11 (13)
12 (17)
13 ( 2 )
14 (5)
15 (19)
Tabla 12. VALORES DE REFERENCIA POR ME PARA LAS SUBPOBLACIONES CD45RA+/CD71+
CD45RA+ TOTALES EN SCUH DE NEONATOS A TERMINO.
0.8
0.6
• 0.2'
33.3
0.2-1.0
0.8
0.8
0.2
25.0
0.4-1.2
CD34+/CD71+
1.2
0.8
0.8
0.8
0.8
1.2
1.0
0.6
0.8
0.8
0.8
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
0.6
0.1
16.7
0.4-0.8
.
-
-
-
-
CD71+
0.4
0.8
0.6
0.8
0.6
0.4
0.6
0.8
0.8
0.6
0.6
0.8
0.6
0.6
0.6
1.0
1.0
0.2
20.0
0.6-1.4
CD45RA+/CD71+
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
1.0
1.2
1.2
1.2
1.2
1.2
1.0
1.0
_
-
-
-
Fb
2.2
1.6
1.6
1.6
1.6
2.0
2.0
1.4
1.6
1.6 .
1.6
0.8
1.6
1.6
1.4
1.5'
1.5
0.1
6.7
1.3-1.7
CD71+ TOT
1.4
1.4
1.5
1.6
1.5
1.5
1.6
1.4
1.8
1.5
1.5
1.6
1.7
1.4
1.6
PARA LAS CELULAS CD71+ TOTALES EN SCUH
Fa
1.6
1.2
1.6
1.6
1.6
1.8
1.8
1.0
1.6
1.2
1.2
1.2
1.6
1.2
1.6
ME
M E , microscopia de epifluorescencia; SCUH, sangre de cordon umbilical humano; Fa, suma de los porcentajes de las celulas C D 7 1 + y C D 3 4 + / C D 7 1 + en los
frotis de las muestras respectivas; Fb, suma de los porcentajes de las celulas C D 7 1 + y C D 4 5 R A + / C D 7 1 + en los frotis de las muestras respectivas.
TOT, suma de los promedios de Fa y Fb; M, mediana; X, media; S, desviacion estandar; CV, coeficiente de variation.
Se seleccionaron 15 muestras al a z a r d e S C U H para poder realizar la comparacion final (Tabla 14) con las 15 de CMSP, el numero en parentesis indica el
numero correspondient'e de cordon en la Tabla 4
CV
X ± 2S
s
(26)
(24)
(28)
(15)
(10)
(3)
(20)
(25)
(7)
(22)
(13)
(17)
(2)
(5)
(19)
M
X
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
CD71+
0.4
0.4
0.8
0.8
0.8
0.6
0.8
0.4
0.8
0.4
0.4
0.8
0.8
0.4
0.8
MUESTRA
Tabla 13. VALORES DE REFERENCIA POR
DE NEONATOS A TERMINO.
0.6-1.4
20
0.2
1
1
0.2 - 0.8
40
0.2
, u r c pcriicricti: S ( T I I . sanyre de cordon umbilical humano: M. medians: X, media: S. desviacion estandar: CV, coeficiente de variation.
0.5
0.4
CD45RA+/CD71 +
0.4-1.2
25
0.2
0.8
0.8
0.2 - 0.6
25
0.1
0.4
0.4
CD34+/CD71 +
1.0-1.6
27.3
0.3
1.
1.0
0.3-1.1
28.5
0.2
0.7
0.4
CD34+/CD45RA+
1.3-1.7
7
0.1
1.5
1.5
0.7-1.1
15.5
0.I
0.9
0.9
CD71+ TOT
84.9 - 93.7
~>
2.5
89.3
84.4
72.4 - 85.8
3.8
3.1
79.6
80.1
CD45RA+ TOT
1.1-2.3
17.6
0.3
1.7
1.6
0.5-1.3
22.2
0.2
0.9
0.9
X ± 2S
c:v
X
M
CD34+ TO I
X±2S
X
M
INMUNOFKNOT1PO
CV
LAS SUBPOBLACIONES DE CMSP
SCUH
. S
DE REFERENCIA DE
CMSP
S
Tabla 14. COMPARACION FINAL DE LOS VALORES
VERSUS SCUH.
Figura 6. CASO REPRESENTATIVO DE CELULAS CD34+ (ROJA) Y
CD34+/ CD45RA+ (ROJA-VERDE) DE UNA MUESTRA DE SCUH.
6.- D I S C U S I O N Y C O N C L U S I O N E S
Se analizaron un total de 45 muestras de las cuales 30 eran de SCUH
y 15 de
CMSP. De las 30 muestras de SCUH, se presento una similitud en cuanto a la etapa de
gestacion que fue de 38 semanas a 41.5, la edad de la madre vario un poco mas
teniendo una minima de 15 anos y una maxima de 38, en cuanto al tipo de parto la
mayoria de estos fue parto normal con excepcion de 8 que fueron por cesarea, y los
mililitros de sangre obtenida vario de acuerdo a el tamano del cordon (Tabla 4).
En cuanto a las subpoblaciones estudiadas (CD34+ / CD45RA+. CD34+ / CD71+,
CD45RA+ / CD71+) . Se utilizaron estos inmunofenotipos ya que la combinacion de
estos permite identificar claramente a las subpoblaciones que son de nuestro interes
teniendo que el inmunofenotipo CD34+/CD45RA+ es caracteristico de la subpoblacion
de la serie granulo-monocitica, el CD34+/ CD71+ es caracteristico de la serie eritrocitica
y el CD34+/CD45RA+/CD71+ es caracteristico de la serie mixta, estos inmunofenotipos
ya han sido estudiados previamente y concuerdan con los resultados de nuestras
subpoblaciones estudiadas (2,8,10).
En los resultados presentados anteriormente (Tablas 8 a la 13) observamos que
en la cantidad de celulas de una sola subpoblacion (CD34+, CD45RA+ o CD71+) de
diferentes frotis de la misma muestras (SCUH o CMSP), las cantidades no variaban
considerablemente (como lo indican los CV respectivos), por lo regular siempre se
mantenia en un rango de la misma cantidad, como ejemplo estan las celulas CD34+ y
CD71 + de diferentes frotis pero de la misma muestra, donde era constante ver la
misma cantidad de celulas, no obstante tambien observamos frotis donde vario
la
cantidad de estas, pero esta variacion fue minima y por consiguiente no significativa.
En cuanto a las celulas CD45RA se observo una mayor variacion en las cantidades de
las celulas por frotis,
sin ser tampoco significativa. Ni incluso al hacer el analisis
poblacional. Por lo tanto, podemos tomar estos datos (CV respectivos) como una
medida de control interno, ya que si nuestro coeficiente de variacion entre un frotis y
otro de ia misma muestra no fue considerable,
se supone que se trabajaron las
muestras adecuada y optimamente. Situacion similar se observo en las subpoblaciones
con el doble inmunofenotipo observadas en SCUH: CD34+/CD45RA+, CD34+/CD71 + ,
CD45RA+/CD71+, ya que sus CV fueron 27.3, 20 y 25 respectivamente.
Las subpoblaciones CD34-/CD45RA+ y CD34-/CD71+, pensamos que son celulas
ya
maduras
tanto
CD45RA-/CD71-,
de
la
estirpe mieloide como eritroide.
CD34+/CD45RA-
,
CD34+/CD71-
En
cuanto
consideramos
que
a
las
estan
relacionadas entre si. De tal forma que al tomar las CD34+/CD45RA- y CD34+/CD71-,
podemos pensar que el resto eran celulas CD45RA + leucocitos, CD71 + eritrocitos o
ambas y en le caso de las CD45RA- / CD71- que estaban presentes podemos pensar
que el resto eran celulas CD34+.
Posteriormente apareamos 15 muestras de SCUH escogidas al azar, con las 15 de
CMSP, con el fin de obtener los valores de referenda en ambas muestras con su
respectivo analisis estadistico. Asi, observamos que al comparar la cantidad de celulas
CD34+ totales en ambas muestras se encontro una mayor cantidad de estas en las
muestras de SCUH que en las de CMSP (Tabla 14). Siendo casi del doble, este dato es
muy significativo y de importancia, ya que como diversos autores han mostrado (1-8),
las celulas CD34+ totales son las que potencialmente dan origen a las subpoblaciones.
En cuanto a las celulas CD45RA+ totales los valores obtenidos para las SCUH
fueron de 84.9 - 93.7% (Tabla 12) y para CMSP fueron tambien menores 73.4 - 85.8%
(Tabla 9). Por io que se vuelve a observar lo que antes se discutio para ios valores de
las celulas CD34+. El porcentaje en las celulas CD71+ totales fue mayor tambien en
SCUH, 1.3 -1.7% (Tabla 13) que en CMSP 0.7 - 1.1%. (Tabla 10). Asi mismo tambien
observamos
la
misma
situacion
con
los
valores
de
las
subpoblaciones
CD34+/CD45RA+, CD34+/CD71+ y CD45RA+/CD71+, encontrado siempre mayores
porcentajes en las muestras de SCUH respecto a las de CMSP. Asi, en
la
subpoblacion CD34+/CD45RA+ el valor para SCUH fue de 0.5-1.7% (Tabla 11) y para
CMSP fue de 0.3 - 1.1% (Tabla 8). Para la subpoblacion CD34+/CD71 de SCUH el
valor fue de 0.4 - 1.2% (Tabla 11) significativamente mayor que el mostrado en las
CMSP, 0.2 - 0.6% (Tabla 8). Finalmente en la subpoblacion CD45RA+/CD71+ el valor
obtenido fue para la SCUH de 0.6 - 1.4% (Tabla 12) comparado con el valor de CMSP
que fue de 0.1 - 0.9% (Tabla 9) observando tambien un menor valor de estas.
Como se observo a io largo de este estudio comparativo, las subpoblaciones
hematopoyeticas varian en cuanto a porcentajes como a cantidad total de un tipo de
muestra a otra, siendo ambos parametros siempre mayores en las muestras de SCUH,
lo que la hace una fuente muy importante para obtener celulas CD34+ para transplantes
hematopoyeticos alogenicos.
Al confrontar nuestros resultados aqui presentados con los realizados por otros
autores, observamos que en la gran mayoria de los casos coinciden (32-35) y en
algunos no (36). Sin embargo, en los casos donde coinciden las cantidades de celulas
totales o de subpoblaciones no son similares, pensamos que esto puede depender
posiblemente de varios factores, como por ejemplo:
•
La metodologia para obtener las celulas precursoras,
•
El procesamiento de las muestras,
•
La metodologia para analizar las muestras.
Aunque cabe senalar que ninguno de estos autores enfocaron sus estudios a la
obtencion de valores de referenda, por lo que su numero de muestras con el que
trabajaron no fue estadisticamente significativo.
Nuestro estudio es el primero que muestra y aporta valores de referencia para las
diferentes subpoblaciones estudiadas tanto para muestras de SCUH como para
muestras de CMSP, que si bien fueron obtenidos por microscopia de epifluorescencia,
marcan la pauta para conocer datos estadisticamente significativos en futuros estudios
relacionados con el tema.
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