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XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
“Evaluación de la participación del canal catiónico TRPV4 en la
diferenciación de células epiteliales”
Vidal López Eva María, Universidad de Sonora, [email protected], Asesora Dra. María del
Refugio García Villegas, Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias CINVESTAVIPN [email protected].
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La familia de canales catiónicos TRP forman parte del grupo de proteínas que
confieren termosensación. Uno de estos canales el TRPV4 participa en la
transportación de calcio y está ligado a la transducción del dolor. En este proyecto
se ha estudiado la participación y comportamiento de este canal catiónico en la
diferenciación de células y se ha observado que durante las primeras 24 horas de
su cultivo de la línea celular MDCK, este canal se presenta en el núcleo y después
sale para posicionarse en la membrana, lo cual ha dado origen a una de las
preguntas de este proyecto, ¿Qué hace en el núcleo?
METODOLOGIA
Previamente en el laboratorio ya se habían hecho estudios para localizar las
secuencias correspondientes a las regiones transmembranales del canal y de
igual forma se ha encontrado una señal de localización nuclear (NLS) en el
dominio amino citoplasmático del TRPV4. Se cuenta ya con una construcción del
canal TRPV4 en donde el dominio amino del canal tiene mutada la NLS, por lo que
la estrategia a seguir es clonar solamente la región amino citoplasmática del canal
TRPV4 mutado (MutNLS) en el vector pEYFP N1, el cual contiene la secuencia
de la proteína amarilla fluorescente para hacer una proteína de fusión y evidenciar
si la señal NLS del dominio amino es la encargada de dirigir al canal del núcleo
celular. Durante mi estancia lo que hice fue una amplificación por PCR del
fragmento amino citoplasmático de TRPV4 mutado y su clonación en el vector
pGEM-T easy. El fragmento de PCR se amplifico, se limpió, se le agregaron
adeninas en los extremos, se ligó en el vector pGEM-T easy y se transformó en
las bacterias competentes. Después se intentará fusionar este fragmento con la
proteína amarilla fluorescente NV4-EYFP. Por lo tanto lo que seguiría seria
secuenciarlo para corroborar la construcción, luego se deberá transfectar en la
línea celular NG108-15 para localizar el fragmento de TRPV4 usando microscopia
de epifluorescencia, lo que se espera es que esta proteína de fusión no se
encuentre en el núcleo ya que se trabajó con la NLS mutada, si esto ocurre
confirmaría que la NLS del canal silvestre es la responsable de enviar al canal al
núcleo celular.
CONCLUSIONES
Podemos decir que hasta lo que va del proyecto que es la clonación del
fragmento de PCR del fragmento amino del canal TRPV4 se está haciendo la
digestión del plásmido para ver si la construcción es correcta en el pGEM-T easy,
solo faltaría proseguir con el siguiente paso que sería intentar fusionar ese
fragmento con la proteína amarilla fluorescente EYFP NV4-EYFP.
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Pacífico
Agosto 2014