universidad de valencia facultad de ciencias biologicas

UNIVERSIDAD
FACULTAD
"ACTIVIDAD
J AS
DE
DE
AMILOLITICA
NARANJO
ton-Navel),
EN
DE
VALENCIA
CIENCIAS
BIOLOGICAS
Y MOVILIZACION
( C i t r u s s i n e n sis
RELACION
CON
LA
L.
DEL
ALMIDON
Osbeck,
cv.
EN
HO­
Washing-
FRUCTIFICACION.
por
M.
Licenciada
Memoria
cias
Firma
presentada
Biológicas
de
la
por
AMPARO
SANZ
GRAU
en C i e n c i a s
para
optar
Biológicas.
al' G r a d o
la U n i v e r s i d a d
autora
de
Ejemplar
tor
drático
Tesis:
Valencia,
Direc­
Prof.Dr.D.
Bárcena,
del
XVIII,
Valencia
Marzo
el
Guardiola
grupo
lo<-ía V e g e t a l " ,
de
por
1984.
de
Jo­
Cat
"F i s i
ol
Luis
Cien­
Valencia.
revisado
la
en
o|
sé
de
de D o c t o r
la E . T . S . I . A
UMI Number: U607628
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UMI U607628
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Ann Arbor, MI 48106-1346
A G R A D E C IM IE N T O S
Deseo e x p re s a r mi g ra titu d al D ir e c to r del presente tra b a jo ,
re a liz a d o en la C á te d ra de F is io lo g ía Vegetal de la E sc u e la T é cn ic a Supe
r io r de In g e n ie ro s Agrónomos de V a le n c ia , D r . D . José Luis G u ard io la
—
B a rc e n a , por su constante o rien tació n y ayuda durante el curso del mismo.
Q u iero a g ra d e c e r también a la D r . D ña. E s th e r Simón M a rtín e z
C a te d rá tic a de F is io lo g ía Vegetal de la F a cu ltad de C ie n c ia s B io ló g ic a s , el
haberme fa c ilita d o el c o m p a tib iliza r mi tra b a jo como P ro fe s o ra Ayudante de
C lases P rá c tic a s en la Facu ltad de C ien cias B io ló g icas con la re a liz a c ió n
de este estudio en la E . T . S . I . A .
Asimismo q u iero h acer extensivo este agradecim iento a los miem
bros de las dos C á te d ras por la desinteresada c o lab o ració n p restada en todo
momento. Deseo h acer constar mi reconocim iento especial a la D r a .
Consuelo
D ña. -
M o n e rri Huguet con la que he com partido muchos tra b a jo s de labo
r a to rio y discutido re s u lta d o s , a D . José G onzález F e r r e r por su inestim a­
ble colaboración en numerosos m uéstreos y a n á lis is y a la D r a . D ñ a .
Is a ­
bel P ic a zo G onzález por su ayuda en la re a liz a c ió n de las fo to g ra fía s .
También deseo m encionar p a rtic u la rm e n te a D . Manuel S e r r a
-
G alindo por su o rien tac ió n en los a n á lis is e stad ístico s y a D ña. F ra n c is c a
V ila S anz por su constante a lie n to y ánimo, así como a mi fa m ilia p o r la com prensión y el apoyo o frecido s p ara lle v a r a térm ino este tra b a jo .
F in a lm e n te , mi agradecim iento a todas las c o o p erativas y p ro p ie
ta rio s de p a rc e la s en las que se han llevado a cabo los exp erim en to s. M ere
cen especial mención D . Joaquín L lu s a r, de A lm e n a ra , y el
co A g ríc o la de la Sociedad de E xp o rtación
rique F o n t.
In g e n ie ro Técni
IN V IC T O de V i ll a r r e a l ,
D . En­
J_ N
I.
D
I_
IN T R O D U C C IO N
7
1. 1 . - LOS C A R B O H ID R A T O S E N LAS P L A N T A S
PERENNES
8
1 . 1 . 1 . - V A R IA C IO N E S E S T A C IO N A L E S
8
I . 1 . 2 . - C A M B IO S P R O V O C A D O S POR LA
P R E S E N C IA DE S U M ID E R O S A C ­
T IV O S
10
1 . 1 . 3 . - V A R IA C IO N E S D U R A N T E LA S E ­
N E S C E N C IA
12
1 . 2 . - C A R B O H ID R A T O S E N C IT R IC O S
14-
I . 3 . - V IA S D E G R A D A T IV A S DEL A L M ID O N
18
- 1. 3 . 1 . — G E N E R A L ID A D E S
18
I . 3 . 1 . 1 . - V IA F O S F O R O L IT IC A
21
1 . 3 . 1 . 2 . - V IA A M IL O L I T IC A
22
1 .3 .2 .-
IM P O R T A N C IA DE LAS DO S V IA S
26
I . 3 . 2 . 1 . - M O V IL IZ A C IO N DEL A L M I­
DON E N S E M IL L A S Y F R U T O S
26
1. 3 . 2 . 2 . - M O V IL IZ A C IO N DEL A L M I­
DON EN H O JA S
27
1. 3 . 3 . - C A R A C T E R IZ A C IO N DE LAS A M ILA S A S
I . 4 . - O B J E T IV O S DEL TR A B A JO
31
34
-2 -
M ATER I ALES
Y
M E T O D O S .-
36
i I’. 1 . - M A T E R IA L V E G E T A L Y D IS E Ñ O E X P E R I­
M ENTAL
I I . 1 .1 .-
37
IN D U C C IO N DE LA S E N E S C E N C IA -
37
1 1 .1 . 2 . - V A R IA C IO N E S T A C IO N A L DE LA AC
T IV ID A D A M IL O L IT IC A Y DEL C O N ­
T E N ID O E N C A R B O H ID R A T O S
1 1 .1 . 3 . -
38
IN F L U E N C IA DE LA F R U C T I F I C A ­
C IO N S O B R E LA A C T IV ID A D A M IL O
L I T I C A Y EL C O N T E N ID O E N C A R ­
B O H ID R A T O S
I I . 2 . - E S T IM A C IO N CE LA A C T IV ID A D A M IL O L I T IC A
40
42
1 1 . 2 . 1 . - O B T E N C IO N DEL E X T R A C T O E N Z IM A
T IC O
42
1 1 .2 . 2 . - D E T E R M IN A C IO N DE LA A C T IV ID A D
42
I I . 2 . 2 . 1 D E T E R M IN A C IO N C U A N T IT A ­
T IV A
42
1 1 .2 . 2 . 2 . - C R O M A T O G R A F IA DE E X C LU
S IO N MOLECULAR
43
1 1 .2 . 2 . 3 . - E L E C T R O F O R E S IS E N G E L E S
L A M IN A R E S DE P O L IA C R IL AM I DA
44
A . - P re p a ra c ió n de los geles
44
B . - E le c tro fo re s is
46
C .-
46
Incubación de los geles
D . - Tinción y fija c ió n de los geles
46
-3 -
E . - F o to g ra fía
47
F . - Secado delos geles
47
I I . 2 . 3 . - E S T IM A C IO N
IN D E P E N D IE N T E DE LAS
A C T IV ID A D E S A L F A - Y B E TA -A M ILO LJ_
T IC A S
1 1 .2 .3 .1 .-
48
IN A C T IV A C IO N CON CLORURO
M E R C U R IC O
1 1 .2 . 3 . 2 . -
IN A C T IV A C IO N POR E L IM IN A ­
C IO N -D E
1 1 .2 . 3 . 3 . -
48
IO N E S C A L C IO
IN A C T IV A C IO N
T E R M IC A
I I . 3 . - D E T E R M IN A C IO N E S A N A L IT IC A S
50
50
53
I 1 . 3 . 1 . - C L O R O F IL A
53
I 1. 3 . 2 . -
54
C A R B O H ID R A T O S
1 1 . 3 . 2 . 1 . - E X T R A C C IO N DE LAS M U E S ­
TRAS
54
A . - A zú c a re s
54
B . - Alm idón
55
1 1 .3 . 2 . 2 . - A N A L IS IS
DE LOS E X T R A C T O S
55
A . - A zú c a re s re d u cto res
55
B . - A zú c a re s solubles y almidón
56
| | . 4 . - A N A L IS IS
E S T A D IS T IC O S
58
-4 -
I I I . - R E S U L T A D O S
59
1 1 1 . 1 . - C A R A C T E R IZ A C IO N DE LA A C T IV ID A D E N Z IM A T IC A
III.
60
1 .1 . - E X TR A C TO S CRUDOS
I I I . 1 . 1 . 1 . - E S T IM A C IO N
60
IN D E P E N D IE N T E
DE LAS D I S T I N T A S A C T IV ID A
D E S A M IL O L I T IC A S
69
A .-
In a ctiv a ció n por c lo ru ro m e rcú ric o
69
B .-
In a ctiv a ció n té rm ica
71
C .-
In a c tiv a c ió n p o r secuestro de iones
c a lc io
I I 1 . 1 . 2 . - E X T R A C T O S S E M IP U R IF IC A D O S
71
POR
C R O M A T O G R A F IA DE E X C L U S IO N MO
LE C U LA R
I I 1 . 1 . 2 . 1 . - S E P A R A C IO N DE LAS E N Z IM A S
77
77
I I 1 . 1 . 2 . 2 . - C A R A C T E R IZ A C IO N DE LAS F R A C C IO N E S E N Z IM A T IC A S
80
A . - F ra c c ió n enzim ática 1
80
B . - F ra c c ió n enzim ática 2
87
I I 1 . 1 . 3 . - E N Z IM A S S E P A R A D A S PO R E L E C T R O
F O R E S IS E N G E L E S DE P O L IA C R IL A M ID A
I I 1 . 1 . 3 . 1 . - S E P A R A C IO N DE LAS E N Z IM A S
91
91
-5 -
1 1 1 . 1 . 3 . 2 . - C A R A C T E R IZ A C IO N DE LAS BAN
A .-
D A S D E A C T IV ID A D A M IL O L IT IC A
94
In a ctiv a ció n p o r in h ib id o res s ele ctivo s
94
B . - E le c tro fo re s is de las fra c c c io n e s e ro
m atográficas
I I 1 . 1 . 3 . 3 . - A M IL O F O S F O R IL A S A S
I I I . 2 . - V A R IA C IO N E S D U R A N T E EL D E S A R R O LLO
95
123
128
1.1 1 .2 . 1 . - V A R IA C IO N E S T A C IO N A L DEL C O N T E N J
DO E N C A R B O H ID R A T O S
128
I I 1. 2 . 1 . 1 . - A L M ID O N
134
I I 1 .2 .1 .2 .- AZUCARES
138
I I 1 . 2 . 1 . 3 . - C A R B O H ID R A T O S T O T A L E S
147
I I 1 . 2 . 2 . - V A R IA C IO N E S T A C IO N A L DE LA A C T I ­
V ID A D A M IL O L IT IC A
II 1 .2 .3 .-
152
IN F L U E N C IA DEL F R U T O S O B R E LA MO
V IL IZ A C IO N DE LOS C A R B O H ID R A T O S
Y LA A C T IV ID A D A M IL O L IT IC A
I I I . 3 . . - V A R IA C IO N E S D U R A N T E LA S E N E S C E N C IA
161
174
I I 1. 3 . 1 C O M P O R T A M IE N T O DE LAS H O JA S S E
P A R A D A S DE LA P L A N T A
174
I I 1. 3 . 2 . - C A M B IO S E N EL C O N T E N ID O E N C A R
B O H ID R A T O S
177
I I 1. 3 . 3 . - C A M B IO S EN LA A C T IV ID A D A M IL O L IT IC A
188
-6 -
IV.-
DISCUSION
A .-- N A T U R A L E Z A
192
Q U IM IC A DE
B . - D IS P O N IB IL ID A D
LAS R E S E R V A S
DE LOS C A R B O H ID R A T O S
195
198
C . - R E L A C IO N DE LOS C A R B O H ID R A T O S CON
LA F R U C T IF IC A C IO N
200
D . - C O N TR O L DE LA M O V IL IZ A C IO N Y D I S T R I ­
B U C IO N DE LOS C A R B O H ID R A T O S E N LA
PLANTA
206
E . - A S P E C T O S M E T A B O L IC O S DE LA M O V IL I­
Z A C IO N D EL A L M ID O N
211
V .- C O N C L U S I O N E S
216
V I . -
220
BIBLIOGRAFIA
in tro du c c ió n
-8 -
I . 1. -
LOS
CARBOHIDRATOS
EN
LAS
PLANTAS
PERENNES.-
1 . 1 . 1 . - V A R IA C IO N E S E S T A C IO N A L E S .-
En las plantas perennes el exceso de productos fotoasím llados du­
ra n te las épocas de menor consumo es almacenado en d is tin ta s p a rte s de la p la n ta . La acumulación de carb o h id ra to s y su dism inución en la planta re fle ja n
v a ria c io n e s de la demanda p ara el crecim ien to vegetativo y re p ro d u c tiv o . Los
a rb o le s que c rec e n mediante brotaciones interm itentes u tiliz a n d iv e rs a s c a n ti­
dades de c arb o h id ra to s en cada una de e lla s y a menudo m uestran v a rio s mí­
nimos y máximos en el contenido de las re s e rv a s (K o zlow ski y K e lle r , 1966).
V a ria c io n e s estacionales del contenido de d iv ers o s c a rb o h id ra to s han sido ca
ra c te riz a d a s en una am plia v arie d ad de plantas leñ o sas, incluyendo especies
fo r e s ta le s , fr u ta le s , árb o les tro p ic a le s y s u b tro p ic a le s , vides y arbustos (r e
v isió n de K ozlow ski y K e lle r , 1966).
En las plantas c ad u cifo lias es obvia la necesidad de la acumula­
ción de re s e rv a s durante el otoño, previam ente a ía abscisión de las h o ja s,
dado que el com ienzo del c recim ien to en p rim a v e ra d eb erá depender en gran
medida de estas re s e rv a s hasta que las hojas re c ié n form adas provean al á r ­
bol de nuevos fotoasim ilados. En la m ayoría de estos á rb o le s las re s e rv a s de
c arb o h id ra to s son máximas durante la p rim a v e ra y disminuyen de form a abrug>
ta durante el crecim ien to que se da en esta época del año, alcanzándose los
v a lo re s mínimos durante el periodo de crecim iento vig oroso de las hojas (fina_
les de p rim a v e ra , p rin c ip io s de v e ra n o ). P o s te rio rm e n te se produce una recu
p erac ió n de las re s e rv a s hasta a lc a n za rs e un nuevo máximo en otoño, p re vio
a la caída de las hojas y , fin a lm en te, ap arece un mínimo de almidón (p ero no
de a zú ca re s solubles) durante el in v ie rn o (S im in o vitch et a l . , 1953; S a u te r ,
1966; K ozlow ski y K e lle r , 1966;. W o rle y,
1979).
-9 -
Muchas plantas p e re n n ifo lia s de las zonas tem pladas presentan un
modelo de c recim ien to s im ila r al de las c a d u c ifo lia s , con una fase p rin c ip a l
de c rec im ie n to en p rim a v e ra . D urante esta época se u tiliz a n grandes cantida
des de c arb o h id ra to s y elementos n u tr itiv o s , prin cip alm en te componentes n itro
genados (M eyer y S p litts to e s s e r, 1971) y aunque estos á rb o les podrían no r e ­
q u e r ir re s e rv a s de c arb o h id rato s como las plantas c ad u cifo lias debido a que
poseen la capacidad de r e a liz a r la fo to s ín te s is , K ozlow ski y K e lle r señalan
en su re v is ió n de 1966 que d iverso s a u to res han d e s c rito una p érd id a neta de
CO^ du rante el comienzo del periodo de c re c im ie n to , indicando que los carbo
h id ra to s de re s e rv a también son indispensables en esta fase del c ic lo v ita l de las plantas p e re n n ifo lia s .
La acumulación de las re s e rv a s com ienza en los puntos más a le ­
jados de los lugares de producción - la s h o ja s - p a ra a c e rc a rs e poco a poco
a ésto s. La m ovilizació n sé produce en sentido in v ers o al de alm acenam iento,
es d e c ir , se in ic ia en los lugares más cercanos al punto de u tiliz a c ió n y pro
g resa basipetalm ente hacia las ra íc e s (K o zlo w ski y K e lle r , 1966; Zim m erm ann,
1 97 4 ), po r lo cual las v a ria c io n e s estacionales del contenido en c arb o h id ra to s
de las ra íc e s pueden e s ta r ligeram ente desplazadas en el tiempo con re sp e c ­
to a la p a rte a ére a (Zim m erm ann, 1974).
En los árboles fru ta le s la u tiliz a c ió n de las re s e rv a s está muy re la c io n ad a también con el c rec im ie n to del fruto.~ G rochowska (1973) indica que
en el manzano el mínimo contenido en almidón se p resenta unas cinco semanas
después de la flo ra c ió n , y en el a lb a ric o q u e , Bennett (1924) encuentra los ni^
v eles mínimos en el mes de M ayo, manteniéndose estos v a lo re s hasta el mes
de A gosto, durante el que se in ic ia una re c u p e ra c ió n , alcanzándose la acumu
lación máxima en el otoño.
La recuperación del contenido en c arb o h id ra to s se produce en la
m ayoría de los árboles antes de que se agoten las re s e rv a s acum uladas, v o l­
viendo a in ic ia rs e el c ic lo de acum ulación tra s el c rec im ie n to del fr u to .
-1 0 -
1 .1 .2 .-
CAMBIOS
PROVOCADOS
SUMIDEROS
POR
LA
PRESENCIA
DE
A C T IV O S .-
La p re se n c ia de sum ideros activos (b ro tes en c re c im ie n to , fru to s
en d e s a rro llo ) provoca m odificaciones de la activid ad m etabólica de la fuente
de elementos n u tritiv o s . A s í, el índice fotosin tético puede v e rs e m odificado p or la p re se n c ia de fru to s en la p la n ta , habiéndose d e s c rito un descenso de la fo to sín te s is en d iv e rs a s especies ai e lim in a r los fr u to s , como en C itru s ma
d u ren sis y Solanum melongena
(L e n z,
1978), manzano (M onselise y L e n z, 1980)
o soja (Mondal et a l . , 1978). Thorne y K o lle r (1974) señalan que en s o ja , al
aum entar la p roporción de órganos que no fo to s in te tiza n ,
iluminando una sola
hoja de la p la n ta , se produce ün increm ento del índice fo to s in té tic o . E sta co­
rre la c ió n e n tre la fo to sín tesis y el tra n s p o rte de asim ilados hacia los sumide­
ros puede s e r m odificada por la degradación de los c a rb o h id ra to s acumulados
con a n te rio rid a d al aumento de la demanda en la planta (M o o rb y, 1 97 7 ), produ
ciéndose en algunos casos mayor tra n s p o rte de c arb o h id ra to s de los que se fo to s in te tiza n en esos momentos.
La e xisten cia de sum ideros potentes de elem entos hidrocarbonados
puede d e te rm in a r una fu e rte competencia e n tre los mism os. C ra n e et a l. (1972)
señalan que en P is ta c ia v e ra
la p resen cia de fru to en el árbol cuando se es
tan d e s a rro lla n d o las yemas flo ra le s produce la caída de é s ta s ,
lo cual se im
pide m ediante Ja elim inación de los fru to s o bien por a n illa d o de las ram as en
tr e fru to s y yem as. E ste mismo equipo de in vestigadores (C ra n e et a l . ,
1973)
com probaron la necesidad de la p re se n c ia de las hojas en las ramas p a ra evi_
ta r la abscisión de las yemas flo ra le s aún en el caso de que no se mantengan
los fru to s en el á rb o l. E stos tra b a jo s indican la e xis te n cia de una competen­
cia po r algún compuesto producido por las hojas y tra n s p o rta d o vía flo em a, presum iblem ente fo to as im ila d o s , aunque en un estudio p o s te rio r (C ra n e et a l . ,
1976) no pudieron dem ostrar d ife re n c ia s en el contenido en almidón e n tre r a -
-li­
mas con y sin fru to . En la in te rp re ta c ió n de este últim o resultado hay que te­
n e r en cuenta que el grado de autonomía e n tre las d is tin ta s ram as de un árbol
depende de la v a rie d a d (M onselise y G oldschm idt,
1982) y que en P is ta c ia v e ra
los mismos au tores d etectaro n movimiento de m etabolitos e n tre ram as vecinas
(C ra n e et a l . ,
197 3 ). Que se establece una competencia por los carb o h id rato s
14
ha sido puesto de m anifiesto mediante la u tiliz a c ió n de
C , observándose que
las yemas flo ra le s de á rb o le s sin fru to acumulan el doble de c arb o h id ra to s -
m arcados que las de á rb o les con fru to s (Takeda et a l . , 1980).
De todo e llo p a rec e desprenderse que la competencia p o r los c a£
b ohidratos es de gran im portancia en determ inados momentos del c ic lo de desa
r r o llo y puede lle g a r a s e r la causa de la abscisión de e s tru c tu ra s rep ro d u c­
tiv a s ,
lim itando a sí la producción final de los á rb o le s .
-1 2 -
1 .1 .3 .-
VARIACIONES
DURANTE
LA
S E N E S C E N C IA .-
D u ran te la senescencia de las hojas se producen una s e r ie de cambios m etabólicos. Aunque se ha d e s c rito en algún caso (Thomas y S toddart
1975) que la senescencia fo lia r puede no e s ta r asociada necesariam ente a la
p érd id a de c lo r o fila ,
la dism inución del contenido de este pigm ento, junto a la
p érd id a de p ro teín as y A R N durante el envejecim iento es un hecho ampliamen­
te reconocido y que se u tiliz a de form a general como un indicador de la senes
cencía (re v is ió n de Thomas y S to d d a rt,
1980). D u ran te este proceso se produ
ce también la salid a de m etabolitos d e - las hojas senescentes hacia o tra s regio
nes de la p la n ta . Numerosos autores han d e s c rito la disminución de c arb o h id ra
tos al mismo tiempo que desciende la cantidad de c lo ro fila en hojas o discos
de hojas de d iv e rs a s especies en las que se ha inducido la senescencia a r t i ­
fic ialm e n te separándolas de la p la n ta .
B e e ve rs (1967) trabajando con Tropaeolum majus bajo un régim en
de 12 horas de ilum inación, y Kao (1981) con segmentos de hojas de a r r o z a
la o s c u rid a d , señalan que se produce un rápid o descenso del contenido de azú
c a re s solubles en los p rim ero s días de perm anencia en el in v e rn a d e ro . P o r el
c o n tr a r io , S te w a rt (1971) indica que en hojas de judía en la oscuridad la can
tidad de a zú ca re s perm anece constante durante las p rim e ra s 24 h o ra s , mien­
tra s que el almidón disminuye en a lre d e d o r de un 7 0 % sobre el contenido im
c ia l.
D w ivedi y M ishra (1979) también describen un descenso de almidón en ho
ja s de a r r o z (a lre d e d o r del 40 % en 72 h o ra s ), destacando el increm ento en
a zú c a re s red u cto res que se produce en las p rim e ra s 24 horas p a ra d is m in u ir
p o s te rio rm e n te por debajo del v a lo r in ic ia l. E ste mismo hecho ha sido d e s c rito
p or Thim ann et a l. (1974) y T e tle y y Thimann (1974) en segmentos de hojas de avena en la o s cu rid a d , en los que increm enta el contenido en a zú ca re s r e ­
ductores durante los dos p rim ero s d ía s , m ientras disminuye drásticam ente la
cantidad de s a c a ro s a . S p en ce r y T itu s (1973) señalan que la v a ria c ió n en cío
-1 3 -
r o fila y a zu ca re s en discos de hojas de manzano depende de la edad de las mismas y de las condiciones en que se m antienen. A s í, m ientras las hojas —
adultas p ie rd en c lo ro fila tanto a lá luz como a la oscuridad aunque en m ayor
p o rcen taje en este últim o caso (2 % y 11 % respectivam ente a los 7 d ía s ), en
las hojas más jovenes se produce un increm ento de un 4 % a la luz y un des
censo de un 10 % a la o s c u rid a d . El contenido en a zú ca re s solubles descien­
de en todos los c as o s , siendo máximo en las hojas jovenes a la oscuridad y
no existiendo d ife re n c ia s e n tre las dos condiciones extern as p a ra las hojas a d u lta s.
A rg u e lle s y G u ard io la (1977) han estudiado el control de la senes
cencía en hojas de naran jo y , si bien no se han hecho en este tra b a jo a n á li­
sis del contenido en c a rb o h id ra to s , s í obtienen un c la ro aumento de hasta un
1 0 0 % en 10 días de la a ctiv id a d a m ilo lític a en hojas mantenidas a la lu z , a la
vez que el contenido en c lo ro fila disminuye en un 50 % en ese mismo periodo
de tiem po, comprobando además que los tratam ientos con ácido g ib e ré lic o , que
re tra s a n la sen e s ce n c ia, inhiben también el aumento de la activid ad a m ilo líti­
ca.
-1 4 -
I .2 . -
CARBOHIDRATOS
EN
C I T R I C O S . -
Los fru to s verd e s con c lo ro fila tienen capacidad de r e a liz a r la foto­
s ín te s is , pero la m ayor p a rte de los c arb o h id rato s n e cesario s p a ra la activid ad b io s in té tic a
de
los fru to s de los c ítric o s proceden de las hojas (M c C re a d y , -
197 7 ). .S i bien el índice fo to sin tético de los c ítric o s es re la tiv a m e n te bajo com
parado con o tra s especies de fru ta le s (12 mg CO^ / dm
1971; B ie lo ra i y M en d el, 1969; Moss et a l . ,
2
1972; L e n z,
x h , K ried em an n , 1968
1978, lo que re p res e n
ta e n tre un te rc io y la mitad del índice fo to sin té tic o del manzano: K riedem ann,
1978),
la producción de fotoasim ilados durante el reposo vegetativo es s u p e rio r
a la dem anda, produciéndose durante el in viern o una acumulación de re s e rv a s
hidro carbo nadas que alcanzan los v a lo re s máximos en las hojas justo antes de
la b ro tació n de p rim a v e ra (Jones y S te in a c k e r,
geman et a l . ,
1951; Sm ith et a l . ,
1952; H iI —
1967; S m ith , 1976). A p a r t ir del momento en que se alcanza el
nivel máximo se produce la degradación continua de las re s e rv a s y los azúca­
re s producidos son transportados hacia las zonas en d e s a rro llo (K rie d e m a n n ,1969a y h; Kubota y Motoyama, 1971; Moss et a l . ,
les mínimos durante el verano (E ric k s o n ,
1 9 7 2 ), llegándose a los nive
196 8 ). La pro p o rció n de almidón y -
azú ca re s v a r ía a lo larg o del c ic lo d e s c rito . El contenido en almidón descien
de du rante el in v ie rn o m ientras que aumenta el nivel de a zú ca re s s o lu b le s , he
cho que se considera generalm ente como una respuesta a las bajas tem peratu­
ras (E ric k s o n ,
1968; Y ele n o s k y ,
1979). P o r el c o n tra r io , el nivel de almidón
aumenta rápidam ente durante la p rim a v e ra , poco antes de la b ro ta c ió n , y va siendo degradado durante este periodo de c rec im ie n to (E ric k s o n ,
1968). Según
Jones y S te in a c k e r (1951) también las brotacio nes en o tra s épocas del año —
pueden e s ta r precedidas por una acumulación de almidón en las h o ja s .
O tros fa c to re s , además de la te m p e ra tu ra ,
influyen en la acumula
ción de almidón en las h o ja s. D iv ers o s autores (Lew is et a l . ,
al . ,
1964,
1970,
1964; Jones et
1973) indican que el nivel de sustancias hidrocarbonadas es­
-1 5 -
tá influid o p o r el número de fru to s que soporta el á rb o l. La cuantía de la co
secha depende no solo del número de e s tru c tu ra s re p ro d u ctivas form adas du—
ra n te la flo ra c ió n sino también del porcen taje de abscisión de las mismas an­
tes de lle g a r a su d e s a rro llo completo como fru to s . Aunque el número de flo ­
re s producidas p o r los c ítric o s es muy elevad o , solo un pequeño p o rc en taje de e lla s llega a c o n v e rtirs e en fru to s maduros ya que numerosas yemas flo r a ­
les y flo re s caen antes del cuajado y aún numerosos fru to s pequeños se des—
prenden antes de lle g a r a la m adurez. E ric k s o n (1968) indica que p a ra la va ­
rie d a d W ashington-N avel el número de fru to s que llega a fo rm a r p a rte de la co
secha fin al puede re p re s e n ta r un p o rcen taje del número de flo re s inicialm ente
form adas tan bajo como el 0 ,2 %.
La coincidencia en el tiempo de los máximos po rcen tajes de caída
de las hojas y de los fru to s (E ric k s o n y B rannam an,
1960) s u g ie re que e n tre
las razones que pueden e x p lic a r la abscisión se encuentra la com petencia por
elementos n u tritiv o s que se establece durante este perio do e n tre los distintos
órganos en c re c im ie n to , momento en que los re q u erim ie n to s son m áxim os. A s í,
durante la época de flo ra c ió n tanto las flo re s como las nuevas hojas en desa­
r r o llo dependen c rític a m e n te del tra n s p o rte de a zú ca re s y elementos m in erales
del re sto de la p la n ta . Las hojas jóvenes en d e s a rro llo son al p rin c ip io una zona im portante de a tra c c ió n de m etabojitos (K rie d e m a n n , 1969a y b; Moss et a l . ,
1972), com pitiendo eficazm ente con las flo re s de tal modo qué, en las p rim e ra s
fases del d e s a rro llo de estas su tamaño es in fe rio r cuando se lo c a liza n en in
flo re s c e n c ia s con hojas que en aquéllas situadas en in flo re s c e n c ia s sin hojas
(Lenz y C a r y ,
1 969). P ro n to , sin em bargo, el ritm o de c rec im ie n to cam bia, -
coincidiendo con la exportación de fotoasim ilados desde las hojas jóvenes y , fi_
nalm ente, el p o rc e n ta je de flo re s que se con vierten en fru to es notablemente
s u p e rio r en las in flo re s c e n c ia s con hojas (S a u e r , 1951, 1954; L e n z, 1966; —
Jahn,
1973). El efecto de las hojas de la in flo re sc e n cia en el p o rc e n ta je de -
fru to cuajado no p a re c e s e r de n a tu ra le za hormonal sino exclusivam ente n u tr i-
-1 6 -
cional (M oss,
1970).
Aunque p a rte de esta competencia se establece p o r los elementos
m in e ra le s (G u a rd io la et a l . ,
1977), la competencia por los a zú ca re s puede de
♦ sem peñar un papel decisivo ya que se produce una caída im portante de fru to d urante la p rim a v e ra (caída de J u n io ), cuando ya se ha re s ta b le c id o el nivel
de elem entos m in era le s en las hojas (G u a rd io la y G o n zá le z,
1982). La disminu
ción de la competencia m ediante la reducción de la flo ra c ió n estim ula m arcada
mente el c rec im ie n to in ic ia l del fru to y , en determ inadas condiciones de com­
petencia e x tre m a , aumenta la producción fin al hasta más de cu atro veces la de
los á rb o le s testigo (G u a rd io la et a l . ,
comunicación p e rs o n a l).
La re la c ió n e n tre el contenido en almidón antes de la b rotació n y
el cuajado del fru to ha sido estudiada por d iv ers o s a u to re s . Lew is et a l ..(1 9 6 4 ),
trab ajand o con la v a rie d a d "W ilkin g" indican que un contenido elevado en c a r ­
bohidratos en las hojas durante la brotació n fa v o rec e la p roducción, aunque afirm an que no p a re c e s e r un fa c to r lim ita n te . P o r o tro lado, Jones et a l. (1973) y Goldschmidt y Golomb (1982) señalan que en el C itru s re tic u la ta
la
cuantía de la cosecha no está relacionada con la acum ulación de a lm id o n e n las
hojas p e ro s í con el contenido del mismo en las ra íc e s . S in em bargo, en la v a rie d a d " V a le n c ia " Jones y c o laboradores (1 9 7 0 ,
1974) s í han encontrado una
c o rre la c ió n p ositiva e n tre el contenido en almidón de las hojas antes de la bro
tación y la cuantía de la cosecha p roducida. Tam bién se ha encontrado una re
lación e n tre . la cuantía de la cosecha y la u tiliz a c ió n del alm idón, de modo que
Jones et a l.
(1975) y Goldschmidt y Golomb (1982) señalan que en v arie d ad es
p a rtic u la rm e n te v ec e ras como "Kinnow " o " M u rc o tt" , la ausencia de c o s e c h a el año sig uiente de una abundante se c o rre la c io n a con el agotam iento de las re s e rv a s h id ro carb o n ad as. M onselise et a l.
(1982) han encontrado d ife re n c ia s
im portantes en el contenido de almidón en las hojas de ramas del mismo árbol
(v a r .
"M ic h a l") con y sin fru to , siendo de casi el doble en el segundo caso.
-1 7 -
En v ís ta de la im portancia d ecisiva que en la producción de los a g rio s puede te n e r la m ovilización del almidón y su tra n s p o rte a los órganos
en d e s a r r o llo ,
re s u lta sorprendente la lim itada cantidad de estudios dedicados
al p ro b le m a. Las v a ria c io n e s estacionales en el contenido en almidón en r e la ­
ción con el estado de d e s a rro llo y la cuantía de la cosecha han sido estudia­
das p o r Jones y S te in a c k e r (1951) y Lewis et a l. (1964) p e ro su estudio es m eram ente d e s c rip tiv o , sin a fro n ta r el problem a de su re g u la c ió n . Del mismo
modo, K riedem ann(1 969a) ha señalado la re la tiv a e stab ilid ad del almidón en las
hojas de lim onero pero sin un a n á lis is de sus c au sas.
La m ovilizació n del almidón en las hojas adultas de los c ítric o s es más lenta que en las de o tra s plantas (E ric k s o n ,
1968). A s í, el m anteni—-
miento de plán tu las de n aranjo en la oscuridad durante v a ria s semanas no pro
duce la d e sa p a rició n del almidón de las h o ja s. Según S in c la ir y Bartholom ew
(1937) el c lo ro p la s to aparentem ente liga el almidón p ro d u cid o , p or lo que es degradado muy lentam ente por las enzimas de las h o ja s. La poca a ctiv id a d en­
zim ática que se m anifiesta "in v iv o " no p a re c e s e r debida a la ausencia de —
p ro teín as d e g rad a tiv a s o su p re se n c ia en estado inactivado ya que según estos
au to res los e x tra c to s de hojas producen la degradación del almidón en azúca­
re s en muy poco tiem po, lo que indica que las enzimas de las hojas son a c ti­
v a s . H a b ría que pensar más bien en una com partim entacíón de las enzimas y
el s u s tra to , que impide que se produzca de form a indiscrim in ada la m o v iliza ­
ción de las re s e rv a s hidrocarbonadas de las c é lu la s .
-1 8 -
I . 3 . -
VIAS
I .3 . 1. -
D E GRA DA TI VAS
DEL
ALMIDON.-
GENERALIDADES.-
Los c arb o h id ra to s formados en la fase oscura de la fo to sín tesis
son rápidam ente polim erizados en los clo ro p la s to s de las h o ja s . E stos p o lisacárido s se encuentran en form a coloidal
o en form a no h id ro s o lu b le , p e r­
mitiendo el almacenamiento de grandes cantidades en las c é lu la s sin que in­
fluyan en el potencial osmótico de las m ism as.
E l p o lis a c á rid o de re s e rv a
mas im portante y mas abundante del mundo v e g e ta l, que se encuentra desde
las algas in fe rio re s a las plantas s u p e rio re s , es el alm idón,
y<
se acumu­
la en granulos de diám etro v a ria b le e n tre 2 y mas de 100 m ie ra s
, cuyo pe
so m olecular puede a lc a n z a r v a rio s m iles de daltons (M c C re a d y ,
1977).
Los granulos de almidón v a ría n tanto en su tamaño como ep -su form a según el origen del que provengan. S in em bargo, en todos los casos
está compuesto por dos tipos de m oléculas,
la am ilosa
y la a m ilo p e c tin a, -
siendo v a ria b le la proporción de ambas en los gránulos de las d is tin ta s plan­
tas (1 0 -3 0 % de a m ilo sa, 7 0 -9 0 % de a m ilo p e c tin a). La am ilosa es una m ezcla
de cadenas lineales de glucosa unidas por enlaces a lf a - 1 ,4 y de cadenas lige
ram ente ram ificadas (una ra m ific a ció n por cada 1000 residuos de glucosa apro
ximadamente) (Banks y M u ir,
1980) por enlaces a lf a - 1 , 6 . La a m ilo p e c tin a , p or
su p a rte está formada por cadenas altam ente ra m ific a d as con los mismos tipos
de enlaces (una ra m ificació n por cada 2 4 -3 0 residuos de glucosa) (M c C re a d y ,
1977). Los enlaces a lfa -1 ,4 existentes e n tre los monómeros de glucosa produ­
cen una torsión del plano en que se hallan las glucosas, dando como re s u lta ­
do m oléculas h e lic o id a le s ; distintos estudios re a liza d o s sobre modelos de d i­
fra c ció n producidos por complejos de am ilosa con alcoholes ram ificados indican
diám etros de hélice que corresponden a ciclohexoam ilosa (B e a r ,
194 4 ), c ic lo -
-1 9 -
heptoam ilosa (Z a s lo w ,
1963) y ciclooctoam ilosa (Yam ashita y Monobe, 1 97 1 ).
E l almidón p re se n te
1 . - Almidón de
periodos de
en las plantas puede s e r de dos tipos:
a s im ila c ió n , que
se
deposita en las hojas
verd e s
durante los
a ctiv id a d fo to s in te tic a , y
2 . - Almidón de
r e s e r v a , que se
encuentra en los am iloplastos de órganos de
alm acenamiento como s e m illa s , fr u to s , tubérculos o rizo m a s .
E l almidón de a sim ilac ió n es regularm ente m etabolizado, es d e c ir ,
se produce durante el perio do luminoso y es degradado durante el periodo os­
c u ro , transpo rtándose sus productos a otro s puntos del v e g e ta l. P o r o tro la ­
do , el almidón de re s e rv a re p re s e n ta la fuente de en erg ía p ara numerosos —
procesos fis io ló g ic o s que la re q u ie re n en gran cantidad como la germ inación ,
brotación, flo ra c ió n o fr u c tific a c ió n , por lo que perm anece acumulado hasta que estos procesos tienen lu g a r, momento en que el almidón es m ovilizado
y
los a zú cares re su lta n te s son transportados a los órganos en c re c im ie n to .
La m o vilizació n del almidón puede lle v a rs e a cabo por dos vías bioquím icas d is tin ta s , en las que están im plicadas d ife re n te s enzim as.
fig u ra 1 puede o b s e rv a rs e un esquema detallado de ambas v ía s .
En la
-2 0 -
R -E N Z IM A
O l i g o s a c á r i do s
FOSFORILASA
* ( 1 - A ) n-6 )glu can o
*-(1* A) g l u c o s i l o
*-D- Glucosa
1-F osfato
HIDROLASA
FQSFATASA
D -G L U C O S A
ALMIDON
,H-AHILAS A
F ra g m e n to s
R- ENZIMA
* ( 1 - A ) ( 1 - 6 tglucano
AHI LASA
F r a g m e n to s
(1 *4) g l u c a n o
Maltosa
O lig o s a c á rid o s
a6 |1 -4 )(1 -6 )g lu cosilo
0 L IQ 0 S A C A R I0 0 Í1-6)QLUC0SIDASA
F ig u r a
1 . - V ía s b io q u ím ic a s p a ra la c o n v e rs ió n de a lm id ó n en D -g lu c o s a
El s e m ic í r c u lo s u p e r i o r , d ib u ja d o con t r a z o f in o , c o rre s p o n d e
a la vía f o s f o r o l í t i c a .
El i n f e r i o r ,
re p re s e n ta d o con t r a z o g ru e s o , a la
a m ilo lí t ic a . (sacado de "E n z y m e s in s y n th e s is and h y d r o l i s i s o f s t a r c h " ,
P a zu r,
1965).
i
-2 1 -
VIA
F O S F O R O L I T I CA . -
La a m iló fo s fo rila s a ( 1 ,4-alfa ^ -D -g lu ca n o :o rto fo s fa to a lfa -g lu c o s iltra n s
fe r a s a , E . C .
2 . 4 . 1 . 1 . ) form a p a rte de las a lfa (1 ,4 ) glucano fo s fo rila s a s , que
están ampliamente d is trib u id a s tanto en aním ales y plantas como en c élu la s mi­
c ro b ia n a s . La reacción que c a ta liz a -s e p a ra c ió n de monómeros de glucosa a —
p a r tir de un p o lím e ro - puede o c u r r ir también en d ire c c ió n de s ín te s is depen—
diendo de una s e rie de fa c to re s ;
las concentraciones elevadas de fosfato in o r­
gánico en el medio a s í como el pH alto favo recen la degradación del almidón ,
m ientras que los pH bajos y la ausencia de fosfato favorecen la s ín te s is .
El proceso de degradación es conocido como fo s fo ro lis is ya que en
él se elim ina la glucosa term inal del extrem o no re d u c to r de la cadena por ata
que del fo s fa to . La enzima actúa repetidam ente sobre los extrem os no reducto­
r e s , de form a que puede lle g a r a d e g ra d a r totalm ente la s cadenas lin ea les de
la am ilo sa, produciendo m oléculas de g lu c o sa —1-fo s fa to .
r r e igual
S in em bargo, no ocu
con la am ilopectina debido a la p re se n c ia de sus ram ificacio n es con
enlaces a lf a - 1 ,6 g lucosídicos, no susceptibles de s e r atacados por la fo s fo r ila s a .
De este modo, su acción s c b re la am ilopectina da lu g ar a la fo rm a c ió n ,
por un lado, de moléculas de g lu c o s a -1 -fo s fa to que re p res e n ta n del 35 al 45 %
del total de la molécula (ap R e e s ,
le c u la r
1974), y por o tr o , de moléculas de peso mo­
relativam ente a lto y muy ra m ific a d a s , conocidas como d e xtrin a s lím ite
(fragm entos a lf a - ( 1 ,4 ) - ( 1 ,6 ) glucano) y cuya degradación solo podrá s e r conti­
nuada tra s la acción de una enzima d e sra m ific a d o ra (R -e n z im a ), que actúa úni_
camente sobre los enlaces a lfa -1 , 6 , proporcionando a la am ilo fo sfo rila sa nue­
vos extrem os no red u cto res p ara p ro s e g u ir la d e g rad a c ió n . Las m oléculas de
g lu c o sa -1 -fo sfa to producidas son finalm ente c o n ve rtid a s en glucosa p or la ac ­
ción de una fo s fa ta s a.
-2 2 -
I *3 ,U 2 ~ -
V IA
H I D R O L I T I C A . -
En la v ía h id ro lític a están im plicadas las a m ila s a s , p o r lo que se
conoce también como degradación a m ilo lític a .
La denominación a lfa y beta dada
a estas enzim as indica la m u tarrotación de los productos form ados tra s su ac­
ción sobre el alm idón, y no la configuración de los enlaces que a ta c a n , ya
que ambas enzimas solo pueden h id r o liz a r las uniones
-
de tipo a lf a - 1 , 4 (G ib b s ,
1966).
La actuación de la a lfa -a m ila s a (1 ,4 -a lfa -D -g lu c a n o glucanohidrola_
sa, E .C .
3 . 2 . 1 . 1 . ) sobre las poliglucosanas produce un rápid o descenso del -
peso m olecular de los substratos y , por ta n to , de sus propiedades (c o lo rac ió n
c a ra c te rís tic a con iodo, descenso de la v is c o s id a d , e tc .) .,
S in em bargo, estos
cambios solo van acompañados por un aumento muy pequeño del poder re d u c to r,
lo que indica que la h id ró lis is in ic ia l de las m oléculas grancfes por esta enzima
se lleva a cabo por ro tu ra al a z a r de los e n la c e s .
P o r o tra p a r te ,
los olig o -
sacárido s re la tiv a m e n te pequeños son h id ro liza d o s mas despacio que los gran ­
des p o lím ero s.
De este modo, la actuación de las a lfa -a m ila s a s sobre el almidón
consta de dos fa s e s .
Una in ic ia l, el la que se da un rápido descenso del ta ­
maño de la m olécula p or h id ró lis is al a z a r de los enlaces a lf a - 1 , 4 g lu c o s íd icos y o tra fin a l en la que se produce una degradación lenta de los productos
formados en la p rim e ra fase y en la que tie n e mayor im portancia la acción no
al a z a r de la enzim a.
La d ife re n te actuación de esta enzima no es debida a reaccion es
d ife ren tes sino a cambios en su afinidad por los s u s tra to s .
T . ap Rees (1974)
señala que la afinidad y la velocidad de reacció n son m ayores p ara sustratos
de alto grado de p o lim e riza c ió n ;
además de é sto , también el grado de r a m if i-
-2 3 -
cación
determ ina la velocidad de re a c c ió n , que disminuye m arcadam ente cuan_
do las cadenas la te ra le s se encuentran a una d istan cia m enor de d ie z unidades
de glucosa sobre la cadena p rin c ip a l (S ch w im m er, 1950).
E llo e xp lica la me­
nor velocidad de actuación sobre la d e xtrin a b e ta -lím ite que sobre ia am ilopec
tin a , ya que m ientras las cadenas e x te rio re s de esta tienen una longitud media
de 15 unidades, las in te rio re s -q u e son las únicas p re se n te s en las d e x trin a s
lím ite s -, tienen una longitud media de s ie te u ocho unidades.
Los productos fin a le s que se obtienen de su actuación sobre la am]
losa son m altosa, cuya unión no pusde a ta c a r, y glucosa. La e xis te n cia de enla
ces a lf a - 1 ,6 en las ram ificacio n es de la m olécula de am ilopectina impide que
ésta sea degradada totalm ente por la a ctiv id a d a lfa -a m ilá s ic a ya que este tipo
de enlaces hace re sis te n te s a la a lfa -a m ila s a a las uniones a lf a - 1 , 4 c e rc a n a s .
P o r tan to , su h id ró lis is sigue el mismo esquema que la de la am ilosa pero los
productos fin a les s e rá n , además de maltosa y glucosa, una s e r ie de oligosacá_
rido s ram ificados compuestos por unos cu atro a s ie te monómeros (d e x trin a s aj_
fa -lím ite ).
En c o n traste con la acción al a z a r de la a lfa -a m ila s a ,
lasa ( 1 ,4 -a lfa -D -g lu c a n o m a lto h id ro la s a , E . C .
la beta-am_i
3 . 2 . 1 . 2 . ) c a ta liz a la s eparación
de form a sucesiva de m oléculas de maltosa a p a r t ir del extrem o no re d u cto r de
una po liglu co sana.
Las cadenas lin ea les de am ilosa pueden quedar totalm ente degrada_
das en maltosa por b e ta -a m ilo lis is si se tra ta de una cadena con un número p a r de monómeros;
en case c o n tra rio a p a re c e ría también una m olécula de maj_
to trio s a , correspondiente a las tre s m oléculas de glucosa te rm in ale s del e x tre
mo re d u c to r.
E sta enzima tampoco puede so b rep a s ar los enlaces a lfa -1 ,6 de
la am ilo pectina, por lo que va separando m oléculas de maltosa a p a r t ir del ex
trem o no reductor de cada ra m ificació n hasta lle g a r a las dos o tre s m oléculas
-2 4 -
de glucosa a n te rio re s a esos puntos, dejándolas sin h id r o liz a r .
El resultado
de la incubación de am ilopectina con b e ta -a m ila sa es a lre d e d o r de un 60 % de
m altosa y el re s to d e x trin a s b e ta -lím ite s , de alto peso m o le c u la r, aunque me­
n ores que las obtenidas por la acción de la fo s fo rila s a (A k a za w a , 1965;
T . ap
R e e s , 1 9 7 4 ).
La actuación de a lfa y b e ta -a m ila s a tanto sobre la am ilopectina co_
mo so bre la am ilosa produce una s e rie de compuestos no u tiliz a b le s directam en
te p o r las c é lu la s . N ecesitan una m ayor degradación
cosa.
hasta c o n v e rtirs e en glu_
E sta degradación se consigue g ra cia s a la e xis te n cia en las c élu las de
enzim as desram ificarites y de m a ltasa.
Las d e x trin a s lím ite se c o n vie rte n en
m oléculas lin e a le s p o r acción de las enzimas d e s ra m ific a n te s .
han encontrado dos d is tin ta s (M acW illiam s y H a r r i s ,
En la cebada se
1959):
-L a R -e n zim a (am ilopectina-6rgl:uc.ano h id r o la s a , E . C . 3 . 2 . l . ' 5 9 í , ;
que rompe los enlaces a l f a - 1 ,6 mas externos de la a m ilo p ectin a, d e x trin a s fo s fo r ila s a -lím ite s y otro s glucógenos a típ ic o s , es d e c ir , enlaces e n tre cade­
nas la rg a s .
-L a d e xtrin a s a lím ite (d e x trin a -6 -g lu c a n o h id ro la s a , E . C . 3 . 2 . 1 .
1 0 .) , que c a ta liz a la ro tu ra de los enlaces a l f a - 1 ,6 externos e n tre cadenas c o rta s como las d e x trin a s a lfa y beta lím ite s .
M anners y Rowe (1969) también han identificado estas dos enzimas
en el m a íz . P o r o tra p a rte , L a rn e r (1960) distingue dos enzim as que degradan
los enlaces a l f a - 1 ,6 e n tre cadenas la rg a s ,
la a m ilo -1 ,6 -g lu c o s id a s a , que ac­
túa como una exoglucosidasa y la R -e n z im a , que lo hace como una endoglucosj^
dasa.
Los extremos no re d u cto res lib re s proporcionados por estas enzimas
son u tiliz a d o s por las am ilasas p ara a ca b a r de d e g ra d a r estas cadenas lineales
en m alto sa. E sta m altosa, producida p o r la acción conjunta de todas las enzi­
-2 5 -
mas d e s c rita s an te rio rm e n te es finalm ente c o n ve rtid a en glucosa por medio de
un a lfa -g lu c o s id a s a (a lfa -D -g lu c ó s id o g lu c o h id ro la s a , E . C . 3 . 2 . 1 . 2 0 . ) , que­
dando a sí lib r e y fácilm ente disponible p a ra el metabolismo c e lu la r .
-2 6 -
1 .3 .2 .-
IMPORTANCIA
DE
LAS
DOS
V I A S . -
1. 3 . 2 . 1 - M O V lL IZ A C IO N DEL A L M ID O N E N S E M IL L A S V F R U T O S .-
La im portancia de cada una de estas dos posibles v ía s m etabólicas
no está aún suficientem ente c la r a , puesto que el modelo de degradación puede
s e r d is tin to según la especie de que se tr a te y según la lo c a liza c ió n del alrrrt
don en la p la n ta .
E xisten una s e rie de fa c to re s que apoyan la degradación p o r una
u o tra v ía .
A s í, si se considera la en erg ía re q u e rid a p a ra la s ín tes is de sa_
c a ro s a , la ruta energéticam ente mas fa v o ra b le s e ría la fo s fo ro lític a ya que en
e lla no se p ie rd e la en erg ía del enlace g lu c o síd ic o .
S in em bargo, es un he­
cho ampliamente reconocido que la a lfa -a m ila s a es la única enzima capaz de
a ta c a r los enlaces a lf a - 1 , 4 en granulos de almidón in ta c to s , p or lo que la ma
y o ría de los au tores la consideran im plicada siem pre en los estados in ic ia le s
de la degradación del alm idón, pudiendo s e r p o s te rio rm e n te degradados los oH
gosacáridos formados p o r las enzimas de las dos vías.v
La m ovilización del almidón en las s em illas ha sido ampliamente estudiada tanto en c e re a le s como en legum inosas. E l método p rin c ip a l de inves
tigación consiste en la com paración de los cambios en las velocidades de degra
dación del almidón con cambios en las activid ad es enzim áticas en los e x tra c to s
v eg e ta les .
Con este sistem a se ha observado una c o rre la c ió n im portante de la
degradación rápid a del almidón en sem illas con el aumento de la a ctiv id a d a m ilo lític a (Juliano y V a r n e r ,
1969; Fernánd ez T á rra g o y N ic o lá s ,
1976).
Numerosos au to res indican que la degradación en las sem illas de
c e re a le s se produce por la vía h id r o lític a , conociéndose bien su regulación por medio de hormonas del tipo g ib e re lin a s , producidas p o r el eje em b rió n ico .
-2 7 -
Los resu ltado s de los a n á lis is químicos de los componentes hidrocarbonados de
las sem illas de a r r o z en germ inación apoyan esta vía y s ugieren que la degra
dación fo s fo ro lític a no es muy im portante en estas sem illas ( Nomura
et
al.,-
1969).
En s em illas de leguminosas se han encontrado todas las enzim as n e ce s aria s p a ra la degradación del almidón tanto por vía h id ro lític a como por
la fo s fo ro lític a (Juliano y V a r n e r ,
T á rra g o y N ic o lá s ,
1969; Abbott y Matheson,
1972; F e rn án d ez
1 97 6 ), con excepción de las sem illas de soja en las
:que:_-
Adams et a l. (1981) no pudieron d e te c ta r fo s fo rila s a .
Del mismo modo, se han localizado también am ilasas y fo s fo r ila sas en d iv ers o s fru to s , ta le s como la p era (Latché et a l . ,
(Young et a l . ,
1974) o la uva (Downton y H a w k e r,
1.3.
2. 2 . -
1973), el plátano
1973).
M O V I L I Z A C I O N DEL A L M ID O N E N H O J A S .-
A s í como la v ía h id ro lític a p a rec e predom inante en las s e m illa s ,
-
exis te una c o n sid e ra b le c o n tro v e rs ia respecto a la, vía de degradación en ho­
jas y en c élu la s no e sp e c ializad a s en el almacenam iento de alm idón, puesto que existe menor inform ación en este campo. Un estudio re a liz a d o por Gates
y Simpson en 1968 con hojas de 79 especies de plantas dio como resultado la
existen cia de a lfa -a m ila s a en todas e lla s ; U ll (1977) encontró la p resencia de
la a lfa -a m ila s a estrecham ente relacionada con la existen cia de alm idón, detec
tándola en todas las especies estudiadas (12) excepto en ajo y en h ie d ra , que no acumulan alm idón. Adem ás, algunos autores han encontrado ritm os d ia rio s
de actividad a m ilá s ic a en h o ja s ,
que son inversos a la v a ria c ió n en el conte
nido en almidón en las mismas ( P o n g ratz y B e c k ,
y de F ekete
(1977)
dad enzim ática
encuentran una v a ria c ió n
y de la cantidad de almidón
1978). S in em bargo, V iew eg
d ia ria
p a ra le la
en las hojas
de la a c tiv i­
de Kalanchoe d a íq re
-2 8 -
m ontiana, aunque señalan que el método u tiliz a d o en este tra b a jo p a ra la d e te r
m inación del almidón incluye también los glucanos de longitud de cadena supe­
r io r a 1 2 -1 4 unidades de glucosa, que pueden s e r productos de la degradación
p or a lfa -a m ila s a .
Tam bién se ha encontrado activid ad fo s fo ro lític a en hojas de d ife ­
ren tes especies vegetales , como guisante
ko,
(Levi y P r e is s ,
1978; Steup y L a tz -
1979), tabaco (Abbott y Matheson, 1 97 2 ), espinaca (P o n g ra tz y B e c k , 1978;
O kita et a l . ,
1979; P re is s et a l . ,
1980; Steup y S c h a c h te le ,
1 9 8 1 ), m aíz (de
F e ke te y V ie w e g ,1 9 7 3 ), plátano (Kum ar y S a n w a l,1 9 7 7 ) o vid (Downton y H aw ­
ker,
1973), no hallándose p a ra esta enzima un ritm o d ia rio como el señalado
p ara las a m ila s as , aunque éste puede s e r debido a que los experim entos se re a liz a ro n a una concentración satu ran te de fosfato (P o n g ra tz y B e c k ,
1978).
Es obvia la posibilidad de una reg u lació n e n tre la s ín te s is y la degradación que perm ita la actuación de esta enzima en ambos p ro c e s o s .
Se
ha comprobado la existencia de un aumento de fósforo en los c lo ro p la s to s en
hojas a la oscuridad (T h o rn e y K o lle r ,
1974) y las concentraciones elevadas
de fosfato inclinan la reacción c a ta liza d a por la fo s fo rila s a en el sentido d e g radativo (P eavey et a l . ,
1977);
igualm ente, existe una v a ria c ió n de p H , sien_
do mas ácido en la o s cu rid a d , lo que también in c lin a ría la. re ac c ió n hacia la
degradació n .
La regulación de la degradación también puede s a tis fa c e rs e en el
caso de que la m ovilización se produzca p or la v ía a m ilo lític a ya que se cono
cen v a rio s aspectos reg u lad o res en esta v ía , como son la conversión de la be
ta -a m ila s a latente en su form a activ a por reducción re v e rs ib le de sus grupos
s u lfh id rilo s (R ow sell y G oad,
1962; S p ra d lin y Thom a,
1 970), o la inhibición
de la a lfa -a m ila s a por su producto, la m altosa (S c h w im m e r, 1950; de F ekete y
V iew e g ,
1973; View eg y de F e k e te ,
1977).
La posible reg u lació n osmótica de
-2 9 -
la
actividad a m ilo lític a indicada por Jones y A rm s tro n g (1971) es cuestionada
sin embargo p or G epstain e lia n (1 9 7 4 , 1981) ya que estos a u to re s indican que no hay evidencias de su existencia tanto en cebada como en ju d ía .
Por
o tra p a r te , de F e k e te y V iew eg (1973) señalan que p a rec e im probable la r e ­
gulación de estas enzimas por cambios de p H , basándose en que encuentran una a ctiv id a d am ilásica óptima a un pH también óptimo p a ra la s ín te s is del a l­
midón.
Numerosos autores se inclinan por una v ía u o tra según la locali_
zación su b celu lar de las enzim as, puesto que pa rec e lógico que su lo c a liz a —
ción corresponda al lugar de s ín tesis del alm idón, el c lo ro p la s to .
De este -
modo, Levi y P re is s (1978) no han encontrado am ilasas en los c lo ro p la s to s de
guisante y s ugieren que la degradación se produce por la vía fo s fo r o lític a - 0
punto de v is ta mas g e n era lizad o e s , sin em bargo, el de una acción concomitan
te de las enzimas de las dos vías en la m ovilizació n del almidón en célu la s fo
to sin téticas (P o n g ra tz y B e c k ,
1978; O kita et a l . ,
1979; Kom brink y W ober, -
1980), ya que se han encontrado dichas enzimas tanto dentro como fu e ra de les
clo ro p lasto s (T a b la 1).
TABLA
O R IG E N ___________E N Z IM A
D u n a lie lla m arina
N ico tian a tabacum
LOCAL I Z A C I O N
-3 0 R E F E R E N C IA
F o s fo rila s a
Am ilasa
c lo ro p la s to
Kom brink y W o b er,1960
F o s fo rila s a
clo ro p la s to
S to c k in g , 1959
citoplasm a
B ird et a l . ,
B e ta -a m ila s a
citoplasm a
Levi y P r e is s ,
F o s fo rila s a
clo ro p la s to
S titt et a l . ,
c lo ro p la s to y
Levi y P r e is s ,
citoplasm a
Steup y L a tzk o ,
c lo ro p la s to
Bourne et a l . , . 1970
clo ro p la s to
Latzko y G ib b s,
c lo ro p la s to y
citoplasm a
Steup y L a tzk o , 1979
P re is s et a l . , 1980
"
Pisum sativum
1
"
1965
1978
1978
1978
1979
Sacharum officinarum A lfa y beta
am iiasas
S p in acia o le rá c ea
"
11
F o s fo rila s a s
M
Steup et a l . ,
A m iiasas y
1968
1981
c lo ro p la s to
P o n g ratz y B e c k ,
F o s fo ri lasas
clo ro p la s to y
citoplasm a
P eavey et a l . ,
A m iia s a s ,
clo ro p la s to y
F o s fo rila s a
R -e n zim a y
citoplasm a
F o s fo ri lasas
A m iiasas y
O kita et a l . ,
1978
1977
1979
D -e n zim a
S te lla r ia media
Am iiasas y
c lo ro p la s to y
R -enzim a
citoplasm a
A lfa y beta
am iiasas
O kita y P r e is s ,
c lo ro p la s to
H a a p a la ,
1969
V ic ia faba
B e ta -a m ila s a
citoplasm a
Chapman et a l . ,
Zea mays
A lfa -a m ila s a
c lo ro p la s to
□ a v ie s ,
1974
F o s fo rila s a
c lo ro p la s to
D a v ie s ,
1974
ii
ii
1980
1972
-3 1 -
! . 3 . 3 . - C A R A C T E R IZ A C IO N DE LAS A M IL A S A S .-
E x ís te n muy pocas re fe re n c ia s p re v ia s de la p re s e n c ia de a c tiv i­
dad a m ilo lític a en hojas de n a ra n jo , no abordándose en estos tra b a jo s el p ro ­
blema de la c a ra c te riz a c ió n de las d is tin ta s enzim as. S in em bargo, e x is te b i­
b lio g ra fía abundante a este respecto sobre am iiasas de d is tin to s o ríg e n e s , ha
biéndose d e s c rito v a rio s métodos distintos p a ra su a n á lis is .
Los métodos más u tilizad o s p a ra el a n á lis is de la a ctiv id a d am ilo
lític a total están basados en d is tin ta s propiedades de los productos form ados
o de los s u strato s parcialm en te degradados, y son:
1 . - D eterm in ación del su strato resid u al por p re c ip ita c ió n con una m ezcla de e ta n o l-a g u a .
2 . - Medida del increm ento del poder re d u c to r debido a la a p a r i­
ción de a zú c a re s re d u cto res como productos de degradación de las m ezclas * incubadas.
3 . - Descenso de la c o lo rac ió n dada p or el s u s tra to con el iodo
a medida que avanza la h id r ó lis is .
4 . - Dism inución de la viscosidad del almidón con la d eg rad ació n .
S in em bargo, ninguno de estos métodos es e sp e c ífico p a ra c u a l­
q uiera de las a m iia s a s , por lo que es n e ce s ario s e p a ra rla s previam ente p ara
d e te ctar su p re s e n c ia . E sta separación se efectúa según propiedades c a ra c te
rís tic a s de cada una, ta les como:
a)
el req u erim ien to de iones c a lc io que presentan las endoam ila-
s as . Las a lfa -a m ila s a s son inactivadas por agentes secu estran tes de c a lc io ,
como el ácido e tilen d ia m in o te traa c étic o (E D T A ).
No hay indicaciones de que el c alc io p a rtic ip e d irectam ente en la
form ación del com plejo e n z im a -s u s tra to . P a re c e más probable que al fo rm a r una fu e rte e s tru c tu ra in tra m o le c u la r e s ta b ilic e la e s tru c tu ra secundaria y te r
-3 2 -
c ia r ia de la p ro te ín a , manteniéndola en su e s tru c tu ra biológicam ente a c tiv a (F is c h e r y S te in ,
1960).
La estabildad general de estas enzimas está determ inada p o r el
número de iones c alc io unidos o por la fu e rz a con que son retenido s; estos
dos fa c to re s v a ría n mucho de una a lfa -a m ila s a a o tr a , aunque se ha determi_
nado que contienen al menos un átomo-agramo por mol (V a lle e ét a l . , 1 95 9 ).
Al c o n tra rio de lo que sucede con la a lfa -a m ila s a , una d iá lis is
prolongada o el tratam iento con agentes quelantes no separa ninguna sustan­
cia de bajo peso m olecular que sea esencial p ara la activid ad de la beta-am_[
las a .
b) Aunque los iones c a lc io unidos a la m olécula de a lfa -a m ila s a
son su ficien tes para la activid ad máxima de é s ta ,
la p re se n c ia de c a lc io en
exceso la p ro te je además de la inactivación té rm ic a . E s te efecto no se p r e ­
s en ta, sin em bargo, para la b e ta -a m ila s a , que es rápidam ente inactivada por
el c a lo r (S w ain y D e k k e r, 1966b; B r ig g s , 1973).
c) La e xis te n cia de grupos s u lfh id rilo en la e s tru c tu ra de la beta
am ílasa de d iv ers o s orígenes vegetales (French-,
1960) la hace sensible a los
re ac tiv o s de estos grupos, como los m etales pesados. P o r el c o n tr a r io , úni­
camente se ha encontrado una re fe re n c ia en la b ib lio g ra fía de una endoam ila­
sa sensible a los re ac tiv o s de los grupos s u lfh id rilo (O k ita et a l . ,
1979).
d) Según indican F is c h e r y S te in (1 9 6 0 ), Ohlsson (1930) y Blom
et a l. (1 9 3 6 , 1937) dem ostraron que la a lfa -a m ila s a de cebada es inactivada
por tratam ientos ácidos (pH a lre d e d o r de 3) a tem p eratu ra b a ja , sin que se
destruya también la actividad b e ta -a m ilo lític a . E sta re s is te n c ia a pH ácidos
se ha comprobado también p a ra b e ta -a m ila s a de o tros o ríg e n e s , como la de
trig o ( M e y e r e t a l . , 195 3 ), boniato (B a lls e t a l . , 1 948), soja (Fukumoto y —
T s u jis a k a ,
1955) y ta llo de guisante (S w ain y D e k k e r,
1966b).
-3 3 -
Las inactivaciones conseguidas según estas propiedades no deben
e n te n d ers e , sin em bargo, en el sentido absoluto sino en el de que la v e lo c i­
dad de in activació n es mucho menor en el caso de una am ilasa que en el de
la o tr a . A s í ,
Pech et a l. (1971) definen como a lfa -a m ila s a la a ctiv id a d inhit>l_
da en más de un 95 % por el E D T A y en menos de un 50 % p o r el c lo ru ro m e rc ú ric o o el c a lo r en p resen cia de
un exceso de inoes
c a lc io , y como be­
ta -a m ila s a aquella que se inhibe en menos de un 5 % por el E D T A y en más
de un 80 % p o r c a lo r o por c lo ru ro m e rc ú ric o .
La in activació n de los e xtrac to s crudos con inhibidores s e le ctivo s
p ro d u c irá sin duda e r r o r e s en la determ inación c u a n tita tiv a de las am iiasas
p or separado dado que no inactivan totalm ente las am iiasas de un grupo mien
tra s que inhiben p a rte de la a ctiv id a d debida al o tro tipo de a m iia s a s . De es
te modo, la detección de la existen cia de a lf a - o b e ta -a m ila s a en un e x tra c to
debe r e a liz a r s e p o r métodos que im pliquen su sep aració n p re v ia p o r crom ato­
g ra fía o e le c tr o fo r e s is , observando p o s te rio rm e n te su com portam iento fre n te a
los inh ib id ores o a los pH ácid o s.
Aun a s í ,
existen re fe re n c ia s de endoam ílasas que no m uestran el
req u erim ien to por c a lc io típ ico de las
O kita et a l . , 1979; O kita y P r e is s ,
a lfa -a m ila s a s (B u lp in y ap R e e s ,
1 98 0 ),
e incluso O kita
1978;
et a l . (1979) d e s c ri­
ben una endoamilasa en clo ro p lasto s de espinaca que es inactivada por los —
reactivo s de los grupos s u lfh id rilo , propiedad considerada c a ra c te rís tic a de
las b e ta -a m ila s a s .
P o r ta n to , p a rec e n e ce s ario en últim o térm ino la u tiliz a c ió n de
sustratos e sp ecífico s (d e x trin a s lím ite ) p ara la c a ra c te riz a c ió n de una activj_
dad a m ilo lític a como p e rte n ec ien te a una endo- (a lfa ) o a una exoam ilasa (be
ta) , o como indican S w ain y D e k ke r (1966a) m ediante la determ inación de las
form as a lfa o beta de los productos de la re a c c ió n .
-3 4 -
1 . 4 . - O B J E T IV O S DEL T R A B A J O . -
De todo lo expuesto a n te rio rm e n te pa rec e obvia la necesidad
de obtener un m ejor conocimiento del metabolismo del almidón en este ge
ñ e ro , a sí como de su im portancia en la fru c tific a c ió n puesto que, a p e s a r
de la re la tiv a m e n te abundante b ib lio g ra fía sobre estos tem as,
los estudios
e xisten tes abordan únicamente aspectos p a rc ia le s del pro b lem a.
P a ra in te n ta r d a r respuesta a algunas cuestiones en re la c ió n
con este tem a, en el p resente tra b a jo se estudian los puntos sig uientes:
A) Las v aria c io n e s que se producen a lo larg o del año en el
contenido en c a rb o h id ra to s de hojas de d is tin ta s b ro ta c io n e s , en re la c ió n
con el c ic lo de crecim ien to del fr u to .
B) Los cambios que provoca la p re se n c ia del fru to sobre la pauta de m o v iliza ció n de estos c a rb o h id ra to s . En este s en tid o , se hace un
estudio com parativo del ritm o de degradación de las re s e rv a s hid ro carb o n a
das e n tre hojas adultas de ram as con y sin fru to s durante el periodo de caída de fru to en p rim a v e ra , estudiándose además en las hojas jóvenes si
la elim inación del fru to del b ro te produce m odificaciones en la m o vilizació n
que la asem eje a la de las hojas de la misma brotació n pero de b ro tes ve
g e ta tivo s .
C) Los aspectos m etabólicos de la m ovilizació n del almidón en
las h o jas. S in d e s c a rta r la posible im portancia de la v ía fo s fo r o lític a , ya
que en este tra b a jo se ha detectado la p re se n c ia de a m ilo fo s fo rila s a s , este
estudio se ha centrado en las enzimas de la v ía a m ilo lític a , y en el se distingue:
- La re la c ió n existente e n tre la m ovilización del almidón y los
cambios en a ctiv id a d de las enzimas de la v ía a m ilo lític a . S e han d e te rm i­
nado las v a ria c io n e s de la actividad a m ilo lític a total durante el c ic lo anu­
-3 5 -
al de acumulación y degradación del almidón y en los experim entos de e li ­
minación de fr u ta , a s í como d u ran te el proceso de envejecim iento de las h o ja s , inducido m ediante la s eparación de las hojas del árbol y su incuba­
ción en in v e rn a d e ro .
- La c a ra c te riz a c ió n de las am iiasas presentes en los e x tra c ­
tos de ho jas. S e r e a liz a la separación c ro m ato g ráfic a y e le c tro fo ró tic a de
las d istin tas iso en zim as, determ inándose su c a r á c te r de a lf a - o b e ta -a m ila
sas por medio de la u tiliz a c ió n de inhibidores s ele c tiv o s de su a c tiv id a d .
-3 6 -
materiales
y
métodos
-3 7 -
I I . 1. -
MATERIAL
VEGETAL
Y
DISEÑO
EXPERIM ENTAL. -
El estudio se ha re a liz a d o en á rb o le s de naran jo dulce (C itru s
sin ensis
L . Osbeck) c v . W ashington-N avel, in jertad o s en naran jo amargo -
(C itru s aurantium L . ) ,
de cinco p a rc e la s s ita s , cu atro de e lla s en la p ro v in ­
c ia de C a s telló n (A lm e n a ra , B u r r ia n a , V a lí de Uxó y V illa r r e a l) y una en la
de V a le n c ia (S ag u n to ).
Las hojas se s ep a ra ro n del ta llo en el punto de in s erc ió n del pe
cio lo y se tra n s p o rta ro n al la b o ra to rio en un plazo máximo de dos h o ra s , a
6 -1 0 2C , en bolsas de p lá stic o p ara e v ita r la pérdida de humedad. Hasta el
momento de su u tiliz a c ió n se m antenían en n evera a 4 2C .
I I . 1 .1.-
INDUCCION
DE
LA
S E N E S C E N C IA .-
A lre d e d o r de 500 hojas con p e c io lo , de edad com prendida e n tre
3 y 7 meses según los experim entos, se desin fectaro n d ie z minutos en una solución de h ip o c lo rito c álc ico al 2 % p ara m antener la contam inación fúngica
y b a cterian a a n iv e le s b ajo s. A continuación se lavaron con agua destilada y
se elim inó el agua adherida en s u p e rfic ie , colocándose en un lecho de v é r m icu lita húmeda apoyadas en el envés. La mitad de las hojas se mantuvo bajo ilum inación constante (2500 luxes) y el resto en la oscuridad, en una cám ara
húmeda con techo de p lástico p a ra e v ita r la pérd id a de agua.
P erió d icam en te se m uestrearon al a z a r 40 hojas de las cám aras
con luz y 40 de las cám aras o s c u ra s , haciéndose dos grupos de 20 hojas en
cada caso. Los c u a tro grupos de hojas fueron tratad o s del mismo modo:
se
h ic ie ro n seis discos ccn un sacabocados de 1 ,8 cm de diám etro (evitando el
n ervio c e n tra l) y se sep araro n los de la mitad izq u ierd a p a ra a n a liz a r el cor\
tenido en almidón y a zú ca re s tra s su desecación en e s tu fa , y los de la mitad
-3 8 -
d erecha p a ra a n a liz a r el contenido en c lo ro fila y la activid ad a m ilo lític a del
te jid o .
I I . 1.2 .-
VARIACION
ESTACIONAL
LOLITICA
DEL
Y
DE
LA
ACTIVIDAD
AMi
CONTENIDO
EN
CARBOHIDRATOS
S e re a liz a ro n m uéstreos p erió d ico s a lo larg o del año de 36 á r ­
boles de la p a rc e la de Alm enara y de 20 á rb o les de las de B u rria n a y V i I l a —
r r e a l , tomándose dos m uestras de 100 hojas cada una en el caso de A lm enara
y 200 en los dem ás. P a ra una de las m uestras se e lig ie ro n he jas de b ro te s de otoño (fig u ra 2 , O); la o tra estaba compuesta p or hojas de la b ro tació n de
p rim av e ra de brotes con un fru to en su extrem o (fig u ra 2 , C ).
El m'uestreo
del p rim e r tipo de hojas se in ició un poco antes del comienzo de la p rim a v e ra
y se continuó, con d is tin ta p e rio d ic id a d según el año, hasta fin a les de v e ra n o ..
P a ra las hojas del segundo grupo los m uéstreos se in ic ia ro n a fin a le s de ’A b r il, cuando el d e s a rro llo de las hojas lo p e rm itió , continuándose hasta me
diados de otoño.
La toma de m uestras se re a liz ó según se indica en la sección I I .
1. Las hojas se lavaron con agua c o rrie n te y se secaron s u p e rfic ia lm e n te , procediendose a su desecación en estufa de a ir e fo rz a d o . Con las hojas mués
treadas en la p a rc e la de A lm e n a ra , tra s su lavado, se h ic ie ro n tre s grupos
al a z a r dentro de cada m u e stra, dos grupos de 25 hojas y uno de 5 0 . De ca­
da grupo de 25 hojas se h ic ie ro n discos de 1 ,8 cm de d iá m e tro , separándo­
los p ara a n á lis is de almidón y azú ca re s y p a ra la determ inación de la a c t M
dad a m ilo lític a como se indica en la sección a n te r io r . E l grupo re s ta n te , de
50 h o ja s, fue despeciolado y se determ inó a continuación el peso fr e s c o . Inme­
diatamente se calcu ló su s u p e rfic ie dibujando- el contorno de las hojas sobre
papel y pesando é s te . E l peso seco de las hojas se determ inó elim inando to
da el agua m ediante lio filiz a c ió n de las m ism as, determ inándose el p o rc en taje
-
39
-
B R O T E S DE
PRIMAVERA
RAMA
VIEJA
F ig u ra 2 . - M aterial vegetal u tiliz a d o . Hojas adultas de la brotación de oto
ño (0 ) y hojas jóvenes de la brotación de p rim av e ra: de brotes
fru c tífe ro s (C) y de brotes vegetativos ( V) .
-4 0 -
de peso seco de cada m uestra.
11.1.3.-
INFLUENCIA
ACTIVIDAD
DE
LA
FR U C TIFIC A C IO N
AMILOLITICA
Y
EL
SOBRE
CONTENIDO
LA
EN
CARBOHIDRATOS
La influencia del fru to sobre la m o vilizació n de los h id ra to s de
carbono desde las hojas se estudió con los á rb o le s de la p a rc e la de Alm ena­
r a , en dos sistem as modelo: desde las hojas de la b ro ta c ió n de
a n te rio r
otoño del aña
hacia el fru to que se d e s a rro lla a p a r t ir de sus yemas a x ila r e s , y
desde las hojas de brotes de p rim a v e ra hacia el fru to situado en el mismo b ro te .
En el p rim e ro de los modelos se comparó el contenido en azúcarre s y almidón y la actividad a m ilo lític a en las hojas adultas de ram as intactas
y de ram as en las que se e lim in aro n manualmente todos los fru to s cuando te ­
nían aproxim adamente 5 -6 mm de d iá m e tro , estando el e s tilo todavía unido al
o v a rio (7 de J u n io ). De cada tra ta m ien to se m arcaron dos ram as por á r b o l,
en un total de 36 árb o les y se tomaron m uestras de hojas hasta p rin c ip io s del mes de J u lio , momento en el que el
fru to había alcanzado un diám etro de
3 cm y se produce la abscisión de gran número de e llo s (caída de Ju n io ).
En el segundo modelo se m arcaro n en cada árbol tre s b ro te s ve­
getativos de p rim av e ra (F ig u ra 2 , V ) y seis b ro te s con un solo fru to term inal
(F ig u ra 2 , C) de la misma b ro ta c ió n . E l 7 de Junio (fru to s de 5 a 6 mm de
diám etro) se elim inaron manualmente los fru to s de la m itad de los bro tes del
segundo tip o . La toma de m uestras se re a liz ó según lo d e s c rito p ara el p r i ­
m er modelo.
E l tra s la d o ai la b o ra to rio se llevó a cabo como se indica en ia
-4 1 -
sección 1 1 . 1 . Las hojas se lavaron con agua c o rrie n te y se secaron s u p e rfi­
c ia lm e n te , dividiéndose p or la mitad y despreciando el n e rv io c e n tr a l. Como
en los re stan tes experim entos, la mitad derecha se u tiliz o p ara a n a liz a r la
a ctivid ad a m ilo lític a y la izq u ierd a p ara a n a liz a r el alm idón y los a z ú c a re s .
-4 2 -
I I . 2.-
ESTIMACION
I I . 2 .1 .-
OBTENCION
DE
LA
DEL
ACTIVIDAD
EXTRACTO
A M ILO LITIC A .-
E N Z IM A T IC O .-
Una cantidad de te jid o f o lia r , v a ria b le según los experim entos,
se tro c e ó con tije ra s y se tr itu r ó
como a b ra s iv o
en m o rte ro con
ayuda de arena de c u arzo
y en un medio tamponado. El proceso se re a liz ó e n tre 0 y 4
2 C y con el m a te ria l p re e n fria d o .
E| macerado se f ilt r ó a tra v é s de una doble capa de muselina y
se cen trifu g ó a 1 0 .0 0 0 g durante 10 m inutos. P o s te rio rm e n te se afo ró el so­
brenadante c la ro obtenido con el tampón de e xtra c c ió n y se u tiliz ó como e x -
-
tra c to enzim ático crudo p ara los a n á lis is c u a n tita tiv o s . Una p a rte alícuota del e x tra c to se concentró mediante la adición de sulfato amónico hasta el 100
% de s a tu ra c ió n . T ra s una nueva c en trifu g ació n de 10 minutos a 1 0 .0 0 0 g , se
resuspendió el p re cip ita d o con un volumen adecuado (0 ,5 - 1
mi) de tampón de
e x tra c c ió n . Una cen trifu g ac ió n adicional del resuspendido, de las mismas ca­
ra c te rís tic a s que las dos a n te rio re s , produjo un sobrenadante lim pio que fue
el u tiliz a d o en las e le c tr o fo re s is , p ara lo cual se le añadió sacarosa 2 ,4 M
en prop orción 1:5 con objeto de que la m uestra no flo ta ra en los p o c ilio s .
El mismo procedim iento fue u tiliza d o p a ra la obtención de extrac_
tos destinados a c ro m a to g ra fía de exclusión m o le c u la r. En este caso no se
añadió s a c a ro s a .
II. 2 .2 .-
DETERMINACION
DE
LA
A C T I V I D A D . -
I I . 2 . 2 . 1 . - D E T E R M IN A C IO N C U A N T I T A T I V A . -
S e ha seguido básicam ente el método de Jones y V a rn e r (1 9 6 7 ),
modificado por G a rc ía Luis (1 9 7 2 ), consistente en la incubación del e x tra c to
-4 3 -
e n zim á tic o , convenientemente diluid o p ara cada p ru e b a , en un tubo de ensayo
con 1 mi
de solución de almidón (140 mg de almidón soluble y 29 mg de C I 2
C a .2 H 2 0
en 100 mi de agua) y 1 mi de tampón a pH 5 , 0 .
La incubación se r e a liz ó en un baño te rm o s tatizad o a
25 2C duran
te un tiempo v a ria b le acorde con la a ctiv id a d del e x tra c to . La reacció n
se de
tuvo añadiendo 1 mi de solución de iodo (3 g de iodo resublim ado y 30 g
de
ioduro potásico en 50 mi de agua, diluido 1:10 en C IH 0 ,0 5 N ). A los 10 mi­
nutos se añadieron 10 mi de agua destilada y se m idió la densidad óptica en
un espectrofotóm etro a 620 nm al menos 15 minutos después de h aber añadido
el agua, restándose de los blancos, en los que la solución de iodo se añadió
antes que la del e x tra c to en zim ático .
E l descenso en densidad óptica respecto a los blancos, es d e c ir,
la a ctiv id a d enzim ática se expresa en increm ento de la densidad óptica a 620
nm por gramo de te jid o fre s c o y por minuto , según la fórm ula:
An ^
/
.
A D . 0 . 6 2 QVg x m m .
(AD .O .)m
=
(AD.O.)m x V
-------------------------------V 1 x t x PF
, en donde
= densidad óptica del blanco menos la de la m uestra incubada
V
=
volumen aforado (en mi)
V*
=
volumen de e x tra c to añadida al médio de incubación (en mi)
t
=
tiempo de incubación (en minutos)
PF
=
peso fre s c o tritu ra d o (en g ).
I I . 2 . 2 . 2 . - C R O M A T O G R A F IA DE E X C L U S IO N M O L E C U L A R .-
El e x tra c te enzim ático crudo p rep arad o
sección 1 1 . 2 . 1 .
del modo señalado en la
se introdujo en una columna de Sephadex G -1 0 0 mediante una
bomba p e ris tá ltic a que proporcionaba un flu jo constante y se eluyó con tampón
acetato 0 ,1
M , pH 5 ,0 con C ^ C a
1 mM, en cám ara f r ía a 4 - C .
En las e r o -
-4 4 -
m atog rafías
destinadas a d e te rm in a r el pH óptimo de las enzim as separadas
se eluyó con agua destilad a que contenía C l^C a 1 mM.
El flu jo del eluyente fue v a ria d o según las e x p e rie n c ia s a s í como
el tamaño de la colum na, obteniéndose las m ejores separaciones con la colum
na de 65 cm de longitud p o r 2 , 5 cm de diám etro y con un flu jo de 0 , 5 mi /
m i n . ................................................................................................................................................................
E l eluato se hizo p a s a r por un d e te c to r u ltra v io le ta con re g is tr a ­
d o r , midiéndose la densidad óptica del mismo
a 280 nm, recogiéndose con un
c o le c to r de fra c cio n e s y u tilizán d o se po sterio rm en te en los a n á lis is como ex­
tra c to e n zim ático .
I I . 2 . 2 . 3 . - E L E C T R O F O R E S IS E N G E L E S L A M IN A R E S D E P O ­
L I A C R IL A M I D A . -
A .- P re p a ra c ió n
de
l os
geles.-
S e siguió el método de O rn stein (1964) lig eram en te m odificado.
Los geles lam inares , de 0 , 4 mm de e s p e s o r, se p re p a ra ro n formando un sis
tema discontinuo de dos c ap a s , el gel de re s o lu c ió n y el gel de concentración
P a ra e llo se u tiliz a ro n las siguientes so lu cio n es, que deben m antenerse en
fr ío :
S olución
A: A c rila m id a 30 % (p /v ) y b is a c rila m id a
0 ,8 % (p /v )
Solución
B : tampón t r is - C IH 0 ,5 M pH 6 ,8
Solución
C : : tampón t r is - C IH
Solución
D : p e rs u lfa to amónico 10 % ( p / v ) , p re p ara d o
1 ,5 M pH 8 ,8
re c ie n te ­
m ente.
La m ezcla de p o lim e riza c ió n se obtuvo v e rtie n d o en un k itas a to
las cantidades correspondientes (indicadas más adelante) de las soluciones A ,
B (o C ), agua y solución D . Después de a g ita r la m e zc la , se desg asificó me­
-4 5 -
diante la a p licació n de vacío durante 7 m inutos, después de lo cual se añadió
T E M E D (N ,N ,N * jN '-te tr a m e tile n d ia m in a ). La m ezcla fin a l se agitó suavemente
y se in tro d ujo con ayuda de una pipeta pasteu r en el molde formado p o r dos
placas de c r is ta l separadas por un m arco constituido por tre s cin tas de t e fló n de 0 ,4 mm de g ro s o r.
P a ra obtener una in te rfa s e lisa y h o rizo n ta l e n tre las dos capas
se depositó cuidadosamente una capa de agua d estilad a de aproxim adamente un
centím etro de a ltu ra inmediatam ente después de v e r t e r la m ezcla de p o lim e riz a
ción corresp o n d ien te a. la p rim e ra capa (capa de re s o lu c ió n ). Dicha capa de
agua se elim inó antes de d e p o s itar la m ezcla gel ¡fic a n te c o rrespondiente a la
capa de c o n cen tració n .
La composición de las dos capas es la sig u ien te:
1 . - Gel de resolución (8 % de a c rila m id a , pH 8 ,8 ) .
Es una capa de 9 ,5 cm de a lt u r a , de una m ezcla compuesta de
2 ,6 2 5 mi
de solución A; 2 ,4 3 8 mi de solución C; 4 ,6 8 8 mi de agua;
c r o litro s
de solución D y 4 ,5 m ic ro litro s de T E M E D .
En lugar de agua, en esta capa se añadió; una solución
8 2 , 5 m ¡-
de am ilo­
pectina a z u re (131 m g /25 mi ) , de almidón (2 6 2 ,5 m g /2 5 mi) o de glucógeno (105 m g/25 mi) p ara p re p a ra r los geles p a ra e le c tro fo re s is con tinción espe­
c ífic a p ara activid ad e n zim a tic a , lo que re p re s e n ta un 0 , 2 5 %, un 0 ,5 0 % y
un 0 ,2 0 % respectivam ente en el volumen fin a l de la m ezcla de p o lim e riz a c ió n .
2 . - Gel de concentración (4 % de a c rila m id a , pH 6 , 8 ) .
E sta cap a , de 1 ,2 cm esta compuesta p o r 0 ,4 9 8 mi de solución A;
0 ,9 3 8 mi de solución B , 2, 31 mi de agua; 2 2 , 5 m ic ro litro s de solución D
y
3 , 7 5 m ic ro litro s de T E M E D .
Antes de a ñ a d ir esta ultim a capa se in tro d u jo en el molde un pe^
ne de teflón
(de dientes de 1 cm de anchura y 3 mm de separación) hasta la
-4 6 -
a ltu ra que indicaba la profundidad de la c a p a . E sto p e rm itió que una v e z p o lim e riz a d a la m ezcla se form asen pocilios donde se depositaron las m u e s tra s .
B .-
Electroforesis.-
Un volumen v a ria b le de e x tra c to , e n tre 25 y 75 m ic r o litr o s , se
in tro du jo en los pocilio s con ayuda de un m ic ro je rin g a H a m ilto n . La e le c tro fo
re s is se llevó a cabo a 4 2C en una cám ara f r í a ,
a c o rrie n te constante (20
mA) y v o lta je v a r ia b le , haciéndose a v a n za r las p ro te ín a s hacia el polo po si­
tiv o . El tampón de e le c tro fo re s is u tiliza d o estaba compuesto p or t r is - g lic in a
a pH 8 ,5 (6 g de tr is y 2 8 , 8 g de g licin a por l it r o ) .
C .-
Incubación
de
l os
geles.-
T ra s s e p a ra r el gel del molde de c r is t a l , se sum ergió en tampón
acetato 0 ,1
M pH 5 ,0 con C \ ^ C a
1 mM y se incubó durante dos horas en una
estufa a 31 2C p ara la v is u a liz a c ió n de la a ctiv id a d a m ilo lític a . En a q u ellas
e le c tro fo re s is en las que no se incorporó am ilopectina o almidón al g e l, se
añadió éste al medio de incubación.
La actividad a m ilo fo s fo ro lític a se detectó incubando el gel en tam
pón c itra to 0 ,1
M a pH ácido con g lu c o s a -1 -fo s fa to 0 ,7 % d urante un tiempo
v a ria b le e n tre 5 horas y toda la noche, a 30 2C , p a ra la re ac c ió n de s ín te ­
s is . P a ra la reacción de degradación se u tiliz ó tampón fo sfato a pH n eutro
con almidón 0 ,5 %, incubándose en este caso d urante 2 h o ra s , a 30 2C .
D .-
Tinción
y
fijación
de
l os
geles.-
Inm ediatam ente después de la incubación, los geles se tiñ e ro n
con la solución io do-iodurada d e s c rita en la sección
M .2.2.1v
manteniéndo
-4 7 -
los inm ersos en e lla durante unos m inutos. A continuación se tra s la d a ro n
a
o tra s bandejas con solución fija d o ra compuesta de úna solución acuosa de á c i­
do acético 12 % e isopropanol 25 %.
E .-
Fotografía.-
Los geles teñidos y fija d o s se extendieron sobre un soporte de c r is ta l velado sobre una caja de ilum inación p a ra r e a liz a r las fc to g ra fía s . E s
tas se h ic ie ro n con una cám ara M inolta s r T
101 p ro v is ta de objetivo M .C .m a -
c ro R okkor 1 : 3 ,5f , 50 mm y con p e líc u la Agfapan 2 5 .
La operación de fo to g ra fía no debe p ro lo n g a rs e , debido a que el
c a lo r
em itido por el foco luminoso produce la a p a ric ió n de burbujas y ondula
ciones que impiden un buen enfoque de todo el g e l.
F .— S e c a d o
de
l os
geles.-
Después de foto g rafiad o el gel se sum ergió
sa de
ácido acético
12 %, . isopropanol 25 % y g lic e rin a
en una solución acuo
2 ,5 % durante la no
che. U tiliza n d o como soporte una placa de v id r io , se envolvió el gel en papel
de celofán previam ente mojado en la solución a n te rio r y se dejó s ec a r a tem­
p e ra tu ra ambiente durante dos o tre s d ía s .
-4 8 -
I I . 2 .3 .-
ESTIMACION
DADES
ALFA-
INDEPENDIENTE
Y
DE
LAS
A C T I V I ­
B E T A - A M I LOL I T I C A S . -
La separación de las actividades a lf a - y b e ta -a m ilo lític a s en ex­
tra c to s crudos se r e a liz a en base a propiedades c a ra c te rís tic a s de cada una
de e lla s ta le s como la te rm o rre s is te n c ia de la a lfa -a m ila s a en p re s e n c ia
de
iones c a lc io y su inactivación p e r agentes s e c u e strad o re s de estos io n es, y
la te rm o lab ilid ad de la b e ta -a m ila s a , aún en p re se n c ia de c a lc io , su re s is te n
c ía a los secu estrad o res de c a lc io y su inactivación p or bajas co n ce n tra c io ­
nes de m etales pesados, p a rtic u la rm e n te por m e rc u rio .
Aunque la m ayor p a rte de los au to res se basan en estas p ro p ie ­
dades indicadas p ara h a c e r a n á lis is específicos de las a m ila s a s , e x is te una
gran d iv e rs id a d en cuanto a las condiciones en que se efectúan las in a c tiv a ­
ciones (T a b la s 1, 2 y 3 ).
Las condiciones de inactivación u tiliz a d a s en este tra b a jo se des­
c rib e n a continuación.
I I . 2.3.1.-
I N A C T I V A C I O N CON CLO RUR O M E R C U R IC O .-
Se re a liz ó añadiendo al e x tra c to crudo C I^ H g (re a c tiv o de los
grupos - S H ) en solución acuosa a concentración v a ria b le e n tre 0 ,0 1
y 1 mM
en proporción igual al e x tra c to y u tilizan d o d irectam en te esta solución en la
determ inación de la a c tiv id a d . P a ra la detección de la a ctiv id a d p o r métodos
e le c tro fo re tic o s y en los extrac to s sem ipurificados por c ro m a to g ra fía ,
la con
cen tració n de C ^ H g u tiliz a d a fue siem pre de 0 ,0 4 mM, dando una con cen tra­
ción final en el e xtrac to de 0 ,0 2 mM.
-4 9 -
T A B L A
INACTIVACION
POR
Gates y S im p so n ,1968
Pech et a l . ,
LA
CLORURO
C oncentración
R e fe ren c ia
S hain y M a y e r,
DE
1968
1971
5 x
-2
10
mM
2 x 10 ^ mM
F . T a r r a g o et a l . , 1976
H ild eb ran d et a l . ,
-3
1 x 10
mM
1981
D o e h le rt y D uke, 1983
1 x 10
-1
mM
2 x 10. ^ mM
1 x 10
_2
mM
1
ENZIMA
BETA-AMILASA
MERCURICO.
M a te ria l vegetal'
ssp
P a rte de la planta
hojas
Pisum sativum
sem illa
P iru s communis
fru to
Lens esculenta
sem illa
G lycin e max
sem illa
Hordeum v u lg a re
sem illa
-5 0 -
11.2 . 3 . 2 . -
I N A C T I V A C I O N POR E L I M I N A C I O N DE IO N E S C A L - :
C IO .-
Los iones c a lc io unidos en las p ro te ín a s del e x tra c to , se s e c u e s tra rq n m ediante la adición de í a ’sal disódica del ácido e tilen d ia m in o te traa c eH
co (E D T A ) a una concentración fin al de 100 mM y preincubándolo d is tin to s tiempos con el e x tra c to . E ste proceso se r e a liz ó a una te m p eratu ra de 4 2C
con el fin de e v ita r la acción de las pro teasas que se encuentran en los ex­
tra c to s c ru d o s.
Los e xtrac to s sem ipurificadós por c ro m a to g ra fía y los destinados
a e le c tro fo re s is se prein cubaron durante 30 minutos o durante toda la noche
en p re se n c ia del agente s e c u e s tra n te , indicándose el procedim iento seguido en cada experim ento.
11.2 . 3 . 3 . -
INACTIVACION TERM ICA.-
Los tubos con el e x tra c to se sum ergieron en un baño te rm o s ta tizado a 70 2C durante tiempos v a r ia b le s , colocándose inm ediatamente en h ie lo
p a ra e v ita r que la inactivación continuase después del tiempo fija d o . A c o n ti­
nuación se c en trifu g aro n a 1 0 .0 0 0 g durante 10 minutos y se desechó la p ro ­
teína p re c ip ita d a , u tilizán d o se el sobrenadante d irectam en te en la d e te rm in a ­
ción a m ilo lític a .
S e estudió en este apartado el posible efecto p ro te c to r de d is tin
tas concentraciones (de 0 .a: 45 mM) de C ^ C a sobre la a c tiv id a d .
-5 1 -
T A B L A
NACTIVACION
DE
LA
POR
R e fe re n c ia
ENZIMA
ALF A-AM I LASA
EDTA
C oncent. Tpo p re in c
M a te ria l vegetal
P a rte planta
S hain y M a y e r,
1968
10 mM
30 min
Pisum sativum
sem illa
Jacobsen et a l,
1970
5 mM
20 min
Hordeum v u lg are
sem illa
7 mM
30 min
O ry za sativa
sem illa
5 mM
30 min
Hordeum vul g are
sem illa
25 m M ,
45 min
N icotian a tabacum
callos
5 mM
60 min
Lens esculenta
sem illa
Pisum sativum
hoja
Baun et a L ,
1970
B ild e rb a c k , 1971
T ho rp e y M e ie r ,
F.
1974
T a rra g o et a l, 1976
Levi y P r e is s ,
1978
1 2 , 5 mM
*
10 mM
*
G epstein e M an, 1979
10 mM
4 días
O kita et a l . , 1979
10 mM
D a v is ,
1979
ti
ii
Phaseolus v u lg a ris
S p in acia o le rá c e a
* sin e s p e c ific a r
sem illa
sem illa
hoja
-5 2 -
T A B L A
INACTIVACION
TERMICA
'Tiem po
Ta
R e fe re n c ia
DE
3
LA
ENZIMA
15 min
20 mM
Juliano et a l . ,
1969
70 2C
15 min
X
Tanaka et a l . ,
1970
7 0 2C
15 min
6 02C
10 min
F .T a r r a g o et a l, 1976
7 0 2C
Levi y P r e is s ,
[>-
it
m
O ry z a s ativa
semil la
semil la
semil la
* r^.
50 mfví*3 P iru s commums
fru to
5 min
1 ,5 mM Lens esculenta
semil la
5 min
20 mM
hoja
01
1978
5 mM
Pisum sativum
P a r te pl«
0
1971
O
7 0 2C
Pech et a l . ,
M a te ria l vegetal
C12Ca
S w ain y D e k k e r, 1966a
BET A- A M IL A S A .
Pisum sativum
Adams et a l . ,
1980
7 0 2C
20 min
10 mM G lyc in e max
Adams et a l . ,
1981
7 0 2C
15 min
20 mM
ii
ti
semil la
70 2C
20 min
10 mM
ti
ii
semil la
7 0 2C
30 min
5 mM V iqna munqo
7 0 2C
20 min
3 mM
1979
H ild eb ran d et a l,
Koshiba et a l . ,
1981
1981
D o e h lert y D u ke,
1983
OI
U
O
10-2Gnin
O kita et a l . ,
10 mM S p in ac ia o le rá c e a
hoja
semil la
ssp
semi I la
semil la s ,
jas y r a íc e s .
*. sin e s p e c ific a r
xx
concentración en la e x tra c c ió n
-5 3 -
I I . 3 . -
DETERMINACIONES
Il„3.,1.-
A N A LITIC AS, -
CLOROFILA.-
S e ha seguido el método c o lo rim é tric o d e s c rito en los " O ffic ia l
Methods of A n a ly s is " ( 1 9 7 0 ) . Un peso aproxim ado de 3 gramos de hojas se
tro c e a ro n con t ije r a s , tomándose una alícuota de 0 ,3 gram os. E sta fue t r i ­
tu rad a en m o rte ro , a 0 -4 2C y en penumbra p a ra e v ita r
la a lte ra c ió n de
la
c lo r o fila , con arena de c u arzo como ab ras ivo y acetona 80 %.
El tritu ra d o obtenido se f ilt r ó a tra v é s de papel Whatman n2 2
a un k itas a to con ayuda de succión,
lavando con acetona
(80 %) hasta que
la pulpa reten id a sobre el papel fuese in co lo ra o ligeram ente a m a rille n ta , p a ra lo cual se h ic ie ro n re e x tra c c io n e s si fueron n e c e s a ria s . E l filtr a d o se
a fo ró a 50 mi con acetona 80 %, 25 de los cuales se pasaron a un embudo
de decantación en donde se había añadido previam ente 20 mi aproxim adam en­
te de é te r e tílic o . T r a s a ñ a d ir el e x tra c to acetónico al embudo, se v e rtió
asimismo igual cantidad de agua destilada p ara fa v o re c e r el paso de los pig
mentos al é te r . Cuando se s ep a ra ro n las dos fases se desechó la in fe r io r
-d e a c e to n a -a g u a -. La fase é te r se lavó tre s veces con agua d e s tila d a ha-*
ciendo s a lir el e x tra c to por el extrem o del embudo, inm erso en el agua con
tenida en o tro embudo de decantación colocado deb ajo . .
„ Después de e lim in a r el agua del últim o lavado, se a fo ró a 25 mi
con é te r e tílic o y se añadió sulfato sódico anhidro (en pro p o rció n 3 g /1 0 mi)
p ara e lim in a r los últim os restos de agua.
Las lec tu ra s espectrofotom étricas se re a liz a ro n a 662 y 6 4 4 ,5
nm, u tilizan d o é te r e tílic o como blanco.
Los resultados se expresan
como m iligram os de c lo ro fila por
centím etro cuadrado de te jid o , según las fórm ulas:
-5 4 -
C lo ro fila total (m g /l)
=
7 ,1 2 x D .O .
o62
+
1 6 ,8 x D .O .
q44j d
(1)
y transform ando estos v a lo re s en:
,
mg / cm
2
=
(1) x V x V "
-----------------------------V l:: x s u p e rfic ie
.
siendo
V = volumen aforado de acetona (mi)
V I = volumen de acetona añadido al embudo de decantación (mi)
V " = volumen aforado de é te r e tílic o (mi)
S u p e rfic ie del te jid o tr itu r a d o , en cm.
I I . 3 .2 .-
CARBOHIDRATOS.El m a te ria l vegetal desecado en una estufa de a ir e fo rza d o a
60 2C , durante al menos tre s d ía s ,
se pasó a
se tr itu r ó con un molino de paletas y
tra v é s de un tam iz de 60 m a lla s , guardándose en bolsas de plás
tico herm éticam ente c e rra d a s hasta el momento de su u tiliz a c ió n .
N .3 .2 .I.-
E X T R A C C IO N D E LAS M U E S T R A S .-
A .- A z ú c a r e s . Una muestra de 100 mg se colocó en un tubo de c en trífu g a y se
añadió
unvolumen aproxim ado de 15 mi de alcohol e tílic o 80 % a 75 2C , ca
lentándose a esta tem peratu ra durante 10 minutos con agitación o c as io n a l.
Después se centrifugó a 1 0 .0 0 0 g 10 minutos y se decantó el sobrenadante
a un e rle n m e y e r. El p recip itad o se re e x tra jo tre s veces del modo c ita d o .
De los e xtrac to s alcohólicos combinados se elim inó el alcohol
por evaporación a 50 2C con un evaporador ro ta to rio y el e x tra c to acuoso
re su lta n te se aforó a 50 mi con agua d e s tila d a , filtrá n d o s e a continuación
a tra v é s de papel Whatman n2 2 .
-5 5 -
E ste e x tra c to fue u tiliza d o en los a n á lis is de a zu ca re s totales
y re d u c to re s .
B. -
Almidón.-
Al residuo sólido p re cip ita d o después de la c u arta c en trifu g a ­
ción
en la e xtrac c ió n de a zú ca re s se le añadieron 25 mi de ácido p e rc ló H
co al 35 %, se agitó y se dejó durante toda la noche a tem p eratu ra ambieji
te . P o sterio rm e n te la m ezcla fue llevada a volumen lavando el tubo de cen
trffu g a
v a ria s veces con agua d e s tila d a .
El contenido del m atraz fue filtra d o a tra v é s
de papel
Whatman
n2 2 y el filtr a d o se u tiliz ó en el a n á lis is de alm idón.
I I . 3 . 2 . 2 . - A N A L IS IS DE LOS E X T R A C T O S .A .-
Azúcares
reductores.-
S e siguió el método de P a rk y Johnson (1 9 4 9 ). A 1 mi
tr a c to ,
convenientem ente d ilu id o y colocado en un tubo de ensayo,
de ex­
se aña­
dió 1 mi de solución c a rb o n a to -c ia n u ro ( 5 ,3 g de CO^Na^ y 0 ,6 5 g de C N K
p or litr o ) y 1 mi de solución fe rr ic ia n u ro ( 0 ,5 g de F e (C N ) K por lit r o ) ,
o J
agitándose la m ezcla y calentándola durante 15 minutos en un baño de agua
h irv ie n d o . Los tubos de ensayo se e n fria ro n , después de este tiem po, en
un baño con agua a tem peratu ra am biente, tra s lo cual se añadieron 5 mi
de solución fé r r ic a ( 1 , 5 g de (S O ^ ^ F e N H ^ . ^ f - ^ O , 50 mi de S O ^h ^ 1 N y
1 g de dodecil sulfato s ó d ico ), y se leyeron las densidades ópticas en un
espectrofotóm etro a 690 nm después de 15 m inutos.
Al mismo tiempo que se a n a liza ro n las m u e s tra s , se hizo una
c urva patrón con 0 , 4 y 8 m icrogram os de glucosa, c u rva en la que se in
te rp o laro n los v alo re s obtenidos p a ra las m uestras.
-5 6 -
Los resultados se expresan en form a de p o rc en taje de azúcares
re d u cto res sobre peso seco, según la form ula:
% a zú ca re s
=
m icrogram os glucosa x - - -
10 ^ x 100 x — - — .
V'
PS
*
siendo:
m icrogram os de glucosa = v a lo r obtenido en la in terp o lació n
V = volumen aforado (mi)
V ’ = volumen analizado (mi)
10 ^ = conversión de m icrogram os a m iligram os
100 = conversión a porcentaje
P S = peso seco analizado (mg)
B .-
Azúcares
totales
y
almidón.-
Los a zú cares totales y el almidón se d e term in aro n con el re a c ­
tivo a n tro n a -s u lfú ric o (M cC ready et a l . ,
1950).
S e añadieron 5 mi de e x tra c to , convenientem ente d ilu id o , a tu­
bos p ire x con tapón de rosca y se colocaron en una bandeja con hielo has­
ta que a lcan zaro n 0 2C . En este momento se añadieron 10 mi del re a c tiv o
a n tro n a -s u lfú ric o (0 ,4 g de antrona en 200 mi de ácido s u lfú ric o 95 %, frío )
p re e n fria d o en la nevera y medidos con b u re ta . Los tubos se ag itaro n e n é r­
gicamente y se a b rió el tapón un cuarto de rosca p ara p e rm itir la salida de
gases, c errán d o se de nuevo y calentando los tubos en un baño de agua h ir ­
viendo durante s ie te minutos y medio exactam ente. A continuación se e n fria ­
ron en un baño con agua a tem peratu ra ambiente y se midió su densidad óp­
tica con un espectrofotóm etro a 630 nm.
Del mismo modo que se hizo en los a n á lis is de a zú ca re s reduc­
to re s , se p re p aró también una curva estándar de glucosa, usándose las con
centraciones 0 , 50 y 100 m icrogram os de glucosa.
-5 7 -
Los v a lo re s de densidad óptica de las m uestras se in te rp o la ro n
en la c u rva patrón y los m iligram os de glucosa obtenidos se tra n s fo rm a ro n
en po rcen taje sobre peso seco u tilizán d o se la misma fórm ula que en el caso
de a zú ca re s re d u c to re s , excepto p ara el cálcu lo del p o rcen taje de almidón
en que se m u ltiplicó el resultado obtenido en la fórm ula por 0 ,9 p a ra com­
pensar la pérdida de una molécula de agua en la p o lim e riza c ió n de la gluco
s a.
% almidón = m icrogram os glucosa x
V
VI
x 10
-3
x 100 x
1
PS
x 0 ,9
-5 8 -
I I . 4 . -
ANALISIS
E S T A D IS T IC O S . -
Los datos obtenidos se som etieron al a n á lis is de la v a ria n z a ,
in
dicándose el modelo seguido en la sección c o rre s p o n d ie n te . En los casos en
los que los datos rep resen tan porcentajes se re a liz ó la transform ación y =
a re sen V p
. En consecuencia, los efectos que han llegado a e stab lecerse
lo fueron m ediante pruebas F de Snedecor (S okal y R o h lf,
1969).
La c a ra c te riz a c ió n de los grupos de n iv ele s o tratam ientos den­
tro de cada e fe c to , generadores de d ife re n c ia s s ig n ific a tiv a s , se re a liz ó me
diante la prueba secuencial de S tu d e n t-N e w m a n -K e u ls , al nivel de p ro b a b ili­
dad del 95 % (Sokal y R o h lf,
1969). Los resultados a s í obtenidos se presen
tan de form a sim plificada como diagram as en los que "1 " re p res e n ta la exis
tencia de d ife re n c ia s s ig n ific a tiv a s y "O" los casos en que no han podido d e m o s tra rs e . Una v is u a liza c ió n inm ediata de los resu ltad o s se obtiene de la
p a rte in fe r io r de los d ia g ram a s, donde se re p re s e n ta n como b a rra s los d is ­
tintos grupos obtenidos del test s e c u e n cia l.
En los casos en que los distin to s n iv ele s de un e fe cto , p re v ia ­
mente establecido por a n á lis is de la v a ria n z a que g e n e ra , poseen una natu­
ra le z a c u a n tita tiv a , el a n á lis is estad ístico se ha com pletado mediante a n á li­
sis de re g re s ió n mínimo c u a d rá tic a . S e ha explorado el a ju ste lin e a l, el cuad rático y el cúbico, y la s ig n ific a ció n de la inform ación asociada a los
d istintos ajustes se ha estudiado mediante el a n á lis is de la v a ria n z a sobre
la p a rtic ió n generada p or la re g res ió n y a un nivel de s ig n ific a ció n del 1 %.
En todas las g rá fic a s se re p re s e n ta el e r r o r estándar de los
puntos mediante b a rra s v e r tic a le s .
resultados
-6 0 -
i;ii:i. -
CARACTERIZACION
I I I .1.1 . -
EXTRACTOS
DE
LA
A C TIV ID A D
ENZIMATICA
CRUDOS.-
Como paso p re v io al estudio
de las c a r a c te rís tic a s de las en­
zim as h id ro lític a s del alm idón, se re a liz a ro n una s e rie de experim entos en­
caminados a la determ inación de las condiciones óptimas de estim ación de su
a c tiv id a d .
E ste estudio p re lim in a r consistió en la com probación de la lin ea -
lidad de la actividad a m ilo lític a fre n te al tiempo de incubación y fre n te a la
concentración re la tiv a de enzima en el m edio. Se obtuvo asimismo el pH óp­
timo de incubación que presentan los e xtrac to s enzim áticos en d ife ren tes tam
pones y la influencia de los iones c a lc io sobre la a ctiv id a d de los extracto s
obtenidos con tampón c ¡tra to -fo s fa to .
E l resultado obtenido al incubar d is tin ta s concentraciones r e la ­
tiv as de e xtrac to enzim ático se presenta en la fig u ra 3 . H ay un cambio de
pendiente p ara una v a ria c ió n de densidad óptica de 0 ,1 2 5 u d ., que se obser,
va también p ara el mismo v a lo r de densidad óptica en la g rá fic a que r e p re ­
senta la actividad a m ilo lític a fre n te al tiempo de incubación (fig u ra 4 ), no
alcanzándose en este caso el lím ite de s ig n ific a ció n debido al menor núme­
ro de puntos en esta g r á fic a . Cuando se com para la a ctiv id a d en las dos condiciones (tiem po constante, concentración constante) se comprueba que los puntos se solapan (fig u ra 5 ),
lo que indica que el cambio de pendiente
que se produce no es debido a la p re se n c ia de una determ inada concentra­
ción de enzima o a un tiempo de incubación de la m e zc la , sino a cambios
producidos en la re la c ió n enzima - s u s tra to , es d e c ir , en la actividad enz_i_
m ática. En todos los experim entos re a liza d o s se han c o rre g id o los v a lo re s
de densidad óptica s u p e rio re s a 0 ,1 2 5 ud. p ara que los p o rcen tajes de ac­
tivid ad recuperada no se vean afectados por el cambio de la razón de pro-^
p orcionalidad que se da a p a r t ir de ese punto.
A 0.0
-
61
-
f « 0 ,0 *2 ♦ 0, 33 8 x
r » 0,99»
y * 0.003 * 0,500 x
r « 0,992
0
0
.2
,*
.6
CONCENTRACION
,3
1.0
R E L A T IV A
F ig u r a 3 . - R e la c ió n e n tre el descenso en den sid a d ó p tic a a 620 nm y la con­
c e n t r a c ió n r e la t iv a de e x t r a c t o e n z im á tic o c r u d o .
0,1 M a pH 5 , 5 , con C l^ C a 1 mM, como medio de in c u b a c ió n .
Tampón aceta to
-
62
-
y * 0,0 31 ♦ 0 ,0 2 6 x
r »0.998
0.3
0,2
0,1
y * 0,0006 * 0,037 x
r . 0,995
0
0
1
2
3
5
7
15
10
TIE M P O
( min.)
F ig u r a 4 . - R e la c ió n e n tre el descenso en d ensidad ó p tic a a 620 nm y el
tiem po de in c u b a c ió n .
Tampón acetato 0,1
C l^ C a 1 mM, como medio de in c u b a c ió n .
M a pH 5 , 5 , con
-
63
-
©
o
y * 0,038 *0 .3 4 3 *
f * 0,002 * 0.432 x
p « 0.990
0
2
,1
3
,7
5
CONCENTRACION RELATIVA
O
t
2
3
5
7
10
TIEMPO (m in .)
F ig u r a 5 . - V a r ia c ió n de la densidad ó p tic a a 620 nm a tiempo c o nsta nte
( • ) y a c o n c e n tr a c ió n r e la t iv a de enzima co n sta n te (o ).
b a ción en tampón a c e ta to 0,1
f ig u r a s 3 y 4).
In c u ­
M a pH 5 , 5 , con CI_Ca 1 mM. (D atos de las —
La a decuación de las e s c a la s de las a b s c is a s p e r m ite o b s e r ­
v a r que ambas re c ta s de r e g r e s ió n son comunes p a r a las d e te rm in a c io n e s a
tie m po co n s ta n te y a c o n c e n tr a c ió n r e la t iv a c o n s ta n te .
-6 4 -
Los e xtrac to s crudos u tiliza d o s p a ra la determ inación del pH óptimo se obtuvieron por tritu ra c ió n con agua d e stila d a o con un tampón de
baja fu e rz a iónica * Al medio de incubación se añadió 1 mi de tampón al pH
deseado en cada caso , u tilizán d o se el tampón ácido a c e tic o -a c e ta to sódico
0 ,2 5 M con un rango de pH e n tre 3 ,7 5 y 5 ,5 0 , tampón tris -m a le a to 0 ,2 5 M
p a ra pH comprendidos e n tre 6 ,0 y 8 ,5 y tampón c itr a to 0 ,0 1
M - fosfató
0 ,0 2 M p ara pH e n tre 3 ,2 y 7 , 0 . Los resultados de a ctiv id a d e n zim á tic a , representados en las fig u ra s 6 , 7 y 8 re sp e c tiva m e n te , se expresan como
p o rcen taje sobre el v a lo r máximo de a ctiv id a d obtenido en cada d e te rm in a ­
c ió n .
Con los tre s sistem as tampón u tiliza d o s se observa un descen­
so acusado de la actividad a los pH e xtrem o s , tanto ácidos como b á s ic o s , y
una meseta en la zona comprendida e n tre pH 5 ,0 y 6 , 5 . Con tampón acetato
la activid ad aumenta hasta el v a lo r de pH de 5 ,5 (fig u ra 6 ),
lím ite de u t ili­
zación de este tampón, existiendo además un hombro a lre d e d o r de pH 4 , 5 .
Con tampón tris -m a le a to (fig u ra 7) la a ctiv id a d máxima se alcanza a pH 6 ,2 5
P a ra el tampón c itra to - fosfato se obtiene el máximo de activid ad e n tre los
pH 5 ,5 y 6 , 5 , zona en la que la actividad es igual o s u p e rio r al 95 % de la m áxim a. Se observa también un hombro e n tre pH 4 , 5 y 5 , 0 ,
lo que in d i­
ca la existen cia de distin tas am ilasas en los e x tra c to s crudos (fig u ra 8 ).
A pH 5 ,5 la activid ad a m ilo lític a es muy s im ila r con los tre s tampones u tiliz a d o s , en p re se n c ia de C l^C a 1 mM, produciéndose una activi_
dad máxima con tampón acetato y siendo 94 + 2 y 89 + 2 los v a lo re s re la U
vos que se obtienen con tampón c itra to -fo s fa to y tr is -m a le a to , respectivam en
te .
La adición de iones c alc io al medio de incubación no aumenta la activid ad a m ilo lític a de los e xtrac to s c ru d o s, aún en el caso en que se
obtuvieron con tampón c itra to -fo s fa to (fig u ra 9 ), condiciones en que se pro
-
65
-
c*
O
F ig u r a 6 . - A c t iv id a d a m ilo lí t ic a r e la t iv a (p o rc e n ta je s o b r e el v a l o r máximo)
a los d is t in t o s p H , con tampón a c e ta to . La c u r v a es el v a l o r medio de c u a t r o r e p e t ic io n e s d is t in t a s .
F ig u r a 7 . - A c t iv id a d a m ilo lí t ic a r e la t iv a (p o rc e n ta je s o b r e el v a l o r máximo)
a los d is t in t o s p H , con tampón t r i s - m a l e a t o .
l o r medio de s e is r e p e t ic io n e s d is t in t a s .
La c u r v a es el v a ­
-
67
-
100
F ig u r a 8 . - A c t iv id a d a m ilo lí t ic a r e la t iv a (p o rc e n ta je s o b r e el v a l o r máximo)
a los d is t in t o s p H , con tampón c i t r a t o - f o s f a t o .
P a r a cada v a lo r
de pH s u p e r i o r a 3 ,7 5 la c u r v a re p re s e n ta d a es la media de dos r e p e t ic io
nes d is t in t a s .
-
68
-
-
toe-
1
.o»
«•
M
“3
1
«9
w
2
o
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»•
O
£
3
MY * 99,325 - 0,059 x
r * - 0,799
40-
20-
0
.......... ................. ......... ................................ — ----------------------- ------------------------- -----------0 09
ss
2Z5
(C l2 C a I
(m M )
F ig u r a 9 . - A c t iv id a d a m ilo lí t ic a (p o rc e n ta je s o b re el v a l o r máximo) en p re s e n
cía de d iv e r s a s c o n c e n tr a c io n e s de C l- C a en el medio de in c u b a c ió n .
Tampón c i t r a t o - f o s f a t o ,
pH 6 , 2 5 .
-6 9 -
duce una notable activación en los e xtrac to s de cotiledones de guisante
(Swain y D e k k e r,
-
1 9 6 6 ^ ).
I I I . 1-. 1 . 1 . - E S T IM A C IO N
IN D E P E N D IE N T E D E LAS D I S T I N ­
T A S A C T IV ID A D E S A M I L O L I T I C A S . -
Los e xtrac to s crudos se som etieron
a la acción de inhibidores
esp ecífico s p ara s e p a ra r las d is tin ta s activid ad es a m ilo lític a s p re s e n te s .
Los experim entos se re a liz a ro n a dos p H , 4 ,5 y 6 ,2 5 , p ara d e te rm in a r qué
in h ib id o res actúan preferentem ente a cada pH y com probar a sí si estas dos
zonas de pH corresponden a máximos de a ctiv id a d de d is tin ta s am ilasas co­
mo sucede en el guisante (S hain y M a y e r,
A .-
Inactivación
por
1968).
cloruro
mercúrico.-
La inhibición de la activid ad b e ta -a m ilo lític a se re a liz ó u tiliz a n
do C ^ H g a d is tin ta s concentraciones e n tre 5 x 1 0
-3
y 5 x 10
-1
mM.
Los
pH a los que se re a liz a ro n los experim entos; se obtuvieron con el tampón acetato (pH 4 ,5 ) y c itra to -fo s fa to y t r is m aleato (pH 6 ,2 5 ) .
Los resultados no se ven influidos por las condiciones de pH
en las que se r e a liz a la d e te rm in a c ió n ;
en todos los casos se obtienen re
sultados s im ila re s p ara las d istin tas concentraciones de in h ib id o r. El c lo ru
ro m e rc ú ric o produce la inactivación p ro g re s iv a de la am ilasa del te jid o fo
lia r de n aran jo (tabla 4 ), siendo muy pequeña a concentraciones bajas ( a
10
-2
mM queda más del 90 % de la activid ad in ic ia l) y aumentando con la -
concentración hasta obtenerse una inactivación
de a lre d e d o r del 45 % con
c lo ru ro m e rcú ric o 0 ,1 mM.
Puesto que no se han encontrado d ife re n c ia s s ig n ific a tiv a s en­
tr e la inhibición obtenida bajo las d is tin ta s condiciones de p H , se ha hecho
un aju ste por re g res ió n con todos los datos de los d is tin to s experim entos ,
-
T A B L A
MO DELO. -
siendo
y
T A B L A DEL A N A L I S I S
Fu en te
Z . ....
k (ij)
B = concentración de inhibidor
DE LA V A R I A N Z A . -
Suma de cu a d ra d o s
pH
-
4
x . . = u + A. + B . + (A * B ) . . +
¡J /
i
J
ij
A = pH
70
G ra d o s lib e r t a d C u a d ra d o s m edios
2 4 ,2 3
1
2 4 ,2 3
18477,29
7
2639,61
5 4 8 ,4 3
7
7 8 ,3 5
2 6 2 5 ,2 3
48
5 4 ,6 9
F
C o n c e n tra c ió n
de in h ib id o r
pH *
c o n c e n tr a c ió n
re s id u a l
**
4 8 ,2 6
1 ,4 3 ns
* * s ig n if ic a tiv o a l 1 %
D lA G R A M A DEL T E S T . 0
0
0 ,0 0 5
0,01
0,02
0 ,0 3
0 ,0 5
0,1
0 ,5
0 ,0 0 5
0,01
0 ,0 2
0 ,0 3
0 ,0 5
0,1
0 ,5
-7 1 -
obteniéndose la cu rva representada en la fig u ra 10.
B .-
Inactivación
Los experim entos de
térmica.inactivación té rm ic a se lle v a ro n a cabo ca
lentando los e xtrac to s crudos a 70 2C , a los
dos pH m encionados, con y -
sin la adición de c a lc io (C ^ C a ) 25 mM (concentración f in a l).
«
No se obtiene protección de la a ctiv id a d p o r la p re s e n c ia de iones c a lc io a ninguno de los dos pH ensayados (T a b la 5 ).
A pH 4 ,5 (fig u ra 1 1 -A ) se produce una in a ctiv a ció n casi total desde el p rim e r minuto de tra ta m ie n to , que deja una a c tiv id a d del 10 % del
testigo y que se mantiene constante a lre d e d o r de este v a lo r hasta los 30 minutos de calentam iento.
A pH 6 ,2 5 el efecto
(fig u ra 11 —B ) . El descenso de la
del c a lo r es más gradual y menos acusado
actividad es menos im portante que a pH
4 , 5 , en especial durante los p rim ero s minutos de c ale n ta m ien to , quedando
a lre d e d o r de un 50 % de la activid ad después del p rim e r minuto y más de
un 30 % a los 10 minutos de tratam iento
C .-
Inactivación
por
secuestro
de
iones
calcio.
La inactivación de la enzima a lfa -a m ila s a se llevó a cabo u t ili­
zando E D T A a una concentración final de 100 mM, que se ha dem ostrado más e fe ctiv a en la inactivación de e xtrac to s crudos de guisante (S a n z ,
1978)
que las u tiliz a d a s por otros au tores (T a b la 2) y preincubando la m ezcla a
4 2C durante distintos tiem pos, de 0 a 60 m inutos. Los expérim entos se rea
Iiz a ro n bajo las mismas condiciones de pH que con los demás in h ib id o re s .
E xisten d ife re n c ia s e n tre los d istin to s experim entos en la inac­
tivación obtenida durante los p rim ero s minutos de p re in c u b a c ió n . S in embar
-
72
-
e
o
»
n
b
a
M»
60 o
o
y = 98,506 *521,390 x * 783,0 26 x2
■' 1' ■
'i--'.
0
00?
001
00 3
--------------------------------------- *— — r1
0,05
0.1
■
0,5
(C l2Hgl (mM)
F ig u r a
1 0 . — In a c tiv a c ió n de e x tr a c t o s c ru d o s p o r d is t in t a s c o n c e n tra c io n e s de
La a c tiv id a d se re p r e s e n ta como p o r c e n ta je s o b re el va ­
lo r del e x tr a c t o sin in h i b i d o r . La c u r v a es el v a l o r medio de ocho r e p e t ic io
nes d i s t in t a s .
-
pK
100
73
-
4 ,5
TIEMPO ( m i n .)
100
pH
6,25
TI EM PO ( min.)
F ig u r a
1 1 .-
In a c t iv a c ió n té r m ic a a 70 2C de los e x t r a c t o s c r u d o s a pH
4 , 5 (A) y a pH 6 ,2 5 ( B ) . La a c tiv id a d se p re s e n ta como
p o r c e n ta je s o b re el v a l o r del e x tr a c t o s in c a le n t a r . Las c u r v a s sen el
v a lo r medio de dos r e p e t ic io n e s d is t in t a s .
-
-
74
-
L A _ _ EL k _ A _ _ i _
MO DELO.
sie n do
^
ijk
_
+ a . + B . + C + ( a * B ) . . +(A#C)
+ (B * C )., + ( A * B * C )
i
j
k
ij
ik
jk
ijk
/
A = tiem po de ca le n ta m ie n to ; B = p re s e n c ia de c a lc io y C = pH
T A B L A DEL A N A L I S I S
Fuente
DE LA V A R I A N Z A . -
Sufría de cu a d ra d o s g ra d o s lib e r t a d C u a d ra d o s medios
T iem po
F
**
12438,91
6
2 0 7 3 ,1 5
1 5 ,9 3
1
1 5,9 3
1816 ,7 3
1
1 81 6 ,7 3
T ¡e m p o #ca lc¡o
2 6 7 ,0 3
6
4 4 ,5 0
T ie m p o *p H
4 1 0 ,5 7
6
6 8 ,4 3
6 ,2 6 *
*•*
9 ,6 2
C a lc¡o # pH
1 3 ,2 5
1
1 3 ,2 5
1 ,86 ns
Resid ua l
4 2 ,6 7
6
7,11
a l 5 % ; ** s ig n ific a tiv o
al 1 %
C a lc io
pH
* s ig n ific a tiv o
2 9 1 ,5 3
2 , 2 4 ns
**
2 5 5 ,4 7
D IA G R A M A S DE LOS T E S T S S E C U E N C I A L E S . pH 4 , 5
0
1
3
5
pH 6 ,2 5
10
20
30
0
0
0
1
1
3
3
5
5
10
10
20
20
30
30
1
3
5
10
20
30
-7 5 -
go, las inactivaciones fin a le s son s im ila re s en todos los casos, estando en
general a lre d e d o r del 40 %, independientemente del pH al que se prein cuba
la m ezcla (fig u ra 12).
-
76
-
100
60.
T i e m p o de p r e i n c u b a c i ó n (m in .)
100
pH
6.25
60 -
T i e m p o de p r e i n c u b a c i ó n ( m i n . )
F ig u r a 1 2 . -
In a c t iv a c ió n de los e x tr a c t o s c r u d o s p o r E D T A , a pH 4 , 5
(A) y a pH 6 ,2 5 ( B ) . La a c tiv id a d se p re s e n ta como p o r ­
ce n ta je s o b re el v a lo r del e x tr a c t o s in i n h i b i r . Cada una de las r e p e ­
t ic io n e s re a liz a d a s se re p re s e n ta p o r s e p a ra d o .
-7 7 -
II I . í . 2 . -
EXTRACTOS
TOGRAFIA
SEM I PUR I F I CADOS
DE
EXCLUSION
POR
CROMA­
MOLECULAR.-
I I I . 1 . 2 . 1 . - S E P A R A C IO N D E LAS E N Z I M A S . -
La separación de un e x tra c to crudo de p ro te ín a s en una colum­
na de Sephadex G -1 0 0 de 31 x 2 ,5 cm , con un flu jo de eluyente de 1 ,6 m i/
min p e rm itió s e p a ra r la activid ad a m ilo lític a de la fra c c ió n m ayor de p ro te í
ñas del e x tra c to . Solam ente se encontró a ctiv id a d enzim ática en las fra c c io
nes e n tre 74 y 133 mi de volumen de e lu c ió n , con un máximo p ara 92 mi y
un hombro a lre d e d o r de 84 mi (c o rre sp o n d ie n te a los volúmenes re la tiv o s de e lu c ió n , V e/ V o , de 1 ,6 2 y 2 ,0 0 ) ,
lo que s u g ie re una m u ltip licid ad de -
enzim as (fig u ra 13).
A largando la columna hasta una longitud de 65 cm y reduciendo
el flu jo hasta un v a lo r de 0 ,5 m l/m in se optim izó la re s o lu c ió n , separándo­
se dos picos claram ente e n tre los volúmenes, de elución de 155 a 200 mi —
<Ve/V o = 1 ,6 6 ) el p rim e ro y de 200 a 270 mi el segundo (V e/ V o= 2 ,0 5 ), y que
denominaremos como F ra c c ió n enzim ática 1 y F ra c c ió n enzim ática 2 según
el orden en que son e lu íd a s . La p roporción re la tiv a de ambas fra c cio n e s fue v a ria b le p ara cada c ro m a to g ra fía , aunque de form a general puede deci_r
se que cada una re p res e n ta a lre d e d o r del 50 % de la a ctiv id a d total recupe
rada tra s el proceso de p u rific a c ió n , con el método de estim ación u tilizad o .
La separación de las dos fra c c io n e s enzim áticas sin embargo no fue to ta l, ya que no existen e n tre e lla s fra c c io n e s cro m ato g ráficas sin
activid ad (fig u ra 14), y no pudo m e jo ra rs e varia n d o las condiciones de la c ro m a to g ra fía . En los experim entos subsiguientes de c a ra c te riz a c ió n de es­
tas fra c cio n e s enzim áticas se e lig ie ro n por tanto las fra c c io n e s crom atográ
fic a s extrem as de cada una de las zonas p a ra e v ita r la p resen cia de los dos tipos de enzim as.
-7 8 -
0.0S
100
200
VOLUMEN
F ig u r a
0 6 ELUCION
1 3 . - A b s o r b a n c ia a 280 nm (o) y a c tiv id a d a m ilo lí t ic a ( A D . O .
620
(■ II
) (•)
que p re s e n ta el e lu a to de la columna de 31 x 2 , 5 cm . V olum en de
las f r a c c io n e s , 7 , 4 mi; f l u j o , 1 ,6 m l / m i n . ; e lu y e n te , tampón a ce ta to 0,1
pH 5 , 0 , con C l^ C a 1 mM.
M a
-
79
-
A0.0.,
toa
200
300
500
VOLUMEN OE ELUCION (mi)
F ig u r a 1 4 . - A b s o rb a n c ia a 280 nm (o) y a c tiv id a d a m ilo lí t ic a ( A D . O .
que p re s e n ta el e lu a to de la columna de 65 x 2 , 5 cm .
620
) (•)
Volum en de
las f r a c c io n e s , 6 , 9 mi; f l u j o , 0 ,5 7 5 m l / m i n . ; e lu y e n te , tampón a ce ta to 0,1
a pH 5 , 0 , con C l^ C a 1 mM.
M
-8 0 -
La disminución del volumen de cada fra c c ió n c ro m a to g rá fic a s í
p e rm itió poner de m anifiesto la fa lta de homogeneidad de la fra c c ió n e n z i­
m ática 2 , apareciendo hasta 5 subpicos, pero no la de la fra c c ió n enzim á­
tic a 1 en la que sigue observándose un solo pico (fig u ra 1 5 ).
I I I . 1 . 2 . 2 . - C A R A C T E R IZ A C IO N D E LA S F R A C C IO N E S E N Z IM A T IC A S .-
Del mismo modo que con el e x tra c to c ru d o , se re a liz a ro n es­
tudios del comportamiento fre n te a d istintos in h ib id o res de las dos fr a c c io ­
nes e n zim á tic a s , con la fin a lid a d de c a r a c te r iz a r su a ctiv id a d como p e rte n e
c íen te a a lf a - o a b e ta -a m ila s a . S e llevó a cabo además un estudio de su
pH óptim o, re alizá n d o se la e xtrac c ió n de las enzimas con agua d e s tila d a , que se u tiliz ó también como e lu ye n te . Las c ro m ato g rafía s se r e a liz a ro n en
una columna de 65 cm de a ltu ra y el flu jo fue de 0 , 5 m l/m in . P a ra la con­
secución de los pH deseados se u tiliz a ro n los tre s sistem as tampón mencio
nados en la sección I I 1 .1 . 1 .
A .-
Fracción
enzimática
1.-
En la c u rva de pH obtenida p a ra la fra c c ió n enzim ática 1 (fig u ­
ra 16) se observa que en un rango muy am plio de v a lo re s de pH no influye
este en la a c tiv id a d , no encontrándose d ife re n c ia s s ig n ific a tiv a s (T a b la 6 )
en tre la actividad obtenida de pH 4 ,0 a pH 6 , 5 . S e observa también que esta fra c c ió n enzim ática no es muy afectada por los pH b a jo s , recuperándo
se más del 70 % de la activid ad máxima a pH 3 , 0 .
P a ra todo el rango de
pH estudiado no se encuentran d ife re n c ia s e n tre los d istin to s tampones p ara
el mismo p H , con la única excepción del pH 5 ,5 e n tre los tampones c it r a t o fosfato y tris -m a le a to .
-8 1 -
0 . 0 . 2 80
a
o . a 420 ( • )
0 ,5 l
O.V
0.3 '
0,2
0,1
O
100
1
1.5
*
2
25
200
VOLUMEN
3
3.5
V« /
F ig u ra
DE ELUCION ( m i )
V
v0
1 5 . - A b s o rb a n c ia a 280 nm (tr a z o g ru e s o ) y a c tiv id a d a m ilo lític a (A D .
O.
) ( • ) que p re s e n ta el e lu a to de la colum na de 65 x 2 ,5 cm .
620
V olum en de la s fr a c c io n e s , 4 ,4 m i. E lu c ió n con tam pón a ce ta to 0,1 M a pH 5,0
con C l^ C a 1 mM, a un flu jo de 0 ,4 6 m l/m ¡n . Los volúm enes r e la tiv o s de e lu ­
c ió n son m a yo re s que en lo s o tr o s ca so s d eb id o a un d is tin to em paquetam ien­
to de la co lu m n a .
20
pH
F ig u ra
1 6 . - C u rv a de pH de la fr a c c ió n e n z im á tic a 1. La c u rv a re p re s e n ta
la media de t r e s re p e tic io n e s d is tin ta s con cada Lampón. Se -
u tiliz a r o n
los tam pones a c e ta to , c it r a t o - fo s f a to y t r is - m a le a to .
-8 3 -
T A B L A
M O D E L O .-
siendo
x ..
ij
=
/
u
+
A.
i
+
£ .,.v
j( i)
A = condiciones de la determ inación (pH y tampón).
T A B L A DEL A N A L IS IS
DE LA V A R I A N Z A . -
Fuente
Suma de cuadrados
G rados lib e rta d Cuadrados medios
Condiciones
5 1 1 4 ,0 9
21
2 4 3 ,5 3
Residual
1 1 8 8 ,3 9
44
2 7,01
F
9 ,0 2 * *
** significativo al 1 %
D IA G R A M A DEL T E S T . A cetato
3 3 ,5 4 4 ,5 5 .5 ,5
Ace
tato
3
3 ,5
4
4 ,5
5
5 ,5
3
3 ,5
C itr .
F o s f.
4
4 ,5
5
5 ,5
6
0
0
0
0
0
0
0 0
0 0
0 0
0 0
0
C itra to -fo s fa to
T ris -m a le a to
3 3 ,5 4 4 ,5 5 5 ,5 6 6 ,5 7 7 , 5
5 ,5 6 6 ,5 7 7 , 5 8
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
1
1
0
1
0
0
1
0
0
0
0
1 0
1 1
0
0
1 0
1 0
0 0
0 0
0
0
0
0
0
1 1
1
1 0
0 0
0 0
0 0
0
0
0
0
0
0
0
5 ,5
6
6 ,5
7
m a l.
7 ,5
T r is
..
—
8
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
1
1
0
1
0
0
0
0
1
0
6 ,5
7
7 ,5
0
0
0
0
0
0
0
0
'
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
0
0
1 1
0 0
0 0
1 0
1
1
1
1
1
1
0
1
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
1
1
1
0
0
0
0
1
-8 4 -
Las fra c c io n e s c ro m ato g ráficas elegidas se som etieron a tr a t a ­
m iento con los dos in h ib id o res específicos u tiliza d o s con los e x tra c to s c ru
dos: E D T A y C I^ H g , a concentraciones fin a le s de 100 mM y 2 x 10
-2
mM,
re sp ectivam en te. Ambos agentes se dejaro n en contacto con el e x tra c to du­
ra n te media hora antes de p ro c e d e r al a n á lis is de la a c tiv id a d .
La fra c c ió n enzim ática 1 es d rá stic a m en te inhibida p o r el C ^ H g
quedando menos de un 10 % de la a ctiv id a d o r ig in a l, m ien tras que el E D T A
la afecta muy poco (T a b la 7 ) ,
recuperándose el 90 % d e la a c tiv id a d in ic ia l.
La prein cubación del e x tra c to enzim ático d urante toda la noche con los in­
h ib id o res no v a r ía los re s u lta d o s .
T A B L A
7
P re in c u b a c ió n , 30 m in .
EDTA
100 mM
C I2Hg 2 x 10“ 2mM
90 + 4 *
9 + 3
P re in c u b a c ió n , toda la noche
9 6 ,1
6 ,3
* los datos de esta columna son la media de cinco re p e tic io n e s d is tin ta s .
La c ro m ato g rafía de b e ta -a m ila s a de cebada c o m ercial ( E . C . 3 .
2 . 1 . 2 . ; M e rc k , n2 de catálogo 1327) en la misma columna y bajo las mismas
condiciones que las re a liz a d a s p a ra los e xtrac to s de te jid o fo lia r de n a ran ­
jo (fig u ra 14) p e rm itió co m p arar los volúmenes de reten ció n re s p e c tiv o s . En
la fig u ra 17 están representados los v a lo re s de absorbancia a 280 nm del
eluato de la cro m ato g rafía de la b e ta -a m ila s a de cebada; en e lla aparecen
v a rio s máximos de a b s o rc ió n . De cada uno de e llo s se a n a lizó la activid ad
enzim ática de la fra c c ió n c ro m ato g ráfic a que~-presenta m ayor absorción
a
280 nm, obteniéndose a ctiv id a d a m ilo lític a únicam ente en el p rim e r p ic o , y
siendo los restantes debidos a p ro teín as contam inantes o bien a productos
de deg rad ació n. Como puede o b s e rv a rs e , la b e ta -a m ila s a de cebada tiene un
-
B-AMILASA
DE
85
-
CEBADA
o.o. 280
0,10
V « lu *« n
«lucían
da la fra c c ió n c n z ia á fic a
1
0.05
O
100
200
300
VOLUMEN OE ELUCION (a i)
1.S
15
2.5
V, / v 0
F ig u ra
1 7 . - A b s o rb a n c ia a 280 nm del e lu a to de la c ro m a to g ra fía de b eta-arm
lasa de ce b a d a . La fr a c c ió n que p re s e n ta a c tiv id a d a m ilo lític a se
se ña la con un c í r c u lo . Colum na y c o n d ic io n e s ig u a le s a las de la fig u r a
14.
-8 6 -
T A B L A
M O D E L O .-
x ..
=
u +
ij
siendo
A
=
/
A.
8
+
£
i
v
j
(
i
)
condiciones de la determ inación (pH y tampón),
T A B L A DEL A N A L IS IS DE LA V A R I A N Z A .Fuente
Suma de cuadrados
Condiciones
Grados lib e rta d
Cuadrados medios
1 3 8 3 9 ,1 0
21
6 5 9 ,0 0
116 9 ,4 7
22
5 3 ,1 6
R esidual
1 2 ,4 0
** significativo al 1 %
D IA G R A M A DEL T E S T . C itra to -fo s fa to
Acetato
T ris -m a le a to
3 3 , 5 4 4 , 5 5 5,5 3 3 , 5 4 4, 5 5 5 , 5 6 6 , 5 7 7 , 5
Ace­
tato
3
'3 ,5
4
4 .5
5
5 .5
3
C itr .
F o s f.
3 .5
4
0
1
.1
1
1
1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
5,566,577,58
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0 0 0
0 0 0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1 1 1 1
1 1 1 1 1 1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0 0 0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
1
5 .5
0
0 0 0
0
0
0
0
0
0
6
6 .5
7
7 .5
5 .5
T r is
6
m a l.
6 .5
7
7 .5
8
1
0
0
1
4 .5
5
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
-8 7 -
volumen de retención de 175 m i, volumen que se encuentra centrado e n tre
los m árgenes obtenidos p a ra la fra c c ió n enzim ática 1 de los e xtrac to s de
n a ran jo y que se indican en la fig u r a .
B .-
Fracción
enzimática
2 .-
E l rango de pH en el que la a ctiv id a d de la fra c c ió n e n zim á ti­
ca 2 no se
ve influida por este es igual de am plio que p a ra la fra c c ió n en­
zim átic a 1 ,
aunque se encuentra desplazado media unidad hacia
más a lc a lin a ( 4 , 5 - 7 , 0 )
la región -
(F ig u ra 1 8). La p rin c ip a l d ife re n c ia con la fra c c ió n
enzim ática 1 se encuentra en su com portam iento fre n te a los pH más ácidos
ensayados puesto que la a ctiv id a d de la fra c c ió n 2 está fuertem ente influida
p or los pH
3 y 3 , 5 . A pH 3 ,0 la a ctiv id a d es in fe r io r al 20 % del máxim o,
y a pH 3 ,5
es in fe rio r al 25 %. P o r el c o n tr a r io ,
las dos fra c c io n e s e n z i­
m áticas no presentan d ife re n c ia s de a ctiv id a d e n tre s í a los pH b á sico s. Al
igual que en la fra c c ió n enzim ática
1, no se encuentran d ife re n c ia s e n tre -
los distin to s
pH (T a b la 8 ).
tampones a los mismos
La a ctiv id a d de esta fra c c ió n enzim ática está fuertem ente in flu í
da p o r el E D T A 100 mM, aunque el p o rc en taje de inhibición es v a ria b le se
gún los experim entos. E x is te también un c la ró efecto del C I^H g sobre su a ctivid ad que produce una inactivación p a rc ia l de a lre d e d o r del 50 % en las
condiciones de exp erim en tació n . Cuando la prein cubación se a la rg ó toda la
noche, la actividad en p re se n c ia de C ^ H g disminuyó d rá s tic a m e n te , quedan
do menos de
un 10 % de la activid ad o r ig in a L (T a b la 9 ).
J__A _B_L_A
9
P re in c u b a c ió n , 30 m in.
E D T A 100 mM
23 + 8 *
C I.H g 2 x 1Ó_2mM
47 + 4
P re in c u b a c ió n , toda la noche
1 5 ,5
6 ,0
* los datos de esta columna son la media de cinco re p etic io n e s d is tin ta s .
t
100
F ig u ra
1 8 . - C urva de pH de la fra c c ió n enzim ática 2 . La c u rva re p res e n ta
la media de dos repeticiones d is tin ta s con cada tampón. S e -
u tiliz a ro n los tampones acetato, c itra to -fo s fa to y tr is -m a le a to .
-8 9 -
En la c ro m a to g ra fía de a lfa -a m ila s a de B a c illu s s u b tilis ( E . C .
3 . 2 . 1 . 1 . ; M erck na de catálogo 1329) en las mismas condiciones que las demás cro m ato g rafía s re a liz a d a s (fig u ra 19) aparecen dos picos de p ro te í­
n as, detectándose a ctiv id a d a m ilo lític a únicam ente en el p rim e ro . E l volu­
men de retención de esta p ro te ín a es de 205 m i, lo que indica un lig e ro desplazam iento respecto a la fra c c ió n enzim ática 2 de los e xtrac to s de na­
ra n jo . Hay que s e ñ a la r a este re s p e c to , que según F is c h e r et a l1. (1 9 6 0 ),
la a lfa -a m ila s a de B . s u b tilis
tiene un peso m o lecu lar de 1 0 0 .0 0 0 dalto n s,
v a lo r s u p e rio r a los pesos m oleculares de las a lfa -a m ila s a s de o tros o ríg e
n e s, que oscilan e n tre 4 5 .0 0 0 y 6 0 .0 0 0 daltons.
90-
ot - A MI L A S A
DE
BAC1LLUS
S UBT I L I S
o.o.2|0
0.10
Volumen 0» «lución
ó* la fracción «nziaáfica 2
0
100
200
300
VOLUMEN CE ELUCION (al)
1
1.5
2
2.S
3
V # /V a
F ig u ra
1 9 . - A b s o rb a n c ia a 280 nm del e lu a to de la c ro m a to g ra fía de a lf e-am_¡_
lasa de B a c illu s s u b tilis . La fr a c c ió n que p re s e n ta a c tiv id a d am]
lo lític a se se ña la con un c í r c u lo . Colum na y c o n d ic io n e s ig u a le s a la s de la
fig u r a
14.
-9 1 -
I I I . 1.3.--
ENZIMAS
EN
GELES
SEPARADAS
DE
POR E LE C T R O F O R E S I S
P OL I A C R I LA M I D A . -
I I I . T . 3 . 1 . - S E P A R A C IO N DE LAS E N Z IM A S .-
La e le c tro fo re s is en geles de p o lía c rila m íd a p e rm itió la separa
ción a p a r t ir
de extracto s crudos de dos zonas de a ctiv id a d e n zim á tic a .
lím ites de estas dos zonas
Los
de activid ad están bien d e fin id o s , llegando a pro
d u c irs e una separación en bandas que en ocasiones no es com pleta, lo que
impide r e a liz a r el estudio de las c a ra c te rís tic a s de cada banda.
La incorporación del sustrato de la reacció n enzim ática a los
geles previam ente a la separación e le c tro fo ré tic a m ejoró notablemente la re
solución o btenida, reduciendo la m ovilidad re la tiv a de las enzim as, m ejoran
do la n itid e z de las bandas y perm itiendo la detección de bandas a d icio n a les
en algunos e x tra c to s . Los resultados obtenidos son m ejores cuando se incor
p ora am ilopectina a zu re a una co ncentración fin al de 0 ,2 5 % que con alm i­
dón s o lu b le , por lo que la m ayor p a rte del tra b a jo se re a liz ó en aquéllas
condiciones.
E l número total de bandas separadas es de 1 3, que se numeran
en el texto c o rre la tiv a m e n te según su m ovilidad re la tiv a y siendo la número
1 la más cercana al o rig e n . Su detección depende c rític a m e n te de la c a n ti­
dad de e x tra c to introducido en el gel a s í como de su a ctiv id a d esp e c ífica y
las condiciones de incubación. Debido a las d ife re n c ia s notables de a c tiv i­
dad, la dem ostración sim ultánea de todas e lla s no es posible ya que las con
diciones adecuadas p ara las más intensas no perm iten la v is u a liza c ió n de las menos a c tiv a s , que exigen tiempos de incubación con el s u strato muy su
p e rio re s y provocan la difusión excesiva de las a n te rio re s (fig u ra 2 0 ). S e is
de estas bandas, de gran intensidad, se encuentran invariablem ente en to -
-
F ig u ra 2 0 . - E le c tro fo re g ra m a s de extractos
92
-
crudos de hojas adultas en gel
de p o liac rilam id a con am ilopectina a zu re 0 ,2 5 % como sustrato
incorporado al g e l. E xtra c to s enzim áticos obtenidos con tampón acetato 0,1
M , pH 5 ,0 , con Cl Ca 1 mM. G eles incubados durante 2 horas en tampón de e x tra c c ió n , a 30 2C .
A . - A ctividad del e xtra c to : 0 ,0 5 3 ud. / cm
B . - A ctividad del extracto: 0 ,0 2 2 ud. / cm
2
x min.
2
x min.
-9 3 -
dos los e xtrac to s (números 1 , 2 - 3 , 5 ,
12 y 1 3 ). Junto a éstas hay o tra s ban
das menos intensas p e ro que también se encuentran en todos los e le c tro fo re •
gram as (números 4 ,
10 y 1 1 ). Las bandas 6 , 7 , 8 y 9 solo se detectan oca
sio nalm ente.
Según su m ovilidad e le c tro fo ré tic a se distinguen dos grupos de
b and as. Las de menor m ovilidad son 8 , de las cuales hay tre s p rin c ip a le s :
a) la número 1 , que se presenta siem pre con ondulaciones típ ic a s ; b) en se
gundo lu gar aparecen siem pre dos bandas muy próxim as (núm eros 2 y 3) ,
que en ocasiones re s u lta d ifíc il d e lim ita r e n tre s í, y c) la número 5 , que
es la banda más ancha. Además de éstas se encuentran c u a tro bandas más
en esta zona del gel: en p rim e r lugar la banda número 4 que se encuentra
en prácticam ente todas las e le c tro fo re s is y se tra ta de una banda difusa con lím ites menos c la ro s que las mencionadas a n te rio rm e n te . Lo mismo pue­
de d e c irs e de la banda número 6 salvo que ésta no se encuentra s ie m p re .
Respecto a las dos re stan tes (núm eros 7 y 8 ), se tra ta de bandas muy es­
tre c h a s que se han detectado únicamente en e le c tro fo re s is
en geles
con
a m ilo p e c tin a , p rin cip alm en te en e x tra c to s de hojas jó v e n e s .
El grupo de bandas de m ayor m ovilidad está form ado p o r c in c o ,
observándose dos p rin c ip a le s (números 12 y 1 3), dos de m enor a ctiv id a d
-
(húmeros 10 y 11) y una últim a banda (núm ero 9) de a ctiv id a d mucho m enor
y que, a d ife re n c ia de las o tra s c u a tro , no se detecta en todas las e le c tro
fo r e s is . Tantc estas cinco bandas como las números 7 y 8 degradan la am_¡_
lopectina a z u re dejando un c o lo r re sid u al en el g e l, a d ife re n c ia de las
-
o tra s seis bandas, que degradan el s u s tra to totalm ente, p o r lo que a p a re ­
cen bandas blancas sin c o lo r re s id u a l.
En la tabla 10 se presentan los r f medidos a s í como los
e rro
re s estándar c o rre s p o n d ie n te s , en buena p a rte debidos a d ife re n c ia s en ac
tiv id a d . S i bien el modelo de separación no cam bia, la m enor a ctiv id a d del
-9 4 -
e x tra c to produce una lig e ra v a ria c ió n en la lo c alizac ió n de las bandas, obte­
niéndose r f m ayores p ara los e xtrac to s de m ayor a c tiv id a d . Los r f calculados
p a ra 'e le c tn ó fo re s ts con almidón como s u strato son m ayores que los c o rre s p o n ­
dientes a am ilopectina; la equivalencia de las bandas en los dos s u strato s se
obtiene fácilm en te p o r com paración de los distin to s e le c tro fo re g ra m a s .
La p re c ip ita c ió n fraccionada dé los e xtrac to s con sulfato amónico
no p e rm ite s e p a ra r las d istin tas bandas o grupos de bandas en fra c c io n e s de
te rm in a d a s , si bien se observa una in te n s ific a ció n de ías bandas de menor m ovilidad en la fra c c ió n p ro te ica que p re c ip ita e n tre el 25 y el 45 % de sa­
tu ra c ió n y de las de mayor m ovilidad con las que p re c ip ita n del 45 al 60 %
(fig u ra s 21 y 2 2 ).
I I 1. 1 . 3 . 2 v - C A R A C T E R IZ A C IO N DE LA S B A N D A S D E A C T IV ^
DAD A M I L O L I T I C A . -
A .-
Inactivación
por
inhibidores
selectivos.-
La c a ra c te riz a c ió n de la a ctiv id a d de las d is tin ta s bandas se lie
vó a cabo , al igual que con los e xtrac to s crudos y las fra c cio n e s c ro m a to g rá fic a s , p o r medio de inactivaciones esp e c ífica s con las mismas co n ce n tra ­
ciones de in a c tiv a d o r, aunque la preincubación se prolongó toda la noche. El
estudio se r e a liz ó con e xtrac to s p ro te ico s fraccionados con el fin de aumen­
t a r la a ctiv id a d e s p e c ífic a . La fra c c ió n p re cip ita d a e n tre 25 y 45 % de satu
ra ció n se u tiliz ó p a ra la c a ra c te riz a c ió n de las bandas de menor m ovilidad
y la que p re c ip ita e n tre 45 y 60 % p a ra las de m ayor m ovilidad.
La preincubación de los e xtrac to s con E D T A
100 mM dio como
resultado la d e sa p a rició n de las bandas numeradas del 2 al 6 , produciéndose
una dism inución muy im portante de la banda numero 1 de la que sólo queda
un r a s tro tenue (fig u ra s 2 3 , 24 y 2 5 , geles con almidón y fig u ra s 2 6 , 27 y
-9 5 -
2 8 , geles con am ilo p e c tin a).
Las bandas 10 a 13 no se ven afectadas por es
te tra ta m ie n to , perm aneciendo in a lte ra d a s .
E l tratam ien to de los e xtrac to s con C ^ H g 2 x 1 0
-2
mM produce
la d e sa p a rició n de las bandas 10 a 13, provocando además una dism inución
de la intensidad de las seis p rim e ra s .
P o r ú ltim o , el calentam iento de los e xtrac to s durante 15 minu­
tos a 70 2C en p re se n c ia de C l^C a 19 mM y a pH 7 , 4 (tampón t r i s - C I H ' 0 ,0 2 5
M) produce la dism inución de la activid ad de las bandas 1 a 6 m ien tras que
desaparecen totalm ente las re s ta n te s , con excepción de la número 12 que m antiene una pequeña a ctiv id a d que se ve prácticam ente elim inada cuando el
e x tra c to calentado se dial iza toda la noche fre n te a tampón t r is - C IH 0 ,0 1 2 5
M a pH 7 , 4 (fig u ra 2 9 ).
B .-
E I ec t r of or es i s
de
la s
fracciones
cromatográ
f icas . -
En las e le c tro fo re s is de la fra c c ió n enzim ática 1 de la crom ato­
g ra fía se observa la a p a ric ió n de las bandas de m ayor m ovilidad y en ocasio
nes se detecta un re sto de las bandas números 1 y 2 - 3 , debido a la existen
c ia de solapamientos e n tre los dos picos c ro m a to g rá fic o s , (fig u ra s 30 y 3 1 ).
Las inactivaciones e sp ecíficas de la a ctiv id a d a m ilo lític a de las
bandas co rrespondientes a esta fra c c ió n enzim ática ponen de m anifiesto en la
e le c tro fo re s is con almidón en el gel que el com portam iento de las mismas es
idéntico al encontrado en las e le c tro fo re s is de e x tra c to s c ru d o s , no siendo
afectadas por el E D T A m ientras que son totalm ente inhibidas por el C I^ H g (fig u ra 3 2 ).
En las e le c tro fo re s is de la fra c c ió n enzim ática 2 se observan
también los dos grupos de bandas, aunque se v is u a liza n p re fe ren tem e n te las
-9 6 -
de menor m ovilidad (fig u ra s 30 y 3 1 ).
E stas bandas desaparecen de form a -
casi total con E D T A , quedando un re sto de la número 1 y siendo afectadas
en menor medida p or el Cl Hg (fig u ra 3 3 ).
r f de las bandas de a ctiv id a d a m ilo lític a en e le c tro fo re g ra m a s con am ilo p e c tina o con almidón incorporado al gel como s u s tra to .
Banda
Am ilopectina
Almidón
1
0 ,0 7 8 + 0 ,0 0 3
0 ,1 3 0 + 0 ,0 1 3
2 -3
0 ,1 2 5 + 0 ,0 0 2
0 ,1 7 0
4
0 ,1 5 9 + 0 ,0 0 3
0 ,1 7 9 + 0 ,0 0 8
5
0 ,2 0 6 + 0 ,0 0 4
0 ,2 3 0 + 0 ,0 1 3
6
0 ,2 4 0 + 0 ,0 0 9
7
0 ,3 0 0 + 0 ,0 1 3
8
0 ,3 3
+ 0 ,0 3
9
0 ,4 4
+ 0 ,0 4
0 ,0 1 3
10
0 ,5 0 0 + 0 ,0 0 8
0 ,5 5
+ 0 ,0 2
11
0 ,5 3 0 + 0 ,0 0 8
0 ,5 9
+ 0 ,0 2
12
0 ,5 7 0 + 0 ,0 0 8
0 ,6 3 0 + 0 ,0 0 4
13
0 ,6 1 0 + 0 ,0 1 0 .
0 ,6 7
+ 0 ,0 2
-9 7 -
F ig u ra 21 . - E le c tro fo re g ra m a s y densitogram as de las fra c cio n e s p ro te ica s
que p re c ip ita n e n tre el 25 y 45 % y e n tre 45 y 60 % de satura
ción con sulfato am ónico. Gel con almidón soluble 0 , 5 % incorporado al gel
como s u s tra to .
-
98
-
1 2-3
FRACCION
2S-<>5%
0.0 620
12-35
1011 12 13
FRACCION
0.0.
620
910111213
AS - 60 %
-9 9 -
F ig u ra 2 2 . - E le c tro fo re g ra m a s y densitogram as de las fra c cio n e s p ro te ic a s
que p re c ip ita n e n tre 25 y 45 % y e n tre 45 y 60 % de s a tu ra ­
ción con sulfato amónico. Gel con am ilopectina a z u re 0 ,2 5 % incorporado
como s u s tra to .
H
-100-
2S - A S
%
FRACCION
AS - 60 %
w rró
F RAC CI ON
ft» -(ñ ¡
-1 0 1 -
F ig u ra 2 3 . - E le c tro fo re g ra m a s y densitogram as de las fra c c io n e s p ro te ica s
que p re c ip ita n e n tre 25 y 45 % y e n tre 45 y 60 % de s a tu r a - '
ción con sulfato am ónico. Gel con almidón soluble 0 ,5 % como s u s tra to .
FRACCION
FRACCI ON
25-45
45-60
%
%
-1 0 3 -
de I i fra c c ió n 2 5 -4 5 % , in a c -2
tívada con E D T A 100 mM y con C I^ H g 2 x 10
mM. Gel con a l -
F ig u ra 2 4 . - E le c tro fo re g ra m a s y densitogram as
midón soluble 0 ,5 % como s u s tra to .
-
IN AC TIV A C IO N E S
OE LA
F R A C C I ON
2 5 -AS
EBTA
1234 5
104
%
100
mh
-
-1 0 5 -
Fdgura
2 5 . - E le c tro fo re g ra m a s y densitogram as de la fra c c ió n 4 5 -6 0 %, inac
tivada con E D T A
i
100 mM
y con C I^ H g 2 x 1 0
midón soluble 0 ,5 % como s u s tra to .
_2
mM. Gel con a l -
-106
INACTIVACIONES
OE
LA
FRACCI ON
LS - 60
%
12
EDTA
100 mM
<3
oO
d
ir
10111213
1
12-34 5
-1 0 7 -
F ig u ra 2 6 . - E le c tro fo re g ra m a s y densitogram as de las fra c c io n e s p ro te ic a s
que p re c ip ita n e n tre 25 y 45 % y e n tre 45 y 60 % de s a tu ra ­
ción con sulfato am ónico. Gel con am ilopectina a zu re 0 , 25 % como s u s tra to .
-
FR A C C I O N
5
10 11 1213
FRACCI ON
-
25-45%
620
1 23 4
108
45-60%
-1 0 9 -
Figura 2 7 .- Electroforegramas y densitogramas de la fracción 25-45 %, i nac
-2
tivada con EDTA
E D T A 100 mM y con C ^ H g 2 x 1 0
mM. Gel con ami
lopectina azure 0,25 % como sustrato.
-
IN A C T IV A C IO N E S
OE
LA
FRACCION
25 - 4 5
%
EOTA
10
o
O
O
\ p
1213
100
mM
110
-
-1 1 1 -
Figura 2 8 .- Electroforegramas y densitogramas de la fracción 45-60 %, inac
_2
tivada con EDTA
E D T A 100 mM y con C ^ H g 2 x 1 0
mM. Gel con ami
lopectina azure 0,25 % como sustrato.
-1 1 2 -
IM A C T IV A C I 0M £ S
OE
LA
FRAC CION
4S * 60
%
EDTA
12-3 4
5
100 («M
-1 1 3 -
F ig u ra 2 9 . - E le c tro fo re g ra m a s y densitogram as de un e x tra c to p ro te ic o p re ­
cipitado at 100 % de s atu ració n con sulfato am ónico. Gel con am ilopectina a zu re 0 ,2 5 % como s u s tra to .
A . - E x tra c to c ru d o .
B . - E x tra c to calentado a 70 2C durante 15 m inutos.
C . - E x tra c to calentado y d ia liza d o fre n te a tampón t r i s - C I .
-
-
TERMICA
E x tr a c to
crudo
°* °* 6 20
0 0 620
I N A C T I V A C IO N
114
ca le n ta d o
•620
E xtracto
Extracto
calentado y diaiízado
-1 1 5 -
Figura 3 0 .- Electroforegramas y densitogramas de las fracciones enzimáticas
separadas por cromatografía, en gel con amilopectina azure 0 ,2 5
% como sustrato.
-
116
-
FR ACCION ENZ1MATICA 2
620
FRACCION
123
9 10111213
ENZIMAT1CA
1
-1 1 7 -
Figura 3 1 .- Electroforegramas y densitogramas de las fracciones enzimáticas
separadas por cromatografía, en gel con almidón soluble 0 ,5 %
como sustrato.
FRACCION E N Z IM A T IC A
2
o
d
123
111213
FRACCION
10111213
ENZIM ATICA
1
-1 1 9 -
F íg u ra 3 2 . - E le c tro fo re g ra m a s y densitogram as de la fra c c ió n enzim ática 1 ,
inactivada con E D T A
100 mM y con C I^ H g 2 x 1 0
almidón soluble 0 ,5 % como s u s tra to .
-2
mM. Gel con
ENZIM ATICA
0.0. ¿2o
FRACCION
COTA
10111213
0.0.¿20
1
100 mM
-121-
F ig u ra 3 3 . - E le c tro fo re g ra m a s y densitogram as de la fra c c ió n enzim ática 2 ,
inactivada con E D T A 100 mM y C ^ H g 2 x 1 0
midón soluble 0 ,5 % como s u s tra to .
-2
mM. Gel con a_l_
-1 2 2 -
F R A C C IO N
ENZ1MAT1C A
2
EQTA 100 mtf
O.O. 62 0
1213
2-3
0 . 0 . 620
Cl 2 «g
2x10*2 m
-1 2 3 -
I I 1 . 1 . 3 . 3 . - A M IL O F O S F O R IL A S A S . -
La p o sib ilid ad de que p a rte de la actividad detectada p udiera s e r
debida a a m ilo fo s fo rila s a s se comprobó estudiando su p resen cia en los geles
mediante la reacción de s ín tes is de alm idón, mucho más sensible y e s p e c ífi­
ca p a ra d e te c ta r su p re se n c ia que la h id r ó lis is . S e incorporó en este caso
glucógeno al gel como in ic ia d o r de la s ín te s is ; la p resen cia de a ctiv id a d h i d r o lític a en estos geles se detectó añadiendo almidón soluble al medio de ¡n
cubación (m a te ria le s y métodos) ya que el c o lo r del glucógeno con el iodo es
muy tenue e in su ficien te p ara c a r a c te r iz a r la actividad enzim ática d e g ra d a tiva.
-
.
Los resultados de un experim ento típ ico se presentan en la figu
ra 3 4 . No se encuentran d ife re n c ia s en los zim ogram as obtenidos m ediante incubación en tampón fosfato y en tampón acetato cuando se estudia la h id ró ­
lis is del almidón s o lu b le , lo que excluye la posibilidad de que alguna de las
bandas estudiadas fu e ra debida exclusivam ente a una a m ilo fo s fo rila s a . La po
s ib ilid a d de que la a ctiv id a d re s is te n te al E D T A asociada a la banda 1 fu e ra
una a m ilo fo s fo rila s a es incom patible no sólo con el hecho de que no re q u ie re
fosfato inorgánico (a p a rec e en tampón acetato) sino también con la ausencia
de a ctiv id a d s in té tic a a ese r f .
S ólo se encuentra a ctiv id a d de s ín te s is de
almidón a un r f s im ila r al de la banda número 4 , pero su a ctiv id a d h id ro líH
ca es in a p re c ia b le como se dem uestra cuando se inhibe la a ctiv id a d a m ilo líH
ca po r acción del E D T A .
La baja actividad obtenida p ara las a m ilo fo s fo rila s a s es debida a
las condiciones de determ inación en este estudio y no r e fle ja el contenido re a l de esta enzima en las h o ja s. Una activid ad sustancialm ente s u p e rio r se
obtiene cuando la e xtrac c ió n se r e a liz a a pH más a lc a lin o s
( 6 , 5 y 7 ,0 ) y -
cuando la incubación se re a liz a a pH 6 , 0 , fre n te al pH 5 ,0 norm alm ente uü
lizado en el estudio de las am ilasas (fig u ra 3 5 ).
-1 2 4 -
En conjunto, se ha puesto de m anifiesto la exis te n cia de tre s
form as d is tin ta s de la enzima a m ilo fo s fo rila s a . Una de e lla s queda re te n id a
en el lím ite del ge! de co n ce n tra c ió n , sin d e s p la za rs e de modo detectable d en tro del gel de resolución en el que está incorporado el glucógeno.
Las
o tra s dos tienen una m ovilidad re la tiv a s im ila r y aparecen como dos bandas
bastante próxim as que pueden s e p a ra rs e p arcialm en te mediante un fra c c io n a ­
miento con sulfato amónico; en la fra c c ió n que p re c ip ita e n tre 25 y 45 % de
s atu ració n sólo se detecta la banda de menor m o vilid ad , m ien tras que p a rte
de la actividad c o rresp o n d ien te a esta enzima y toda la a ctiv id a d de la is o enzima de m ayor m ovilidad se re cu p e ra en la fra c c ió n que p re c ip ita e n tre 0
y 25 % de s a tu ra c ió n ,(fig u ra 3 5 ). En algunos casos las dos bandas que pe­
n etran en el gel de resolución no son d is tin g u ib le s , sin que se haya hecho
un estudio c r ític o de la ausencia de alguna de e lla s o si es un a rte fa c to de
bido a la u tiliz a c ió n de condiciones poco fa v o rab le s p a ra su s e p a ra c ió n . El
tra ta m ien to de los e x tra c to s con deterg en te (Tw een 80) reduce la actividad
re te n id a en la ¡n te rfa s e e n tre las dos capas del gel y p a re c e aum entar la
p resente en las bandas de m ayor m ovilidad (fig u ra 3 6 ).
-1 2 5 -
F ig u ra 3 4 . - E le c tro fo re g ra m a s de e xtracto s crudos obtenidos con tampón ace
tato 0 ,1 M , pH‘ 5 ,0 , con Cl Ca 1 mM. P a ra ia reacción de d e gradación los geles se incubaron durante 2 horas a 30 2C en presencia de a l­
midón soluble 0 ,5 % como s u s tra to , en tampón de extracció n (A ), tampón fosfato
0,07 M , pH 7 ,0 (B) y tampón fosfato 0,07 M , pH 7 , 0 , con E D T A 100 mM (C ). Pa
ra la reacción de sín tesis (D ) la incubación se re a liz ó durante 5 horas a 30 9C
en tampón c itra to 0 ,1 M , pH 5,1 , en presencia de g lu c o s a -1 -fo s fa to 0 ,7 %. Gel
con glucógeno 0 ,2 % incorporado como in ic ia d o r de la s ín te s is .
-
126
-
tn
X
*o
01
CL
F ig u ra 3 5 . - E le c tro fo re g ra m a s de extractos fraccionados con sulfato amónico
e n tre el 0 y el 25 % (A ) y el 25 y el 45 % de saturación (B ), obtenidos con tampón acetato 0 ,1
6 ,5 .
M a pH 5 ,0 y tampón c itra to 0 ,1
Incubación durante 5 horas a 30 gC en tampón c itra to 0 ,1
M a pH -
M a pH 5,1
y a pH 6 , 0 , en presencia de g lu c o s a -1 -fo s fa to 0 ,7 %. Gel con glucógeno 0 ,2
% incorporado como in ic ia d o r de la s ín te s is .
-
127
-
r
F ig u ra 3 6 . - E le c tro fo re g ra m a s de e xtracto s obtenidos con tampón c itra to 0,1
M a pH 6 ,5 (A) y con el mismo tampón más Tw een 80 ai 1 % (B).
Incubación durante 5 horas a 30 2C en tampón c itra to 0 ,1
M a pH 6 , 0 ,
en -
presencia de g lu c o s a -1 -fo s fa to 0 ,7 %. Gel con glucógeno 0 ,2 % incorporado
como in ic ia d o r de la s ín te s is .
-1 2 8 -
I I i .2 ,-
VARIACIONES
I I I . 2 . 1. -
VARIACION
DURANTE
EL
ESTACIONAL
DESARROLLO.-
DEL
CONTENIDO
EN
CARBOHIDRATOS.-
Las m uestras tomadas p ara el estudio de la v a ria c ió n estacional
del contenido en c arb o h id rato s presen taro n oscilaciones muy am plias tanto en
el peso fre s c o como en el peso seco (fig u ra. 3 7 ), que no se corresponden con
cambios re a le s en .las hojas sino que son orig in ad as por el e r r o r del m uestr e o . Las v a ria c io n e s en el peso se corresponden fielm ente con el tamaño de
las hojas tomadas en cada caso (fig u ra 38) y , al menos p a ra las hojas adul­
ta s ,
re s u lta evidente que no re p res e n ta n una situación re a l ya que com pleta­
ron su expansión mucho antes de que se in ic ia ra n las d e te rm in a c io n es . Algún
aumento en. s u p e rfic ie tuvo lugar indudablemente en las hojas jóvenes durante
las p rim e ra s semanas de m uestreo -p rin c ip io s de A b ril a mediados de J u n io p e ro las v a ria c io n e s en s u p e rfic ie debidas al c rec im ie n to no son sep arab les
de los e r r o r e s de m uestreo con los datos de este estu d io , si bien estos e r r o
re s fueron en este caso mucho m enores durante los m uéstreos in ic ia le s (sema
ñas 15 a 25) que p o s te rio rm e n te , debido a que al comienzo se m uestrearon las hojas mas grandes de la b ro ta c ió n .m ie n tra s que mas adelante los m uestre
os
se re a liz a ro n al a z a r .
Los resultados a n a lític o s se expresan como contenido por unidad
de s u p e rfic ie de la h o ja , procedim iento que compensa las d ife re n c ia s provoca
das por el distin to tamaño de las hojas (M onselise et a l . ,
1953; M onselise ,
1980) y que se ha m ostrado mas sensible p a ra d e te c ta r v a ria c io n e s en el con
tenido en elementos m in erales de las hojas que el contenido p o r hoja (G u a r d iola y G o n zá le z,
1982). En el caso de las hojas a d u lta s , ambos sistem as de
expresió n de resultados son p ro p o rc io n ale s; la razón de p ro p o rc io n a lid a d ,
la
s u p e rfic ie de la h o ja , es además constante durante todo el p erio do experim en
-
PESO
FRESCO
POR
HOJA
129
-
• hoja» da otoño
•
"
"
priaavara
SEMANA
PESO
SECO
POR
HOJA
a hojas da o toño
o
*
•
pri «avara
SEMANA
MES
F ig u r a 3 7 . - V a r ia c ió n del peso f r e s c o (A ) y del peso seco (B) p o r h oja a lo
la rg o del a ño. M u e s tra s de la p a r c e la de A lm e n a ra .
-1 3 0 -
S U P E R F IC IE
PO R
H G JA
o hojas da «tono
o
*
*
pri cavara
30
SE H A M A
MES
f
F ig u ra 3 8 . - V a ria c ió n de la s u p e rfic ie por hoja a lo largo del año. M uestras
de la p a rc e la de A lm e n ara .
-1 3 1 -
t a l. No o c u rre lo mismo en las hojas jovenes durante la fase de c re c im ie n to ,
no pudiéndo e v a lu a rs e cuantitativam ente la influencia del mismo en la acum ula­
ción de m etabolitos con los datos de este estu d io .
Los cambios en el peso de las hojas por unidad de s u p e rfic ie a
lo larg o del año se re p res e n ta n en la fig u ra 3 9 . El peso seco de las hojas
v ie ja s Se mantuvo razonablem ente constante, siendo la máxima desviación res
pecto al v a lo r medio de todos los m uéstreos in fe r io r al 10 % del peso de la
h o ja . En las hojas jo v en e s , el peso seco aumenta durante los p rim e ro s m ués­
tre o s ; como coincide con el aumento en s u p e rfic ie de la hoja esta acumula du
ran te estas semanas in ic ia le s una cantidad im portante de m etabolitos. Hay una
detención en el aumento en el peso a lre d e d o r de la semana 2 5 , p ara p ro s e g u ir
a continuación , aunque a un ritm o más len to , hasta el final del periodo expe­
rim ental p ero sin lle g a r a ig u a la r el peso de las hojas a d u lta s .
Las v a ria c io n e s en el peso fre s c o siguen una pauta s im ila r , si bien la v a ria b ilid a d es m a yo r, a lo que contribuye indudablemente la influen­
c ia del estado h íd ric o de la planta en el momento del m uestreo y las p érdidas
de agua durante el tra n s p o rte al la b o ra to rio . El máximo peso fre s c o de las
hojas jóvenes se a lcan za la semana 21 , antes que el máximo peso seco y es
del mismo orden que el encontrado en las hojas a d u lta s. Consecuencia de e llo
es el menor p o rc en taje en peso seco de las hojas jóvenes durante todo el pe­
riod o experim ental (fig u ra 4 0 ), con una pauta de v a ria c ió n s im ila r a la señala
da p ara el peso s ec o , si bien las d ife re n c ia s son re la tiv am e n te m ayores.
-
^
PESO
FRESCO
POR
U N tO A Q
OC
132
-
S U P E R F IC IE
ag
/ta *
40
30
20
• hojas d« oloÁfc
prt esvara
S
10
1S
20
2S
31
35
40
45
SO
PESO
B
20
SECO
POR
U N IO A O
OE
S U P E R F IC IE
•|
/C W 2
SEHANA
10
O
S
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10
F
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15
A
20
H
25
J
30
J
3S
A
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*
40
O
primavera
4S S Q U | U »
N
O
MI S
F ig u ra 3 9 . - V a ria c ió n del peso fre s c o (A) y del peso seco (B) por unidad de
s u p e rfic ie a lo largo del año. Muestras de la p a rc e la de Almena
ra .
-
PO RCENTAJE
EN
PESO
133
-
SECO
□ Aojas
d« otoño
o
*
•
p r ia a v o r a
SEMANA
MES
F ig u ra 4 0 . - V a ria c ió n del porcentaje en peso seco a lo largo del año. Mues­
tra s de la p a rce la de A lm en ara.
-1 3 4 -
I I 1. 2 . 1 . 1 . - A L M ID O N .-
El contenido en almidón de las hojas adultas v a r ía de modo c a ra c
te r ís tic o du rante el perio do co n sid erad o , si bien la magnitud absoluta de este
contenido a sí como la in icia ció n de los cambios v a r ía tanto con el año como
con la p a rc e la (fig ú ra 4 1 ). En las hojas adultas se observan tre s fases bien
d ife re n c ia d a s . Una in ic ia l, de acum ulación, durante el comienzo de la p rim a ­
v e ra con contenidos máximos en las semanas 10 a 15 y que no presentan un
p e rfil re g u la r posiblem ente debido a las oscilaciones c lim á tic as en esta época del
año. S igue a continuación una fase de desaparición ráp id a del almidón en la
que se p ie rd e a lre d e d o r del 50 % del contenido máximo en las hojas de 1980
en un plazo de unas d ie z semanas y más de un 75 % en 1981 y 1982, mante­
niéndose los v a lo re s a p a r tir de ese momento hasta que se in te rru m p ie ro n los
m uéstreo s. El contenido final no guarda una re la c ió n evidente con el conteni2
do máximo y a s í, es in fe r io r en 1981 (0 ,3 8 mg/cm ) que en 1980 (0 ,6 0 m g/
2
cm ) a p e s a r de que el contenido máximo es notablemente m ayor en 1981 (2 ,3 8
m g/cm
2
2
fre n te a 1 ,3 0 mg/cm ).
La pauta de v a ria c ió n cambia con la p a rc e la estudiada p ero la in
flu en cia del año p a re c e s e r de m ayor im p o rta n cia . Aunque los datos e x p e ri—
m entales p ara la p a rc e la de V illa r r e a l en 1982 no son s u ficie n te s p a ra c a ra c
t e r iz a r la pauta de v a ria c ió n d e s c r ita , sí’ bastan para e s ta b le c e r un m ayor contenido máximo (1 ,9 4 mg/cm
mínimo (0 ,4 8 m g/cm
2
2
2
fre n te a 1 ,4 7 mg/cm ) y un menor contenido
2
fre n te a 0 ,6 0 mg/cm ) que eñ el año j19 8 0 .
El contenido en almidón en las hojas de la b ro tació n de prim ave
ra es muy bajo inicialm ente (0 ,4 2 + 0 ,0 5 mg/cm
2
en la semana 17) aumentan­
do rápidam ente d u ran te las p rim e ra s sem anas, coincidiendo con la d e s a p a ri-.
ción del almidón en las hojas a d u lta s. A lcanzan un p rim e r máximo al que s i­
gue de modo inm ediato un mínimo re la tiv o (semana 2 4 , año 1980 y 25 en 1981)
seguido de una recu p e ra ció n muy rá p id a , en el plazo de una sem ana, p a ra -
N
-1 3 5 -
F íg u ra 41
V a ria c ió n del contenido en almidón por unidad de s u p e rfic ie a lo
larg o del año en las d is tin ta s p a rce las estudiadas. Las hojas jó ­
venes se re p res e n ta n mediante c írc u lo s unidos con tra z o grueso; las a d u lta s ,
con cuadrados unidos por tra z o fin o .
-1 3 6 -
1980
VILLAR REAL
1980
«e / «»
B U R fílA N A
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I .......................
|
20
30
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1981
VILLA RR EAL
• g / c*2
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M)
SO
SEMA NA
-1 3 7 -
SEMANA
F ig u r a 4 2 . - V a r ia c ió n del c o n te n id o en alm idón como p o r c e n ta je s o b r e el peso
seco de las h o ja s a du lta s (A) y jó ve n e s (B) a lo la r g o del año.
p a r c e la de B u r r ia n a (1980)
p a r c e la de V i l l a r r e a l (1980)
p a r c e la de A lm e n a ra (1981)
p a r c e la de V il la r r e a l (1982)
-1 3 8 -
d escender a continuación de un modo p a ra le lo al de las hojas adultas hasta un
contenido s im ila r al in ic ia l e in fe r io r en un 50 % aproxim adamente al contení^
do fin a l de las hojas a d u lta s , sin que aumente de modo s ig n ific a tiv o hasta el
fin al del m u e streo .
E n ambos tipos de hojas el contenido en almidón re p re s e n ta un p o rc e n ta je re la tiv a m e n te pequeño del peso seco total de la h o ja , con un V alo r
máximo p a ra este p a rám e tro en las hojas adultas del 1 7 ,4 % y del 9 ,1
% en
las hojas jó v e n e s . Después de la semana 35 el contenido en almidón re fe rid o
al peso seco de la hoja es del orden del 5 % en las hojas adultas y lig e r a ­
mente in fe r io r en las hojas de p rim a v e ra (a lre d e d o r del 3 %; fig u ra 4 2 ). Es
notable la velocidad de los cambios en el "contenido en alm idón, con variacio_
nes d rá s tic a s en el plazo de una semana y que en las hojas jóvenes p a rec e
e s ta r re la c io n ad o con la proxim idad a las flo re s y /o el fr u to . Las hojas de
b ro te s vegetativos presentan unos lím ites de v a ria c ió n acusados (fig u ra 4 3 ),
con contenidos más bajos hasta la semana 27 y más elevados p o s te rio rm e n te ,
que las hojas de la misma edad de b ro te s fr u c tífe r o s , tendiendo a ig u a la rs e
ambos v a lo re s (semana 4 1 ).
I I 1 . 2 . 1 . 2 . - A Z U C A R E S .-
E l contenido en a zu cares solubles en las hojas adultas desciende
gradualm ente desde las p rim e ra s determ inaciones experim entales a un ritm o con stan te, p a ra el v a lo r medio de las cu atro p a rc e la s e stu d iad as, hasta el. r
mes de J u lio a p a r t ir del cual su v a lo r se e s ta b iliz a a lre d e d o r de 0 ,8 mg/cm
(fig u ra 4 4 ), contenido notablem ente s u p e rio r al;del almidón en ese momento.
En las hojas jóvenes el contenido en a zu c a re s solubles re p re s e n
ta un p o rc en taje del peso seco total de la hoja m ayor que en las hojas adul­
tas (fig u ra 45) y que el almidón (fig u ra 4 2 ). Su contenido por unidad de super
fic ie aumenta d urante las p rim e ra s semanas de m uestreo (fig u ra 4 4 ), p ara a l -
-1 3 9-
2.0
O*
• o
SEMANA
MES
F ig u r a 4 3 . - C o n te n id o en alm id ó n (
) , a z ú c a re s s o lu b le s ( * * *) y c a r b o h id r a t o s
to ta le s (------- ) p o r unidad de s u p e r f ic ie de las h o ja s jó v e n e s de b r o ­
tes f r u c t í f e r o s ( c í r c u lo s u n id o s p o r t r a z o g ru eso ) y de b r o te s v e g e ta tiv o s ( t r i á n ­
gulos u n ido s p o r t r a z o fin o ) en los m u é s tre o s r e a liz a d o s en 1982 en la p a r c e la
de V i l l a r r e a l .
-1 4 0 -
F lg u ra 4 4 . - V a ria c ió n del contenido en a zú ca re s solubles por unidad de super
fic ie a lo larg o del año en las d is tin ta s p a rc e la s e stu d iad as. Las
hojas jóvenes se re p res e n ta n m ediante c írc u lo s unidos p o r tra z o grueso; las a d u lta s , con cuadrados unidos por tra z o fin o .
-1 4 1 -
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c a n z a r el v a lo r máximo e n tre las semanas 19 a 21; se presenta un segundó máximo re la tiv o a fin a le s de Junio o p rin c ip io s de J u lio , p a ra descender l i /
2
geram ente a un v a lo r próxim o a 0 ,8 m g/cm durante la semana 3 3 , a p a r t ir
de la que su contenido puede p erm anecer constante (p a rc e la de A lm e n a ra ,
8 1 ), d is m in u ir (p a rc e la de V i ll a r r e a l ,
(p a rc e la s de B u rria n a y V i ll a r r e a l ,
19
1982) o aum entar de modo s ig n ific a tiv o
1 98 0 ).
Los cambios en el contenido en a zú ca re s durante las semanas 5
a 35 son p a ra le lo s a los cambios en el contenido en alm idón, tanto en las ho
jas adultas como en las jó ven es. D u ra n te el año 1980 el contenido en azúca­
re s de las hojas adultas perm anece elevado hasta la semana 16, al mismo - tiempo que acumulan almidón y el descenso en su contenido sólo
se in ic ia con
—— la -h id r ó lis is de este compuesto. En las hojas jó v e n e s , el m áxim a contení do- er> -----_ a zú ca re s coincide con (1 9 8 0 , p a rc e la de V illa r r e a l; 1 98 1 , p a rc e la de A lm e n a -..........
ra ) o preced e a (1 9 8 0 , p a rc e la de B u r r ia n a , semanas 21 y 23) los máximos en el contenido de alm idón. S in em bargo, no e x is te una re la c ió n d ire c ta en el contenido de estos dos grupos de sustancias
y si el contenido de a zú ca re s
solubles es s u p e rio r en 1980 que en 1981 tanto en hojas jóvenes como en ho_
jas adultas (fig u ra 4 4 ),
lo c o n tra rio sucede p a ra el contenido en almidón ( f i ­
gura 4 1 ).
La m ayor p a rte de los a zú c a re s solubles son de un bajo grado de p o lim eriza ció n como indican los v a lo re s p a ra el contenido en a zú ca re s re
d uctores -e x p re s a d o s en equivalentes de g lu c o s a - que siguen una pauta de va
ria c ió n s im ila r aunque no idéntica a la de los a zú c a re s totales (fig u ra 4 6 ). E l
grado de p o lim e riz a c ió n , obtenido m ediante el cociente e n tre ambas d e te rm i­
n acio nes, es en las hojas jóvenes in icialm en te próxim o a la unidad p a ra aumen
ta r gradualm ente hasta un v a lo r máximo de 2 , 5 en 1980 (semana 28) y de 3 —
en 1981 y 1982 (semana 24); po sterio rm en te se m antiene e n tre 2 y 2 ,5 hasta
el fin a l de las determ inaciones (fig u ra 4 7 - B ).
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F ig u ra 4 5 . - V a ria c ió n del contenido en azúcares solubles como p orcentaje so­
b re peso seco de las hojas adultas (A) y jóvenes (B ) a lo largo
del año.
_.
p arcela de B u rria n a (1980)
parcela
—
de
V illa r r e a l (1980)
parcela de Alm enara (1981)
parcela de V illa r r e a l (1982)
-1 4 4 -
F ig u ra 4 6 . - V a ria c ió n del contenido en azu ca re s re d u cto res por unidad de su
p e rfic ie a lo largo del año en las d is tin ta s p a rc e la s estudiadas.
Las hojas jóvenes se re p res e n ta n mediante c írc u lo s unidos p or tra z o grueso;
las a d u lta s , con cuadrados unidos por tra z o fin o .
-1 4 5 -
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F ig u ra 4 7 . - V a ria c ió n de la longitud de los azúcares solubles a lo largo del
año en hojas adultas (A) y jóvenes (B ).
p a rce la de B u rria n a
(1980)
-----------------
p a rce la de V illa r r e a l (1980)
-----------------
p arcela de A lm enara (1981)
p a rce la de V illa r r e a l (1982)
-1 4 7 -
En las hojas a d u lta s, m ientras el grado de p o lim e riza c ió n es l i ­
geram ente m ayor en las m uestras de Alm enara en re la c ió n con las hojas jóve
nes y va aumentando desde un v a lo r de 2 ,5 en la semana 10 hasta c e rc a de
3 en la semana 3 9 , en las restantes p a rc e la s es bastante s u p e rio r al comien­
zo (e n tre 3 y 5 unidades) y disminuye a lo largo de la p rim a v e ra hasta el mes de Ju n io , durante el cual se alcanzan v a lo re s s im ila re s a los obtenidos
en 1981 en la misma época y se mantienen hasta el fin a l de las determ in acio ­
nes (fig u ra 4 7 - A ).
1 1 1 . 2 . 3 . 1 . - C A R B O H ID R A T O S T O T A L E S .-
La v a ria c ió n de los carb o h id ra to s totales (almidón más a zú cares
solubles) a lo largo del año se p resenta en la fig u ra 4 8 . En las hojas a d u lta s -s e distinguen claram en te tre s fases (fig u ra 4 8 -A ); en p rim e r lu g ar se pro
duce un acumulo de c arb o h id ra to s durante el periodo de reposo v e g e ta tiv o .
2
El v a lo r máximo (a lre d e d o r de 3 ,2 5 mg/cm ) se a lcan za al comienzo de la p rim a v e ra (fin a le s de M a rz o ).
ción de las re s e rv a s
Inm ediatam ente se in ic ia una rápid a m o v iliza ­
acumuladas en las hojas durante la fase a n te rio r; esta
degradación se produce de form a lineal con el tiempo y a un ritm o constante
hasta la semana 2 8 -3 0 (mediados de J u lio ), excepto en la p a rc e la de V iIla ­
r r e a I en la que se observa un descenso en dos fa s e s ,
la p rim e ra al comien_
zo de la p rim a v e ra y la segunda durante el mes de Junio (fig u ra 4 8 - D ). A
p a r t ir de ese momento y hasta el final de los m uéstreos el contenido en car,
bohidratos se mantiene constante en este tipo de h o ja s .
En las hojas jóvenes de brotes fru c tífe ro s e x is te una fase de almacenamiento durante la época de d e s a rro llo de las mismas (fig u ra 4 8 - B ),
que coincide en el tiempo con los p rim ero s momentos de degradación de los
c arb o h id rato s en las hojas adultas (semanas 15 a 2 3 ). En cuanto cesa el e re
cim iento de las hojas jóvenes (fig u ra s 38 y 39) desciende de m anera brusca
y en muy pocos días el contenido en re s e rv a s hidrocarbonadas de estas ho­
-1 4 8 -
ja s , p a ra re c u p e ra rs e p o s terio rm en te con ra p id e z (fig u ra 4 8 -C y E ) y se­
g u ir a p a r t ir de la semana 27 una evolución' p a ra le la a la de las hojas adu[
tas (fig u ra 4 8 - B ).
Tam bién en las hojas jóvenes el descenso en el conteni­
do en c arb o h id ra to s cesa hacia mediados del mes #de J u lio , época en la que
el ín d ice de c rec im ie n to de los fru to s disminuye drásticam ente (G onzález F e r r e r , comunicación p e rs o n a l).
mg/cm
2
Los v a lo re s máximos obtenidos se encuentran a lre d e d o r de 3 ,2 5
2
en las hojas adultas y de 2 ,0 0 mg / cm en las jó v e n e s , observán­
dose que en las p rim e ra s el contenido en almidón es menor al de a zú ca re s
en las p a rc e la s m uestreadas en 1980 m ientras que en los dos años p o s te rio
re s el almidón contribuye m ayo ritariam en te al total de los c arb o h id ra to s de
las hojas (fig u ra s 41 y 4 4 ), dando v a lo re s s im ila re s en las cu atro p a rc e la s
estudiadas (fig u ra 4 8 ). En las hojas jóven es, sin em bargo, si bien los azu
c a re s solubles re p res e n ta n un p o rcen taje m ayor de los c arb o h id ra to s to tale s
que el alm idón, no se encuentran d ife re n c ia s im portantes e n tre los v a lo re s
obtenidos en las d is tin ta s p a rc e la s .
-1 4 9 -
F ig u ra 4 8 . - V a ria c ió n del contenido en c arb o h id ra to s totales p or unidad de
s u p e rfic ie a lo largo del año.
A . - V a lo re s medios p ara Iss hojas adultas de las cu atro p a rc e la s
B . - V a lo re s medios p ara las hojas jóvenes de las cu atro p a rc e la s
C . D , E y F . - V a lo re s obtenidos p ara cada p a rc e la . Las hojas jó ­
venes se rep resen tan m ediante c írc u lo s unidos con tra z o grueso; las a d u lta s ,
con cuadrados unidos por tra z o fin o .
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VARIACION
ESTACIONAL
D E . LA
ACTIVIDAD
AMILOLITICA.-
La a ctiv id a d a m ilo lític a en las hojas v a ría am pliam ente a lo la r ­
go del año, mostrando oscilaciones notables en la activid ad enzim ática total
en el plazo de una semana y que se presentan sim ultáneam ente en las hojas
de otoño y en las de la brotación de p rim a v e ra , sugiriendo un mecanismo de
reg u lació n común. Las o scilaciones en la a ctiv id a d enzim ática son c u a n tita ti­
vamente más im portantes en las hojas adultas (fig u ra 49) que presentan a lo
larg o del estudio una activid ad s u p e rio r al de las hojas jó v e n e s , si bien las
cu rva s de v a ria c ió n p a ra ésta a lo larg o del año sigue una pauta s im ila r en
ambos tipos de h o ja s.
No e xis te una correspondencia c la ra e n tre el contenido en alm i­
dón de las hojas y las v a ria c io n e s en la a ctiv id a d a m ilo lític a . En las hojas
2
adultas ésta p resenta un v a lo r máximo (0 ,0 5 7 u d ./c m x m in .) la semana 12, en
coincidencia con el máximo contenido en alm idón, p ara c a e r de modo in m ed iato a un nivel notablemente in fe r io r (0 ,0 2 a 0 ,0 3 u d ./c m
2
x m in .) d urante las
semanas 13 a 2 3 , en las que el almidón se h id ro liz a a un ritm o constante y
e levad o . E l máximo re la tiv o de la activid ad a m ilo lític a que se presen ta en la
semana 24 no se corresponde con un cambio s ig n ific a tiv o en el ritm o de h i­
d ró lis is del almidón y cuando la h id ró lis is neta del almidón se com pleta, en
la semana 3 3 , hay un aumento en la activid ad enzim ática a n iveles s u p e rio re s
a los encontrados durante el periodo de máxima velocidad de h id ró lis is del almidón (semanas 15 a 2 3 ).
En las hojas de p rim a v e ra la activid ad enzim ática es b aja duran
te las semanas 15 a 2 2 , en las que se produce la acum ulación in ic ia l del aj_
midón. El máximo en activid ad a m ilo lític a durante las semanas 23 y 24 coin­
cide con la h id ró lis is del alm idón, pero la activid ad a m ilo lític a , que había -
-1 5 3 -
AMILOLI TICA
a hoja» de otoñe
4S
SEMA MA
F ig u r a 4 9 . - V a r ia c ió n de la a c tiv id a d a m ilo lí t ic a en h o ja s jó ve ne s ( c í r c u lo s u n id o s p o r t r a z o g ru e so ) y a du lta s (c u a d ra d o s unidos p o r t r a z o
f in o ) .
M u e s tra s de la p a r c e la de A lm e n a ra .
-1 5 4 -
descendido notablemente durante la semana 25 a un v a lo r próxim o al 50 % del
v a lo r encontrado la semana 2 4 , vuelve a aum entar la semana 26 coincidiendo
con la acum ulación de alm idón. D u ran te las semanas 30 a 40 la actividad en­
zim átic a es s u p e rio r a la encontrada durante las semanas 14 a 2 2 .
Las d ife re n c ia s en activid ad a m ilo lític a en las hojas adultas a lo
larg o del tiempo no se traducen en modelos de zim ogram as distintos en las e le c tr o fo r e s is . S e encuentran las 13 bandas d e s c rita s en la sección 111.1.3.1
s i bien los números 7 , 8 y 9 sólo aparecen ocasionalm ente y sin que su p re ­
sencia está relacio n ad a con la activid ad total del e x tra c to . A s í, estas tre s bandas son indetectables en los e le c tro fo re g ra m a s corresp o n d ien tes a la sema
na 18 (fig u ra 5 0 ), en que la actividad del e x tra c to es de 0 ,0 3 u d ./c m
2
x m in .,
m ientras tanto la banda 7 como la 8 son evidentes en el e le c tro fo re g ra m a de
la semana 3 3 , en que la a ctiv id a d total es m arcadam ente in fe r io r (0 ,0 2 u d . /
2
‘
,
cm x m in .). En los correspondientes a la semana 24 (con un máximo de acti_
vidad muy acusado) s í que es evidente la p re se n c ia de las tre s bandas c ita ­
d a s.
S í se encuentran d ife re n c ia s c u a lita tiv a s en ios e le c tr o fo r e g r a mas de las hojas jóvenes con el tra n s c u rs o del tiempo y cuando se com paran
con los co rrespondientes a hojas adultas de la misma época. En a q u é lla s , las
bandas número 7 y 8 son inicialm ente muy evidentes (semana 22; fig u ra 50)
-
disminuyendo su intensidad con el tiempo p ara h a ce rs e indetectables a p a r t ir
de la semana 2 5 . Con p o s te rio rid a d a estas fe c h a s , estas bandas sólo se p re
sentan ocasionalm ente y precisam ente en los mismos m uéstreos en que se de­
tectan en las hojas adultas (semanas 33 y 42; datos no p re se n ta d o s ).
Coincidiendo con la reducción en la intensidad de las bandas 7 y
8 hay un aumento en la a ctiv id a d de las bandas 5 y 6 , in icialm en te ¡ndetecta
b le s , siendo esta banda número 5 perfectam ente v is ib le en la semana 25 ( f i­
gura 5 1 ). En las semanas siguientes su activid ad re la tiv a fre n te a las bandas
-1 5 5 -
SEMANA 18
SEMANA 24
SEMANA 33
I
4
SEMANA 22
SEMANA 23
SEMANA 24
SEMANA 25
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I
F ig u ra 5 0 . - E le c tro fo re g ra m a s de e xtracto s crudos de hojas adultas (A ) y jó
venes (B) en geles con am ilopectina a z u re 0 ,2 5 % como s u s tra to .
Incubación en tampón acetato 0 ,1 M pH 5 ,0 con C l^C a 1 mM, durante dos ho
r a s , a 30 2C .
-1 5 6 -
1, 2 y 3 aumenta gradualm ente y ya en la semana 27 el modelo de zim ogram a
p a ra las bandas de baja m ovilidad es com parable al obtenido p a ra las hojas
a d u lta s .
Desde los p rim ero s m uéstreos las c u atro bandas de m ayor moviH
dad presentan una intensidad s im ila r en las hojas jo v en e s . Con la edad de la
hoja disminuye la intensidad re la tiv a de las bandas 10 y 11 en re la c ió n con
la de las bandas 12 y 13 y en la semana 25 el modelo de zim ogram a obtenido
es com parable en los dos tipos de hoja (fig u ra 5 2 ).
-1 5 7 -
F ig u ra 5 1 . - Zona de menor m ovilidad de los e le c tro fo re g ra m a s y d e n s ito g ra mas de extrac to s crudos de hojas adultas y jó v e n e s .
Incubación
en tampón acetato 0,T M 'p H 5 ,0 con C l^C a 1 mM , d urante dos h o ra s , a 3 0 2C .
Am ilopectina a z u re 0 ,2 5 % como s u s tra to .
-1 5 8 -
Hojas
Hojas
de
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otoño
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F ig u ra 5 2 . - Zona de m ayor m ovilidad de los e le c tro fo re g ra m a s y d e n s ito g ra mas de e xtrac to s crudos de hojas adultas y jo v e n e s . Incubación
en tampón acetato 0 ,1
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A m ilopectina a z u re 0 ,2 5 % como s u s tra to .
Hojas
o t o ñ o
de
-1 6 1 -
1*11.2.3.,-
INFLUENCIA
CION
DE
LOS
DEL
FRUTO
SOBRE
CARBOHIDRATOS
LA
Y
M O V ILIZA ­
LA
ACTIVIDAD
AM 1LOL í T I C A . -
La
•
elim inación de los fru to s en d e s a rro llo de los b ro te s con una
sola f lo r (fru to ) en posición term inal a c e le ró la h id ró lis is del almidón de modo
lig e ro p ero s ig n ific a tiv o en las hojas del b ro te (F ig u ra 5 3 - A ,
T ab la 11) que, al
cabo de nueve días p re se n ta ro n un contenido s im ila r al de las hojas de brotes
v e g e ta tiv o s , manteniendo p osterio rm ente v a lo re s iguales a e s ta s . En las hojas
de bro tes con fru to s la m ovilización del almidón continuó más lentam ente. En los tre s tipos de hojas se produce una lig e ra dism inución en el contenido en a zú c a re s so lu b le s , p rin cip alm en te durante los nueve p rim e ro s días (F ig u r a 5 4 -A ,
T a b la 1 2 ), sin que se observen d ife re n c ia s e n tre las hojas de ram as con y sin
fr u to , de modo que la evolución de los c a rb o h id ra to s to tales en estas hojas es
igual a la d e s c rita p a ra el almidón (fig u ra 5 5 - A , tabla 13).
La a ctiv id a d a m ilo lític a aumentó de form a constante a p a r t ir del co
mienzo en las hojas de b ro tes sin fru to hasta 9 días (fig u ra 5 6 -A ) o una sema
na (fig u ra 57) después de in ic ia rs e los exp erim en to s, aproxim ándose rápidamen
te a los v a lo re s de a ctiv id a d que presentaban las hojas de bro tes v eg e ta tiv o s,
in icialm en te m a yo res, p a ra s e g u ir una evolución p a ra le la hasta al menos un mes después de la elim inación del fru to (tab la 14).
En las hojas de otoño no se a p rec ian d ife re n c ia s en la m o v iliza —
ción del almidón cuando se elim inan todos los fru to s en d e s a rro llo de la rama
en que están situados con respecto a ramas con fru to s (fig u ra 5 3 - B , tabla 11).
S e produce un descenso rápido del contenido en almidón en ambos tipos de ho­
ja s du rante los p rim e ro s d ía s , seguido de un descenso más g ra d u a l.
Tampoco
se a d v ie rte n d ife re n c ia s en azú ca re s solubles (fig u ra 5 4 - B , tabla 12) y a c tiv i­
dad a m ilo lític a (fig u ra 5 6 - B , tabla 14); ambos pa rám e tro s m antienen los v a lo re s
iniciales' durante todo el periodo de estudio.
—
—
-----------
-1 6 2 -
© con fruto
o sin fruto
A vegetativas
F ig u r a 5 3 . - C am bios en el co n te n id o de alm idón en h o ja s jó ve n e s (A) y a d u l­
tas (B) en r e la c ió n con la p re s e n c ia o a u s e n cia de f r u t o en las
ra m a s . M u e s tra s de la p a r c e la de A lm e n a ra , tomadas d u r a n te el p e r io d o de
la caída de f r u t ó en p r im a v e r a ,
to s ,
en 1982. P a ra la t r a n s f o r m a c ió n de los d a 2
o btenidos como p o r c e n t a je s o b r e peso s e c o , en mg / cm , se m u lt ip lic a
ro n los v a lo r e s p o r el peso p o r unidad de s u p e r f ic ie de h o ja s de la misma
b r o ta c ió n y tomadas en las mism as fe c h a s .
-1 6 3 -
J^A
B_J_ A
1_1_
E fe c to de la e lim in a c ió n del f r u t o s o b re el co n te n id o de a lm id ó n en hojas
M O D E L O .-
+
x uk=
sie n do :
A = fecha ;
A.
r,
+
B.
j
+
(A # B )..
,j
+
k( i j)
B = tra ta m ie n to (p re s e n c ia o a u se n cia de f r u t o )
T A B L A DEL A N A L I S I S
DE LA V A R I A N Z A . - H o ja s jó v e n e s .
Fu en te
Suma de c u a d ra d o s
G ra d o s lib e r t a d C u a d ra d o s medios
Fecha
3 ,4 3 8
4
0 ,8 6 0
5 3 ,1 9 **
T ra ta m ie n to
0 ,2 3 8
• 2
0 ,1 1 9
7 ,3 5 **
1n te ra c c ió n
0 ,1 2 3
8
0 ,0 1 5
R esidual
0 ,2 4 2
15
0 ,0 1 6
**
s ig n ific a tiv o
F
-
al 1 %
D IA G R A M A DEL T E S T (e fe c to t r a t a m i e n t o ) . -
Con f r u t o
■
S in f r u t o
V e g e ta tiv a s
1
1
Con f r u t o
S in f r u t o
0
V e a e ta tiv a s
T A B L A DEL A N A L I S I S
DE LA V A R I A N Z A . - H o ja s a d u lt a s .
F uente
Suma de cu a d ra d o s
G ra d o s lib e r t a d C u a d ra d o s m edios
Fecha
2 ,3 9 3
4
0 ,5 9 8
T ra ta m ie n to
0 ,0 1 2
1
0 ,0 1 2
1n te ra c c ió n
0 ,0 9 6
4
0 ,0 2 4
R e sid ua l
0 ,1 9 5
10
0 ,0 1 9
** s ig n ific a tiv o
al 1 %
ns no s i g n i f i c a t i v o
F
3 0 ,7 4 **
1 ,23 ns
-1 6 4 -
0.5'
# con fruto
o «jo fruta
* vagototivo*
J U NI Q
JULIO
J U N IO
■ con
frut o
a si n
fruto
J U L IO
F ig u r a 5 4 . - C am bios en el c o n te n id o en a z ú c a re s s o lu b le s en h o ja s jo ve ne s
(A) y a du lta s (B) en r e la c ió n con la p r e s e n c ia o a u s e n cia de f r u t o en las ra m a s .
M u e s tra s tomadas en 1982 en la p a r c e la de A lm e n a ra ,
d u ra n te el p e r io d o de caída de f r u t o en p r im a v e r a .
P a r a la t r a n s f o r m a c ió n
2
de los d a to s , o b te n id o s como p o r c e n ta je s o b re peso s e c o , en mg / cm , se
m u lt ip lic a r o n los v a lo r e s p o r el peso p o r unidad de s u p e r f ic ie de h o ja s de
la misma b r o ta c ió n y tomadas d u r a n te las mismas fe c h a s .
-1 6 5 -
JQ A
B_J_ A
12
Efecto de la elim inación del fru to sobre el contenido de azúcares solubles en hojas
M O D E LO . •JK
s ie n d o :
/
A = fecha;
i
j
ij
k( i j)
B = tra ta m ie n to ( p re s e n c ia o a u se n cia de f r u t o )
T A B L A DEL A N A L I S I S DE LA V A R I A N Z A . - H o ja s jo v e n e s .
Fu e n te
Suma de c u a d ra d o s
Fecha
0,263
4
0,066
T ra ta m ie n to
0,057
2
0,029
1n te r a c c ió n
0,013
8
0,002
R e s id u a l
0,062
15
0,004
**
G ra do s l i b e r t a d C u a d ra d o s m edios
s ig n ific a tiv o
16,01 *
*
6 ,9 6 **
-
al 1 %
D IA G R A M A DEL T E S T (e fe c to t r a t a m i e n t o ) . Con f r u t o
S in f r u t o
Con f r u t o
0
V e g e ta tiv a s
1
1
S in f r u t o
V e g e ta tiv a s
T A B L A DEL A N A L I S I S DE LA V A R I A N Z A . - H o ja s a d u lta s .
Fu en te
Suma de c u a d ra d o s
Fecha
0,020
4
0,005
1,33 ns
T ra ta m ie n to
0,010
1
0,010
2,61 ns
1n te r a c c ió n
0,016
4
0 ,0 0 4
1,02 ns
R e sid u a l
n,038
10
ns
G ra do s l ib e r t a d C u a d ra d o s medios
no s i g n i f i c a t i v o
0,0038
F
-1 6 6 -
•
con
fruro
o
sin
fruto
t
vegetativas
JULIO
&
con f r u t o
□
sin
JUNIO
fruto
JULIO
F ig u r a 5 5 . - Cambios en el co n te n id o en c a r b o h id r a t o s to ta le s en h o ja s jó ve n e s
(A)
y a d u lta s (B) en r e la c ió n con la p r e s e n c ia o a u se n c ia de f r u t o
en las ra m a s . M u e s tra s de la p a r c e la de A lm e n a ra , tomadas en 1S02 d u ra n te
el p e r io d o de la caída de f r u t o en p r im a v e r a .
-1 6 7 -
Efecto de la elim inación de fru to sobre el contenido de carbohidratos totales en hojas
M O D E L O .Xi j k
s ie n d o :
A= fe c h a ,
+
A
A.
' ’i
+
’
B.
“ j
+
’
(A *B )..
v~
'ij
+
T
’
k ( ij )
B = tra ta m ie n to (p re s e n c ia o a use n cia de f r u t o )
T A B L A DEL A N A L I S I S
DE LA V A R I A N Z A . - H o ja s jó v e n e s .
Fu e n te
Suma de c u a d ra d o s
G ra d o s lib e r t a d C u a d ra d o s medios
Fe cha
5 ,5 9 6
4
1 ,3 9 9
8 5 ,8 3 * *
T ra ta m ie n to
0 ,4 8 0
2
0 ,2 4 0
14,71 * *
1n te r a c c ió n
0 ,1 8 2
8
0 ,0 2 3
1 ,4 0 ns
R e sid ua l
0 ,2 4 5
15
0 ,0 1 6
**
s ig n ific a tiv o
al 1 %
D IA G R A M A DEL T E S T (e fe cto t r a t a m i e n t o ) . Coni f r u t o
Con f r u t o
S in f r u t o
V e g e ta tiv a s
1
1
S in f r u t o
1
V e g e ta tiv a s
T A B L A DEL A N A L I S I S
DE LA V A R I A N Z A . - H o ja s a d u lta s .
Fu en te
Suma de cu a d ra d o s
Fecha
2 ,4 7 3
4
0 ,6 1 8
T ra ta m ie n to
0,0001
1
0,0001
1n te r a c c ió n
0 ,1 4 9
4
0 ,0 3 8
R e sid u a l
0 ,1 9 2
10
0 ,0 1 9
G ra d o s lib e r t a d C u a d ra d o s m edios
** s ig n ific a tiv o
F
3 2 ,1 3 * *
1 ,9 6 ns
al 1 %
ns no s i g n i f i c a t i v o
-1 6 8 -
4
0.0301
0.030
■
0.025
*
0JÍ25
0.020
x
8
O
O
* 0,020
OjOIS
OjOIS
0.010 i
0.010
• can frutn
O sin fruí»
A. v»g«tativ«*.
» can
fruta
o sin
frut»
0.005
o.oos
7 9
12
14
20
J U N IO
25
29
4
JULIO
7 9
12
14
20
2S
J U N IO
29
4
J U L IO
F ig u r a 5 6 . - C am bios en la a c tiv id a d a m ilo lí t ic a en h o ja s jo v e n e s (A) y a d u lta s
(B)
en r e la c ió n con la p re s e n c ia o a u se n cia de f r u t o en las ra m a s .
M u e s tra s tomadas en 1982 en la p a r c e la de A lm e n a ra d u ra n te el p e r io d o de la
caída de f r u t o en p r im a v e r a .
P a r a la t r a n s f o r m a c ió n de los d a to s , obte nido s
como a c tiv id a d p o r gram o de peso f r e s c o , en a c tiv id a d p o r unida d de s u p e r fi
c i é , se m u lt ip lic a r o n los v a lo r e s p o r el peso p o r unidad de s u p e r f i c i e de ho­
ja s de la misma b r o ta c ió n y tomadas d u ra n te las mism as fe c h a s .
-1 6 9 -
0.030i
0.025i
"
0,0 20-
o
o
<1
0,015
• con f r ut o
0,010'
o sin f r ut o
A vegetativas
0,005
0
í~
¡I
21
28
JUNIO
F ig u r a 5 7 . - C am bios en la a c tiv id a d a m ilo lí t ic a
en h o ja s jó v e n e s en r e la c ió n con la
p re s e n c ia o a u s e n cia de f r u t o en las ra m a s . M u e s tra s tomadas en 1983 en la p a r c e la de A l ­
menara d u ra n te el p e r io d o de la caída de f r u t o
en p r im a v e r a .
-1 7 0 -
JQ A
B_L A
1_A
Efecto de la elim inación del fru to sobre la actividad a m ilo lítica en hojas,
M O DELO . -
x...
=
u +
ijk
siendo:
/
A = fech a,
A.
+
i
B.
+
(A x B )..
j
+
Z .....
k ( ij)
ij
B = tratam iento (presencia o ausencia de fru to )
TA B LA DEL A N A L IS IS DE LA V A R I A N Z A .- Hojas jóvenes. Año 1982,
Fuente
Suma de cuadrados
Grados lib e rta d Cuadrados medios
F
Fecha
0 ,0 0 0 2 2 2
5
0 ,0 0 0 0 4 4
1 7 ,0 0 * *
T ratam iento
0,000241
2
0,000121
4 6 ,1 5 * *
I nteracción
0 ,0 0 0 0 9 3
10
0 ,0 0 0 0 0 9
3 ,5 6 * *
Residual
0,0 0 0 0 4 7
18
0 ,0 0 0 0 0 2 6
* * s ig n if ic a tiv o a l 1 %
D IA G R A M A DEL T E S T (efecto tratam iento) . Con fru to
Con fru to
S in fru to
1
S in fru to
V egetativas
1
1
V egetativas
TA B LA DEL A N A L IS IS DE LA V A R I A N Z A . - Hojas adultas
Fuente
Suma de cuadrados
G rades lib e rta d Cuadrados medios
F
Fecha
0 ,0 0 0 0 0 6
7
0 ,0 0 0 0 0 0 9
-
T ratam iento
0 ,0 0 0 0 0 6
1
0 ,0 0 0 0 0 6
-
In te rac c ió n
0 ,0 0 0 0 9 0
7
0 ,0 0 0 0 1 3
-
Residual
0 ,0 0 0 2 9 8
16
0 ,0 0 0 0 1 9
-1 7 1 -
TA B L A
DEL A N A L IS IS
Fuente
DE LA V A R IA N Z A . -
Suma de cuadrados
Hojas jóvenes. Año 1983.
Grados lib e rta d
Cuadrados medios
Fecha
0 ,0 0 0 2 5 9
3
0 ,0 0 0 0 8 6
3 9 ,6 9
T ratam iento
0 ,0 0 0 1 6 7
2
0 ,0 0 0 0 8 4
3 8 ,7 7 * *
I n teracción
0 ,0 0 0 0 2 8
6
0 ,0 0 0 0 0 4 7
Residual
0 ,0 0 0 0 2 6
12
0,0000022
* * s i g n i f i c a t i v o a l 1%
D IA G R A M A DEL T E S T (efecto tra ta m ie n to ).Con fru to
Con fru to
S in fru to
V egetativas
Sin fru to
V egetativas
2 ,1 7 ns
-1 7 2 -
Los e le c tro fo re g ra m a s de los extrac to s enzim áticos de las hojas
adultas (A) y las jóvenes (C , hojas de brotes con fru to ; V , hojas de brotes
vegetativos) se presentan en la fig u ra 58. En todos los m uéstreos es posible
d is tin g u ir los e xtrac to s co rresp o n d ien tes a las hojas adultas y a las jóvenes,
siendo las d ife re n c ia s s im ila re s a las d e s c rita s en el apartado
I I I . 2.2.
: la
banda número 5 aparece en las hojas adultas pero no en las jóvenes m ientras
que la intensidad re la tiv a de las números 10 y 11 fre n te a las 12 y 13 es ma­
y o r en las hojas jó v e n e s . S in em bargo, no se observan d ife re n c ia s debidas a
la p re se n c ia del fru to en cada grupo de h o jas. Las pequeñas v a ria c io n e s cuan
tita tiv a s en activid ad encontradas no son detectables densitom ótricam ente y las
mismas isoenzim as están p resentes en las hojas de bro tes vegetativos y en las
de b ro tes fr u c tífe ro s .
-1 7 3 -
F ig u ra 5 8 . - E lec tro fo re g ra m a s de extracto s crudos de hojas de ram as con
fru to s (+) y de ram as en las que éstos han sido elim inados ma
nualmente ( - ) . Hojas adultas (A ) y jovenes de brotes fru c tífe ro s (C ) y vege
tativos ( V) .
Incubación en tarrpón acetato 0,1 M a pH 5 , 0 ,
con C l^C a 1 mM
durante dos h o ra s , a 30 2C . Gel con am ilopectina a z u re 0 ,2 5 % incorpora
da como su strato .
-1 7 4 -
I I I . 3.-
III.3 .1 . -
VARIACIONES
DURANTE
COMPORTAMIENTO
DE
LA
DE
LA
LAS
S E N E S C E N C IA .-
HOJAS
SEPARADAS
PLANTA.-
La s e p a ra c ió n de la s h o ja s de la planta y su incubación en un
medio húmedo desencadena una s e rie de procesos que
culminan con la m uer­
te de la h o ja . La abscisión del peciolo es el p rim e r síntoma norm alm ente ob­
servado que coincide en el tiempo con la perdida v is ib le en c lo r o fila . E sta se acentúa con el tiempo hasta que finalm ente la hoja a dquiere un c o lo r ma­
rró n parduzco y s u fre una contaminación fúngica im portante.
S i bien
las mismas
estas fases se presentan en este o rd e n ,
la velocidad de
está determ inada por la edad de la hoja y por las condiciones de
incubación. En la fig u ra 59 se presenta la v a ria c ió n en el tiempo del conteni_
do en c lo r o fila . E sta v a ria c ió n es in a p re c ia b le en las hojas de tre s meses de edad que cuando se incuban a la luz presentan incluso un increm ento .neto
en el contenido que aumenta gradualm ente con el tiem po. A p a r t ir de los 5
meses de edad, la perdida de c lo ro fila es evidente dos días después de la separació n de la planta y procede linealm ente con el tiempo en las hojas in­
cubadas a la luz durante al menos una sem ana, tiempo durante el que se de­
grada la mitad de la c lo ro fila presente inicialm ente en las h o jas.
A la oscuridad la pérdida de c lo ro fila es mucho menos im portan­
te y 10 días después de la separación de la p la n ta , las hojas conservan en­
tr e el 80 y el 90 % de la c lo ro fila presen te al comienzo de los experim entos.
-1 7 5 -
F i gura 5 9 .- Variaciones en el contenido en clorofila de hojas separadas de
la planta a lo largo de su incubación a la luz (símbolos vacíos)
o a la oscuridad (símbolos llenos).
-1 7 6 -
5 meses
3 meses
70
70.
50-
a
9
-
30.
30
0
0 12
4
4 7
9
12
13
0
15
2
13
O IA S
6
O IA S
mes
7
me se
70-
;
■
so.
m
»
30.
10 .
o
0
2
S
9
0
14
11
2
01 A S
O IA S
LUZ
9
OSCURI DAD
100.
*100
c
o
v a lo r a
uncíalas
I jjg r /c a ü )
m
m
3«asas:
47
SO
Ja
o
4 S 4
4 9
13
OIAS
4 S
7
I 9
12
13 14 15
O IA S
-1 7 7 -
I I I . 3 .2 . -
CAMBIOS
EN
EL
CONTENIDO
EN
CARBOHIDRA­
TOS
La
separación de la planta provoco de modo inmediato la movili_
zació n del almidón almacenado en sus te jid o s (fig u ra 60); después de dos días
de incubación el contenido en almidón o s cila e n tre el 45 y el 85 % del conte_
nido in ic ia l, siendo ligeram ente m ayor en las plantas mantenidas a la lu z , aunqüe las d ife re n c ia s no son siem pre consistentes en todos los experim entos.
P o ste rio rm e n te hay una pérdida gradual de almidón a la oscuridad hasta valo
re s cercanos al 40 % del almidón in ic ia l; a la lu z , el com portam iento u lte r io r
es e r r á tic o pues m ientras en algunos casos hay una re cu p e ra ció n hasta un va
lo r del 75 % del in ic ia l (hojas de tre s meses de edad), en o tro s (hojas de 5
y 6 meses) hay una pérd id a adicional s u p e rio r a la encontrada en las hojas
mantenidas a la o s c u rid a d . S orprendentem ente no hay re la c ió n e n tre la hidró
lis is del almidón y el contenido in ic ia l en la h o ja , salvo p ara las hojas incu
badas a la luz después de 5 días en que el p o rcen taje de almidón h id ro liza d o
es m ayor en las hojas de 6 y 7 meses de edad (contenido in ic ia l de almidón:
2
T ,4 8 y 1 ,2 2 mg/cm ) que en las hojas mas jóvenes (contenido in ic ia l: 0 ,4 2 y
2
0,J53. m g /c m -) . A s í, en las hojas incubadas en la oscuridad el almidón r e s i­
dual después de 15 días es del mismo orden en las hojas de 3 y 6 meses de
edad, a p e sa r de la m arcada d ife re n c ia en su contenido in ic ia l.
S e presentan influencias notables de las condiciones de incuba­
ción en el contenido de azu ca re s (fig u ra s 61 y 6 2 ). En las hojas incubadas a
la luz los azú ca re s solubles se m antuvieron a una concentración s im ila r a la
encontrada en el momento de la s e p a ra c ió n , independientemente del v a lo r i n i—
c ia l -q u e o sciló e n tre 0 ,5 mg/cm
2
“
(hojas de 3 meses) y 1 ,0 mg/cm
2
—
•
(hojas de
7 m e se s )- y aún aumenta notablem ente en un caso (hojas de 6 meses de edad).
A la o scuridad hay un descenso gradual pero s ig n ific a tiv o en su concentra—
ción que, tre c e días después, o s cila e n tre el 50 y el 60 % del contenido inj_
-1 7 8 -
Figura 6 0 .- Variaciones en el contenido en almidón de hojas separadas de
la planta a ío largo de su incubación a la luz (símbolos vacíos)
o a la oscuridad (símbolos llenos).
-1 7 9 -
3
meses
5 meses
0. 4
v.
a*
a
0.2
0
0
1 2
4
4
7
9
12 13
0
ft
2
OI AS
OI AS
7 meses
6*- m e s e s
a
o»
a
V
T
O.SH
14-
0
2
3
9
14
0
OIAS
2
5
I
14
01 A S
(■f/c*2)
0 .4 1 9
OS CU R I D A D
O.S 3 5
\220
ico
I
50
s
m■
te
1
*
o
0
2
4
5 4
«
9
13
O IA S
12
0 I AS
13
14
15
-1 8 0 -
F i gura 61
Variaciones en el contenido en azúcares solubles de hojas sepa
radas de la planta a lo largo de su incubación a la luz (símbo-
los vacíos) o a la oscuridad (símbolos llenos).
-1 8 1 -
3
meses
5 me s e s
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O IA S
O IA S
-1 8 2 -
Figura 6 2 .- Variaciones en el contenido en azúcares reductores de hojas se­
paradas de la planta a lo largo de su incubación a la luz (sím­
bolos vacíos) o a la oscuridad (símbolos llenos).
-1 8 3 -
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12
OI AS
13
14
15
-1 8 4 -
cial a excepción de las hojas de 6 meses en las que se produce un aumento.
in ic ia l en su contenido p ara a lc a n z a r finalm ente un v a lo r s im ila r al del día 0 .
El comportam iento de las hojas de 6 meses en lo que respecta a la evolución
en el contenido en a zú ca re s solubles no guarda re la c ió n aparente con ninguno
de los parám etros m edidos. Los a zú cares re d u cto res aumentan en las hojas incubadas a la lu z , alcanzando los v a lo re s máximos a los 5 días (hojas de 5
y 7 meses) y aún continúa este ascenso en el caso de las hojas de 6 m eses.
Las hojas mas jó v en e s , sin em bargo, mantienen v a lo re s s im ila re s al in ic ia l.
En la oscuridad se produce un comportam iento d is tin to según la edad de la ho
ja pues m ientras en las de 3 meses hay un descenso de hasta un 50 % del va
lo r obtenido el día 0 , en las hojas de 5 meses el contenido en a zú ca re s
re ­
ductores no v a ría con el tra n s c u rs o del tiempo y en las de 6 y 7 meses se produce un aumento, de magnitud in fe r io r al de las hojas a la luz y cuyos va
lo re s máximos se obtienen hacia el día 8 ó 9 de incubación.
El grado de p o lim eriza ció n medio de los a zú ca re s solubles disrrU
nuye gradualm ente durante la incubación de las hojas a p a r t ir de 5 meses de
edad (tabla 11), pasando de un v a lo r medio in ic ia l de 2 ,4 9 unidades de gluco
sa a 1 ,2 6 unidades después de 8 ó 9 d ía s . En las hojas de tre s meses el gra
do de p o lim eriza ció n es menor que el del re sto de las hojas a h com íenzo-( 1,43
unidades) y aumenta ligeram ente con el tra n s cu rs o del tiem po, siendo de 1,64
unidades a los 9 d ía s .
E l contenido en c arb o h id ra to s totales desciende m arcadam ente du
ra n te la incubación (fig u ra 63) siendo este descenso en general m ayor en las
hojas mantenidas a la o s cu rid a d . B ien la luz re ta rd a la u tiliz a c ió n de estos
a zú ca re s o p erm ite una fo to sín tesis s ig n ific a tiv a . E sta segunda po sib ilid ad se
ve re fo rz a d a por el hecho de que durante las últim as fases de la incubación
se observa un aumento en el contenido en c a rb o h id ra to s .
f
-1 8 5 -
Fígura 6 3 .- Variaciones en el contenido en carbohidratos totales de hojas separadas de la planta a lo largo de su incubación a la luz ,—
(símbolos vacíos) o a la oscuridad (símbolos llenos).
3
mes
5 meses
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m
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12
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13
14 15
-1 8 7 -
-
—
-
,
LA
B L A
15
V a ria c ió n del grado de p olim erización de los azúcares solubles durante la
s en e s ce n c ia .
1ncubación
—
------------------
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meses
5
meses
6
meses
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1 ,5 0
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4
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1 ,0 5
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6
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8
IV
9
1 ,5 9
IV
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ii
8
........O scuridad
ii
2 , 3 4 ------‘
1 ,3 8
1 ,0 9
1 ,2 4
1 ,0 2
1, 25
_______________
1 ,93
3 ,0 5
1 ,5 8
1 ,7 8
2 ,4 6
1,41
1 ,62
0 ,9 7
1 ,7 0
9
1 ,69
ii
12
1 ,7 0
ii
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ii
14
15
meses
1 ,6 2
ii
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7
i
1 ,3 6
1 ,4 3
1, 55
1 , 62
1 ,21
-1 8 8 -
I I I . 3 . 3 . -
C A M B I OS
EN
LA
ACTIVIDAD
A M I LOL I T I C A . -
La a ctiv id a d a m ilo lític a en las hojas aumenta in variablem ente du­
ra n te la incubación, si bien la magnitud de los increm entos en su actividad
v a r ía de un experim ento a o tro y no guarda re la c ió n aparen te con la a c tiv i­
dad in icialm en te presente o el contenido en almidón de las hojas (fig u ra s 60
y 6 4 ). El increm ento en la a ctiv id a d es inicialm ente menor en las hojas man
tenidas a la luz que en las incubadas a la o s c u rid a d . Solam ente después de
cinco días de incubación se observa en algunos experim entos (hojas de 5 y 7
meses de edad) una m ayor a ctiv id a d en las hojas mantenidas a la oscuridad
cuyo ritm o de s ín tes is de enzima es constante hasta el final del periodo ex­
perim ental (dos sem anas), seis días después de la m uerte de las hojas man­
tenidas a la lu z .
No se observan v a ria c io n e s en la im portancia re la tiv a de las cU
v e rs a s bandas de a ctiv id a d a m ilo lític a durante la senescencia (fig u ra 6 5 ). Los cambios en la a ctiv id a d total se traducen en cambios en la intensidad de
todas las bandas sin que el procedim iento e le c tro fo ré tic o u tiliza d o p erm ita d e te c ta r v a ria c io n e s en el modelo obtenido.
-1 8 9 -
Figura 6 4 .- Variación de la actividad amilolítica de hojas separadas de la
planta a lo largo de su incubación a la luz (símbolos vacíos)
o a la oscuridad (símbolos llenos).
-190-
meses
3 meses
0.03.
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0.02-
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100 -
0 I AS
-1 9 1 -
F ig u ra 6 5 . - E le c tro fo re g ra m a s de extractos de hojas de 6 meses de edad
el día en que fueron separadas de la planta (A ) y tra s 9 días
de perm anencia a la luz (B) o a la oscuridad (C ).
acetato 0 ,1
Incubación en tampón -
M a pH 5 ,0 , con C l^C a 1 mM, durante 2 horas a 30 2C . Gel
con am ilopectina a zu re 0 ,2 5 % incorporado como s u s tra to .
discusión
-1 9 3 -
El contenido en c arbohidratos to tale s de las hojas adultas (fig u ra
4 8 -A ) m uestra una pauta de v a ria c ió n s im ila r a la d e s c rita en o tra s v a rie d a ­
des de c ítric o s (Jbnes y S te in a c k e r,
P a lm e r,
1951; Hilgem an et a l . ,
1967; Dugger y
1969). Hay un aumento en su contenido durante el in v ie rn o , alcanzan
dose el máximo de mediados de M arzo a p rin c ip io s de A b r il, seguido por una
dism inución aproxim adam ente lineal con el tiempo p a ra a lc a n z a r un v a lo r m í­
nimo a fin a les del mes de J u lio . E ste modelo de v a ria c ió n es s im ila r al en—
contrado en plantas c ad u cifo lias aunque está desplazado en el tiem po. En es­
ta s , el máximo contenido en carb o h id rato s se p resenta a fin a le s de otoño o aún a n te s, coincidiendo con la senescencia y abscisión de las h o jas. D u ran te
la b ro tació n de p rim a v e ra se produce una disminución del nivel de c arb o h id ra
to s , alcanzándose el v a lo r mínimo e n tre los meses de Mayo y Junio (Z im m e rman, 1974; W o rle y, 1979).
E sta pauta de v a ria c ió n se ha in te rp re ta d o con fre c u e n c ia como
una acumulación de re s e rv a s en el árbol que es u tiliz a d a durante la b rotació n
y la fr u c tific a c ió n , y si la necesidad de acum ular r e s e r v a s , al menos p a ra la b ro ta c ió n , pa rec e evidente en las plantas c ad u c ifo lias (P r ie s tle y ,
lo es tanto en el
1971) no
n a ra n jo , en que el descenso en el contenido en c a rb o h id ra ­
tos de las hojas adultas no tiene lugar hasta v a ria s semanas después de in i­
ciada la bro tació n y en el que las hojas hacen una contribución fo to sin té tic a
s ig n ific a tiv a durante el reposo invernal como lo m uestra la acum ulación de c a rb o h id ra to s durante este periodo del año (fig u ra 4 8 ). E s de s e ñ a la r que tanto en el tra b a jo de Hilgem an et a l. (1967) como en el de Dugger y P a lm e r
(1 9 6 9 ), el descenso en el contenido en c arbohidratos de las hojas se in ic ia al
menos dos meses antes que en nuestros experim entos,
lo que puede e s ta r re
lacionado con la situación más m eridional de sus p a rc e la s experim entales que
provoca una anticipación en las fechas de brotación y flo ra c ió n .
-1 9 4 -
In cluso en p la n ta s :c a d u c ifo lia s , en las que la dependencia de la
b ro tació n de las re s e rv a s previam ente acumuladas es o b v ia , el papel de estas
re s e rv a s en el d e s a rro llo u lte r io r de la planta y en la fru c tific a c ió n no apa­
re c e c la ro en todos los caso s. P rie s tle y (1 9 7 1 ), en su re v is ió n c r ític a sobre
este tem a, señala la lim itación de los conocim ientos, en p a rtic u la r en los s_i^
guientes aspectos: a) la n a tu ra le za química de estas re s e rv a s ; b) la disponibj^
lidad de los c arb o h id ra to s acumulados p ara el c rec im ie n to de la p la n ta , y c)
su re la c ió n con la fru c tific a c ió n . A estos aspectos h a b ría que a ñ a d ir d) el control de la m o v iliza ció n y d is trib u ció n en la planta y e) los aspectos m e ta bólicos de esta m o v iliza c ió n .
-1 9 5 -
A . - N A T U R A L E Z A Q U IM IC A DE LAS R E S E R V A S .-
La n a tu ra le za química de las re s e r v a s , esto e s , qué fra c c ió n de
los c a rb o h id ra to s acumulados en el árbol son re u tiliz a b le s p ara el c rec im ie n
to , puede in fe r irs e de los cambios estacionales en el contenido de las d iv e r­
sas fra c c io n e s . De los datos de las fig u ra s 41 y 44 re s u lta evidente que tan_
to la fra c c ió n almidón como la de carb o h id rato s solubles disminuyen durante
el perio do de fru c tific a c ió n , y dentro de cada p a rc e la experim ental la evolu­
ción de ambas fra c cio n e s sigue curvas aproxim adam ente p a r a le la s , — con la ex
cepción de la p a rc e la A lm enara en 1 9 8 1 -, si bien el contenido en a zu ca re s solubles se mueve en un rango de v a lo re s más estrecho que el contenido en
alm idón. La fra c c ió n almidón p a rec e u tiliz a r s e en la planta como una re s e rv a
que m antiene los azú ca re s por encima de un v a lo r m ínim o, del orden de 0 ,7
2
a 0 ,8 mg / cm . Goldschmidt y Golomb (1 9 8 2 ), revisand o los tra b a jo s de Jones
et a l. (1975) y Sm ith (1976) re s a lta n la im portancia de las re s e rv a s de alm i­
dón ya que las c o rre la c io n e s e n tre su contenido y la producción son m ejores
que p ara los azú ca re s solubles o los c arb o h id ra to s to ta le s . S in em bargo, es
tos datos se r e fie re n a a n á lis is re a liza d o s en las m andarinas
"K innow "
y -
" M u rc o tt" , que presentan un caso de extrem a v e c e r ía , y en las que se produ
ce en ocasiones una desap arició n total de las re s e rv a s de c a rb o h id ra to s en
los años de cosecha e le v ad a,
seguida norm alm ente por la m uerte del á rb o l.
Como señalan Jones et a l. (1975) pa rec e razonable que los c a rb o h id ra to s sean
lim itantes en estas condiciones extrem as
en que el almidón d esaparece
por -
com pleto, pero no en condiciones norm ales en las que, no obstante, se encue£i
tra n c o rre la c io n e s s ig n ific a tiv a s e n tre los c arb o h id ra to s de las hojas y la —
fru c tific a c ió n .
Los datos de nuestro estudio m uestran que la proporción de c a r ­
bohidratos solubles a almidón v a ría e n tre lím ites muy amplios y esta v a ria c ió n
está más relacionada con el año que con la p a rc e la . La acum ulación de azúca
-1 9 6 -
re s solubles está re la c io n ad a con la te m p e ratu ra y el fotoperiodo y se ha in­
te rp re ta d o como una defensa de la planta a las condiciones am bientales adve£
sas (S im in o vitch et a l . ,
1953; S akai y Y o sh id a ,
1969; K an d ler y H o p f, 1980).
Una acum ulación de sacarosa ha sido señalada en los a g rio s cuando estos se
someten a bajas te m p e ratu ra s in v e rn a le s (Y elenosky y G uy, 1977; Y ele n o s k y ,
1979) aunque la ra fin o s a y otro s o lig o sacárid o s re p res e n ta n una fra c c ió n im­
p o rta n te de los a zú c a re s acumulados en estas
(K a n d le r y H o p f,
condiciones en o tra s
plantas -
198 0 ). P ruebas adicionales a esta in te rp re ta c ió n son las cH
fe re n c ia s en la pauta de v a ria c ió n de c a rb o h id ra to s solubles y almidón en las
hojas (D u gger y P a lm e r,
1969) y el menor grado de p o lim e riza c ió n de los azú
c a re s solubles el año 1981 (fig u ra 4 7 ), en que estos se acum ularon en menor
cantidad en las hojas (y el almidón lo hizo en m ayor cantidad) que en los años
1980 y 1982, en que los n iveles de a zú ca re s fueron s ig n ificativam en te m ayo res.
A la v is ta de estos resultados pa rec e lógico c o n c lu ir que tanto los a zú ca re s solubles como el alm idón constituyen re s e rv a s m etabólicam ente re
u tiliz a b le s p o r la p la n ta , que su prop o rció n está controlada por fa c to re s e x ó genos al á r b o l, concretam ente c lim á tic o s , y que en los á rb o les que hemos uti_
Iizad o eJ contenido en azú ca re s en c u a lq u ie r momento del d e s a rro llo de la h o -
2
ja se m antiene p o r encima de los 0 , 7 - 0 , 8 mg / cm , si bien v a lo re s más ba­
jos se encuentran tra n s ito ria m e n te en las hojas jóvenes en d e s a r ro llo .
Una discusión adicional m erece la n a tu ra le za de la fra c c ió n deno
minada alm idón en este estudio. El método de e xtrac c ió n u tiliz a d o (ácido p e r c ló ric o en fr ío ) no es específico del almidón y e x tra e m ayor cantidad de c a r ­
bohidratos que métodos en p rin c ip io más específicos como es la h id ró lis is —
por enzimas a m ilo lític a s . G onzález F e r r e r (comunicación p e rs o n a l), trabajando
con el mismo m a te ria l, ha determ inado que la e xtrac c ió n del almidón m ediante
la h id ró lis is e xh a u s tiv a , después de una g e la tin iz a c ió n , con una m ezcla de a lf a - y b e ta -a m ila s a de B .s u b tilis y de endospermo de cebada respectivam en­
-1 9 7 -
t e , s o lu b iliz a un 85 % de los c arb o h id ra to s e x tra íb le s con ácido p e rc ló ric o .
S in em bargo, a p e s a r de la m ayor e sp ecificid ad de este a n á lis is no hay se­
guridad de que la h id ró lis is enzim ática s o lu b ilic e completamente el almidón n a tiv o , y se han señalado d ife re n c ia s en la cantidad de almidón e x tra íd o por
d is tin ta s enzim as (M acRae et a l . ,
1974; Banks y M u ir ,
1980). De hecho, en
nuestro m a te ria l, un 25 % de los p o lisa c árid o s e x tra íb le s con ácido perclóri_
co después de la h id ró lis is exhaustiva con am ilasa es p re c ip ita b le con iodo,
lo que s u g ie re la exis te n cia de restos de am ilopectina no s o lu b iliza d a;
por -
o tro lado, el h id ro liza d o de este e x tra c to final contiene pequeñas cantidades
de x ilo s a y a rab in o sa lo que indica la s o lu b iliza c ió n de algunas h em icelulosas,
fra c c ió n que al menos en p a rte se considera que puede s e r también m o v iliza ­
da en la planta ( P r ie s tle y ,
o tra p a r te ,
1971). El método de e x tra c c ió n u tiliza d o e s , por
incapaz de h id r o liz a r c e lu lo s a , incluso después de un periodo de
incubación de 20 horas (Hansen y M ^ lle r ,
1975).
-1 9 8 -
B .-D IS P O N IB IL ID A D
DE LOS C A R B O H ID R A T O S . -
D iv e rs o s autores indican que la d isponib ilidad de los c a rb o h id ra ­
tos acumulados es únicam ente p a rc ia l en condiciones norm ales y solo se tienen
re fe re n c ia s de la u tiliz a c ió n completa de las re s e rv a s hidrocarbonadas de la planta en aquellos casos en los sigue la m uerte del á r b o l, como los ya mencio
nados de las v a rie d a d e s de c ítric o s MKinnowM, "M u rco tt" y "W ilk in g 11 (Jones et
a l.,
1975; S m ith ,
1976; M onselise y Golomb, 198 2 ). P r ie s tle y (1971) señala que
en el manzano no es posible la u tiliz a c ió n de más de un te rc io de los c a rb o h i­
d rato s e x tra íb le s manteniendo al mismo tiempo la planta v ig o ro s a . E s te a u to r s u g ie re la h ip ó te s is de la existen cia de un e q u ilib rio e n tre la u tiliz a c ió n de los
c arb o h id ra to s p o r los tejidos del árbol y la s ín tesis de nuevos fotoasim ilados
o el nivel de las re s e rv a s d is p o n ib le s , de form a que la planta tiende a mante­
n e r en sus c é lu la s un nivel re la tiv am e n te constante de c arb o h id ra to s u tiliz a b le s .
En n uestro estudio el nivel de c arb o h id ra to s en las h o ja s , tanto adultas como jóvenes de bro tes fru c tífe ro s (F ig u ra 4 8 ), no desciende en ningún
2
momento del v a lo r de 1 mg / cm
- l o que re p re s e n ta a lre d e d o r del 30 % del contenido máximo en las hojas adultas y el 50 % en las jó v e n e s -, y si en la —
p a rc e la de A lm e n ara el contenido de almidón llega a s e r muy bajo a final de v eran o y p rin c ip io s de otoño (a lre d e d o r de 0 ,4 mg / cm^; F ig u ra 4 1 ), está aún
lejos de a g o ta rse en la planta ya que este v a lo r re p re s e n ta aproxim adam ente el 20 % del máximo encontrado en p rim a v e ra , y es s u p e rio r al contenido en aj_
O
midón de las hojas jóvenes en esa misma época ( 0 ,3 mg /c m ; F ig u ra 4 1 ). Aún
teniendo en cuenta que, según se ha indicado en el apartado a n te r io r , es pos_i_
ble que el contenido re a l de almidón sea a lre d e d o r del 10 % in fe r io r al obten[
do p o r el método u tiliz a d o , el nivel de almidón en esta p a rc e la se m antiene en
todo momento p o r encima del 17 % del v a lo r m áxim o, v a lo r al que hay que aña
2
d ir el de a z ú c a re s solubles (s u p e rio r a 0 ,8 mg / cm ) p ara te n e r el balance global de c a rb o h id ra to s en esas fe c h a s . Estos resultados están de acuerdo con
-1 9 9 -
los de Cam eron y S c h ro e d e r (1945) y M onselise y Goldschmidt (1 9 8 2 ), que se­
ñalan que los c arb o h id ra to s de la planta sólo son m ovilizados p a rcia lm en te y
la u tiliz a c ió n com pleta del almidón no se a lcan za ni s iq u ie ra en los momentos
de gran demanda como la b rotació n de p rim a v e ra . En la m ayoría de los á rb o ­
les se produce una re cu p e ra ció n del contenido en c arb o h id ra to s antes de que
se agoten las re s e rv a s acum uladas, de form a que generalm ente la degradación
no sobrepasa un nivel mínimo de c arb o h id ra to s en las c élu la s ( P r ie s tle y ,
La p re se n c ia de un residuo de almidón
1971).
no m etabolizado se observa
también en las hojas separadas de la p la n ta , en las que la rápid a degradación
que se produce en estas condiciones se detiene al a lc a n z a r un contenido m ín imo de 0 ,2 mg / cm
2
(F ig u ra 6 0 ),
lo que re p re s e n ta más del 15 % del v a lo r ¡ni_
c ia l en todos los c aso s. Kriedem ann (1 969a) ha señalado que el almidón acumula_
do en las hojas de c ítric o s no es totalm ente metabol izado ni aun cuando se in­
cuban las hojas separadas de la planta a la oscuridad durante 21 d ía s . S in em
b a rg o , con estos datos no queda c la ro si la m uerte de la hoja se produce debí
do a que se alcan za un contenido lím ite en c arb o h id ra to s p ara la su p erv iv en c ia
de las c é lu la s del te jid o o s i, p or el c o n tr a rio , está regulada por c tro fa c to r
d is tin to , de modo que si no se metabol izan todos los c a rb o h id ra to s contenidos
in icia lm e n te en la hoja es porque este o tro fa c to r provoca dla m uerte con a n te rio
rid a d al agotam iento de las re s e rv a s .
En resum en, sólo un determ inado p o rc en taje de las re s e rv a s acu­
muladas d u ran te el reposo vegetativo son u tiliz a d a s en el perio do de crecim ien_
to y d e s a r r o llo , pues si bien la m ovilizació n del almidón puede p ro d u c irs e has
ta en un 80 % de su contenido máximo, sólo se m o v iliza e n tre el 50 y el 60 %
de los c arb o h id ra to s to ta le s , perm aneciendo el re sto de las re s e rv a s en equil_i_
b río dinám ico con el metabolismo y el tra n s p o rte .
-2 0 0 -
C . - R E L A C IO N D E LOS C A R B O H ID R A T O S CO N LA F R U C T I F I C A C I O N . -
La im portancia de los c arb o h id rato s en la fru c tific a c ió n p a re c e des
p re n d e rs e de los estudios de d iverso s a u to re s , que señalan una c o rre la c ió n po­
s itiv a muy e s tre c h a e n tre el nivel de c arb o h id rato s de las hojas al fin al del re
poso in v ern a l y la cuantía de la cosecha siguiente (Lew is et a l . ,
et a l . ,
1964; Jones
197 4 ). Del mismo modo, se ha encontrado una c o rre la c ió n negativa en­
tr e la cosecha p recedente y la acumulación de c a rb o h id ra to s en las hojas (S m ith
et a l . ,
1953; H ilgem an et a l . ,
1967; Jones et a l . ,
1 9 7 0 ). A p e sa r de la e x is ­
tencia de estas c o rre la c io n e s Jones et a l. (1974) dudan que el contenido en —
c a rb o h id ra to s sea un fa c to r lim itante que c o n tro le la producción del año siguien
te , debido fundam entalm ente a dos hechos: 1) los tratam ientos re a liz a d o s con ácido n a fta len a c ético (N A A ) er. la varie d ad MW ilkingn re v ie rte n el c ic lo de a lte r
nancia en la fru c tific a c ió n de esta v arie d ad pero no cambia el de acum ulación
de c arb o h id ra to s en las hojas (Lew is et a l . ,
1964) y 2) en la v a rie d a d " V a le n ­
c ia ” hay un c la r o efecto del fru to sobre el cuajado, de modo que una re c o le c ­
ción ta rd ía d eterm in a una menor producción al año siguiente que si la re c o le c ­
ción es te m p ra n a, p e ro no afecta sin embargo el contenido en c arb o h id ra to s de
las hojas a d u lta s , que es independiente del momento de la re co le cc ió n (Jones et
al.,
1 970), rp o r lo que pa rec e d e s c a rta rs e la p o sib ilid ad de una re la c ió n c a u s a -
efecto e n tre n iv e le s de carb o h id ra to s y fru c tific a c ió n .
La in te rp re ta c ió n de las c o rre la c io n e s e n tre el contenido en carbo
h id rato s de las hojas y la fru c tific a c ió n no es unívoca ya que puede r e f le ja r la in te rve n c ió n de o tro s mecanismos de regulación d is tin to s , siendo aquéllas c o rre la c io n e s secu n d arias y debidas a la acción de estos m ecanism os. P a rtic u
larm ente re le v a n te es la influencia de la flo ra c ió n en la fru c tific a c ió n , muy es
tre c h a cuando el número de flo re s form adas en el árbol es baja (M oss,
1973),
situación muy fre c u e n te en las v a rie d a d e s , v e c e ra s , en que se han re a liz a d o
los estudios discutidos a n te rio rm e n te . Adem ás,
la flo ra c ió n está inversam ente
-2 0 1 -
re la c io n ad a con la cosecha precedente (M oss,
1971; A güstí et a l . ,
1982) y ,
p o r tan to , c o rre la c io n a d a positivam ente con el nivel de c arb o h id ra to s en las
h o ja s , que se ha señalado como el fa c to r d eterm inante de las d ife re n c ia s en
flo ra c ió n (Goldschm idt y Golomb, 1982) ya que Altm an y Goren (1977) señalan
que la s a c a ro sa es esencial p a ra la bro tació n de las. yemas - "in v it r o " . S in
em bargo, esta exigencia p a ra la brotación ha sido cuestionada (G u a rd io la et a l.
1982) y hay evid en cias de una regulación hormonal de la flo ra c ió n tanto en ag rio s (G u a rd io la et a l . ,
fru ta le s (Lu ckw ill y S ilv a ,
1977; M onselise y G oldschm idt,
1979; E b e rt y B a n g e rth ,
1982) como en o tro s
1981) por lo que la c o r re
lación e n tre c arb o h id ra to s y flo ra c ió n podría s e r meram ente accidental y de­
bida a mecanismos que operan sim ultáneam ente.
A p e s a r de las dudas en la in te rp re ta c ió n de las c o rre la c io n e s
apuntadas, los datos de este estudio dem uestran que las excepciones señaladas
pueden s e r o rig in ad a s p or la desafortunada elección de las hojas adultas como
órganos a a n a liz a r . Las v a ria c io n e s estacionales en el contenido en c a rb o h i­
drato s p resen ta una pauta d is tin ta en aquellas y en las hojas de la brotació n
de p rim a v e ra situadas junto a un fru to en d e s a r ro llo , que presentan un acusa
do descenso en el contenido en c arb o h id ra to s en el momento de la caída de Junio (fig u ra 4 8 ). E sta caída en el contenida en c arb o h id rato s se produce —
cuando su capacidad fo to sin tó tica es máxima (Moss et a l . ,
1972) y coincide -
con el aumento en la velocidad de crecim ien to - y p o r tanto en la acumulación
de m e ta b o lito s - en el fru to en d e s a r ro llo , que supera la capacidad fotosinteH
ca de las hojas jóvenes en los b ro tes mixtos (Moss et a l . ,
1 972), momento en
el que se produce una detención tra n s ito ria en la acum ulación en las hojas de
los elem entos m óviles en el floema (n itró g e n o , fó s fo ro , potasio; G onzález F e rre r,
datos sin p u b lic a r). P a re c e evidente la e xis te n cia de un momento en el
que se p resenta un d é fic it en la disponibilidad de c a rb o h id ra to s y elementos
m in e ra le s , que no se traduce en un m odificación en el ritm o de tra n s p o rte desde las hojas adultas (fig u ra 4 8 -A ) y presum iblem ente ambos fa c to re s pue­
-2 0 2 -
den lim ita r el d e s a rro llo y , por ta n to ,
(Zucconi et a l . ,
1978; A gustí et a l . ,
la capacidad de s u p erviven cia del fru to
1982) p or lo que las c o rre la c io n e s e n tre
contenido en c a rb o h id ra to s y cosecha no se presentan s ie m p re , aunque deben
s e r más estables p ara el contenido en hojas jovenes que en hojas a d u lta s .
E s notable al respecto que Hilgem an et a l. (1967) s í encuentran
una in flu encia de la época de re co lecció n del fru to de la n a ran ja " V a le n c ia "
y el contenido en a zú ca re s en las hojas jó v en e s , aunque no en las a d u lta s ,
si bien el número de m uestras analizad as p or estos au to res es in s u fic ie n te -p a ra e sta b le c e r la influencia en el cuajado del fr u to . La a se veració n de Gold
schmidt y Golomb (1982) de que las hojas son un mal indicador del nivel de
c a rb o h id ra to s en el árbol es adm isible p ara las hojas a d u lta s , que aún g u a r­
da una re la c ió n con el contenido en las ra íc e s -ó rg a n o que proponen a n a liz a r
estos a u to r e s -, pero no p a ra las jó ven es. P o r el c o n tra r io , estas parecen suficientem ente sensibles p ara d e te rm in a r la disponib ilidad de c arb o h id ra to s
p a ra el fru to en d e s a rro llo y proporcionan una s e r ie de ventajas de índole —
p rá c tic a (fa c ilid a d de m uestreo, posib ilid ad de tip ific a c ió n , re p e tib ilid a d ) que
aconsejan su u tiliz a c ió n fre n te al uso de las ra íc e s .
La velocidad de tra n s p o rte constante desde las hojas adultas ( f i ­
gura 4 8 -A ) no es un caso s in g u la r. S i bien en la m ayor p a rte de los casos
hay una c o rre la c ió n e n tre la fo to sín te s is y el tra n s p o rte desde las hojas
(M o o rb y,
—
1977), se ha señalado un ritm o de exportación constante, aunque du
ra n te un perio do de tiempo lim itad o , tanto p a ra n iveles foto sin tetico s muy ba­
jos (H o ,
1976) como p a ra contenidos elevados de a zú ca re s en las hojas (C h ris
ty y S w anson, 1976). Ambos casos deben r e f le ja r d is tin to s fa c to re s lim itantes
en el tra n s p o rte ; la velocidad de m o vilizació n de las re s e rv a s p reviam ente acumuladas en el p rim e ro y la capacidad del sistem a de tra n s p o rte en alguno
de sus puntos en el segundo. En las hojas adultas del n a ra n jo , el ritm o de tra n s p o rte de las re s e rv a s medido e s , en el periodo de descenso constante del contenido en c arb o h id ra to s (p rin c ip io s de A b ril a mediados de J u lio ) de
-2 0 3 -
0 ,0 7 4 mg glucosa / dm
x h o ra , v a lo r unas 35 veces menor a la máxima foto­
s ín te s is neta medida y al que h a b ría que a ñ a d ir la fija c ió n de CO
h o ja s , que no supera los 2 ,5 6 mg glucosa / dm
2
p o r estas
x hora (Moss et a l . ,
1972).
Teniendo en cuenta que en esta época del año el perio do luminoso e fe ctiv o p a ra la fo to sín te s is es a lre d e d o r de 10 horas d ia ria s m ientras que el tra n s ­
p o rte se lle v a a cabo también durante el periodo oscuro del d ía , el tra n s p o r
te total de asim ilados (re s e rv a s más fotoasim ilados del día: 2 7 ,3 5 mg glucosa
/ dm
2
x día) es apenas m ayor (1 ,0 7 veces) que la fotosíntesis producida d ia ria
mente (2 5 , 6 mg glucosa / dm
2
x d ía ), lo que da como resultado un descenso -
lento y gradual del nivel de las re s e rv a s de c arb o h id ra to s en estas h o ja s . La
s atu rac ió n del sistem a de tra n s p o rte parece en este caso responsable del ri_t
mo constante de d e sap arició n de las re s e rv a s a p e s a r del aumento del consu­
mo po r el fru to en estas fe c h as , puesto que la disponib ilidad de las re s e rv a s
no puede c o n s id e ra rs e lim itante ya que el nivel de c arb o h id ra to s en estas ho­
jas es elevado y la a ctiv id a d a m ilo lític a encontrada po d ría e x p lic a r la m o v ili­
zación del alm idón p resen te en pocas h o ra s . La posib ilid ad de que el sistem a
v a s c u la r lim ite el tra n s p o rte al fru to ya ha sido señalada por B o lla rd (1970)
p a ra el tom ate, y Habeshaw (1969) indica que p a ra índices fo to sin tético s e le ­
vados se produce una s a tu ra c ió n -d e l sistem a de tra n s p o rte en las hojas de re
m olacha.
E l hecho de que la elim inación del fru to localm ente no afecte la
velocidad de exportación (fig u ra 5 3 -B ) indica que los gradientes locales de c arb o h id ra to s no tienen gran influencia en el tra n s p o rte , pudiendo e s ta r regu
lado p o r las re s is te n c ia s de los tejidos al mismo. Luckw ill y S ilv a (1 9 7 9 ), trab ajand o con m anzano, sugieren que la e fic ie n c ia de las conexiones vascula
re s puede ju g a r un papel im portante en la n u tric ió n de los fru to s , ocasionan­
do una m ayor caída de los que están en posición a x ila r fre n te a los te rm in a ­
le s . P o r ta n to , no puede s e r ignorada la posibilidad de que la aparente inde
pendencia del tra n s p o rte e n tre las hojas adultas y los sum ideros esté d e te r­
-2 0 4 -
minada p o r la ausencia de conexiones d ire c ta s e n tre los te jid o s conductores
de estas hojas y los de los bro tes en d e s a rro llo (fig u ra 6 6 ). Según é sto , un
aumento del consumo en los fru to s provoca un increm ento inm ediato del tra n s
p o rte desde las hojas jó v en e s , a las que están conectadas d ire c ta m e n te , y ul_
te rio rm e n te desde el ta llo . La influencia del consumo a nivel del b ro te sobre
las hojas adultas es g e n e ra liza d a e n tre todas e lla s por e s ta r conectadas al sistem a de tra n s p o rte a larg a distan cia y no d irectam en te con los fru to s . El
efecto del sum idero se diluye y por e llo no se detecta una influ en cia c la ra del aumento del consumo en el fru to sobre las hojas a d u lta s , c o n tra ria m e n te
a lo que sucede con las hojas jó ven es, que están unidas direc ta m e n te con los
fru to s .
-2 0 5 -
■floema
FRUTO
conexiones
cu lares
vas­
directas
BROTE DE PRIMAVERA
re sistencia b a j a )
HOJA
ADULTA
t
co n exio nes
d irectas con
| el sistem a de t ra n s p o rte
| a
la rg a
d is t a n c i a .
RAMA DE OTOÑO
conexio nes laterales
poco e f i c a c e s
( r e s i s t e n c ia elevada)
F ig u r a 6 6 . - R e la c io n e s n u t r i c io n a le s e n tre las h ojas y el f r u t o en d e s a r r o l l o .
-2 0 6 -
D . - C O N TR O L DE LA M O V I L I Z A C I O N Y D I S T R I B U C I O N DE LOS C A R B O H I­
D R A T O S E N LA P L A N T A .-
A la re la c ió n fuente-su m id ero que e x is te e n tre hojas y fr u to s , que
se ob serva de form a mucho más patente en las hojas jovenes y que provoca el
descenso brusco del contenido en c arb o h id ra to s de estas hojas en la época de
crecim ien to rápid o del fr u to , se superpone una re la c ió n d is tin ta que hace que
la d is trib u c ió n de los a zu ca re s en la planta no pueda entenderse sim plem ente en térm inos de demanda de fotoasim ilados por c re c im ie n to . El contenido de c a r
bohidratos en las hojas jóvenes a p arece determ inado por la p re se n c ia del fr u to ,
teniendo menor contenido en a zú ca re s solubles y en almidón las hojas de b ro te s
vegetativos que las de bro tes fru c tífe ro s (fig u ra 4 3 ). Aunque en p rin c ip io esto
p odría deberse a que el ápice vegetativo en c rec im ie n to es un sum idero más po
tente que el fru to en d e s a rro llo ya que hasta el mes de Junio el peso seco me
dio del fru to es del mismo orden que el de una hoja y las hojas en d e s a rro llo
son sum ideros muy potentes en esta época (K riedem annn, 1969a y b; Kubota y
Motoyama, 1971; Moss et a l . ,
1 97 2 ), los experim entos de elim inación de fru to
no admiten esta in te rp re ta c ió n . En las hojas de. ram as sin fru to s e ría e s p e ra ble un aumento del contenido en a zú ca re s en cuanto que se elim ina el sumide­
ro p rin c ip a l de sustancias n u tritiv a s y a s í, T re h a rn e (1982) obtiene este resu£
tado trab ajand o con m anzano. S in em bargo, en nuestros exp erim en to s,
la elinrW
nación de los fru to s de la rama no a lte ra la pauta de m o v iliza ció n en las ho­
jas adultas (fig u ra 5 5 - B ), m ien tras que en las hojas jóvenes se produce una re
ducción inm ediata del nivel de c a rb o h id ra to s , tanto en v a lo r absoluto como en
re la c ió n a las hojas de ram as con fru to s (fig u ra 5 5 - A ), a p esar de que en es_
ta época del año no se produce la brotació n de las yemas a x ila r e s ,
lo que oca
s io n a ría la c rea c ió n de sum ideros a lte rn a tiv o s . E ste resu ltad o es c o n tra rio a
la respuesta esp erab le de e x is tir únicamente una re la c ió n fu en te-su m id ero en­
tr e las hojas y los fru to s como re g u lad o r de la m o vilizació n de los c a rb o h i—
-2 0 7 -
dratos en la planta.
Estos resultados no excluyen la fu e rz a del sum idero p a ra a tr a e r
m etabolitos como re g u lad o r del movimiento de
asim ilados sino que indican que
no es el único fa c to r im plicado. E x is te la p o s ib ilid ad de que los altos niveles
horm onales de les órganos en crecim ien to puedan ju g a r un papel im portante en
su capacidad de m ovilizació n y les perm itan d e te rm in a r la d ire c c ió n del trans_
p o rte (W areing y P a t r ic k ,
1975; T r e h a r n e ,
1982; M a r r ó ,
1982) y , por tan to ,
es pro bable que en la d is trib u c ió n de los a zú ca re s en los distintos órganos de
la planta en cada momento del d e s a rro llo este im plicado un e q u ilib rio horm onal.
Numerosos autores indican que los fru to s en d e s a rro llo son una fuente im portante de sustancias reg u lad o ras del c rec im ie n to y*. a s í ,
nero C itru s
lifah et a l . ,
se ha determ inado la p resencia én los fru to s de g ib e re lin a s (Kha
1965; Wiltbank y K re z d o rn ,
Goldschmidt et a l . ,
y G oldschm idt,
M o n selise,
en el gé­
1970; M o n selise,
1969; G oren y G oldschm idt.
1977), auxinas (Lew is et a l . t 1965; G oren
197 0 ), citoquininas (K h alifa h y L e w is ,
1977; F u r ió et a l . ,
1970; Goldschmidt et a l . ,
1970,
1970; —
1966; E r n e r et a l . , 1976;
1981) y acido abscísico (G oren y G oldschm idt,
1973; G a rc ía M a rtín e z et a l . , 1 97 6 ). Grochows
ka (1973) señala que en el manzano el descenso rápid o del contenido en a lm i­
dón de las hojas coincide en el tiempo con la a p a ric ió n de grandes cantidades
de g ib e re lin a s en las s e m illa s . Adem ás, las sustancias horm onales producidas
en los fru to s difunden fácilm ente hacia otros te jid o s . En el m anzano, E b e rt y
B angerth (1981) d e sc rib e n un aumento de g ib e re lin a s d ifu s ib le s en los fru to s durante los p rim ero s estadios de su d e s a rro llo y en el género C itru s
G a rc ía
M a rtín e z y G a rc ía P apí (1979) han detectado en las p rim e ra s semanas después
de la an tesis la producción de hormonas d ifu s ib le s desde el fr u to , que identifi_
can como sustancias de tipo auxínico y como g ib e re lin a s .
Es un hecho am pliamente reconocido que las sustancias regulado­
ras del c recim ien to afectan el tra n s p o rte y T re h a rn e , en su re v is ió n de 1982,
-2 0 8 -
señala que el tra n s p o rte de asim ilados hacia los fru to s se ve increm entado p or
aplicacion es esp ecíficas o generales tanto de g ib e re lin a s como de auxinas o c ito q u in in as . A sim ism o, el ácido abscísico es capaz de in d u c ir tanto un aumejn
to como una reducción de la im portación de asim ilados en sem illas de avena dependiendo de su concentración y del estado de d e s a rro llo de las s em illas (T ie tz et a l . ,
1981) y según estos autores es posible que el efecto del ácido
ab scísico sobre el tra n s p o rte y almacenam iento de a zú c a re s sea más general
y no este únicamente re s trin g id o a c e re a le s , dado que o tro s autores (D ü rin g
y A lle w e ld t,
1980) lo han observado también en o tra s plantas ( Vi t i s v in ife r a ) .
S in em bargo, el papel de las hormonas en la d is trib u c ió n de los asim ilados no
está claram en te dilucidado y es objeto de c o n tro v e rs ia .
Una te o r ía , apoyada p o r numerosos e xp e rim en to s, indica que el aumento del tra n s p o rte que se produce hacia zonas tra ta d a s con sustancias hor
monales es una consecuencia del increm ento de la a ctiv id a d m etabólica de la región tra ta d a (S eth y W areing ,
1967; G ersani et a l . ,
1980a y b ), lo que ins­
c rib e este efecto en la re la c ió n fu en te-su m id ero típ ic a . E sta re la c ió n , bien de
form a d ire c ta o bien mediada por una acción horm onal, no es s u ficie n te p ara
e x p lic a r los resultados obtenidos en este tra b a jo y únicam ente una acción so­
b re el tra n s p o rte de form a independiente a la u tiliz a c ió n m etabólica de las sus
tancias tran sp o rtad as e x p fIc a ria nuestros re su lta d o s .
La hipótesis del tra n s p o rte d irig id o horm onalm ente ha sido form ula
da por d iverso s autores basándose en los resultados obtenidos con segmentos
de plantas a d u lta s , que no están en c re c im ie n to , y en los que las aplicaciones
horm onales provocan el aumento del tra n s p o rte en menos de 6 horas (D a v ies y
W areing,
1965), tiempo que pa rec e insu ficien te p a ra que la respuesta este me
diada por un increm ento de la activid ad m etabólica. P o r e l l o,
s ugieren que el
aumento del tra n s p o rte puede o c u r r ir sin ningún cambio concom itante de la —
fu e rz a del sum idero. El aumento del crecim ien to inducido por las hormonas -
-2 0 9 -
puede no s e r el mecanismo exclusivo por el que estas sustancias actúan sobre
el tra n s p o rte (M oorby,
1977; P a tr ic k ,
1982). P a tr ic k y W areing (1 9 7 0 ), tra b a ­
jando con entrenudos de judía no pudieron d e te c ta r ninguna a lte ra c ió n del es­
tado metabol ico ni de la capacidad de alm acenar sac a ro sa por tratam ientos con
ácido indolacetico que, sin em bargo, produce un aumento del tra n s p o rte . La p o sib ilid ad de que el ácido indolacetico pueda a fe c ta r de form a d ire c ta los me
canismos de tra n s p o rte esta apoyada por el hecho de que promueve la d ife re n ­
ciació n del tejid o del floema (S a c h s ,
1975).
M a rre (1982) indica que hay numerosas observaciones que demues
tra n claram en te que sustancias producidas p or órganos en c rec im ie n to d irig e n
los flu jo s de n u trie n te s no sólo hacia esas zo n as; en c rec im ie n to sino también
hacia las regiones v e c in a s . E sto podría e x p lic a r los m ayores n iv ele s de c a r ­
b ohidratos encontrados en las hojas de bro tes fru c tífe ro s fre n te a los de b ro
tes v e g e ta tiv o s . Adem ás, señala que la elim inación de los fru to s jóvenes d e te r
mina un m arcado descenso de los a zú ca re s solubles y el almidón en las zonas
vecinas en el b ro te , como sucede en las hojas jóvenes de naran jo y que, por
el c o n tr a r io , no afecta de form a detectable el contenido en c a rb o h id ra to s de las hojas a d u lta s.
Según indican W areing y P a tr ic k en su re v is ió n de 1975, estos c.
experim entos con segmentos de ta llo s no desestim an la fu e rz a del sum idero co
mo re g u la d o r del movimiento de asim ilados y , como señala T re h a rn e (1982) los
argum entos en fa v o r del tra n s p o rte d irig id o horm onalm ente no será n concluyen
tes m ien tras no se diseñen experim entos en los que se pueda d ife r e n c ia r c la ­
ram ente la actividad m etabólica del sum idero del tra n s p o rte en s í mismo. P o r
e llo ,
la m ayoría de los autores consideran in su ficien te los datos disponibles -
hasta el momento para, inclin arse por una u o tra hipótesis (P a tr ic k y W areing,
1973; M ulligan y P a t r ic k ,
1979) y aún Altm an y W areing (1975) s ugieren que -
ambos sistem as pueden e s ta r controlando el tra n s p o rte , m ien tras que Bowen y
-2 1 0 -
W aretng (1971) señalan que parecen e x is tir objeciones a ambas hipótesis como
únicas responsables del tra n s p o rte de m etabolitos.
-2 1 1 -
E . - A S P E C T O S M E TA B O L IC O S DE LA M O V I L I Z A C I O N DEL A L M ID O N .-
La activid ad enzim ática asociada a la fra c c ió n enzim ática 2 , que
correspo nd e a las bandas 1 a 6 de los e le c tro fo re g ra m a s , se debe a am ilasas
de tipo a l f a.
E ste grupo de enzimas p resenta c a ra c te rís tic a s típ ic as de
a lfa -a m ila s a s , siendo inactivadas por E D T A (S w ain y D e k k e r,
et a l . ,
las
1966b; Pech
1971; tabla 9 y fig u ra s 24 y 27); su a ctiv id a d desciende d rásticam en­
te a pH bajos (F re n c h ,
1960; S hain y M a y e r,
1968; tabla 8 y F ig u ra 18); son
re s is te n te s a la inactivación té rm ica (Pech et a l . ,
1971; fig u ra 29) y se tra ta
de endoam ilasas puesto que degradan sustratos altam ente ra m ific a d o s , como la a m ilo p e c tin a , sin d e ja r residuos de alto peso m olecular (F is c h e r y S te in ,
1960; B ild e rb a c k ,
1973; D o e h le rt y D uke,
198 3 ). A dem ás, su peso m o le c u la r,
cercan o a los 5 0 .0 0 0 d a lto n s , es s im ila r al encontrado p ara o tra s a lfa -a m ila
sas de orig en vegetal (F is c h e r y S te in ,
196 0 ). Su re s is te n c ia al c lo ru ro m er
c ú ric o es in fe r io r a la que algunos autores (P ech et a l . ,
1971) consideran -
prop ia de las a lfa -a m ila s a s (tab la 9 ), pero esta menor re s is te n c ia se ha seña
lado también p ara o tra s a lfa -a m ila s a s de te jid o f o lia r . O kita et a l. han des­
c r ito una endoamilasa p resen te en el c lo ro p la s to (1979) y el el citoplasm a (1980) de las células de hojas de espinaca que es sensible a los agentes o x i­
dantes de los grupos s u lfh id r ilo . El com portam iento de la a lfa -a m ila s a de na­
ra n jo d ifie r e también en cuanto a su respuesta a la adición de iones c a lc io al m edio. Según S w ain y D e k k e r (1966b) la a lfa -a m ila s a de guisante es a c ti­
vada por la presencia de bajas concentraciones de c a lc io cuando los e xtrac to s
han estado en contacto con s ec u estrad o res de estos iones ta les como el c itr a
to u o x a la to . S in em bargo,
los e xtrac to s de naran jo obtenidos con tampón c ¡ -
tra to -fo s fa to no son activados por la adición de bajas concentraciones de c a l­
cio (fig u ra 9 ),
lo que indica que estos iones están fuertem ente unidos a la -
m olécula de enzim a.
I rshad y Sharm a (1981) d e sc rib e n un efecto in h ib id o r de
concentraciones elevadas de c a lc io sobre la a ctiv id a d de las a lfa -a m ila s a s se
-2 1 2 -
m ip u rifica d a s de sem illa de m a íz, tr ig o , cebada y cacahuete, no presentándo­
se sobre a lfa -a m ila s a s de o rig en animal (p a n c re á tic a ) o b a cteria n o ( B a c illu s ) .
E ste efecto in h ib id o r no se p resenta en los e x tra c to s crudos de hoja de naran
jo (fig u ra 9) a s í como tampoco se ha encontrado sobre los de cotiledones de
guisante (M o n e r ri,
1983). No puede e x c lu irs e la posib ilid ad de que e xista una
in te rfe re n c ia con el c a lc io p or p a rte de alguna sustancia p re se n te en los ex­
tra c to s c ru d o s.
La fra c c ió n enzim ática 1, c o rres p o n d ie n te a las bandas 7 a 13 de los e le c tro fo re g ra m a s , responden a las c a ra c te rís tic a s c lá s ic a s de las be
ta -a m ila s a s , siendo rápidam ente afectadas p o r el c lo ru ro m e rc ú ric o , m ientras
que no son inactivadas por el E D T A (tabla 7 y fig u ra s 25 y 28) ni los pH —
muy ácidos (tabla 6 , fig u ra 16). Su peso m o lecu lar - a lre d e d o r de 1 5 0 .0 0 0 d a lto n s - es s im ila r al de o tra s b e ta -a m ila sa s (F re n c h ,
1960). E stas enzimas
son capaces de a ta c a r también la a m ilo p é c tin a , formando d e x trin a s lím ite co­
mo producto de re a c c ió n . La longitud de onda de absorción máxima del com—
p ie jo io d o -s u s tra to v a ría con el grado de p o lim e riza c ió n de este últim o (A k a zaw a,
1965) por lo que en los e le c tro fo re g ra m a s las bandas de a ctiv id a d de­
bidas a la b e ta -a m ila s a presentan una co lo rac ió n d is tin ta a la c o lo rac ió n de
fondo producida p or el com plejo a m ilo p e c tin a -io d o . Las bandas de a ctiv id a d debidas a las a lfa -a m ila s a s no presentan ninguna c o lo ra c ió n , puesto que es—
tas enzim as degradan totalm ente el su strato (fig u ra 3 0 ).
Los resu ltad o s obtenidos con los e xtrac to s crudos d ifie re n de los
d e s c rito s p ara los e xtrac to s p u rific ad o s en cuanto a su respuesta al c lo ru ro
m e rc ú ric o . C oncentraciones de c lo ru ro m e rc ú ric o muy e fe ctiv a s p a ra la inac­
tiv ac ió n de la b e ta -a m ila s a en e xtrac to s p u rific ad o s de hojas de naran jo ( f i ­
guras 25 y 28) y en e xtrac to s crudos de guisante (S a n z ,
1978; M o n e rri,
1983
no afectan prácticam ente a los e xtrac to s crudos de naranjo (fig u ra 1 0), por lo que la estim ación de la a ctiv id a d a lfa -a m ilo lític a como la resid u al de los
e xtrac to s crudos tratad o s con c lo ru ro m e rcú ric o c o n d u ciría a a tr ib u ir la casi
-2 1 3 -
to talid a d de la activid ad a am ilasas de tipo a l f a ,
lo cual es e rró n e o . Median­
te c ro m ato g rafía se ha determ inado que la b e ta -a m ila s a contribuye en a lre d e ­
d or del 40 % a la a ctiv id a d total re c u p e ra d a , que es s u p e rio r al 80 % de la
p resen te en los e xtrac to s crudos en todos los c aso s. P a re c e obvia la e x is —
tencia de alguna sustancia en los extrac to s crudos que impide la inactivación
de la b e ta -a m ila s a por acción de este agente y que es elim inada durante la p u rific a c ió n por cro m ato g rafía o e le c tro fo r e s is , por lo que se cuestiona la u tiliz a c ió n de este método p a ra la estim ación de la a ctiv id a d de los dos g ru ­
pos de isoenzim as en e xtrac to s de hojas sin p u r ific a r .
La a ctiv id a d a m ilo lític a total encontrada a lo larg o de este tra b a
jo es muy s u p e rio r a la,, re q u e rid a p ara h id r o liz a r el almidón contenido, en las hojas ya que la a ctiv id a d mínima obtenida es capaz de e x p lic a r la d e g ra ­
dación del contenido máximo de almidón en pocas h o ra s . Es muy posible que
con el método u tiliza d o se produzca la e xtra c c ió n de enzimas no a ctivas "in
v iv o " en esos momentos, por lo que la a ctiv id a d encontrada es muy s u p e rio r
a la realm ente en activo en las c é lu la s .
P a ra d e te rm in a r si la m o vilizació n del almidón está regulada p or
la a m ila s a , los cambios del contenido en almidón deben c o m p ararse con las v a ria c io n e s de la a ctiv id a d a m ilo lític a y no con la a ctiv id a d total en cada mo­
mento. Las v a ria c io n e s de la a ctiv id a d a m ilo lític a a lo larg o del año en las
hojas adultas (fig u ra 49) no
almidón (fig u ra 41) .
guarda re la c ió n aparente con la acumulación de
El contenido en almidón dism inuye de m anera constante >
gradual desde el comienzo de la p rim a v e ra sin que se o b serve ninguna acele
ració n de la m ovilizació n en coincidencia con la a p a ric ió n de los acusados picos de a ctiv id a d obtenidos. En las hojas jóvenes se encuentra ¡nicialm ente
una re la c ió n e n tre la a ctiv id a d a m ilo lític a y el contenido en alm idón. D u ran te
la época de acumulación de almidón la a ctiv id a d a m ilo lític a es baja y en el mes de Junio se produce un increm ento inmediatamente a n te r io r al descenso
del contenido en almidón que se da en esta época (fig u ra s 41 y 4 9 ). P o ste ­
-2 1 4 -
rio rm e n te , sin em bargo, se presenta de forma p a ra le la un aumento de la acti_
vidad y una re cu p eració n del contenido en almidón (semanas 26 y 27) y a par,
t i r de ese momento la a ctiv id a d se mantiene re la tiv am e n te constante hasta la
semana 48 m ientras que el nivel de almidón desciende en pocas sem anas. Te
niendo en cuenta que, como se discute en el apartado A , el método u tiliza d o
e x tra e m ayor cantidad de almidón que los métodos en zim á tic o s , al c o r r e g ir los v a lo re s se obtiene que el contenido en almidón a p a r t ir de la semana 33
correspo nd e al fija d o por la fotosíntesis d ia ria y p or tanto, a la a ctiv id a d a m ilo lític a re la tiv am e n te elevada que se obtiene en esta época no puede c o rre s
ponder una u lte r io r m o vilizació n del alm idón.
P o r el c o n tra r io , e n -lo s estudios re a liza d o s en sistem as mas l i ­
mitados y controlados como los experim entos de elim inación de fru to y los de
hojas separadas de la p la n ta , s í que exis te una co rrespondencia e n tre los cam
bios de la a ctiv id a d a m ilo lític a y la degradación del alm idón. La m ovilizació n
más ráp id a provocada en las hojas jóvenes por la elim inación del fru to (fig u ­
ra 5 3 -A ) va acompañada por un increm ento
en la activid ad a m ilo lític a s u p e rio r
al encontrado en las hojas de brotes con fru to s (fig u ra s 5 6 -Á y 5 7 ). En las
hojas a d u lta s , en las que la pauta de m ovilización del almidón no v a r ía al eH
m in ar el fr u to , no se producen tampoco d ife re n c ia s en la s ín tes is de enzimas
a m ilo lític a s (fig u ra s 5 3 -B y 5 6 - B ). Del mismo modo, en las hojas separadas
de la planta se observa también un descenso del contenido en almidón junto a
un aumento de la activid ad a m ilo lític a (fig u ra s 60 y 6 4 ).
La ausencia de c o rre la c ió n e n tre las v a ria c io n e s estacionales de
la activid ad a m ilo lític a y los cambios del contenido en almidón a lo larg o del
año indica que la m ovilizació n del almidón no está regulada al menos exclus_[
vamente por estas enzim as, pudiendo e s ta r im plicada también la vía fosforol_í
tic a . La p re se n c ia de enzimas de las dos vías en hojas (P e av e y et a l . ,
P o n g ra tz y B e c k,
1978; O kita et a l . ,
1977;
1979), así como la detección de produc
tos de reacció n de los dos sistem as enzim áticos (Levi y G ib b s,
1976; H eldt et
-2 1 5 -
al.,
1977; P eavey et a l . ,
1977) han llevado a O kita y colab o rad o res (1979) a
p rop on er un modelo de acción conjunta según el cual el almidón s e r ía in ic ia l­
mente atacado por las am ilasas produciendo m altosa, glucosa y o lig o sa c árid o s
y liberándose po sterio rm en te g lu c o s a -1 -fo s fa to por acción de la fo s fo rila s a a
p a r t ir de los o lig o sacárid o s formados por la a lfa -a m ila s a .
En el metabolismo del almidón en las hojas de n a ran jo p o drían es
ta r im plicadas las dos vías d egradativas y si bien no se ha re a liz a d o un es­
tudio de los productos del metabolismo del alm idón, s í se han detectado al me
nos tre s fo s fo rila s a s en los e xtrac to s (fig u ra 3 5 ).
c on cl usi on es
-2 1 7 -
De la discusión de los resultados a n te rio rm e n te expuestos se des
prenden las siguientes conclusiones:
1 . - Tanto los a zú ca re s solubles como el almidón constituyen re s e rv a s m e ta bólicam ente re u tiliz a b le s por la p la n ta , siendo el almidón una re s e rv a de car.
bohidratos que pe rm ite m antener el nivel de a zú c a re s solubles por encim a de
un v a lo r mínimo.
2 . - La caída del fru to durante el mes de Junio no viene determ inada por el
agotam iento de las re s e rv a s hidrocarbonadas de la p la n ta , pues sólo un p o r­
centaje e n tre el 50 y el 60 de las re s e rv a s acumuladas durante el reposo ve
getativo son u tiliz a d a s en el periodo de crecim ien to y d e s a rr o llo .
3 . - La m o vilización de las re s e rv a s en las hojas adultas se produce de form a
gradual y a un ritm o constante, al menos hasta mediados de J u lio y no se ve
afectada p o r la elim inación de los sum ideros de las ram as en que están sitúa
d as. E sto es e xp lic ab le por la ausencia de conexiones v a s c u la re s d ire c ta s e n tre estas hojas y los fru to s en d e s a rro llo a s í como por s atu rac ió n del sis
tema de tra n s p o rte .
4 . - El estado n u tric io n al de la planta se re fle ja de m anera d is tin ta en las ho
jas jóvenes y en las a d u lta s . D urante el mes de Junio se p resenta un p e rio ­
do c r ític o en el contenido en c a rb o h id ra to s en las hojas jóvenes cerc a n as al
fr u to ,
lo que re fle ja la existen cia de una competencia de c a rá c te r local p or
los fotoasim ilados y que puede p ro v o c a r la caída de los pequeños fru to s en
d e s a r r o llo .
-2 1 8 -
5 . - La re la c ió n exis te n te e n tre el fru to y las hojas situadas en el mismo bro
te no se exp lica sim plemente por la re la c ió n fu e n te -s u m id e ro . Las hojas de b ro tes fru c tífe ro s presentan una acumulación m ayor de almidón y una degrada
ción más rápid a que las hojas de brotes v e g e ta tiv o s . La d is trib u ció n de los
a zu ca re s en los d istin to s órganos de la planta en cada momento del d e s a rro ­
llo no e s tá , por ta n to , regülada únicamente p o r fa c to re s n u tric io n a le s sino también p o r otros d is tin to s , presum iblem ente horm onales.
6 . - En las hojas de naranjo exis te el complemento enzim ático n e ce s ario p ara
la degradación del alm idón, tanto por la vía a m ilo lític a como por ia fo s fo ro lític a . P o r e le c tro fo re s is en geles de p o lia c rila m id a se encuentran 3 fo s fo r ilasas y un total de 13 a m ila s a s , de las cuales 7 son exoam ilasas (b e ta -a m ilasas) y las o tra s 6 endoamilasas (a lfa -a m ila s a s ).
7 . - La a lfa -a m ila s a de n aranjo p resenta c a ra c te rís tic a s a típ ic a s como son su
p a rc ia l s e n s ib ilid a d .a la acción de los in a ctiv a d o res de los grupos s u lfh id r ilo y su m ayor re s is te n c ia a los agentes s ec u estran tes de iones c a lc io , p or e s ta r estos iones fuertem ente unidos a la m olécula de enzim a.
8 . - En los e xtrac to s crudos e xis te alguna sustancia que impide la inactivación
de la b e ta -a m ila s a p o r el c lo ru ro m e rc ú ric o , p o r lo que la determ inación de
la activid ad a lfa -a m ilo lític a como la residual de e x tra c to s tratados con c lo ru
ro m e rc ú ric o debe r e a liz a rs e con e xtrac to s p u rific a d o s o s em ip u rific ad o s .
9 . - La m o vilización del almidón en hojas adultas no está regulada a p are n te —
mente por la a ctiv id a d a m ilo lític a y las v a ria c io n e s de a ctiv id a d que se p ro ­
ducen a lo largo del año no coinciden con v a ria c io n e s en la velocidad de de
gradación del alm idón.
-2 1 9 -
1 0 . - La elim inación de los fru to s de las ram as en que están situados no pro
voca cambios en el ritm o de degradación en las hojas adultas y tampoco afee
ta su a ctiv id a d a m ilo lític a .
•
1 1 . - En las hojas jó v e n e s , p a rtic u la rm e n te
ción
en los experim entos de e lim in a —
del fr u to , se p resenta una estrech a re la c ió n é n tre la v a ria c ió n de l a -
actividad a m ilo lític a y la del contenido en alm idón. La elim inación del fru to ,
que provoca un descenso más rápido del contenido en alm idón, induce también
una m ayor a ctiv id a d a m ilo lític a que en las hojas de b ro te s con fru to . .D e l mis
mo modo, durante la senescencia de las hojas separadas de la planta se pro
duce un im portante aumento de la actividad a m ilo lític a sim ultáneam ente con un
rápido descenso del nivel de alm idón.
bibliografía
-2 2 1 -
A B B O T T , I . R . a n d N . K . M A T H E S O N . (1972) S ta r c h depletion in germinating
w heat, w rín k le d seeded peas and senescing tobáceo l e a v e s . .
Phytochem istry 2 1 ,
1261 -1 27 2 .
A D A M S , C . A . ; R . W . R I N N E and M . C .
FJERSTAD.
(1980).^ S ta r c h d e p o s it-
ion and carbohydrase a c tiv itie s in developing and germinating soya
bean s eeds. A n n .B o t. 45 , 5 7 7 -5 8 2 .
A D A M S , C . A . ; T . H . BROMAN; S . W . N O R B Y and S . W . R I N N E .
(1 9 81 ). O c c u -
rence of m últiple forms of alphararnylase and absence of s ta rch
p ho s p h o ry la s e.in soya bean seeds. A n n .B o t.
-
48 , 8 9 5 -9 0 3 .
A G U 5 T T , M .; F . G A R C I A -M A R I and J . L . G U A R D IO L A . (1 9 82 ).
The influence
of flo w e r in g intensity on the shedding of re productive e s tru c tu re s
in sweet o ra n g e. S c i . H o r tic u ltu ra e V7 , 3 4 3 -3 5 2 .
A K A Z A W A , T . (1 9 6 5 ). S t a r c h ,
inulin and other r e s e r v e p o lysaccharides.
En: P lan t biochem istry (Bonner & V a r n e r ,
e d s .).
Academic P r e s s .
A L T M A N , A . and P . F . W A R E IN G . (1 9 75 ).
The effect of IA A on sugar a c c u 14
mulation and basipetal transport of
C -la b e lle d a ssim ilates in r e lation to root formation in Phaseolus v u l g a r i s . cuttings. P h y s io l.
P la n t. 33 , 3 2 - 3 8 .
A L T M A N , A . and R . G O R E N .
(1977).
D iffe re n tia l effeets of s u cro s e , abscisic
a cid , and benzyladenine on shoot growth and callus formation in the
abscission zone of excised c itru s buds. P lant P h y s io l. 5 9 , 116 1 -6 4
A .O .A .C .
(1 9 7 0 ). Methods of a n a ly s is .
1 1 th .e d . Association of O ffic ial Ana
lytical C h em ists. Washington D . C .
A R G U E L L E S , T . and J . L . G U A R D IO L A .
(1 9 77 ). Hormonal control of senescen
ce in excised orange leaves. J . H o r t .
S c i.
52 , 1 9 9 -2 0 4 .
-2 2 2 -
B A L L S , A . K . ; M . K . WALDEN and R . R . T H O M P S O N .
(1948). A c r y s ta llin e -
be ta-am ylase from sweet potato. J .b io l . C h e m .
B A N K S , W. and D . D . M U I R .
173 , 9 - 1 9 .
(1 9 80 ). S tr u c tu r e and chem lstry of the starch
g ra n u le. En: The biochem istry of pla nts .
s tru c tu re and function. ( P r e í s s , J . , e d . ) .
V o l. _3 : Carbohydrates:
Academic P r e s s .
B A U N , L . C . ; E . P . P A L M IA N O ; C . M . P E R E Z and B . O . J U L I A N O . (197.0). Enzymes of s ta rch metabolism in the developíng r i c e g ra in .
P h y s io l. 46 , 4 2 9 -4 3 4 .
BEAR, R .S .
Plant
,
(1944). J .A m e r . C h e m . S o c . 66 , 2 1 2 2 -2 1 2 3 . Citado por Banks,W.
& D . D . M u ir (1 9 8 0 ).
B E E V E R S , L . (19 68 ). Growth re g u la to r control in leaf discs of nasturtium
(Tropaeolum majus). En: Biochem istry and physiology of plant growth
substances. (Wightman, F . & G . S e t t e r f i e l d , e d s .) pp 1 4 1 7 -1 43 5 .
Runge P r e s s .
B E N N E T , J . P . (1 9 2 4 ). The distribution of c arbohydrate in the a p ric o t t r e e .
P r o c . a m e r . s o c . H o r t . s c i . 21_ , 3 7 2 -3 8 4 .
B I E L O R A I j H . and K . M E N D E L . (1 9 69 ).
The simultaneous measurement of a p -
parent photosynthesis and tr a n s p ira tio s of c itru s seedlings at dif—
fe re n t soil moisture le v e ls . J . a m e r . s o c . H o r t . s c i .
B IL D E R B A C K , D . E .
9 4 , 2 0 1 -2 0 4 .
(1 9 73 ). A simple method to d iffe re n c ia te between a lp h a -
and be ta -a m yla se . P lant P h y s io l.
5J_ , 5 9 4 -5 9 5 .
B I R D , I . F . j H . K . P O R T E R and C . R . S T O C K I N G . (1 9 6 5 ). Biochim . Biophys.
Acta 100 , 3 6 6 -3 7 5 . Citado por P r e i s s , J . & C .L e v i (1 9 8 0 ).
BLOM, J . A . ; A . BAK and B . B R A A E .
Citado por F r e n c h ,
(19 36 ). Z . P h y s io l. Chem. 241_ ,
D . (1960).
273.
-2 2 3 -
BLOM, J . ; A . BAK and B . B R A A E . (1937).
Z . physiol. Chem. 250 , 104.
Citado por F r e n c h , D . (1960).
B O LLA R D , E . G .
(1 9 70 ).
The physiology and nutritio.n of developing plants.
En: The biochem istry of fr u its and th e ir products. ( H u l m e , A . C . ,
e d .) pp 3 8 7 -4 2 5 . Academic P r e s s .
B R IG G S , D . E .
(1973). Hormones and carbohydrate metabolism in germinating
cere a l g r a in s . En: Biosynthesis and its control in pla n ts . (M il b o r r o w , B . V . , e d . ) . Academic P r e s s .
B U L P I N , P . V . and T . ap R E E S *
(1978). S ta rc h breakdown in spadix of Arum
maculatum. Phytochem istry V7 , 3 9 1 -3 9 6 .
C A M E R O N , S . H . and C . A .
S C H R O E D E R . (1 9 4 5 ). Cambial a c tiv ity and starch
cycle in bearin g orange tr e e s . P r o c . a m e r. s o c . H o r t . s c i . 4 6, 5 5 -5 9
B O U R N E, E . J . ; D . E . D A V I S a n d J . B . P R ID H A M .
(1 9 70 ). A lp h a -a m yla se ac­
tiv ity in sugarcane (Saccharum officinarum ) c h lo ro p la s ts . Phytoche
m istry 9 , 3 4 5 -3 4 8 .
BO W EN, M . R . a n d P . F . W A R E IN G . (1 9 71 ). F u r t h e r investigations into hormo
n e -d ire c te d tra n s p o rt in stems. P lanta 99 , 1 2 0 -1 3 2 .
C H R I S T Y , A . L . and C . A . S W A N S O N . (1976). Control of translocation by photosynthesis and carbohydrate concentrations of the source lea f.
En: T ra n s p o rt and tr a n s fe r processes in plantas (W ardlaw , I . F . &
J . B . P a s s io u ra , e d s .) pp 3 2 9 -3 3 8 . Academic P r e s s .
CRANE, J .C .
and M .M . N E L S O N . (1972). E ffect of crop load and auxin a p -
plication on a lté rn a te bearing of the p istachio. J . a m e r . s o c . H o r t . s c i .
97 , 3 3 7 -3 3 9 .
; I . A L -S H A L A N and R . M . C A R L S O N . (19 73 ). Abscission of pistachio
¡nflorescence buds as affected by leaf a re a and number of nuts.
-
-2 2 4 -
J . a m e r . s o c . H o r t . s c i . 98 , 5 9 1 -5 9 2 .
; , P . B . C A T L I N and 1. A L - S H A L A N . (1 9 7 6 ). C a rbohydrate levels in the
pistachio as re la te d to a lté rn a te b e a r in g . J . a m e r . s o c . H o r t . s c i . U)1_,
371 -3 7 4.
t
C H A P M A N , G .W .; J . E . PALLAS and J . M E N D I C I N O .
(1 9 72 ).
The hydrolysis
of m altodextrins by a beta-am ylase isolated from leaves of V ic ia
f a b a . B io c h im .B io p h y s .A c ta 276 , 4 9 1 -5 0 7 .
D A V IE S ,
D .R .
(1 9 7 4 ). Some aspects of sucrose metabolism. En: P lant c a r ­
bohydrate bioc h em is try . ( P r i d h a m , J . B . , e d . ) pp 6 1 - 8 1 .
Academic
FVess.
D A V I E S , C . R . and P . F . W A R E IN G . (1 9 6 5 ). A u x in -d ir e c te d tra n s p o rt of radio
radiophosphorus in stems. Planta 65 , 1 3 9 -1 5 6 .
D A V I S , B . D . (1 9 79 ).
Influence of cotyledons upon alp ha-am ylase a c tiv ity in
pea embrionic a x e s . P la n t. P h y s io l. 63 , 1 0 1 0 -1 0 1 5 .
D O E H L E R T , D . C . and S . H . D UK E. .(1 9 8 3 ). S p e c ific determ ination of a lp h a amylase a c tiv ity in crude plant e x tra c ts containing b e ta -a m y la s e .
P la n t. P h y s io l. 71_ , 2 2 9 -2 3 4 .
DO W N TO N , W . J . S . and J . S .
H A W K E R . (1 9 7 3 ). Enzymes of starch metabolism
in leaves and b e r r ie s of V itis v in if e r a . P hytochem istry L2, 1 1 5 7 -6 3 .
DUGGER,
W .M . and R . L . P A L M E R . (1 9 6 9 ). Seasonal changes in lemon leaf
c a rb o h y d ra te s .
D U R IN G , H .
P roc.
1st In t. C itr u s Symp.
1_ > 3 3 9 -3 4 3 .
and G . A LL E W E L D T . (19 80 ). E ffects of plant hormones on phloem
tra n s p o rt in gra p ev in e s. B e r . D t s c h . B o t . G e s .
D W I V E D I , S .; M. KAR and D . M I S H R A .
93 , 3 3 9 -3 4 7 .
(1 9 7 9 ). Biochemical changes in excP
sed leaves of O r y z a sativa sübjected to w a te r s tr e s s .
P la n t. 45 , 3 5 - 4 0 .
P h y s io l. -
-2 2 5 -
E B E R T , A . and F .
B A N G E R T H . (1 9 81 ). R elation s between the c o n c e n tra ro n
of diffusable and e xtrac ta b le g i b b e r e llin - lik e substances and the a l te rn a te -b e a rin g bohaviour ¡n apple as a ffected by Chemical fr u it
-
thinning. S c ie n tia H o r t i c . ]_5 , 4 5 - 5 2 .
*
E R I C K S O N , L . C . (1 9 6 8 ). The general physiology of c it r u s . En: The c itr u s
in d u s try . Vol
I I : Anatomy, physiology, m ineral n u tr itio n , seed re
production, genetics, growth r e g u la to r s . (R e u th e r ,W .; L . D . Batche
lo r and H . J . Webber, e d s .) U n iv e r s ity of C a l if o r n i a .
and B . L .
B R A N N A M A N . (1 9 60 ). Abscission of reproductive s tru c tu re s
and leaves of orange tr e e s . P r o c . a m e r . s o c . H o r t . s c i . 7 5 , 2 2 2 -2 2 9 .
E R N E R , Y . ; R . G O REN and S . P . M O N S E L I S E . (1 9 7 6 ).
The rough fr u it condij.
ion of the "Shamouti" orange connections with the endogenous h o r—
monal balance. J . h o r . s c i.
F E K E T E , M . A . R . d e and G . H .
51_ , 3 6 7 -3 7 4 .
V I E W E G . (1 9 7 3 ). The ro le of phosphorylase
in the metabolism of s ta rc h . A n n .N e w Y o r k A cad. S c i . 2 1 0 , 1 7 0 -1 8 0 .
F E R N A N D E Z T A R R A G O , J . and G . N I C O L A S . (1 9 76 ). S ta r c h degradation in
the cotyledons of germinating le n tils . P lant P h y s io l. 58, 6 1 8 -6 2 1 .
F I S C H E R , E . H . and E . A . S T E I N .
v o l.
IV .
(1960). A lp h a -a m y la s e s . En: The enzymes.
(B o y e r , Lardy and M y rb a ck , e d s .).p p 3 1 3 -3 4 3 . Academic -
P ress.
------; w .N . SUMMERW ELL; J .M . JU N G E and E . A . S T E I N .
(1 9 60 ). C a l c i u m -
and the m olecular s tru c tu re of a lp h a -a m y la s e s . P r o c .
4th In te r n .
C o n g r. Biochem. Symp. 8 , r e p r in t 3: 1 -1 3 . Wien 1958. Pergamon
P ress.
F R E N C H , D . (1 9 6 0 ). B e ta -a m y la s e s . En: The enzymes. Vol
dy & Myrback*, e d s .) Academic P r e s s .
IV .
(B o y e r , L a r
-2 2 6 -
F U K U M O T O , J . and Y . T S U J I S A K A . (1 9 55 ). Kagaku to Kógyo 29 , 124. C ita ­
do por F r e n c h , D . (19 60 ).
F U R 1 0 , J . ; F . CALVO ; J . L . T A D E O and E . P R IM O M IL L O . (1 9 8 1 ). R e la tio n ship between endogenous hormonal content and fr u it set in c itru s
v a r ie tie s of the navel group. P r o c .
I n t . S o c . C i t r i c u l t u r e 1_, 2 5 3 -
2 5 6 . Japan.
G A R C I A L U I S , A . (1 9 72 ). Cambios inducidos por el ácido g ib e ré lic o duran­
te.-la germinación de sem illas de guisante. T e s is d o c to ra l. F a c u l­
tad de C ie n c ia s . U niversidad de V a le n c ia .
G A R C I A M A R T I N E Z , J . L . ; M . A . G A R C IA P A P I
y
A . M A N S A N E T , (1 9 76 ).
I dentificadón y cuantificación de ácido abscísico por crom atografía
de gases en frutos inmaduros de clementino fino y clementino Monr e a l . Agroquim . T e c n o l. A lim .
and M . A .
G A R C IA P A P I .
(19 79 ).
1_6 , 5 7 - 6 8 .
Influence of g ib b e r e llic acid on e a r ly
f r u i t development, diffusible growth substances and content of macro
nutrients in seedless clementine m andarín. S c ie n tia H o r t i c . JJ_, 3 3 7 347.
G A T E S , J .W . and G . M . S I M P S O N . (1 9 68 ).
The presence of starch a lp h a -
amylase in the leaves of plants. C a n . J . Bot. 4 6 , 1 4 5 9 -1 4 6 2 .
G E P S T A I N , S . and I .
IL A N . (1 9 74 ). Does osmotic regulation of amylase syn
thesis in b a rle y endosperm e x is t? . Plant & C ell P h y s io l.
1_5, 3 9 9 -
4 02 .
and
. (1 9 7 9 ). Cytokinin-induced am ylolytic a c tiv ity in bean c o ty le dons: Identification of the regulated enzyme. P lant & Cell P h y s io l.
20 , 1 6 0 3 -1 6 0 7 .
, and
. (19 81 ). Does osmotic regulation of amylase a c tiv ity in bean
cotyledons e x is t? . P h y s io l. P la n t. 5 3, 1 8 8 -1 9 0 .
-2 2 7 -
G E R S A N I , M .; S . H . L I P S and T . S A C H S . (1 9 8 0 a ).
The influence of shoots,
ro o ts , and hormones on sucrose d ls trib u tio n . J . e x p . B o t . 3J_, 1 7 7 184.
, ------- , a n d
. (1980b).
The influence of shoots, roots and hormones
on the distribution of leucine, phosphate and benzyladenine. J . e x p .
Bot. 3 1 , 7 7 7 -7 8 2 .
G I B B S , M. (1 9 66 ). Carbohydrates: th e ir ro le in plant metabolism and n u t r i t ion. En: Plant Physiology (S te w a r d , F . C . , e d .) V o l . IV B . Acade
mic P r e s s .
G O L D S C H M ID T , E . E . ; S . K . E I L A T I and R . G O R E N . (19 70 ). J n c r e a s e in A B A like growth ¡nhibitors and decrease in g ib b e r e llin - lik e substances
during ripening and senescence o f c itr u s f r u i t s . En: P lant growth
substances 1970. ( C a r r , D . J . , e d . ) pp 6 1 1 -6 1 7 . S p r in g e r V e r la g .
and A . GOLOMB. (1982) The carbohydrate balance of a lt e r n a te -b e a r ig
c itru s tr e e s and the significance of r e s e r v e s fo r flo w e rin g and fr ú itin g . J . a m e r . s o c . H o r t . s c i . 107 , 2 0 6 -2 0 8 .
; R . G O REN; Z . E V E N - C H E N a n d S . B I T T N E R .
(1 9 7 3 ).
In c re a s e ¡h fr e e
and bound abscisic acid during natural and ethylene-induced senes­
cence of c itru s f r u it p e e l. Plant P h y s io l.
G O R E N , R . and E . E . G O LDSCHM I D T .
veloping c itru s f r u i t .
I.
tis su e s . P h y s io l. P la n t.
51 , 8 7 9 -8 8 2 .
(1 9 70 ). Regulative systems in the de
The hormonal balance in orange f r u it —
23 , 9 3 7 -9 4 7 .
G RO CHO W SKA, M . (1973). Com parative studies on physiological and morpho
logical fea tu re s of be arin g and n o n-b earing spurs of the apple t r e e .
I.
Changes in s ta rc h content during grow th. J . H o r t . S c i .
356.
48 , 3 4 7 -
-2 2 8 -
G U A R D IO L A , J . L . ; M. A G U S T I and F . G A R C IA M A R I . (1 9 77 ). G ib b e r e llic acid and flo w e r bud development in sweet orange. P r o c . I n t . S o c .
C itric u ltu re
2
,
6 9 6
-
6 9 9
.
a n d J . G O N Z A L E Z . (1 9 82 ). N utrie nt re tran slo c atio n in N av ela te and Washington navel oranges. X X I
; C . MONERRI
and M. A G U S T I .
I n t . H o r t . C o n g r e s s . Hamburg.
(1982).
llic acid on flo w e rin g in C it r u s .
The inhibitory effect of gibbere
Physiol .P l a n t .
55 , 1 3 6 -1 4 2 .
H A A P A L A , H . (1 9 69 ). Studies on the activ ity of beta-am ylase in the chloro
plasts of S t e l l a r i a media during prolonged illum ination.
P la n t. 2 2,
HABESHAW, D.
P h y s io l. -
1 4 0 -1 4 6 .
(1 9 69 ).
The effect of light on the translocation from sugar
beet lea v es . J . e x p . B o t .
2 0, 6 4 - 7 1 .
H A N S E N , J . and I . M 0 L L E R . (1 9 75 ). P ercolation of s ta rch and soluble c a r bohydrates from plant tissue fo r quantitative determ ination with an
throne. A n a l. Biochem. ,68 , 8 7 - 9 4 .
H E L D T , H . W . ; C . J . CHON; D . M AR ON DE; A . HERO LD; Z . S . S T A N K O V I C ; D .
A . WALKER; A . K R A M IN E N ; M . R . K I R K and V . H E B E R . (1 9 77 ). —
Role of orthophosphate and other factors in the regulation of starch
formation in leaves and isolated c h lo ro p la s ts . P l a n t . P h y s i o l . 59 ,
1 1 4 6 -1 15 5 .
H I L D E B R A N D , D . F . and T . H Y M O W IT Z . (1981). Role of beta -a m yla se in —
starch metabolism during soybean seed development and germ ination.
P h y s io l. P la n t.
53 , 4 2 9 -4 3 4 .
H IL G E M A N , R . H . ; J . A . D UN LAP and G . C . S H A R P L E S .
(1 9 6 7 ). E ffe c t of t i ­
mes of harvest of Valencia oranges on leaf c arbohydrate content and subsequent set of f r u i t .
P r o c . a m e r . s o c . H o r t . s c i . 90 , 1 1 0 -1 1 6 .
-2 2 9 -
H O , L . C . (1 9 7 6 ).
The relationship between the ra te s of carbón tra n s p o rt -
and of photosynthesis in tomato le a v e s . J . e x p . B o t . 27 , 8 7 - 9 7 .
I R S H A D , M . and C . B . S H A R M A . (1981). S e n s itiv ity of plant alpha-am ylases
¿o calcium ions "in v i t r o " . Phytochem istry 20 , 1 2 0 5 -1 2 0 9 .
IU P A C -IU B .
(1 9 7 2 ). Comission on biochemical nom enclature. Enzyme nomen
c la t u r e . E l s e v i é r .
J A C O B S E N , J . V . ; J . G . S C A N D A L 1 0 S and J . E . V A R N E R . (1 9 70 ). M últiple form of amylase induced by g ib b e re llic acid in isolated aleurone l a y e r s . P la n t. P h y s io l. 45 , 3 6 7 -3 7 1 .
JAHN, O .L .
(1 9 7 3 ).
In florescence types and fr ü itin g patterns in Hamlin and
V ale n c ia oranges and Marsh g r a p e f r u it . A m e r . J . B o t . 60 , 6 6 3 -6 7 0 .
J O N E S , R . L . and J . E . A R M S T R O N G . (1 9 7 1 ). E vidence fo r osmotic regulation
of h y d ro litic enzyme a c tiv ity in germ inating b a rle y seeds. Plant P h y s io l. 48 , 1 3 7 -1 4 2 .
and J . E . V A R N E R . (1 9 6 7 ). The bióassay
of g ib b e re llin s . Planta 72 ,
1 5 5 -1 6 1 .
J O N E S , W .W .; T . W . E M B L E T O N ; E . L . B A R N H A R T and C . B . C R E E . (1 9 74 ).
E ffe c t of time and amount of fr u it thinning on leaf carbohydrates
and fr u it set in V alencia oranges. H ilg a rd ia 42 , 4 4 1 -4 4 9 .
;
and C . W . C O G G IN S . (19 75 ). S ta r c h content of roots of Kinnow
mandarín tre e s be arin g fr u it in a lté rn a te y e a r s . H o r ts c i.
; ------- ;
1_0 , 5 14.
and D . D . H A L S E Y . (1 9 7 3 ). F a c to rs re la te d to fr ü itin g of -
Kinnow m andarín. P r o c . 2nd C itr u s Symp. 235-241 .
; ------- ;
m
. L . S T E I N A C K E R and C . B . C R E E .
(1 9 6 4 ).
The effect of f r u i t
ha rve s t on fr ü itin g and carbohydrate supply in the V ale n c ia orange.
P ro c .a m e r.s o c .H o rt.s c i. 84,
1 5 2 -1 5 7 .
-2 3 0 -
; ------- ;
and
. (19 70 ). C arbohydrates and fr ü itin g of Valencia
orange tr e e s . J . a m e r . s o c . H o r t . s c i . 95 , 3 8 0 -3 8 1 .
and M . L . S T E I N A C K E R .
*
(1951). Seasonal changes in concentration of
sugars and s ta rch in leaves and twigs of c itru s t r e e s . P r o c . a m e r .
s o c . H o r t . s c i . 58 , 1 - 4 .
J U L IA N O , B . O . and J . E . V Á R N É R . (1 9 69 ). Enzymic degradation of s tarch granules in the cotyledons of germ inating pe as . Plant P h y s io l. 4 4 ,
8 8 6 -8 9 2 .
K A N D L E R , O . and H . H O P F . (1 9 80 ). O c c u rre n c e , metabolism and function of
oligosa c cha ride s. En: The biochem istry of pla n ts . V o l.
J . , e d .).
3. (P re is s ,
Academic P r e s s .
K A O , C . H . (19 81 ). Senescence of r ic e lea v es . V I .
Com parative study of the
metabolic changes of senescing tu rg id and w a t e r - s t r e s s e d excised
lea v es . P lant & Cell P h y s io l. 22 , 6 8 3 -6 8 8 .
K H A L IF A H , R . A . and L . N . L E W IS .
(19 66 ). Cytokinins in c itru s :
Isolation of
a cell d iv is ió n ' fa c to r from lemon seeds. N a tu re 212 , 1 4 7 2 -1 4 7 3 .
;
and C . W . C O G G IN S . (19 65 ).
Iso lation and p ro p e rtie s of g ib b e r e -
l l i n - l i k e substances from c itru s f r u i t s .
P lant P h y s io l. 4 0 , 4 4 1 -4 4 5 .
K O M B R IN K , E . and G . W OBER. (19 80 ). P r e p a r a tio n of intact chloroplasts by
chem ically induced lysis of the green alga D u n a lie lla m a r in a . Plan
ta 149 , 1 2 3 -1 2 9 .
K O S H I B A , T . and T . M IN A M IK A W A . (1 9 8 0 ). E ffe c t of growth tem peratu re on
re s e r v e m obilization and h ydrolytic enzyme a c tiv itie s in Viqna munqo
cotyledons. Plant S- Cell P h y s io l. 2J_ , 8 6 5 -8 7 2 .
K O Z L O W S K I, T . T . and T . K E L L E R . (1966)* Food re la tio n s of woody p lants.
B o t .R e v .
32^ , 2 9 3 -3 8 2 .
-2 3 1 -
K R IE D E M A N , P . E .
(1 9 68 ). Some photosynthetic c h a r a c te r is tic s of c itru s -
le a v e s . A ust. J* B i o l . 21_ , 8 9 5 -9 0 5 .
. (1 9 6 9 a ).
« (1 9 69 b ).
14
C distrib u tio n in lemon p la n ts . J . H o r t . s c i .
14
44 , 2 7 3 -2 7 9 .
C distrib u tio n in orange p la n ts . A u s t . J . a g r i e . r e s .
20 ,
2 9 1 -3 0 0.
K U B O T A , S . and E . M O T O Y A M A . (1 9 71 ). Th e effeets of f r u i t - b e a r i n g on the
14
tra ns loc a tion and d istribution of
C-photosynthates in Satsuma mandarín t r e e s . Bull .Shikoku a g r ie , exp. s ta . 24 , 2 7 - 4 0 .
K U M A R , A . a n d 'G . G . SANW A L. (19 77 ). Múltiple forms of s tarch p hos phory lase from banana leaves. Phytochem istry JM5 , 3 2 7 -3 2 8 .
LARNER, J.
(1 9 6 0 ). O th e r glucosidases. En: The enzymes. V o l.
Lardy and M y rb a ck , eds*) pp 3 6 9 -3 7 8 .
IV .
(B o y e r ,
Academic P r e s s .
L A T C H E , A . ; J . C . PECH; A . D IA R R A e t J . FA LLO T.
(1 9 74 ). F a c te u rs sus­
ceptib les de c o n tr o le r l ’amylolyse chez la pomme et la p o ir e . —
Colloques Internationaux C . N . R . . S .
n2 2 38 . F a c te u rs et regulation
de la maturation des f r u i t s .
L A T Z K O , E . and M. G I B B S .
(19 68 ). D is trib u tio n of enzymes of the r e d u c t i-
ve pentose phosphate eyele in spinach leaves and in chloroplasts
isolated by d iffe re n t methods. Z . P fla n ze n p h y s io l. 59 , 1 8 4 -1 9 4 .
LENZ, F .
(1 9 6 6 ). F lo w e r and fru it development in V a le n c ia -la te orange as
affected by type of inflorescence and nutritional status. H o r t .
Res.
6 , 6 5-78 .
. F r u i t effeets on photosynthesis, lig h t- and d a r k - r e s p i r a t io n . En: Pho
tosynthesis and plant development. ( M a r c e lle , R . ; H . C l i j s t e r s and
M. van Poucke, e d s . ) .
and P . R . C A R Y .
(19 69 ).
W. Junk, p u b l.
Relatioship between vegetative and reproducH
-2 3 2 -
ve growth in Washington-navel orange as affected by n u tr itio n . P ro c . Is t
I n t . C itr u s Symp. 3 , 1 6 2 5 -1 6 3 3 .
L E V I , C. and M. G I B B S .
(1 9 76 ). S ta rc h degradation in isolated spinach —
c h lo ro p la s ts . P lant P h y s io l.
#
57 , 9 3 3 -9 3 5 .
—
and J . P R E I S S .
e x tr a c ts .
(1 9 78 ). Amylopectin degradation in pea c hloroplast -
P lant P h y s io l. 61_ , 2 1 8 -2 2 0 .
L E W I S , L . N . ; C . W . C O G G IN S and H . Z .
H IE L D .
(1 9 64 ).
The effeets of b ie n -
nial bearin g and N A A on the carb o h y d ra te and nitrogen composition
of Wilking mandarín leaves. P r o c . a m e r . s o c . H o r t . s c i .
LU C K W ILL, L . C . and J . M . S lj_ V A . (1 9 79 ).
84 , 1 4 7 -1 5 1 .
The effeets of daminozide and -
g ib b e re llic acid on flo w e r in itia tio n , growth and fr ü itin g of apple
c v . Golden D e lic io u s . J . H o r t . s c i.
54 , 2 1 7 -2 2 3 .
M a c R A E , J . C . ; D . S M I T H and R . M . M c C R E A D Y .
(1 9 74 ). S ta rc h estimation '
in leaf t i s s u e . - A comparison of re s u lts using six methods. J . s c i .
Food a g r ie . 2 5 , 1 46 5 -1 46 9 .
M a c W IL L IA M S , I . A . and G . H A R R I S .
(1 9 59 ).
The separation of lim it dextri_
nase from R -enzym e and aspeets of the a c tiv itie s of the separated
enzymes. A r c h s .B io c h e m .B io p h y s . 84 , 4 4 2 -4 5 4 .
MANNERS,
D . J . and K . L . ROWE. (1969).
C a rb o h y d r. r e s . 9 , 4 4 1 - 4 5 0 . Cita
do por P r e i s s , J . and C . L e v i, 1979.
MARRE, E .
(1 9 82 ). Hormonal regulation of tra n s p o rt: data and p e rs p e c tiv e s .
En: Plant growth substances 1982. (W areing, P . F . , e d . ) .
pp 4 0 7 -
4 17 . Academic P r e s s .
M c C R E A D Y , R . M . (1 9 77 ). C arbohydrates: composition, d is trib u tio n , s ig n if icance. En: C itr u s science and technology. V o l . I .
; J . GUGGOLZ; V . S I L V E I R A and H . S . O W E N S . (1 9 5 0 ).
The Avi p u b l.C o .
Determ ination
-2 3 3 -
of starch and amylose in vegetables. A n a l.C h e m . 22 , 1 1 5 6 -1 1 5 8 .
M E Y ER , K .H .; P . F . SPAHR
e t' E .H . F IS C H E R .
(1 9 53 ). P u r if¡c a t ió n , c r i s
ta llis a tio n et p ro p rie te s de la alpha-am ylase de b le . H e l v . Chim .
A c ta . 36 , 1 9 2 4 -1 9 3 6 .
M E Y E R , M . M . and W . E . S P L I T T S T O E S S E R .
.
.
(1 9 7 1 ). The u tiliz a tio n of c a r
bohydrate and nitrogen re s e rv e s by Taxus during its sp rin g growth
p e rio d . P h y s io l. P la n t. 24 , 3 0 6 -3 1 4 .
M O N D A L , .M . H . ; W. A . B R U N and M . L . B R E N N E R . (1 9 7 8 ). E ffe e ts of sink r e
moval on photosynthesis and senescence in leaves of soybean (G l y cine max, L . ) p la n ts . P lant P h y s io l. 61_ , 3 9 4 -3 9 7 .
M O N E R R I , C . (1 9 8 3 ). Control de la m ovilización del almidón en sem illas de guisante durante la germ inación.
T e s is d o c to ra l. Fa cultad de
C ie ncia s B io ló g ica s . U niv ers ida d de V a le n c ia .
M O N S E L IS E , S . P .
(1 9 7 7 ). C itru s f r u it development: endogenous systems -
and external re g u latio n . P r o c . I n t . s o c . C i t r i c u l t u r e 2 , 6 6 4 -6 6 8 .
. (1 9 8 0 ). S election of a p p ro p riate bases of calculation fo r the e v a lu a tion of data in plant Science and a g r ic u ltu r e . Codata B u ll. n2 39.
Problem s in the treatment of numerical d a ta . P r o c . of joint F r e n c h Is ra e li
In te r d is c ip lin a r y Symp.
. (1 9 8 2 ). Use of growth re g u la to rs in e ve rg re en fr u it c ro p s .
XXI
In t.
H o r t . C ongress. Hamburg.
and E . E . G O L D S C H M ID T . (1 9 8 2 ). A lté rn a te b e a rin g in fr u it tre e s ; a
r e v ie w . H o r t . r e v . 4 , 1 2 8 -1 7 3 .
and L. H E Y M A N N - H E R S C H B E R G . (1 9 53 ).
Influence and age on d ry -
m atter content, a re a and m ineral composition of Shamouti orange
lea v es . P r o c . a m e r . s o c . H o r t . s c i . 6 2 ., 6 7 - 7 4 .
-2 3 4 -
and F . L E N Z .
(1 9 80 ). E ffe c t of fr u it load on photosynthetic. ra te s of -
budded apple t r e e s . G artenbauw iss. 45 , 2 2 0 -2 2 4 .
M O O R B Y , J . (1 9 7 7 ).
Inte gration and regulation of translocation within the
whole p la n t. En: Symposia of the S o cie ty fo r experimental Biology.
In te g ratio n of a c tiv ity in the higher p la n t. pp 4 2 5 -4 5 4 .
S y m p .X X X I.
Cambridge U n iv e r s ity P r e s s .
MOSS, G. I .
(1 9 70 ). Chemical control of flo w e r development in sweet orange
(C itr u s s in e n s is ).
A ust. J . a g r . r e s . 21_ , 2 3 3 -2 4 2 .
. (1 9 7 1 ). E ffe c t of:f r u it oh flowTéring in réfáition tobiennial b e a rin g in sweet orange ( C itr u s s in e n s is ).
J . H o r t . s c i.
46 , 1 7 7 -1 8 4 .
and K . B . B E V I N G T O N . (1 9 73 ). Methods fo r c o n tro llin g biennial bearing
in L a te -V a le n c ia sweet ora n g e.
1 e r . Congreso Mundial de C i t r i c u l -
tu ra 2 , 3 6 7 -3 7 2 . M u rc ia .
; B . T . S T E E R and P . E . K R I E D E M A N . (1 9 7 2 ). The re g u la to ry r o le of
inflore sc e nce leaves in f r u it- s e ttin g by sweet orange (C itr u s sinen­
s i s ) . P h y s io l. P la n t. 27 , 4 3 2 -4 3 8 .
M U L L IG A N ,
D .R . a n d J .W . P A T R IC K .
(1 9 7 9 ). G ib b e r e llic -a c id -p r o m o te d -
tra n s p o rt of assim ilates in stems of Phaseolus v u lg a r is , L .
P la n ­
ta U 5 , 2 3 3 -2 3 8 .
N O M U R A , T . ; Y . KONO and T . A K A Z A W A . (1 9 6 9 ). Enzymic mechanism of sta rch breakdown in germinating r ic e seeds.
II.
Scutellum as the
site of sucrose synthesis. P lant P h y s io l. 4 4 , 7 6 5 -7 6 9 .
O H L S S O N , E . (1 9 3 0 ).
The two components of malt d ia s ta s e , esp e c ially with
re fe re n c e to the mutarotation of the producís formed in the h y d r o lysis of s ta rc h .
Z .p h y s io l .Chem .
189 , 1 7 - 6 3 .
O K I T A , T . W . j E . G R E E N B E R G ; D . N . K U H N and J . P R E I S S .
(1 9 79 ). S u b c e l-
-2 3 5 -
lu la r localizatio n of the starch degradative and biosynthetic enzy­
mes of spinach lea v es .
Plant P h y s io l. 64 , 1 8 7 -1 9 2 .
a n d ü . P R E I S S . (1 9 8 0 ). S ta rc h degradation in spinach lea v es .
Is o la t­
ion and c h a ra c te riz a tio n of the amylases and R-enzym e of spinach
leaves. P lant P h y s io l. 66 , 8 7 0 -8 7 6 .
O R N S T E I N , L . (1 9 64 ). Disc electrophoresrs: l .
Ann. N . Y . Acad. S c i .
PARK, J .T .
Background and th e o ry . -
121 , 3 2 1 -3 4 3 .
and M . J . J O H N S O N . (1 9 49 ). A subm icrodeterm ination of glucose.
J . b io l. Chem.
P A T R IC K ,J .W .
181 , 1 4 9 -1 5 1 .
(1 9 8 2 ). Hormonal control of a ssim ilate tr a n s p o rt.
En: P lant
growth substances 1982. (W areing, P . F . , e d .) pp 6 6 9 -6 7 8 . Acade­
mic P r e s s .
and P . F . W A R E IN G .
(1 9 70 ). Expérim ents on the meehanism of horm one-
d ire c te d tra n s p o rt* En: P lant growth substances 197Q. ( C a r r , D . J .
e d . ) . pp 6 9 5 -7 0 0 . S p r in g e r V e r l a g .
and
. (1 9 7 3 ). Auxin-prom oted tra n s p o rt of metabolites in stems of
Phaseolus v u lg a ris L .
J . exp. B o t. 2 4 , 1 1 5 8 - 1 1 7 1 .
P A Z U R , J . H . (1 9 6 5 ). Enzymes in synthesis and h y d ro lys is of s ta r c h . En:
S ta rc h chem istry and technology. V o l. ]_ : Fundamental aspects.
(W histler a n d P a s c h a l, e d s . ) . Academic P r e s s .
P E A V E Y , D . G . ; M. S T E U P and M. G I B B S .
(19 77 ). C h a r a c te r iz a tio n of s ta rch
breakdown in the intact spinach c h lo ro p la s t.
Plant P h y s io l. 60 ,
3 0 5 -3 0 8 .
P E C H , J . C . ; G . B O N N E A U et J . F A L L O T . (1 9 71 ). Les amylases de la poire:
c a r a c té ris a tio n . C . R . A c a d . S c i . 273 , 7 7 5 -7 7 8 .
P O N G R A T Z , P . and E . B E C K .
(1 9 78 ). Diurnal o s c illa tio n of am ylolytic a c -
-2 3 6 -
tiv ity in spinach c h lo ro p la s ts . Plant. P h y s io l. 62 , 6 8 7 -6 8 9 .
P R E I S S , J . and C . L E V I .
(1 9 7 9 ). Metabolism of s ta rch in lea v es . En: E n -
cyclopedia of P lant P hysiology. V o l . 6: Photosynthesis I I . -
Photo
synthetic carbón metabolism and r e la te d p ro c e s s e s . (G ib b s ,M . and
E . Latzko, e d s .) pp 2 8 2 -3 1 2 , S p r in g e r V e r l a g .
—■—• ; T . W . O K I T A and E . G R E E N B E R G . (1 9 8 0 ). C h a r a c te r iz a tio n of the —
spinach leaf phosphorylases. P lan t P h y s io l. 66 , 8 6 4 -8 6 9 .
P R I E S T L E V , C . A . (1 9 7 1 ). C a rbohydrate storage and u tiliz a t io n . En: Physio
logy of tr e e c ro p s . (L u c w ill, L . C . and C . V . C uttings, e d s .) p p 113—
127. Academic P r e s s .
REES,
T . ap. (1 9 7 4 ). Pathways of c arbohydrate breakdown in higher pla nts .
En: B io c h em is try . S e r i e s O ne. (N o rth c o te , D . H . , e d . ) .
Vol 1_1_.
Plant B io c h e m is try . M T P International Review of S c ie n c e .
RO W SELL, E . V . and L . J . G O A D . (1962) The constituent of wheat binding l a tent b e ta -a m y la s e . Latent beta-am ylase of wheat: its mode of a t t a chement to glutenin and its r e le a s e .
SACHS, T .
(1 9 75 ).
Biochem. J . 84 , 73 P .
The induction of tra n s p o rt channels by auxins. Planta -
127 , 2 0 1 -2 0 6 .
S A K A I , A . and S . Y O S H I D A .
(1 9 6 8 ). The r o le of sugar and re la te d com—
pounds in v a ria tio n s of fre e z in g re s is ta n c e . C r y o b ío l.
SANZ, A.
5 , 1 6 0 -1 7 4 .
(19 78 ). Estimación de la actividad a m ilo lític a en cotiledones de guisante.
Tesina de L ic e n c ia tu ra . Facultad de Ciencias B io ló g ic a s .
U niversidad de V a le n c ia .
S A U E R , M . R . (1 9 51 ). Growth of orange shoots. A u s t. J . a g r ie , r e s . 2 r 105—
117.
. (1 9 5 4 ).
F lo w e rin g in the sweet orange. A u s t . J . a g r i e . r e s . 5 , 6 4 9 -6 5 7 .
-2 3 7 -
S A U T E R , J . J . (1 9 6 6 ). Untersuchungen z u r Physiologie d e r .P a p p e lh o lz s tra h len .
I . J a h re s p e rio d is c h e r V e r ia u f d e r S ta rke s p eic h e ru n g im Holz
parenchym .
Z . P flan zen p h y s io l. 55 , 2 4 6 -2 5 8 .
S C H W IM M E R , S . (1950) K inetics of malt alpha-am ylase action. J . b io l. Chem.
166 , 1 8 1 -1 9 3 .
S E T H , A . and P . F . W Á R É IN G . (19 67 ). Hormone d ire c te d tra n s p o rt of m e ta bol ites and its possible ro le in plant senescence. J . exp. B ot.
18,
67-77 .
S H A I N , Y . and A . M . M A Y E R . (1 9 68 ). Activation of enzymes during germina
tion: amylopectin-1 ,6 -g lu co s id a se in peas.
P h y s io l. P la n t . 21_, 7 6 5 -
776.
S I M I N O V I T C H , D . ; C . M . W ILSO N and D . R . B R I G G S . (1 9 5 3 ). Studies on the
chem istry of the living b a rk of the black locust in re la tio n to its
f r o s t h a rd in e s s . V .
Seasonal transform ation and v a ria tio n s in the
carbohydrates: s ta r c h -s u c ro s e in te rco n ve rsio n s . P lant P h y s io l. 2 8 ,
3 8 3 -4 0 0 .
S I N C L A I R , W .B . and E . T . B A R TH O LO M E W . (1 9 37 ). D ia s ta tic a c tiv ity of —
orange leaves as affected by tim e, te m p e ra tu re , pH and c e rta in zinc s a lts .
J. agr.
res.
54 , 6 0 9 -6 1 9 .
S M I T H , P . R . ; W. R E U T H E R and A .W . S P E C H T .
V ale n c ia orange t r e e s .
II.
(1 9 5 2 ). Seasonal changes in
Changes in m ic ro e le m e n ts , sodium and
carbohydrates in lea v es . P r o c . a m e r . s o c . H o r t . s c i . 59 , 3 1 - 3 5 .
S M IT H , P . F .
s c i.
(1 9 76 ). C ollapse of Murcott tangerine t r e e s . J . a m e r . s o c . H o r t .
101 , 2 3 - 2 5 .
SOKAL, R .R . y F . J .
dísticos en
ROHLF.
(19 69 ). B io m e tría .
la investigación biológica.
P r in c ip io s y métodos esta
H .B lu m e ediciones.
-2 3 8 -
S P E N C E R , P . W . and J . S . T I T U S .
(1973). Apple leaf senescence: leaf disc
compared to attached le a f. P lant P h y s io l.
, 89-92.
S P R A D L I N , J . and J . A . T H O M A . (19 70 ). B e ta -a m y la s e thiol groups. J . b l o l .
Chem. 245 , 1 1 7 -1 2 7 .
S T E U P , M . and E . L A T Z K O . (1 9 79 ).
I n t r a c e l l u la r localizatio n of phospho-
r y la s e s in spinach and pea lea v es . P lanta 145 , 6 9 - 7 5 .
and C . S C H A C H T E L E . (1 9 81 ). Mode of glucan degradation by p u rifie d
phosphorylase forms from spinach lea v es . Planta 153 , 3 5 1 -3 6 1 .
S T E W A R T , C . R . (1 9 7 1 ). E ffe c t of w iltin g on carbohydrates during incubation of excised bean leaves in the d a r k .
P lant P h y s io l. 48 , 7 9 2 -
794.
S T I T T , M .; P . V . B U L P I N and T . ap R E E S .
(1 9 7 8 ). Pathway of s ta rch b reak
down in photosynthetic tissues of Pisum sativum . Biochim . Biophys.
A cta 544 , 2 0 0 -2 1 4 .
S T O C K I N G , C . R . (1959) P lant Physiol 34 , 5 6 - 6 1 . Citado por P r e i s s , J .
&
C . Levi (1979).
S W A IN , R . R . and E . E . D E K K E R . (1 9 66 a ). Seed germination studie s.
I . Pu
r ific a tio n and p ro p e r tie s of an a lp ha-am ylase from the cotyledons
of germinating peas. Biochim. Biophys. Acta 122 , 7 5 - 8 6 .
and
. (1966b).
Seed germination studies.
II.
Pathways fo r s ta rch
degradation in germinating pea seedlings. Biochim . Biophys. Acta
1 2 2 ,8 7 -1 0 0 .
T A K E D A , F . ; K . RYUG O and J . C . C R A N E . (19 80 ). T ra n s lo c a tio n and d i s t n
14
bution of
C-photosynthates in bearing and nonbearing pistachio
b ra n c h e s . J . a m e r . s o c . H o r t . s c i .
105 , 6 4 2 -6 4 4 .
-2 3 9 -
T A N A K A , Y . ; T . I T O a n d T . A K A Z A W A . (1 9 7 0 ). Enzymic mechanism of s ta rch
breakdown in germinating r ic e seeds.
Plant P h y s io l.
M i.
A lpha-am ylase isozymes.
46 ,' 6 5 0 -6 5 4 .
T E T L E Y , R . R . and K . V . T H I M A N N .
during senescence.
(1 9 7 4 ). The metabolism of oat leaves -
I . R e s p ir a tio n , c arbohydrate metabolism and
the action of c ito k in in s . Plant P h y s io l. 54 , 2 9 4 -3 0 3 .
T H I M A N N , K . V . ; R . R . T E T L E Y and T . V . THA'NH. (1 9 74 ).
oat leaves during senescence.
III.
The metabolism of
Senescence in leaves attached
to the p la n t. P lant P h y s io l. 54 , 8 5 9 -8 6 2 .
T H O M A S , H . and J . L . S T O D D A R T . (1 9 7 5 ). S e p a ra tio n of chlorophyll de g ra ­
dation from other senescence processes in leaves of a mutant geno
type of meadow fescue ( Festuca pra te n sis L . ) .
P lant P h y s io l. 56 ,
4 3 8 -4 4 1 .
and
. (1 9 80 ). Leaf senescence. Ann. R e v . P lant P h y s io l. 31_, 8 3 - 1 1 1 .
T H O R N E , J . H . and H . R . KO LLE R . (1 9 74 ).
Influence of assim ilate demand on
photosynthesis, diffusive re s is ta n c e s , translocation and carbohydra
te levels of soybean lea v es . P lant P h y s io l.
T H O R P E , T . A . and D . D . M E I E R .
54 , 2 0 1 -2 0 7 .
(1 9 7 4 ). Enzymes of s ta rch metabolism in
Nicotiana tabacum c a llu s . P hytochem istry ]_3 , 1 3 2 9 -1 3 3 4 .
T I E T Z , A . ; M. L U D E W IG ; M . D IN G K U H N and K . D O R F F L I N G . (1 9 8 1 ). E ffe c t
of abscisic acid on the tra n s p o rt of assim ilates in b a r le y . Planta
152 , 5 5 7 -5 6 1 .
T R E H A R N E , K . J . (1 9 8 2 ). Hormonal control of photosynthesis and a s s im ila tion d is trib u tio n . E n : Chemical manipulation of crop growth and development. (M cLaren, J . S . , e d . ) pp 5 5 - 6 6 .
B u tterw o rth S c ie n tific .
ULL, M . A . (1 9 7 7 ). A ctividad a m ilo lític a en hojas y su v a ria c ió n durante la
-2 4 0 -
senescencia. Te sin a de L ic en c iatu ra.
Fa cultad de C ie n c ia s . U n iv e£
sidad de V a le n c ia .
V A L L E E , B . L . ; E . A . S T E I N ; W .N . SUMMERWELL and E . H . F I S C H E R .
J . b io l. Chem. 234 ', 2901.
(1959)
Citado por F i s c h é r , E . H . & E . A . S te in
(1 9 60 ).
V I E W E G , G . H . und M . Á . R . de F É K E T E . (1 9 77 ).
Tagesgang d e r A m y las e n -
a k tiv ita t im B la tt von Kalanchoe daigrem ontiana.
Z . P fla n z e n p h y s io l.
§1 , 7 4-79.
W A R E IN G , P . F . and J .W . P A T R I C K . (1 9 75 ). S o u r c e -s in k re la tio n and the
p a rtitio n os assim ílates in the plant. En: Photosynthesis and p r o ductivity in d iffe re n t environments. (C o o p e r, J . P . , e d . ) Cambridge
U n iv e rs ity P r e s s .
W IL T B A N K , W .J . and A . H T K R E Z D O R N . (1969). Determ ination of g ib b e rellin s
in o v arie s and young fr u its of Navel oranges and th e ir c o r r e la tio n
with f r u i t grow th.
W ORLEY, R . E .
J .a m e r.s o c .H o rt.s c i.
94 , 1 9 5 -2 0 1 .
(1 9 79 ). F a ll defoliation date and seasonal c arbohydrate c o n -
centration of pecan wood tis su e . J . a m e r . s o c . H o r t . s c i .
104 , 1 9 5 -
199.
Y A M A S H I T A , Y . and K . M O N O B E . (1 9 71 ). J . polum. s c i. A2 9 , 1 4 7 1 -1 4 8 1 .
Citado por B anks, W. & D . D . M u ir , 09801
Y E L E N O S K Y , G . (19 79 ). Accumulation of fr e e p ro lin e in c itr u s leaves du­
ring coid hardening of young tre e s in c ontrolled te m peratu re r e g i mes. P lant P h y s io l. 64 , 4 2 5 -4 2 7 .
and C . L . G U Y . (19 77 ). Carbohydrate accumulation in leaves and stems
of V alencia orange at p ro g re s s iv e ly c o ld e r te m p e ra tu re s . B o t .G a z .
138 , 1 3 -1 7 .
-2 4 1 -
Y O U N G , R . E . ; S . S A L M IN E N and P . S O R N S R I V I C H A I . (1 9 74 ). Enzyme r e ­
gulation associated with ripening in banana fr u it * Col loques I n t e r nationaux C . N . R . S .
n2 238.. F a c te u rs et regulation de la m a tu ra -
tion des f r u i t s .
ZA S LO W , B . (1 9 63 ). Biopolym ers ]_ , 1 6 5 -1 6 9 . Citado por B a n k s,W . & D . D .
M u ir (1980).
Z IM M E R M A N N , M . H . (1 9 7 4 ). S to r a g e , m obilization and c irc u la tio n of a s s i m ilate s . En: T r e e s s tru c tu re and function. (Zim m erm ann, M . M . &
C . L . B ro w n , e d s .) S p r in g e r V e r la g .
Z U C C O N I , F . j S . P . M O N S E L IS E and R . G O R E N . (1 9 78 ). G row th-a bs cis sion
relationships in developing orange f r u i t .
146.
S c ie n tia H o r t i c . 9 , 1 3 7 -
¿t