BOLETÍN ESCUELA DE MEDICINA U.C., PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE VOL. 33 Nº1 2008 LOS ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS Y MOLECULARES INVOLUCRADOS EN EL TRASPASO DE LISTERIA MONOCYTOGENES A TRAVÉS DE LA BARRERA PLACENTARIA. (UNA REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA) Demetrio Larraín de la C.(1) Jorge Carvajal C. Ph.D (2) 20 RESUMEN INTRODUCCIÓN La Listeria monocytogenes, agente infeccioso causal de la listeriosis, es un bacilo gram positivo intracelular facultativo, cuya principal vía de contagio es la ingestión de alimentos contaminados. Este enteropatógeno ha desarrollado diferentes mecanismos que le permiten la invasión, sobrevida y multiplicación en las células del hospedero. La infección por Listeria monocytogenes es usualmente asintomática, sin embargo en pacientes embarazadas la infección intrauterina puede producir complicaciones perinatales graves. No se conocen con exactitud los mecanismos exactos mediante los cuales Listeria monocytogenes se localiza y logra traspasar la barrera placentaria. En este artículo se revisan los factores de virulencia de Listeria monocytogenes y su rol en la listeriosis perinatal. La Listeria monocytogenes, agente causal de la listeriosis, es un bacilo gram-positivo que infecta humanos y animales. Este microorganismo se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza y su principal vía de contagio es a través de la ingestión de agua y alimentos contaminados (1,2). Las infección por Listeria monocytogenes es usualmente asintomática, sin embargo las manifestaciones clínicas de la listeriosis pueden ser variables según el estado inmune del paciente. Puede presentarse como un cuadro gastrointestinal leve y autolimitado en el paciente inmunocompetente, o bien como un cuadro severo y de alta mortalidad, como meningitis, abscesos cerebrales y sepsis, en el paciente inmunocomprometido (3). Actualmente existe evidencia de que la inmunidad contra Listeria monocytogenes es casi completamente dependiente de la actividad de los linfocitos T (4,5). El embarazo es un (1) Departamento de Obstetricia y Ginecología, Unidad de Medicina Materno Fetal, Pontificia Universidad Católica de Chile. (2) Departamento de Obstetricia y Ginecología, Unidad de Medicina Materno Fetal, Pontificia Universidad Católica de Chile. Correspondencia: [email protected] Fax: 632 1924 estado de tolerancia inmunológica que determina una supresión de la inmunidad celular evitando así una reacción cruzada contra el feto (6,7). Sin embargo esta menor actividad inmunológica puede predisponer a la madre y al feto a infecciones por gérmenes intracelulares, como Listeria monocytogenes; el riesgo de infección es 12 veces mayor en las embarazadas que en la población general (8,9). La infección intrauterina puede producir importantes complicaciones como aborto espontáneo, parto prematuro, corioamnionitis clínica, óbito fetal y sepsis neonatal, determinando una alta mortalidad perinatal (8,10). La mayoría de los gérmenes capaces de infectar al feto alcanzan la cavidad amniótica por la vía canalicular ascendente e infrecuentemente logran vulnerar la barrera placentaria. Sin embargo, a diferencia de otros microorganismos, Listeria monocytogenes tiene la capacidad de traspasar la placenta e infectar al feto por vía hematógena. LOS ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS Y MOLECULARES INVOLUCRADOS EN EL TRASPASO DE LISTERIA MONOCYTOGENES A TRAVÉS DE LA BARRERA PLACENTARIA. Recientemente, los avances en el campo de la bioquímica y biología molecular han permitido entender mejor los mecanismos involucrados en este proceso. El objetivo de este artículo es revisar los mecanismos celulares y moleculares mediante los cuales Listeria monocytogenes logra alcanzar el torrente sanguíneo e infectar la unidad fetoplacentaria. MATERIAL Y MÉTODOS Realizamos una búsqueda bibliográfica en la base de datos MEDLINE utilizando los términos Mesh “Listeria infections”, “placenta”, “pathophysiology”, “Ecadherine”, “ActA”, “internalins” y “listeriolisin O”. Se seleccionaron aquellos artículos enfocados en la fisiopatología y en los mecanismos moleculares implicados en la infección por Listeria monocytogenes durante el embarazo y aquellas publicaciones dedicadas al traspaso de Listeria monocytogenes a través de las barreras del hospedero. Se obtuvo un total de 70 artículos como referencias primarias. El resto de los artículos seleccionados corresponden a referencias secundarias debido a citación frecuente en los artículos de referencia primaria. Los artículos de revisión y de opinión de expertos fueron excluidos de las publicaciones seleccionadas para esta revisión. MICROBIOLOGÍA DE LISTERIA MONOCYTOGENES La Listeria monocytogenes es un bacilo grampositivo, β-hemolítico, catalasa (+), no esporulado y móvil. Es un microorganismo aerobio, anaerobio facultativo y es capaz de sobrevivir en el interior de las células, incluso en células fagocíticas del sistema monocitomacrófago. La Listeria monocytogenes es un enteropatógeno que mide 0.5 x 1.5 µm y ha desarrollado diferentes mecanismos para sobrevivir bajo condiciones extremas de pH, salinidad y temperatura (11) (Tabla Nº1). Listeria monocytogenes tiene la capacidad de desarrollarse sin problemas a temperaturas desde -18o a 10oC, rango que incluye las Tabla 1. Mecanismos adaptativos utilizados por Listeria monocytogenes para sobrevivir y desarrollarse bajo condiciones ambientales adversas. Característica bacteriana Mecanismo adaptativo Termorresistencia Inducción de proteínas de stress térmico Cambios en la composición lipídica de membrana Acumulación de solutos crioprotectores Cambios transcripcionales (factor sigma B asociado a RNA polimerasa bacteriana) Tolerancia a pH ácido Inducción de proteínas de stress ácido Sistema glutamato decarboxilasa Cambios transcripcionales (Factor sigma B) Sistema de transducción histidina kinasa Transporte activo de protones a través de la membrana (tipo H+-ATPasa) Osmotolerancia Inducción de proteínas de stress salino Acumulación de solutos osmoprotectores Cambios transcripcionales (Factor sigma B) Sistema de transducción de señales Kdp Resistencia a antibióticos y desinfectantes Formación de biofilms temperaturas usuales de refrigeración, por lo que la infección puede ser transmitida incluso a través de alimentos refrigerados o congelados (11). Sin embargo, Listeria monocytogenes es destruida a través de la pasteurización y por la mayoría de los agentes desinfectantes (11). Se han descrito 17 serotipos de Listeria monocytogenes en base a sus antígenos somáticos y flagelares. Corresponden a 15 antígenos somáticos (I-XV) y 4 flagelares (A-D). Las diferentes combinaciones dan origen a un serotipo, que tiene una combinación antigénica única. Sólo 3 serotipos (1/2a, 1/2b y 4b) son responsables de más del 95% de las infecciones en humanos. Sin embargo, se sabe que dentro de un mismo serotipo existen diferentes cepas, genéticamente disímiles (12). Estudios recientes han demostrado que los primeros brotes de listeriosis fueron causados por un grupo de cepas relacionadas del serotipo 4b, llamadas Epidemic Clone I (ECI); el análisis de brotes posteriores ha identificado un clon diferente, el ECII, que es fenotípica y genotípicamente distinto a otras cepas del serotipo 4b descritas previamente (13). La Listeria monocytogenes se comporta como un parásito intracelular facultativo, capaz de sobrevivir en los macrófagos e invadir numerosos tipos de células no fagocíticas, como células epiteliales, hepatocitos y células endoteliales (14). En todos estos tipo celulares desarrolla una fase intracelular en la cual 1) se internaliza a la célula del hospedero; 2) sobrevive en fagolisosoma; 3) escapa del fagolisosoma; 4) se libera y replica en el citosol de la célula blanco; 5) se mueve en base reorganización del citoesqueleto de la célula hospedera; 6) extiende un filopodio y se disemina a la célula vecina (Figura 1). De esta forma logra traspasarse directamente a las células vecinas, donde reinicia el ciclo (14), diseminándose a través de los tejidos del hospedero sin exponerse al ambiente extracelular, protegida de la inmunidad humoral. Esta propiedad ha sido extensamente estudiada en cultivos 21 BOLETÍN ESCUELA DE MEDICINA U.C., PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE VOL. 33 Nº1 2008 Figura 1. Proceso infeccioso y fase intracelular de la infección por Listeria monocytogenes. 1) Internalización a la célula del hospedero; 2) Sobrevivencia en fagolisosoma; 3) Escape del fagolisosoma; 4) Liberación y replicación bacteriana en el citosol de la célula blanco; 5) Movilidad bacteriana en base reorganización del citoesqueleto de la célula hospedera; 6) Extensión del filopodio y diseminación directa a la célula vecina; 7) Formación del fagolisosoma; 8) Escape del fagolisosoma; 9) Liberación de Listeria monocytogenes al citosol y reinicio del ciclo. celulares y se considera hoy en día como un fenómeno clave en la fisiopatología de la listeriosis en humanos. I. FACTORES DE VIRULENCIA Los avances en las técnicas de biología molecular han permitido identificar diversos factores de virulencia implicados en procesos clave del ciclo intracelular de esta bacteria. Estos factores de virulencia, involucrados en: la invasión de la célula blanco, el escape del fagolisosoma y el traspaso de célula a célula, se describen en detalle a continuación. a) Invasión de la célula: Internalinas y sus receptores La adhesión y entrada de Listeria monocytogenes a la célula está comandada por la acción de proteínas expresadas en la superficie de la bacteria, las internalinas. Las internalinas pertenecen a un gran familia de proteínas bacterianas 22 caracterizadas por poseer un dominio amino-terminal rico en leucina (15,16). Existen muchos tipos de internalinas, sin embargo sólo las internalinas A (InlA) y B (InlB) están involucradas en la invasión celular a células no fagocíticas. Estudios recientes han evaluado los niveles de expresión génica y la capacidad de invasión in vitro de distintas cepas de Listeria monocytogenes en diferentes tipos de células humanas, demostrándose que la capacidad invasiva y la producción de citoquinas proinflamatorias (IL-8) es variable según el tipo de célula y la cepa de Listeria monocytogenes analizada (17). Estas observaciones llevaron a estudiar los niveles de expresión de los genes de las internalinas (inlA, inlB), a través del análisis de los ARN mensajeros (mRNA), por técnica de RTPCR en 27 cepas de Listeria monocytogenes obtenidas de muestras clínicas y 37 cepas obtenidas de cultivos de laboratorio (18). En general, aquellas cepas obtenidas de muestras clínicas mostraron una menor capacidad invasiva, una menor producción de IL-8 y niveles de expresión génica más bajas que sus controles de laboratorio. Esta expresión diferente de los factores de virulencia entre cepas obtenidas de pacientes enfermos y cepas aisladas desde alimentos ha sido confirmada por otros estudios (19,20) y permite concluir que la virulencia de Listeria monocytogenes es variable. Esta virulencia variable pudiese explicar además el diferente comportamiento clínico que muestran las distintas cepas de Listeria monocytogenes. En un estudio epidemiológico reciente se analizó la expresión de las internalinas en 300 cepas de Listeria monocytogenes obtenidas de pacientes enfermos, de las cuales 61 (20%) correspondían a pacientes embarazadas y las compararon con 150 cepas aisladas desde diferentes alimentos (21). El 96% de las cepas obtenidas a partir de pacientes enfermos expresaban internalina en su forma completa y funcional, mientras que esto sólo ocurría en el 65% de las cepas obtenidas de alimentos. Las cepas obtenidas de alimentos se asociaron significativamente más a la expresión de una forma truncada y no funcional de internalina, en comparación con las cepas obtenidas de muestras clínicas (OR 12.73 95% Intervalo de Confianza (IC) [6.2726.34]). Estos resultados concuerdan con los de otros estudios, poniendo en evidencia que el rol de la internalinas en la patogénesis de la listeriosis humana es crítico (21,22). Los receptores naturales de las InlA e InlB son E-caderina y Met, respectivamente (23,24). E-caderina es una glicoproteína transmembrana, dependiente de Ca+2 e involucrada en la adhesión celular. Met es un receptor tirosina kinasa cuyo ligando natural es el factor de crecimiento derivado de los hepatocitos (HGF). Se ha demostrado que, aún por separado, cualquiera de estas proteínas es suficiente para permitir la invasión celular (25,26). En condiciones fisiológicas la E-caderina y Met se localizan LOS ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS Y MOLECULARES INVOLUCRADOS EN EL TRASPASO DE LISTERIA MONOCYTOGENES A TRAVÉS DE LA BARRERA PLACENTARIA. en la matriz extracelular en estrecha relación con las uniones intercelulares, manteniendo las células pegadas entre sí. Se ha descubierto que la interacción InlAE-caderina es especie-específica, InlA tiene alta afinidad por la E-caderina humana y no es capaz de interactuar con la Ecaderina de ratones, aunque sólo difieran en un aminoácido (27). Recientemente, esta interacción especie-específica también ha sido descrita para InlB (28). Una vez que Listeria monocytogenes se ha unido a sus receptores (vía E-caderina o vía Met), se produce la fosforilación y activación de una serie de proteínas intermedias en la célula del hospedero (α y β cateninas, Gab1, Cb1, PI3-Kinasa) capaces de interactuar y reorganizar los filamentos de actina del citoesqueleto de la célula blanco (29-31). Existe evidencia molecular de que otras proteínas como la miosina VIIA y su ligando, la vezatina son necesarias para la internalización (32,33). Mediante la reorganización del citoesqueleto y la interacción miosina VIIA-vezatina se facilita la captación de la bacteria por la célula del hospedero (endocitosis) y disgregación del epitelio. Se postula además que la reorganización del citoesqueleto y la formación del complejo miosina VIIA-vezatina pudiesen tener una acción sinérgica en la invasión celular (34,35). b) Escape del fagolisosoma: Listeriolisina O y Fosfolipasas C Al traspasar la membrana plasmática Listeria monocytogenes queda incluida en vesículas fagocíticas (vacuola primaria). Esta vacuola se fusiona con los lisosomas, que contienen enzimas proteolíticas y un pH ácido, para formar los fagolisosomas (vacuola secundaria). En condiciones normales las bacterias y sus productos son degradados en los fagolisosomas. Las condiciones adversas en el interior del fagolisosoma no permiten la multiplicación de Listeria monocytogenes, pero inducen la secreción de listeriolisina O. Listeriolisina O es una toxina dependiente de colesterol, codificada por el gen hly, perteneciente a una gran familia de toxinas formadoras de poros, las citolisinas, propias de las bacterias gram-positivas (36). Al ser secretada por la bacteria, listeriolisina O permite el escape del fagolisosoma (y en menor proporción de la vacuola primaria) a través de la formación de poros, evitando la destrucción bacteriana y permitiendo el crecimiento y desarrollo microbiano en el citosol de la célula infectada. Listeriolisina O es uno de los factores de virulencia de Listeria monocytogenes mejor estudiados. Se sabe que esta toxina se encuentra en forma monomérica y que para formar poros y favorecer la lisis de la membrana lisosomal requiere que estos monómeros se fijen al colesterol de la membrana y se polimerizen (37). A diferencia otras citolisinas, listeriolisina O tiene mayor actividad a pH ácido, denaturándose a pH neutro (38-40). Una vez que listeriolisina O perfora la membrana del lisosoma es rápidamente ubiquitinizada y degradada por los proteasomas (lisosomas proteolíticos), antes de que pueda dañar la membrana plasmática (41,42). Existe evidencia de que en ausencia de actividad de listeriolisina O, la bacteria disminuye notablemente su capacidad invasiva y es no es capaz de reproducirse, al no poder escapar del fagosoma (43). Además de listeriolisina O, Listeria monocytogenes secreta 2 fosfolipasas C (PLC), que contribuyen al escape de los lisosomas: La fosfolipasa C fosfatidilinositolespecífica (PI-PLC) y la fosfolipasa C fosfatidilcolina-específica (PC-PLC). Estas proteínas son codificadas por los genes plcA y plcB, respectivamente. Las cepas bacterianas con mutación de plcA son menos eficientes en escapar de la vacuola primaria en comparación con cepas nativas, demostrando la participación de PI-PLC en esta función (44). En cambio, la mutación de plcB se traduce en una acumulación de bacterias en las vacuolas secundarias, sin alterar el escape de las vacuolas primarias (fagocíticas), sugiriendo que PC-PLC tiene mayor rol en el escape de la vacuola secundaria y diseminación a células vecinas. Existe un aumento de 250-500 veces en la cantidad de bacterias necesarias para destruir el 50% de las células del cultivo (dosis letal50), cuando ambos genes son inactivados, aportando evidencia experimental de que ambas fosfolipasas C tienen funciones importantes en la virulencia de este germen (45). El mecanismo exacto mediante el cual listeriolisina O y el sistema de las fosfolipasas C comandan el escape del fagosoma es actualmente motivo de extensa investigación. Se sabe que depende de vías metabólicas complejas que incluyen la traslocación de las PLC e hidrólisis de fosfolípidos, generación de diacilglicerol (DAG), activación de la proteína kinasa C (PKC) y flujo de Ca+2 intracelular como segundo mensajero (46,47). c) Traspaso de célula a célula en base a actina: Rol de ActA ActA es una proteína localizada en la superficie de la bacteria, que permite a la Listeria monocytogenes desplazarse eficientemente a través del citosol de la célula del hospedero para invadir células vecinas que aún no han sido infectadas. ActA es codificada por el gen actA. Se ha observado que las cepas bacterianas deficientes en ActA presentan una menor capacidad de invadir células vecinas (traspaso de célula a célula). Estudios utilizando fragmentos de células cubiertos con ActA han demostrando que la sola presencia de ActA es factor suficiente para que estos fragmentos sean capaces de desplazarse sobre extractos celulares (48). El mecanismo exacto mediante el cual ActA comanda el movimiento celular es objeto de investigación; se sabe que depende de la interacción de ActA con otras proteínas como VASP y WASP, y que involucra la polimerización de los filamentos de actina del citosol de la célula blanco (29). Listeria monocytogenes es capaz de 23 BOLETÍN ESCUELA DE MEDICINA U.C., PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE moverse rápidamente sobre la plataforma de actina y presionar contra la membrana plasmática, creando una prolongación citoplasmática llamada filopodio que incluye al microorganismo. Este filopodio, al tomar contacto con la célula vecina es fagocitado, quedando la bacteria incluida en los fagosomas de la célula vecina y lista para reiniciar un nuevo ciclo infeccioso (49) (Figura 1). Además, la expresión de ActA es suficiente para promover la entrada de Listeria innocua (una especie no virulenta) en células epiteliales, por lo que se piensa que ActA tendría además un rol en la invasión celular (50). II. CRECIMIENTO Y DESARROLLO EN EL CITOSOL DE LA CÉLULA DEL HOSPEDERO Los patógenos intracelulares pueden dividirse en aquellos que son capaces de vivir en el interior de los lisosomas de la célula blanco y aquellos que deben escapar del fagolisosoma y desarrollarse en el citosol, como Listeria monocytogenes (51). La estrategia básica de los patógenos intracelulares para poder sobrevivir el mayor tiempo posible en la célula infectada se basa en no extraer de la célula hospedera una cantidad excesiva de nutrientes esenciales para su metabolismo, de lo contrario, la célula hospedera se quedaría sin nutrientes y moriría, haciendo que las bacterias perdieran su nicho de crecimiento. Más aún, las bacterias intracelulares han desarrollado mecanismos para utilizar productos de desecho o no indispensables en el metabolismo de la célula hospedera para su desarrollo. Aunque muchos de los pasos intracelulares claves de Listeria monocytogenes han sido bien caracterizados, el conocimiento sobre los factores necesarios para la proliferación citosólica es aún limitado. Con el uso de DNA- microarrays y PCR se ha estudiado el perfil transcripcional de la fase intracelular de Listeria monocytogenes. Se demostró una mayor expresión de genes que 24 VOL. 33 Nº1 2008 codificaban para proteínas transportadoras esenciales en la captación de carbono y nitrógeno, proteínas de stress, reguladores de transcripción y otras proteínas con función hasta ahora desconocida (52). Posteriormente se demostró, mediante el desarrollo de cepas mutantes, que Listeria monocytogenes es capaz de utilizar fuentes de carbono alternativas (ej: glucosa fosforilada), como también fuentes alternativas de nitrógeno (ej: etanolamina), durante su replicación en células epiteliales y que la vía de las pentosas y no la glicolisis es la vía predominante para metabolizar los azúcares en los tejidos del hospedero (52). III. TRASPASO DE LISTERIA MONOCYTOGENES A TRAVÉS DE LAS BARRERAS DEL HOSPEDERO Nuestro entorno contiene una enorme variedad de agentes infecciosos, por lo que los seres humanos estamos en contacto permanente con una gran cantidad de gérmenes. La mayoría de los agentes infecciosos a los que se ve expuesto un individuo no consiguen penetrar en su organismo, sino que son detenidos por una serie de barreras físicas como la barrera intestinal, la barrera placentaria y la barrera hematoencefálica. Sin embargo algunos microorganismos como Listeria monocytogenes han desarrollado diferentes mecanismos que les permiten vulnerar estas barreras. a) Traspaso de la barrera intestinal: el rol de E-caderina En 1981, la investigación de un brote de listeriosis en Nova Scotia, Canadá, puso en evidencia por primera vez la transmisión de Listeria monocytogenes a través de los alimentos (53). Actualmente se sabe que la puerta de entrada es el tracto digestivo, de modo que la capacidad de Listeria monocytogenes de producir una infección sistémica depende directamente de su capacidad de atravesar el epitelio intestinal. En un elegante modelo murino de listeriosis Lecuit y cols utilizando ratones transgénicos, que expresaban E- caderina humana, demostraron que Listeria monocytogenes lograba traspasar la barrera epitelial del intestino gracias a su interacción con la E-caderina de los enterocitos. Esta interacción llevaba a internalización y multiplicación de la bacteria en la lamina propria del intestino delgado y diseminación hacia los linfonodos mesentéricos, hígado y bazo (54). Estudios recientes, utilizando sondas marcadas fluorescentes, han demostrado varias interacciones entre las células intestinales y Listeria monocytogenes. Los investigadores han demostrado que la bacteria es capaz de invadir las células sólo en aquellos lugares en los cuales el epitelio está eliminando células muertas, un fenómeno constante en la mucosa intestinal. En este proceso, las células remanentes pierden transitoriamente las uniones intercelulares con sus vecinas. Esta brecha transitoria en la barrera epitelial expone la E-caderina permitiendo la fijación de la bacteria y el traspaso del epitelio intestinal (17,55). Una vez en el torrente sanguíneo el hígado es el primer órgano blanco. En el hígado, después de atravesar el epitelio intestinal, Listeria monocytogenes invade los hepatocitos a través de la interacción de InlB y Met (49,56,57). En los hepatocitos Listeria monocytogenes se replica activamente hasta que la infección es controlada por la respuesta inmune celular (17,49). Esta etapa es subclínica y se cree que es un fenómeno frecuente dada la amplia distribución de Listeria monocytogenes en la naturaleza. En individuos normales, la exposición continua a antígenos listeriales, probablemente, determina el mantenimiento de linfocitos T de memoria anti-listeria; sin embargo, en pacientes en los que la inmunidad celular está deteriorada o es más permisiva, como en las embarazadas, la proliferación bacteriana descontrolada determina bacteremias prolongadas, permitiendo la invasión de los órganos blancos como cerebro o unidad fetoplacentaria (6,49,58). LOS ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS Y MOLECULARES INVOLUCRADOS EN EL TRASPASO DE LISTERIA MONOCYTOGENES A TRAVÉS DE LA BARRERA PLACENTARIA. b) Traspaso de la barrera placentaria, transmisión vertical e infección intrauterina La barrera placentaria se encuentra anatómicamente a nivel de las vellosidades placentarias, específicamente en el sincitiotrofoblasto. El sincitiotrofoblasto es un tipo de epitelio especializado, compuesto por células multinucleadas, que se encuentra en contacto directo con la sangre materna que circula por el espacio intervelloso. En una capa celular subyacente, las células del citotrofoblasto (mononucleadas) se dividen y fusionan renovando la población celular del sincitiotrofoblasto. Una delgada membrana basal separa las células trofoblásticas del tejido conectivo que contiene los vasos fetales por lo que se cree que la invasión del trofoblasto es un paso crítico para el desarrollo de infección fetal (59). La similitud existente entre la placenta de los roedores y los seres humanos (tipo hemocorial) ha contribuido a que gran parte de nuestro conocimiento sobre la fisiopatología de la infección intrauterina por Listeria monocytogenes provenga de modelos murinos. Recientemente se evaluó los mecanismos implicados en la transmisión vertical de Listeria monocytogenes utilizando hembras de cobayos embarazadas (60). Los autores demostraron que la invasión de las células del sincitiotrofoblasto por Listeria monocytogenes era dependiente de InlA y que la capacidad de invadir las células trofoblásticas in vitro era 100 veces menor en cepas mutantes de Listeria monocytogenes con deleción de InlA (60). Curiosamente, los autores no encontraron diferencias significativas en el crecimiento y desarrollo bacteriano en las placentas, fetos y órganos maternos, al comparar las cepas de Listeria monocytogenes nativas y las con deleción del InlA (60), por lo que postulan que probablemente exista otro mecanismo, independiente de InlA, involucrado en la transmisión vertical de Listeria monocytogenes in vivo (60). Actualmente se ha demostrado la expresión de E-caderina en la superficie apical de las células del trofoblasto del espacio intervelloso, en estrecha relación con la sangre materna, por lo que es altamente probable que la interacción entre E-caderina y InlA sea el mecanismo involucrado en el traspaso de Listeria monocytogenes a través de la barrera placentaria (61,62). En un interesante estudio, se estudió el rol del complejo InlA- E-caderina en este proceso. Utilizando tejidos placentarios frescos obtenidos de embarazos fisiológicos, los investigadores observaron que las cepas de Listeria monocytogenes que expresaban InlA (cepa nativa) invadían sin problema el interior de las células trofoblásticas, sobre todo en los espacios intervellosos, donde las circulaciones materna y fetal están en estrecha cercanía. La evaluación cuantitativa de la invasión bacteriana demostró que la capacidad de las cepas mutantes de Listeria monocytogenes (con inactivación de InlA) para invadir los tejidos placentarios era 10 veces menor que la cepa nativa. Más aún, la invasión bacteriana de los tejidos placentarios reprodujo exactamente las lesiones histológicas que se observan en las vellosidades coriales de las pacientes con listeriosis en las que ha ocurrido infección fetal (62). Además se demostró que el 100% de las cepas de Listeria monocytogenes extraídas de pacientes embarazadas con listeriosis expresan InlA en su forma completa y funcional (21). Tomados en conjunto, estos estudios ex vivo demuestran que la afinidad de Listeria monocytogenes por la placenta y la capacidad de infectar al feto se debe a la interacción ligando-receptor de InlA con E-caderina de las células trofoblásticas. No se sabe cual es la función que desempeña E-caderina en la superficie del sincitiotrofoblasto. Se ha postulado que su presencia se deba sólo a remanentes de membrana que han quedado después de la fusión de las células del citotrofoblasto durante la diferenciación de las vellosidades coriales (63,64). El sincitiotrofoblasto es el único epitelio sincitial en humanos y posee características únicas, como la ausencia de membranas laterales entre sus células y su contacto directo con la sangre materna en el espacio intervelloso. Estas propiedades otorgan al sincitiotrofoblasto las características de un endotelio especializado. Actualmente existe evidencia de que además de formar una barrera física entre la circulación materna y fetal, el trofoblasto tiene actividad fagocítica y un rol inmunomodulador a través de la secreción de citoquinas (65-68), permitiendo aún el desarrollo de Listeria innocua y cepas de Listeria monocytogenes mutantes, menos virulentas (58,69). La InlB no parece tener rol en el traspaso de la barrera placentaria. Se sabe que la invasión por Listeria monocytogenes es mediada por InlB en varios tipos celulares y que los receptores de InlB se hallan ampliamente distribuidos en casi todos los tejidos (70). Sin embargo, la infección transplacentaria no ocurre en especies animales en las que la invasión celular por Listeria monocytogenes es mediada únicamente por la vía de la InlB, como tampoco en aquellas en las que la interacción InlA- E-caderina no es posible, como ocurre en ratones (70). Sin embargo, la interacción InlA- Ecaderina parece no ser el único factor determinante en la infección trofoblástica y transmisión vertical de Listeria monocytogenes (60). En placentas hemocoriales, la barrera placentaria consiste tan sólo en 2 capas celulares de trofoblasto y las células endoteliales de los vasos fetales (71), por lo que diferentes estudios han propuesto que la diseminación célula a célula tiene también un rol en el traspaso de Listeria monocytogenes a través de la barrera placentaria (58,71). Se demostró que si bien la diseminación célula a célula no es indispensable en la infección placentaria, al menos facilitaría este proceso al evidenciar una menor concentración bacteriana en fetos de cobayos si se comparan cepas mutantes de Listeria monocytogenes incapaces de expresar ActA, con aquellas que expresan la proteína (58). 25 BOLETÍN ESCUELA DE MEDICINA U.C., PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE En un estudio reciente utilizando hembras de cobayo embarazadas se reportó que la expresión de internalinas A y B no era necesaria para el desarrollo de infección placentaria concluyendo que la transmisión vertical de Listeria monocytogenes era completamente dependiente de la expresión y funcionalidad de ActA, permitiendo a la bacteria pasar fácilmente a través del trofoblasto y endotelio para alcanzar la circulación fetal (69). En suma, el mecanismo mediante el cual Listeria monocytogenes cruza la barrera placentaria e infecta al feto no ha sido aclarado en su totalidad, siendo probable que exista más de un mecanismo involucrado. Los modelos murinos actualmente disponibles sólo han permitido establecer que la presencia de factores de virulencia es necesaria en este proceso, sin embargo, la importancia relativa de cada uno de estos factores en la fisiopatología del paso placentario es aún desconocida. c) Traspaso de la barrera hematoencefálica La barrera hematoencefálica es la separación anatómica y funcional entre el sistema nervioso central y el compartimiento vascular. El endotelio microvascular es la estructura más extensa de la barrera hematoencefálica y se caracteriza por poseer uniones estrechas entre sus células (72,73). Datos experimentales sugieren que Listeria monocytogenes utiliza diferentes mecanismos en el traspaso de la barrera hematoencefálica e infección del sistema nervioso central. Algunos estudios en animales han sugerido que desde el torrente sanguíneo Listeria monocytogenes puede alcanzar el parénquima cerebral a partir de invasión directa del endotelio microvascular o invadiendo las células epiteliales de los plexos coroídeos a través de un proceso mediado por la interacción de InlB y Met (24,74-77). Recientemente se demostró que la capacidad del complejo InlB-Met de invadir las células endoteliales de la microvasculatura cerebral era inhibida 26 VOL. 33 Nº1 2008 en la presencia de inmunoglobulinas del suero de pacientes adultos (sobre todo Inmunoglobulina G), y que esta inhibición existía, pero era 50 veces menor si se usaba suero de recién nacidos (78). Se ha demostrado la presencia de anticuerpos contra proteínas de superficie de Listeria monocytogenes en el suero de pacientes sanos (79). Estas observaciones son interesantes pues in vivo, las células endoteliales y las bacterias libres en la sangre se encuentran en constante contacto con las proteínas del suero, por lo que puede dudarse del real rol de InlB en la patogenia de la infección del sistema nervioso central en adultos. Estos hallazgos pudiesen sin embargo explicar el mecanismo implicado en la infección del sistema nervioso central por Listeria monocytogenes en recién nacidos pues, como comentábamos previamente, el rol inhibidor de las proteínas séricas es 50 veces menor en el suero de recién nacidos en comparación con el de los adultos sanos (78). La causa de esta diferencia en la capacidad de inhibir la invasión de Listeria monocytogenes entre el suero de recién nacidos y adultos no ha sido aclarada, pues la IgG traspasa libremente la barrera placentaria y alcanza sin problemas la circulación fetal. Se ha postulado que otras clases de inmunoglobulinas, como la inmunoglobulina A, pudiesen estar involucradas en determinar esta inhibición de la invasión bacteriana. Otro mecanismo que pudiese explicar esta diferencia entre el suero de adultos y recién nacidos es la selectividad que existe en el transporte placentario de las diferentes clases de inmunoglobulina G (80). Es posible que los anticuerpos anti-InlB pertenezcan a un subtipo de anticuerpos que no alcance niveles adecuados en la circulación neonatal como para inhibir la invasión de Listeria monocytogenes al endotelio de la barrera hematoencefálica. Esta observación es de la mayor relevancia pues otorga un probable rol a la inmunidad humoral en la infección del sistema nervioso central. Por el contrario, el rol del complejo InlA- E-caderina en el traspaso de la barrera hematoencefálica no ha sido demostrado, pese a haberse demostrado la expresión de E-caderina en el endotelio microvascular y el epitelio de los plexos coroídeos (81). El análisis de un caso fatal de meningoencefalitis por Listeria monocytogenes demostró la presencia de Listeria monocytogenes en el interior de las células endoteliales y en la superficie luminal de los vasos sanguíneos (82), otorgando un rol a la invasión de las células endoteliales en el traspaso de la barrera hematoencefálica. Además, en un estudio de la década del 60 se evidenciaron signos de infección endotelial en la vena umbilical de en un feto de 28 semanas con corioamnionitis por Listeria monocytogenes (83). Estos hallazgos son interesantes, pues no sólo demuestran que la invasión de las células endoteliales humanas es posible in vivo, sino que además otorgan un probable rol a la invasión de las células endoteliales en la fisiopatología del traspaso de Listeria monocytogenes a través de a barrera placentaria. Estudios más recientes sugieren que Listeria monocytogenes logra alcanzar el sistema nervioso central a través de un mecanismo llamado “caballo de Troya”. Este mecanismo involucra el transporte de la bacteria desde el torrente sanguíneo hacia el tejido neural, en el interior de los macrófagos (84). Una vez que Listeria monocytogenes ha activado la respuesta inmune celular se produce un reclutamiento masivo de células del sistema monocito-macrófago desde el torrente sanguíneo hacia el foco infeccioso. Los macrófagos fagocitan y eliminan las bacterias extracelulares, sin embargo se infectan con Listeria monocytogenes a través del traspaso célula a célula desde las mismas células del tejido blanco. Estos fagocitos infectados reingresan al torrente sanguíneo y “transportan” a Listeria monocytogenes a través de la barrera hematoencefálica. La infección puede entonces propagarse a través del sistema nervioso central, por diseminación célula a célula hacia el endotelio microvascular o por la propia LOS ASPECTOS FISIOPATOLÓGICOS Y MOLECULARES INVOLUCRADOS EN EL TRASPASO DE LISTERIA MONOCYTOGENES A TRAVÉS DE LA BARRERA PLACENTARIA. migración de los fagocitos infectados hacia las neuronas y microglía (76,84,85). Una tercera ruta por la cual Listeria monocytogenes puede alcanzar el parénquima cerebral es a través del transporte neural. Según este modelo, Listeria monocytogenes llega al sistema nervioso central por vía axonal ascendente desde terminaciones nerviosas periféricas (86,87). Existen estudios que apoyan que el mecanismo por el cual Listeria monocytogenes llega a estas terminaciones nerviosas sería la diseminación célula a célula a partir de macrófagos infectados en un proceso dependiente de ActA (87,88). Actualmente se ha documentado el papel de la vía neural ascendente en modelos animales de listeriosis, sin embargo el rol de la vía transneural en la fisiopatología de la listeriosis humana no ha sido demostrado (86). En suma, los resultados de los diferentes estudios en animales y observaciones en humanos, entregan una visión parcial de elementos involucrados en la llegada de Listeria monocytogenes al sistema nervioso central. Es probable que en la neuroinvasión se conjuguen diversos mecanismos y que una vez que Listeria monocytogenes traspasa la barrera hematoencefálica, la diseminación a través del tejido neural y glial sea a través de la diseminación célula a célula (88). En nuestra perspectiva es interesante notar como la barrera hematoencefálica es más permeable en el recién nacido, explicando el rol perinatal adverso en la infección por Listeria monocytogenes. CONCLUSIONES La infección es un proceso complejo en el que interactuan diversos factores de la bacteria y del hospedero. La Listeria monocytogenes es un bacilo gram positivo ampliamente distribuido en la naturaleza cuyo mecanismo de contagio más frecuente es la ingestión de agua o alimentos contaminados. Este enteropatógeno afecta principalmente a pacientes inmunosuprimidos y embarazadas; en estas últimas tiene especial capacidad para producir infección fetal determinando cuadros severos y de alta mortalidad perinatal. Durante los última década se ha logrado conocer con bastante detalle los mecanismos celulares y moleculares que permiten a Listeria monocytogenes alcanzar el torrente sanguíneo e infectar al feto por vía hematógena. Esto pues a diferencia de otros microorganismos Listeria monocytogenes ha desarrollado la increíble capacidad de traspasar 3 importantes barreras: intestinal, hematoencefálica y fetoplacentaria. Listeria monocytogenes puede infectar las células del hospedero mediante invasión directa o por diseminación directa de célula a célula. Este proceso de invasión y diseminación requiere de la presencia de diversos factores de virulencia que le permiten a la bacteria: invadir la célula blanco (internalinas), escapar del fagolisosoma (listeriolisina O) y traspasarse directamente de célula a célula (ActA). La revisión de la literatura sugiere que Listeria monocytogenes utiliza una estrategia común en el traspaso de las barreras intestinal y placentaria, por lo que es planteable que el tropismo placentario de esta bacteria sea sólo consecuencia del mismo mecanismo utilizado por Listeria monocytogenes en el traspaso de la barrera intestinal. Sin embargo en la fisiopatología de la infección fetal parecen haber otros mecanismos involucrados, como la diseminación célula a célula mediada por ActA. El traspaso de Listeria monocytogenes a través de la barrera hematoencefálica y la infección del sistema nervioso central parece ser un fenómeno más complejo que involucra la diseminación célula a célula, la presencia de Listeria monocytogenes en el interior de los fagocitos y la diseminación bacteriana transneural, aunque este último mecanismo parece menos probable en humanos. El conocimiento actual de los mecanismos moleculares involucrados en la fisiopatología de la listeriosis es parcial. En los próximos años con los nuevos avances y tecnologías disponibles en el campo de la genética, biología molecular e inmunología se lograrán descifrar las complejas interacciones entre Listeria monocytogenes y su entorno permitiendo crear nuevas estrategias de diagnóstico, prevención y tratamiento de las infecciones por Listeria monocytogenes. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Sr. Hernán Ahumada Poblete y a la Sra. Carmen Gloria Sandoval Tillería, asistentes de biblioteca de la Pontificia Universidad Católica de Chile, por su buena disposición y asistencia en la recolección del material utilizado en la elaboración de este manuscrito. REFERENCIAS 1. GERNER-SMIDT P, ETHELBERG S, SCHIELLERUP P, CHRISTENSEN JJ, ENGBERG J, FUSSING V y cols. Invasive listeriosis in Denmark 1994-2003: a review of 299 cases with special emphasis on risk factors and mortality. Clin Microbiol Infect 2005; 11: 618-24. 2. GELLIN BG, BROOME CV. Listeriosis. JAMA 1989; 261: 1313- 20. 3. DOGANAY M. 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