Citogenética Básica

RECOPILACIÓN: Dr Albis Garcia M. D.
Citogenética Básica
¿Qué son los Cromosomas?
La citogenética es el estudio de los cromosomas y las enfermedades relacionadas, causadas por
un número y/o estructura anormales de los cromosomas. Los cromosomas son estructuras
complejas localizadas en el núcleo de las células, compuestos por DNA, histonas y otras
proteínas, RNA y polisacáridos. Son básicamente los "paquetes" que contienen el DNA.
Normalmente los cromosomas no se pueden ver con un microscopio óptico, pero durante la
división celular se condensan lo suficiente como para poder ser fácilmente analizados a 1.000
aumentos. Para recoger células con sus cromosomas en este estado condensado se las expone
a un inhibidor de la mitosis, que bloquea la formación del huso mitótico y detiene la división
celular en la etapa de metafase.
Se pueden usar distintos tejidos para obtener preparaciones de cromosomas; por ejemplo,
sangre periférica, medula ósea, fluido amniótico y productos de la concepción. Aunque las
técnicas específicas difieren según el tejido usado, el método básico para obtener preparaciones
de cromosomas es así:
1.-Recolección de la muestra y preparación inicial.
Cultivo celular.
2.- Adición de un inhibidor de la mitosis para detener las células en metafase.
3.- Recogida de las células. Este paso es muy importante para obtener preparaciones de
alta calidad. Implica exponer las células a una disolución hipotónica, seguida de una serie
de disoluciones fijadoras. Esto hace que las células se expandan, de modo que los
cromosomas se extiendan y puedan examinarse individualmente.
Tinción de las preparaciones cromosómicas para detectar los posibles cambios numéricos y
estructurales.
Morfología del Cromosoma
Bajo el microscopio, los cromosomas se ven como estructuras delgadas y alargadas. Tienen un
brazo corto y otro largo separados por un estrechamiento o constricción primaria, llamada
centrómero. El brazo corto se designa como p y el largo como q. El centrómero es el punto de
unión del huso mitótico y es parte integral del cromosoma. Es esencial para el movimiento y
segregación normales del cromosoma durante la división celular. Los cromosomas metafásicos
humanos presentan tres formas básicas y se pueden clasificar de acuerdo con la longitud de los
brazos corto y largo, así como por la posición del centrómero. Los cromosomas metacéntricos
tienen los brazos corto y largo de aproximadamente la misma longitud, con el centrómero en el
punto medio. Los cromosomas submetacéntricos tienen los brazos corto y largo de longitudes
desiguales, con el centrómero más próximo a uno de los extremos. Los cromosomas
acrocéntricos tienen el centrómero my cerca de un extremo, con un brazo corto muy pequeño.
Con frecuencia tienen constricciones secundarias en los brazos cortos, conectando trozos muy
pequeños del DNA, llamados tallos y satélites, al centrómero. Los tallos contienen genes que
codifican el RNA ribosómico.
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Los diagramas, idiogramas*, de los cromosomas 1, 9 y 14 con bandas G` mostrados a
continuación son ejemplos típicos, respectivamente, de cromosomas metacéntricos,
submetacéntricos y acrocéntricos. El idiograma es básicamente un "mapa cromosómico" que
muestra la relación entre los brazos corto y largo, el centrómero (cen) y, en el caso de
cromosomas acrocéntricos, los tallos (st, de stalk) y satélites (sa). También se ilustran los
patrones de bandas específicos. Cada banda se numera para ayudar en la descripción de
reorganizaciones.
Submetacéntrico
(Cromosoma 9)
Metacéntrico
(Cromosoma 1)
Acrocéntrico
(Cromosoma 14)
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EJEMPLO DE IDEOGRAMA
Esta imagen muestra cada cromosoma humano normal comparado con su idiograma, o mapa, de bandas G, un
esquema acordado internacionalmente para los patrones de bandas.
Análisis Cromosómico
Prácticamente todos los análisis citogenéticos de rutina se realizan sobre preparaciones
cromosómicas que se han tratado y teñido para producir un patrón de bandas específico de cada
cromosoma. Esto permite la detección de cambios sutiles en la estructura de los cromosomas. El
tratamiento de tinción más común se llama bandeo G. Se dispone de otras técnicas de tinción
que ayudan a identificar anomalías específicas. Una vez que se han obtenido las preparaciones
de cromosomas metafásicos teñidos, pueden examinarse al microscopio. Típicamente, se
observan y cuentan de 15 a 20 células, con un análisis completo de al menos 5 de ellas. Durante
un análisis completo, cada cromosoma se compara críticamente banda por banda con su
homólogo. Es necesario examinar tantas células para poder detectar un mosaicismo, con
significado clínico.
Tras el análisis al microscopio, se toman imágenes de las células en metafase que tengan mejor
calidad, bien mediante fotografía o por digitalización de imagen computerizada. Cada
cromosoma puede entonces disponerse en pares de acuerdo con su tamaño y patrón de
bandas, formando un cariotipo. El cariotipo permite al citogenetista examinar aún más en detalle
cada cromosoma en busca de cambios estructurales. Se hace entonces una descripción por
escrito del cariotipo, definiendo el análisis cromosómico.
*Los idiogramas son gentileza de Tim Knight (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle,
WA., U.S.A.)
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Cromosomas Normales
Las células somáticas humanas normales tienen 46 cromosomas: 22 pares de cromosomas
homólogos o autosomas (los cromosomas 1 a 22) y dos cromosomas sexuales. A esto se le
llama el número diploide. Las mujeres tienen dos cromosomas X (46,XX) mientras que los
varones tienen un X y un Y (46,XY). Las células germinales (óvulo y espermatozoide) tienen 23
cromosomas: una copia de cada autosoma más un solo cromosoma sexual. A esto se le llama el
número haploide. Se hereda de cada progenitor un cromosoma de cada par autosómico y un
cromosoma sexual. Las madres sólo pueden aportar un cromosoma X a sus hijos e hijas,
mientras que los padres pueden aportar bien un X (a sus hijos) o bien un Y (a sus hijas).
Anomalías Cromosómicas
Aunque las anomalías cromosómicas pueden ser muy complejas, hay dos tipos básicos:
numéricas y estructurales. Ambos tipos pueden darse simultáneamente.
Las anomalías numéricas implican la pérdida y/o ganancia de uno o varios cromosomas
completos y puede incluir tanto a autosomas como a cromosomas sexuales. Generalmente, la
pérdida de cromosomas tiene mayor repercusión en un individuo que la ganancia, aunque ésta
también puede tener consecuencias serias. Las células que han perdido un cromosoma
presentan monosomía para ese cromosoma, mientras que aquéllas con un cromosoma extra
muestran trisomía para el cromosoma implicado. Casi todas las monosomías autosómicas
llevan a la muerte poco después de la concepción y sólo unas pocas trisomías permiten llegar al
nacimiento. La anomalía autosómica numérica más común es el Síndrome de Down o trisomía
21. Los individuos con trisomía en los cromosomas 13 y 18 pueden también sobrevivir hasta el
nacimiento, pero están más seriamente afectados que aquéllos con síndrome de Down.
Curiosamente, los individuos con una condición llamada triploidía, en la cual hay una copia
extra de todos los cromosomas (69 en total), pueden ocasionalmente sobrevivir hasta el
nacimiento, aunque normalmente mueren durante el periodo neonatal.
Otra regla general es que la pérdida o ganancia de un autosoma tiene consecuencias más
graves que la de un cromosoma sexual. La anomalía de cromosomas sexuales más común es la
monosomía del cromosoma X (45,X), o Síndrome de Turner. Otro ejemplo bastante común es el
Síndrome de Klinefelter (47,XXY). Aunque hay variaciones considerables dentro de cada
síndrome, los individuos afectados a menudo llevan vidas bastante normales.
En ocasiones, un individuo porta un cromosoma extra que no se puede identificar por su patrón
de bandas; a éstos se les llama cromosomas marcadores. La introducción de las técnicas FISH
ha sido de gran ayuda en la identificación de estos cromosomas marcadores.
Las anomalías estructurales implican cambios en la estructura de uno o varios cromosomas.
Pueden ser increíblemente complejas, pero para el propósito de esta discusión nos centraremos
en tres de los tipos más comunes:
Las deleciones implican la pérdida de material de un solo cromosoma. Los efectos son
típicamente graves, puesto que hay pérdida de material genético.
Las inversiones tienen lugar cuando se dan dos cortes dentro de un mismo cromosoma y el
segmento intermedio gira 180° (se invierte) y se vuelve a unir, formando un cromosoma que
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estructuralmente tiene la secuencia cambiada. Normalmente no hay riesgo de problemas para el
individuo si la inversión es de origen familiar (es decir, se ha heredado de uno de los
progenitores). Hay un riesgo algo mayor si es una mutación de novo (nueva), debido
posiblemente a la interrupción de una secuencia clave de un gen. Aunque el portador de una
inversión puede ser completamente normal, tiene un riesgo ligeramente mayor de producir un
embrión con un desequilibrio cromosómico. Esto se debe a que un cromosoma invertido tiene
dificultad en emparejarse con su homólogo normal durante la meiosis, lo que puede producir
gametos que contengan derivados cromosómicos desequilibrados si ocurre un entrecruzamiento
desigual.
Las translocaciones implican el intercambio de material entre dos o más cromosomas. Si una
translocación es recíproca (equilibrada) el riesgo de problemas para el individuo es similar al de
las inversiones: normalmente nulo si es familiar y ligeramente mayor si es de novo. Surgen
problemas con las translocaciones cuando a partir de un progenitor equilibrado se forman
gametos que no contienen ambos productos de la translocación. Cuando tal gameto se combina
con un gameto normal del otro progenitor, el resultado es un embrión desequilibrado que es
parcialmente monosómico para un cromosoma y parcialmente trisómico para el otro.
Las anomalías numéricas y estructurales se pueden dividir a su vez en dos categorías
principales: constitutivas, aquéllas con las que se nace, y adquiridas, las que surgen como
cambios secundarios a otras enfermedades, tales como el cáncer.
A veces se encuentran personas que tienen tanto líneas celulares normales como anormales. A
estos individuos se los denomina mosaicos y en la inmensa mayoría de los casos la línea
celular anormal tiene una anomalía cromosómica numérica. Los mosaicos estructurales son
extremadamente infrecuentes. El grado en el cual un individuo resulta afectado clínicamente
depende habitualmente del porcentaje de células anormales. Un análisis citogenético de rutina
incluye típicamente el examen de al menos 15 o 20 células, con el fin de descartar cualquier
mosaicismo clínicamente significativo.
Éstas son sólo algunas de las anomalías más comunes que se encuentran en un laboratorio de
citogenética. Puesto que el número de posibilidades anormales es casi infinito, se debe preparar
al citogenetista para detectar e interpretar virtalmente cualquier anomalía cromosómica que
pueda tener lugar.
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Ejemplo 1: Síndrome de Down, una anomalía numérica frecuente.
Este cariotipo es un ejemplo del Síndrome de Down, la anomalía numérica más frecuente en
recién nacidos. Se caracteriza por un cromosoma 21 extra y el cariotipo se escribe así:
47,XX,+21. La clave de la descripción de cariotipo es:
47: el número total de cromosomas (46 es lo normal).
XX: los cromosomas sexuales (femeninos).
+21: indica que el cromosoma extra es un 21.
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Ejemplo 2: Inversión en el cromosoma 10.
Este cariotipo es un ejemplo de inversión, una de las reorganizaciones estructurales más
frecuentes. En este caso, un segmento del brazo q, o brazo largo, del cromosoma 10 de la
derecha está invertido. Puesto que ambas rupturas han ocurrido en el brazo largo y el
centrómero no está implicado, se habla de una inversión paracéntrica. Si hubiera habido
rupturas separadas tanto en el brazo largo como en el corto, el centrómero estaría también
invertido y se hablaría de una inversión pericéntrica. El cariotipo se escribe como
46,XY,inv(10)(q11.23q26.3). La clave para la descripción del cariotipo es:
46: el número total de cromosomas.
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XY: los cromosomas sexuales (masculinos).
inv(10): inversión en el cromosoma 10.
(q11.23q26.3): puntos de corte del segmento invertido.
El idiograma siguiente ilustra detalladamente esta inversión
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Ejemplo 3: Deleción del cromosoma 16.
Este cariotipo es un ejemplo de deleción simple en un cromosoma. En este caso se ha perdido
un segmento del brazo q, o brazo largo, del cromosoma 16 de la derecha. En este ejemplo
particular hay dos cortes visibles microscópicamente dentro del brazo largo, que forman una
deleción intersticial. Si hubiera un corte, ocasionando la pérdida de un extremo del cromosoma,
se llamaría deleción terminal. El cariotipo se escribe así: 46,XX,del(16)(q13q22). La clave de la
descripción del cariotipo es:
46: el número total de cromosomas.
XX: los cromosomas sexuales (femeninos).
del(16): deleción en el cromosoma 16.
(q13q22): puntos de corte del segmento delecionado (o perdido).
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El idiograma siguiente ilustra en detalle esta deleción intersticial.
Ejemplo 4: Translocación entre los cromosomas 2 y 15.
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Este cariotipo es un ejemplo de una translocación equilibrada entre dos cromosomas. En este
caso, un segmento largo del brazo p, o brazo corto, del cromosoma 2 de la derecha se ha
intercambiado con el brazo q prácticamente completo, o brazo largo, del cromosoma 15 de la
derecha. Debido a que el tamaño de los fragmentos intercambiados es casi igual, esta
reorganización estructural en particular sería casi imposible de detectar sin técnicas de bandeo.
El cariotipo se escribe como 46,XY,t(2;15)(p11.2;q11.2). La clave para la descripción del
cariotipo es:
46: el número total de cromosomas.
XY: los cromosomas sexuales (masculinos).
t(2;15): translocación entre los cromosomas 2 y 15.
(p11.2;q11.2): los puntos de corte en los cromosomas 2 (p11.2), y 15 (q11.2), respectivamente.
El siguiente idiograma ilustra en detalle esta translocación.
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Ejemplo 5: Translocación entre los cromosomas 5 y 8.
Este cariotipo es un ejemplo de translocación equilibrada entre dos cromosomas. En este caso,
un segmento grande del brazo q, o brazo largo, del cromosoma 5 de la derecha se ha
intercambiado con un segmento pequeño del brazo p, o brazo corto, del cromosoma 8 de la
derecha. El cariotipo se escribe así: 46,XY,t(5;8)(q31.1;p23.1). La clave para la descripción del
cariotipo es:
46: el número total de cromosomas.
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XY: los cromosomas sexuales (masculinos).
t(5;8): translocación entre los cromosomas 5 y 8.
(q31.1;p23.1): puntos de corte en los cromosomas 5 (q31.1) y 8 (p23.1), respectivamente.
El idiograma siguiente ilustra en detalle esta translocación.
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Ejemplo 6: Inversión sutil en el cromosoma 3.
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Esta célula en metafase es un ejemplo de una inversión muy sutil. Así es como ve la célula un
citogenetista bajo el microscopio óptico. En este caso, está invertido un segmento del brazo q, o
brazo largo, del cromosoma 3 que se señala. Puesto que ambas rupturas han tenido lugar en el
brazo largo y no se ve implicado el centrómero, a esto se le llama inversión paracéntrica. El
cariotipo se escribe así: 46,XX,inv(3)(q24q27). La clave de esta descripción del cariotipo es
ésta:
46: el número total de cromosomas.
XX: los cromosomas sexuales (mujer).
inv(3): inversión en el cromosoma 3.
(q24q27): puntos de ruptura del segmento invertido.
La siguiente comparación de cromosomas e idiogramas proporciona una ilustración en
detalle de esta inversión.
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Ejemplo 7: Deleción intersticial en el cromosoma 7.
\
Este cariotipo es un ejemplo de una deleción (eliminación) simple en un cromosoma. En este
caso se elimina un segmento del brazo q,o brazo largo, del cromosoma 7 de la derecha. En este
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ejemplo concreto hay dos rupturas visibles al microscopio en el brazo largo, lo que la convierte
en una deleción intersticial. Si hubiera habido una ruptura, con pérdida de un extremo del
cromosoma, se llamaría deleción terminal. El cariotipo se escribe así:
46,XY,del(7)(q11.23q21.2). La clave para esta descripción del cariotipo es ésta:
46: el número total de cromosomas.
XY: los cromosomas sexuales (varón).
del(7): deleción en el cromosoma 7.
(q11.23q21.2): puntos de ruptura del segmento eliminado.
El siguiente idiograma proporciona una ilustración en detalle de esta deleción intersticial.
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Ejemplo 8 - TRASLOCACION CROMOSOMA DICENTRICO
Este cariotpo es un ejemplo de un tipo especial de translocación que implica a los brazos largos
completos, y bastante a menudo a los centrómeros, de los cromosomas acrocéntricos. Se la
llama translocación de Robertson.
En este caso todo el brazo largo (q) y el centrómero de un cromosoma 13 se fusionan con todo
el brazo q y el centrómero de un cromosoma 14. Este ejemplo concreto es una translocación no
equilibrada y conduce a trisomía 13. Hay dos cromosomas 13 normales más el cromosoma 13
implicado en la translocación, por tanto tres copias del cromosoma 13. La translocación se
muestra e el cariotipo como el cromosoma 14 de la derecha. El cariotipo se escribe así:
46,XY,+13,dic(13;14)(p11.2;p11.2). La clave de esta descripción del cariotipo es ésta:
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46: el número total de cromosomas. Sigue siendo 46 porque los brazos largos de los
cromosomas 13 y 14 se han fusionado en un cromosoma.
XY: los cromosomas sexuales (varón).
+13: indica la presencia de un cromosoma 13 adicional.
dic(13;14): cromosoma dicéntrico que implica a los cromosomas 13 y 14. Como en el caso de
muchas translocaciones de Robertson, están presentes los centrómeros de ambos cromosomas,
de donde viene la designación "dicéntrico".
(p11.2;p11.2): puntos de ruptura en los cromosomas 13 (p11.2), y 14 (p11.2) respectivamente.
El siguiente idiograma proporciona una ilustración en detalle de esta translocación.
Hibridación in situ Fluorescente
(FISH : Fluorescent In Situ Hybridization)
La FISH es una nueva tecnología que utiliza sondas de DNA marcadas con fluorescencia para
detectar o confirmar anomalías génicas o cromosómicas que generalmente están más allá del
poder de resolución de la citogenética de rutina. Primero, la muestra de DNA (cromosomas
metafásicos o núcleos en interfase) se desnaturaliza, proceso que separa las hebras
complementarias de la estructura en doble hélice del DNA. A la muestra desnaturalizada se le
añade entonces la sonda de interés, marcada con fluorescencia, que se hibridará al DNA de la
muestra en el sitio diana, en el proceso denominado templado, donde se vuelve a formar una
doble hélice. La señal de la sonda se observa mediante un microscopio de fluorescencia y la
muestra de DNA se clasifica según la presencia o ausencia de la señal.
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FISH de Metafase
La FISH puede usarse sobre células en metafase para detectar microdeleciones específicas más
allá de la resolución de la citogenética de rutina o para identificar material extra de origen
desconocido. Puede también ser de ayuda en casos donde es difícil determinar mediante la
citogenética de rutina si un cromosoma tiene una deleción simple o está implicado en una
reorganización sutil o compleja. Además, la FISH de metafase puede detectar algunos de los
reordenamientos específicos que se observan en ciertos cánceres.
El número de síndromes de microdeleción diagnosticados por FISH está aumentando con
rapidez. La sensibilidad de estos ensayos es en todos los casos mejor que la de la citogenética
de rutina, pero depende del síndrome en concreto. En algunos, la sonda es específica para el
gen defectuoso, como en el Síndrome de Williams, donde se ha encontrado una deleción en el
gen de la elastina en el 96% de los pacientes con diagnóstico confirmado. En otros síndromes
como el de Prader-Willi/Angelman, la etiología es heterogénea y las microdeleciones sólo forman
una parte de los casos (60%).
Síndromes de Microdeleción Actualmente Diagnosticables mediante FISH
Síndrome del maullido (cri-du-chat)
Síndrome de Kallman
Síndrome de Miller-Dieker
Síndrome de Williams
Síndrome de Smith-Magenis
Síndrome de Wolf-Hirschhorn
Deficiencia de esteroide-sulfatasa
Síndrome de Prader-Willi/Angelman
Síndrome DiGeorge/Velo-Cardio-Facial/CATCH 22/Shprintzen
FISH de Interfase
La FISH se puede usar sobre células en interfase para determinar el número de copias de uno o
varios cromosomas, así como para detectar algunas reorganizaciones específicas que son
características de ciertos cánceres. La ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede
realizar muy rápidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere
crecimiento de las células.
Un buen ejemplo es el ensayo de Prueba de Aneuploidía, que se realiza sobre células del
fluido amniótico cuando hay una fuerte indicación clínica de una de las trisomías más comunes.
Se desnaturalizan los núcleos de la muestra, se hibridan con sondas específicas para los
cromosomas 13, 18, 21, X e Y, y los resultados se obtienen comúnmente en 24 horas. La prueba
de aneuploidía suele incluir también una citogenética de rutina para confirmar los resultados o
detectar cualquier anomalía no detectada por la FISH de interfase.