Autor: Cristian H. Danna - Instituto de Investigaciones Biotecnológicas
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE GENERAL SAN MARTIN Caracterización molecular y fisiológica de una mutante por deleción de la región distal del cromosoma 6BL de Triticum aestivum. Autor: Cristian H. Danna Director: Rodolfo A. Ugalde Co-director: Francisco Sacco Tesis para optar al título de “Doctor en Biología Molecular y Biotecnología” de la Universidad Nacional de General San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas-Instituto Tecnológico Chascomús-CONICET-UNSAM Diciembre de 2002 UNIVERSIDAD NACIONAL DE GENERAL SAN MARTIN Caracterización molecular y fisiológica de una mutante por deleción de la región distal del cromosoma 6BL de Triticum aestivum. Autor: Cristian H. Danna Director: Rodolfo A. Ugalde Co-director: Francisco Sacco Jurados Titulares: Jurados Suplentes: Dr. Ricardo Wolosiuk Dr. Jorge Casal Dr. Carlos Frasch Dr. Nestor Carrillo Dra. Estela Valle Tesis Doctoral Instituto de Investigaciones Biotecnológicas-Instituto Tecnológico Chascomús-CONICET-UNSAM Diciembre de 2002 Agradecimientos I Agradecimientos. El orden de los agradecimientos listados a continuación no refleja ninguna prioridad, por lo tanto no debería ser considerado para formar una opinión respecto de mi. Como verán, es dificil referirse a otras personas sin considerar que uno es el centro. Pido perdón a los que no sean recordados por mi en los próximos 15 minutos, porque habrán quedado fuera de los agradecimientos. Bueno…. tampoco es que se van a pelear por estar en mis agradeciemientos!!! A Eyleen, porque me ama y comparte su vida conmigo y me permite amarla. A mis padres, porque son personas íntegras y me quieren tanto y sufren tanto por quererme. A Susana, porque nos permitió a Eyleen y a mi desarrollarnos plenamente en esta profesión sin sufrir las miserias que el medio impone a los que viven de becas en Argentina, y por querernos. A María, porque siempre está para lo que sea. A Daiana y Ezequiel, por creer que puedo ser un buen ejemplo para ellos y permitirme colaborar minimamente en forjar un futuro mejor para sus vidas. A Walter, Mary, Valentina y Nacho por creer en mi y por los momentos compartidos. A mis amigos (Ana, Andrea, Ariana, Carlos, Carly, Ivan, Mariana, Nandus, Negro, Ogui, Romina y Verónica) por ser mis amigos. Al Dr. Ugalde por proveerme de todos los materiales para hacer esta tesis y por darme toda la libertad para pensar. A los Drs. Frasch y Cazzulo por facilitarme materiales y apoyo. A Carmen, Ernesto, Ester, Graciela, Miguel, Mirna, Mónica, Nely, Oscar, Pablo, Paola, Susana, Teresa y Zulma, por estar siempre bien dispuestos para ayudar y aguantar las exigencias. A mis compañeros de laboratorio (Alejandra, Andrés, Ariel, Cristina, Florencia, Gabi, Guillermo, Luisa, Mara, Marcela, Mariela, Marta, Nora, Ogui y Victoria) por soportarme y enseñarme tantas cosas (la mayoría de las cuales no he aprendido, por supuesto). A toda la gente de los otros laboratorios del IIB-UNSAM, porque hemos compartido conocimientos, materiales, experiencias, y hemos sabido convivir en armonía y democracia a pesar de ser muchos y de estar un poco hacinados; o será por eso que nos llevamos bien? A Carlos Bartoli, Francisco Sacco, Guillermo Santa-María, Hector Saione, Juan Jose Guiamet y Lorena Ingala, por enseñarme y ayudarme a hacer esta tesis. Al Dr. Oscar Burrone, por permitirme hacer experimentos en su laboratorio y enseñarme. A Nelson Dusetti, Jorge Sepulveda, Hiu Lin-Hin, Fulvia Vascotto, Federica Benvenuti, Marco Bestagno, Luca Vangelista y Elsa Fabbretti, por los momentos divertidos que compartimos. A Draga Obersnell por su cariño, sus comidas y su confianza. Al Instituto de Genética, CNIA-INTA, Castelar. Al INGEBI. Al INTECH. A la Fundación Campomar. Al INFIVE. Al ICGEB (Trieste, Italia). Al CIC-CSIC (Barcelona, España). En todos estos institutos he encontrado gente buena con la que he colaborado de alguna u otra manera. Al CONICET, al FOMEC y a la UNSAM, por la ayuda económica. Resumen II Resumen. La resistencia a patógenos y a factores ambientales adversos, debería ser una característica fundamental de los cultivares de plantas de interés agronómico. La pérdida de la región distal del cromosoma 6BL de trigo (Triticum aestivum) está completamente asociada a la suceptibilidad a la raza 66 de Puccinia recondita (roya de la hoja) y a la reducción del crecimiento y producción de semillas. La línea S-SV8 es una mutante delecionada en la región distal del cromosoma 6BL, obtenida espontaneamente de la línea parental R-SV8. Se analizó la expresión de genes en ambas líneas isogénicas en condiciones control y 48 h después de la inoculación con roya. Se obtuvieron 34 cDNAs de los cuales 33 se expresaron sólo en la línea parental inoculada. El cDNA TaRr16 se expresó constitutivamente sólo en la línea parental control e inoculada. Varios de los cDNAs aislados mostraron homología con genes previamente descriptos en otras interacciones planta-patógeno. Los cDNAs TaRr01 y TaRr16, mapearon físicamente sobre la región cromosómica en estudio. El análisis de ligamiento genético indicó que TaRr16 está estrechamente ligado al gen Lr3 de resistencia a la raza 66 de roya de la hoja. Sin embargo, las secuencia del cDNA TaRr16, no mostró homología con genes de resistencia, sino que resultó ser el extremo 3´ no traducido del mensajero de un gen que codifica para una enzima Ascorbato Peroxidasa tilacoidal, que por su localización cromosómica hemos denominado TaAPX-6B. Estudios bioquímicos previos han demostrado que las APX del cloroplasto (chAPX) son las principales enzimas encargadas de la detoxificación del H2O2 producido durante la fotosíntesis. El rol “in vivo” de las chAPX permaneció oscuro ya que no se disponía de plantas mutantes. Dado que TaAPX-6B esta ausente en las plantas S-SV8, esta línea es la primer mutante para estos genes descripta hasta el presente. El análisis de la actividad enzimática indicó que TaAPX-6B es un contribuyente mayoritario de la actividad tAPX. El análisis de expresión génica indicó que TaAPX-6B es inducible por luz y que los niveles de transcriptos están modulados por la irradiancia lumínica. El análisis de la acumulación de biomasa y expansión de las hojas de las plantas mutantes reveló que un aumento en la irradiancia lumínica ejerce un efecto nocivo sobre su crecimiento. De igual modo, mediciones de fluorescencia de clorofila y de fijación de C02 indicaron que las plantas mutantes transportan menos electrones entre los fotosistemas, son más sensibles al estrés producido por exceso de luz y tienen menor actividad fotosintética que las plantas parentales cultivadas en alta irradiancia. La reducción del transporte de electrones podría constituir un mecanismo homeostático para evitar el daño oxidativo al disminuir la producción de H2O2. Sin embargo, este mecanismo podría ser penalizado por una reducción en el crecimiento de las plantas mutantes. Abstract III Abstract. Crop species might be resistant to pathogens and adversary climate conditions. The loss of the distal region of wheat chromosome 6BL (dr-6BL) is completely associated to susceptibility to the leaf rust 66 race (Puccinia recondita) and to impaired growth and seed production. The wheat line S-SV8 is a dr-6BL deleted-mutant, spontaneously obtained from the parental R-SV8 line. Genes absents in the deleted mutant must be directly or indirectly involved in its phenotype. Comparison of mRNA fingerprinting profiles, obtained from both mock and rust-inoculated S-SV8 and R-SV8 plants, allowed the isolation of 34 differentially displayed cDNAs. All these cDNAs, but one, were up-regulated in the rust-inoculated resistant line. One cDNA (TaRr16) showed constitutive mRNA expression in the rust-resistant line while no expression was detected in the rust-susceptible line. A number of the isolated cDNAs revealed homology to genes previously identified in other plant-pathogen interactions. Two out of the 34 isolated cDNAs, including TaRr16, were mapped on dr-6BL chromosome. Genetic linkage analysis indicates that TaRr16 is tightly linked to Lr3 resistance gene, which confers race 66 leaf-rust resistance. After cDNA elongation, the sequence obtained revealed that TaRr16, instead of a resistance gene, is the 3´ untranslated sequence of a gene encoding an Ascorbate Peroxidase enzyme anchored to chloroplast thylakoid membrane. Due to its genomic location, this gene was named TaAPX-6B. Previous studies indicated that chloroplastic APX (chAPX) isoenzymes (tAPX and sAPX) are the main scavengers of H2O2 produced during photosynthesis. However, since chAPX mutant plants have not been isolated so far, the “in vivo” relevance of these enzymes have remained unclear. As TaAPX-6B is absent in S-SV8 plants, this is the first tAPX mutant line described. Mutant plants have a 40% lower tAPX activity than parental plants. tAPX mutant plants exhibit impaired PSII electron transport, photosynthetic activity and biomass accumulation when cultured at high light, indicating that a normal tAPX activity is essential for the proper functioning of photosynthesis. The impaired electron transfer observed in tAPX mutant plants could be an homeostatic mechanism to avoid oxidative damage and this could be penalized by a reduced growth. Indice IV Indice. Agradecimientos. Resumen. Abstract. Indice. 1. Introducción. 1.1 Estrés biótico. 1.1.1 Biología de la interacción trigo-roya. 1.1.2 Interacción genética trigo-roya. 1.1.3 Genes de resistencia. 1.1.4 Respuesta a patógenos. 1.1.5 Cambios de expresión génica durante la respuesta de las plantas a los patógenos. 1.1.6 Participación de las especies reactivas de oxígeno (ERO) en el estrés producido por patógenos. 1.2 Estrés abiótico. 1.2.1 Fotosíntesis oxigénica. 1.2.2 Mediciones de fluorescencia aplicadas al estudio del transporte de electrones en la fotosíntesis. 1.2.3 Producción de ERO en la fotosíntesis. 1.2.4 Daño oxidativo producido por las ERO. 1.2.5 Mecanismos de control de las ERO en el cloroplasto. 1.2.6 Las APX y el ciclo agua-agua. 1.2.6.1 Rol fisiológico de las chAPX. 2. Objetivos. 3. Materiales y Métodos. 3.1 Material vegetal. 3.2 Medición de la irradiancia lumínica. 3.3 Inoculación con royas. 3.4 Mediciones de crecimiento y biomasa acumulada. 3.4.1 Elongación de la hoja. 3.4.2 Peso fresco. 3.4.3 Peso seco. 3.5 Tratamiento con Metil Viologeno y exceso de luz. 3.6 Aislamiento de RNA y DNA genómico. 3.7 mRNA-Differencial Display. 3.7.1 Tratamiento del RNA total con DNAasa-I. 3.7.2 Síntesis de cDNA. 3.7.3 Reacciones de PCR. 3.7.4 Separación de los productos de PCR. 3.7.5 Clonado de los cDNAs del mRNA-DD. 3.7.6 Secuenciación de clones. 3.7.7 Análisis de las secuencias. 3.8 Purificación de DNA. 3.8.1 Extracción de DNA de geles de agarosa y purificación de productos de PCR o digestión con enzimas de restricción. 3.8.2 Minipreparación de plásmidos. 3.9 5´RACE. 3.10 3´RACE 3.11 Hibridación sobre filtros de DNA. 3.12 Hibridación sobre filtros de RNA. 3.13 Preparación de sondas. 3.14 Screening diferencial. 3.15 RT-PCR semicuantitativa. I II III IV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 13 14 16 17 18 18 18 18 19 19 19 19 19 19 20 20 20 20 20 21 21 21 21 21 21 21 22 22 22 23 23 24 Indice 3.16 Mapeo físico. 3.17 Análisis de ligamiento genético. 3.18 Detección específica de los genes TaAPX. 3.19 Expresión de proteínas recombinantes en E. coli. 3.20 Medición de actividades enzimáticas. 3.20.1 Ascorbato Peroxidasa. 3.20.2 Monodehidroascorbato Reductasa. 3.20.3 Dehidroascorbato Reductasa. 3.20.4 Glutatión Reductasa. 3.21 Fluorescencia de clorofila. 3.22 Asimilación de CO2. 3.23 Carbonilación de proteínas. 3.23.1 Extracción de proteínas. 3.23.2 Derivatización. 3.23.3 Western blot. 3.24 Bibliotecas sustractivas. 4. Resultados. 4.1 Clonado y caracterización de cDNAs expresados diferencialmente entre R-SV8 y S-SV8. 4.1.1 mRNA-Differential Display 4.1.1.1 Análisis confirmatorios de la expresión diferencial de los genes clonados. 4.1.1.1.1 Differential Screening. 4.1.1.1.2 RT-PCR semicuantitativa. 4.1.2 Bibliotecas sustractivas. 4.2 Mapeo de los clones aislados del mRNA-DD. 4.2.1 Mapeo físico. 4.2.1.1 Análisis de la expresión de TaRr16. 4.2.2 Análisis de ligamiento genético entre los marcadores TaRr01, TaRr16 y el gen Lr3 de resistencia a roya. 4.2.2.1 Obtención del cDNA completo correspondiente al clon TaRr16. 4.3 Análisis de la función fisiológica del gen TaAPX-6B en relación al fenotipo de crecimiento reducido de las plantas S-SV8. 4.3.1 Clonado de cDNAs homólogos a TaAPX-6B. 4.3.2 Localización cromosómica de los genes tAPX. 4.3.3 Estudios de expresión de los genes tAPX. 4.3.4 Genes tAPX en otras monocotiledoneas. 4.3.5 Caracterización del fenotipo de "crecimiento reducido" de las plantas S-SV8. 4.3.6 Análisis de la expresión de los genes TaAPX en respuesta a la luz. 4.3.7 Actividad enzimática de la proteína recombinante TaAPX-6B. 4.3.8 Análisis de la actividad APX en plantas. 4.3.9 Contenido de ácido ascórbico y medición de las actividades enzimáticas del ciclo glutatión-ascórbico. 4.3.10 Análisis del transporte de electrones y actividad fotosintética. 4.3.11 Análisis del daño oxidativo. 5. Discusión. 5.1 La técnica de mRNA-DD aplicada al clonado de genes diferencialmente expresados en trigo y a la obtención simultánea de marcadores moleculares. 5.1.1 Eficiencia de la estrategia utilizada para la obtención de marcadores moleculares. 5.1.2 Eficiencia de la estrategia aplicada al clonado de genes con expresión diferencial en trigo. 5.1.3 Expresión diferencial de genes entre R-SV8 y S-SV8 en respuesta al patógeno. 5.1.4 Diferencias de expresión entre R-SV8 y S-SV8 en condiciones control. 5.2 La ausencia de TaAPX-6B en las plantas mutantes S-SV8 produce una menor actividad fotosintética y una reducción en el crecimiento. V 24 24 25 25 26 26 26 26 27 27 28 28 28 28 28 28 29 29 29 31 31 32 32 33 33 34 35 36 38 38 38 39 40 41 42 43 45 47 47 49 50 50 50 51 52 53 53 Indice El reducido transporte de electrones y la menor actividad fotosintética de las plantas mutates puede ser atribuida a la ausencia de TaAPX-6B. 5.2.2 La redundancia funcional de las tAPXs de trigo facilitarían la sobrevida de las plantas mutantes. 5.2.3 La expresión de TaAPX-6B y la actividad foliar APX están reguladas por la irradiancia a la cual se cultivan las plantas. 5.2.4 La deficiencia en la actividad tAPX conduce a la inhibición masiva de la actividad APX foliar cuando las plantas son sometidas a un estrés súbito. 5.2.5 El daño oxidativo sería evitado mediante la reducción del transporte de electrones con una penalización en el crecimiento en las plantas S-SV8. 5.2.5.1 Reducción del transporte de electrones de las plantas mutantes. 6. Conclusión. 7. Anexo. 8. Bibliografía. VI 5.2.1 54 54 55 56 56 57 60 61 64 Introducción 1. 1 Introducción Justificación, historia e hipótesis inicial. Por su volumen de producción y utilidades (212 millones de hectáreas; 585 millones de toneladas/año), el trigo pan es el cereal de mayor importancia económica mundial (72.000 millones U$S/año). La resistencia a enfermedades y la buena aptitud ante adversidades climáticas, deberían ser características fundamentales de los cultivares comerciales. Mejoras en la resistencia a factores bióticos y abióticos serán en los próximos años de gran relevancia para alcanzar una mayor calidad y rendimiento de las cosechas. Estos dos aspectos de la aptitud de los cultivares serán fundamentales para lograr el desafío de alimentar una población mundial que crece a ritmo acelerado (FAO, 2002). En esta tesis se han estudiado aspectos relacionados a la resistencia biótica y abiótica del trigo. La línea “Sinvalocho-MA” ha sido ampliamente utilizada en planes de mejoramiento clásico para introducir genes de resistencia a royas en cultivares comerciales suceptibles. En esta tesis la línea “Sinvalocho-MA se denominará R-SV8 (R : resistente a roya). En la década de 1980, los Ings. Agrons. Francisco Sacco, Enrique Suarez y Ewald Favret (Instituto de Genética, INTA, Castelar) aislaron una línea mutante espontanea derivada de R-SV8 que es susceptible a la raza 66 de Puccinia recondita, el agente causal de la roya de la hoja del trigo (Sacco, 1995; Suarez and Favret, 1982). A esta línea se la denominó S-SV8 (S : susceptible a roya). Además del fenotipo de susceptibilidad, S-SV8 difiere de R-SV8 en el tamaño y el peso de las plantas (Fig. 1). A B Figura 1. Fenotipos de las plantas R-SV8 y S-SV8. (A) Diferencia de tamaño entre plantas parentales y mutantes cultivadas en alta irradiancia. (B) Respuesta a la roya de las plantas parentales resistentes (izq.) y mutantes suceptibles (der.). Las plantas mutantes tienen un tamaño menor y producen una menor cantidad de semillas que las parentales. El análisis citogenético reveló que S-SV8 tiene una deleción en la región telomérica del brazo largo del cromosoma B6 (Sacco, 1998)(Fig. 2). Introducción A B Parental R-SV8 2 Mutante S-SV8 6S centrómero 6L A B D A B D Figura 2. Cromosomas del grupo 6 del trigo hexaploide. (A) Bandeo “C” del cromosoma 6B de la línea R-SV8 (izq.) y S-SV8 (der.). (B) Representación esquematica de grupo 6 de cromosomas. El genoma hexaploide del trigo pan (Triticum aestivum L.) esta constituido por 3 genomas diploides de 7 cromosomas cada uno: el genoma A, el genoma B y el genoma D. Cada genoma proviene de una especie ancestral. Los 21 cromosomas dobles se organizan y enumeran del 1 al 7 en grupos de 3 cromosomas. El aislamiento de genes y el estudio de su función en el trigo hexaploide es una tarea particularmente dificultosa por varias razones: a) no se dispone de marcadores moleculares para la región distal del cromosoma 6BL; b) el tamaño del genoma del trigo (16.000 Mpb) y su alto contenido de heterocromatina repetitiva, dificulta el análisis de bibliotecas genómicas (clonado posicional); c) no existen transposones que permitan el aislamiento de mutantes para un gen específico; d) no se puede aplicar la metodología de interrupción de genes por T-DNA. Ante la imposibilidad de aplicar las aproximaciones mencionadas, el análisis al azar de la expresión génica es una alternativa para identificar los genes involucrados en las diferencias fenotípicas observadas entre las líneas R-SV8 y S-SV8. Los genes localizados en la región telomérica del cromosoma 6BL, directa o indirectamente deben estar involucrados en las diferencias fenotípicas analizadas en esta tesis. 1.1 Estrés biótico. Las plantas son sometidas permanentemente a diferentes tipos de situaciones que generan una reducción en el crecimiento y la productividad. El estrés biótico, impuesto por otros organismos, es un desafío constante que las plantas deben superar para completar exitosamente su ciclo de vida. La roya de la hoja del trigo es una enfermedad causada por el hongo biotrófico Puccinia recondita tritici. Si bien se denomina “roya” estrictamente a la enfermedad producida por Puccinia recondita, en esta tesis se usará el término “roya” para referirse al patógeno. La raza 66 de P. recondita es una de las diferentes razas que atacan los cultivos de trigo pan en la cuenca triguera argentina. En inviernos húmedos y templados, las pérdidas en el rendimiento de las cosechas producidos por la infección con royas suelen sobrepasar el 15 % (Rodriguez, 1961) (Roels, 1987) (Hogg, 1969). El gen de resistencia Lr3, localizado en la región telomérica del cromosoma 6BL, es el determinante genético de la resistencia a la raza 66 de la roya de la hoja. Varios genes de resistencia a royas han sido Introducción 3 identificados genéticamente desde la década de 1930 (MacIntosh, 1995). Muchos de estos genes han sido utilizados en planes de mejoramiento clásico, para introducir resistencia en cultivares susceptibles. Sin embargo, hasta el presente ninguno de estos genes ha sido clonado. La disponibilidad de genes de resistencia a royas, o marcadores moleculares ligados a ellos, permitiría entender las bases moleculares de la interacción trigo-roya, lo que posibilitaría un manejo más adecuado de la resistencia de los cultivares de interés agronómico. 1.1.1 Biología de la interacción trigo-roya. Puccinia recondita es un hongo biótrofo (patógeno obligado), del orden Bacidiomicetes, ampliamente distribuido en los suelos de las regiones trigueras en forma de esporas diploides. Durante su ciclo de vida asexuado, P. recondita utiliza como hospedador al trigo pan. Esta interacción es especie-específica y raza/cultivar-específica, de manera que no existen hospedadores alternativos. La inoculación natural de los cultivares de trigo susceptibles se produce durante los inviernos templados (15°C y 20°C) y húmedos. La espora germina, el tubo germinativo crece sobre la hoja y se introduce a través de los estomas en la cámara subestomática. A partir de este momento, el tubo germinativo del hongo entra en un contacto estrecho con las células de la planta. Sin romper las células vegetales, se abre paso entre los espacios intercelulares hasta que forma un apresorio que posteriormente dará los cuerpos reproductivos (urediosporos). Desde el apresorio y a través de la pared celular se prolonga una estructura especial llamada haustorio, que le permite al patógeno entrar en contacto íntimo con la membrana plasmática de la célula de la planta. A través del haustorio, el E TG hongo A se alimenta a expensas de la célula vegetal viva (Fig. 3). Después de establecida la infección, el apresorio HA comienza a formar los MP cuerpos fructíferos que protruyen finalmente hacia el exterior de la hoja. Estudios citológicos demostraron Figura 3. Representación esquemática de la germinación y desarrollo de P. recondita en la hoja de trigo. E: espora; TG: tubo germinativo; A: apresorio; HA: haustorio; MP: membrana plasmática. formación que la exitosa del haustorio es un evento crucial que define el futuro de la interacción Introducción 4 (Jacobs, 1989). Precisamente en el momento en que el hongo comienza a penetrar por los espacios intercelulares, las células de la planta en contacto con el patógeno forman una estructura engrosada de pared celular llamada papila, que impide la formación del haustorio (Fig. 4). Al impedir la formación del haustorio, la E interacción TG A incompatible. resulta Este evento decisivo ocurre entre 24 h y 48 APapila h después de la inoculación. Figura 4. Representación esquemática de la germinación de la espora y aborto del desarrollo de P. recondita en la hoja de trigo. E: espora; TG: tubo germinativo; A: apresorio. 1.1.2 Interacción genética trigo-roya. La interacción trigo-roya a nivel genético se encuadra dentro del modelo denominado “gen a gen” establecido por Flor (Flor, 1971). Las diferentes razas de royas han sido clasificadas de acuerdo a sus interacciones genéticas con diferentes cultivares de trigo. Más de 30 genes de resistencia a royas han sido identificados y mapeados geneticamente en el genoma de trigo (McIntosh, 1995). La teoría del gen por gen establece que cada gen de resistencia de la planta confiere protección contra un patógeno portador de un gen de avirulencia específico. Cualquier interacción en la cual el gen de resistencia de la planta no se corresponda con el gen de avirulencia del patógeno, permitirá el desarrollo del patógeno (Fig. 5). Genotipo del patógeno Genotipo del hospedador R1 r1 resistencia suceptibilidad suceptibilidad suceptibilidad AVR1 avr1 Figura 5. Modelo “ gen por gen” de interacción planta-patógeno. Introducción 5 Si el patógeno se desarrolla y completa su ciclo biológico la interacción es compatible y por lo tanto la planta es susceptible y el patógeno es virulento. Si por el contrario el patógeno no consigue completar su ciclo biológico, la interacción es incompatible y por lo tanto la planta es resistente y el patógeno es avirulento. 1.1.3 Genes de resistencia. Independientemente del patógeno para el cual confieran resistencia, la mayoría de los genes de resistencia clonados de diferentes especies muestran características comunes (HammondKosack and Jones, 1997), aún cuando confieran resistencia específica contra patógenos intra o extracelulares con modos de vida muy diversos (Tabla 1). Tabla1: Genes de resistencia. Clase Gen "R" Planta Patógeno RPS2 RPS5 RPS4 Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis RPM1 Arabidopsis Rx Papa Gpa2 Papa N L6 M RPP5 RPP1 RPP8 Tabaco Lino Lino Arabidopsis Arabidopsis Arabidopsis Pseudomonas syringae p.v. tomate P. syringae p.v. maculicola Virus X Globodera pallida Virus mosaico Melanospora lini M. lini Peronospora parasitica I2C-1 Tomate Mi Tomate Rp1-D Maiz Xal Arroz 4 Prf Pto Cf-9 Cf-4 Cf-2 Cf-5 Xa21 Tomate Tomate Tomate Tomate Tomate Tomate Arroz 5 Hml Maiz 6 Mlo Cebada 1 2 3 ??? pro1 Hs1 Caña azúcar Fusarium oxysporum Meloidogyne Incognita Puccinia sorghi Xanthomonas oryzae P. syrigae p.v. tomate Cladosporium fulvum X. orizae Cocliobolus carbonum Erysiphe graminis Heterodera schachtii Tipo de patógeno bacteria Estructura proteína "R" LZ-NBS-LRR LZ-NBS-LRR TIR-NBS-LRR bacteria LZ-NBS-LRR virus LZ-NBS-LRR nematodo LZ-NBS-LRR virus hongo hongo hongo TIR-NBS-LRR TIR-NBS-LRR TIR-NBS-LRR TIR-NBS-LRR TIR-NBS-LRR LZ-NBS-LRR hongo NBS-LRR nemátodos y áfidos hongo NBS-LRR bacteria NBS-LRR bacteria NBS-LRR KINASA eLRR-TM eLRR-TM eLRR-TM eLRR-TM LRR-KINASA Reductasa de toxinaH Proteína-G acoplada a receptor hongo bacteria hongo hongo nemátodo NBS-LRR Controversial La característica más notable de la mayoría de los genes de resistencia es que las proteínas por ellos codificadas contienen regiones ricas en leucina (LRR) y sitios de unión a nucleótidos (NBS). Las LRRs estan involucradas en las interacciones proteína-proteína (Kobe and Introducción 6 Deisenhofer, 1994). Los dominios LZ (cremallera de leucinas) encontrados en otros genes de resistencia también participarían en la interacción entre proteínas. Algunos genes de resistencia codifican para proteínas con dominios “kinasa” y NBS posiblemente involucrados en la transducción de señales (Taylor et al., 1993). Una minoría de los genes de resistencia codifican para proteínas con LRR-NBS-Kinasa. Estas características son esenciales para poner a los genes de resistencia en el marco de la teoría “gen por gen” desde una perspectiva molecular: mientras las LRR reconocen directa o indirectamente a los factores de avirulencia de los patógenos, los dominios “kinasa” y NBS transducen la señal necesaria para que la planta responda al ataque del patógeno (Fig 6). Extracelular Cf-2, Cf-4, Cf-9 N Intracelular LRR Xa-21 NN LRR Hs1 pto1 LZ KINASA Pto LZ N LRR Prf KINASA N LZ N LRR RPS2, RPM1 TIR N LRR N, L6, RPP5 N N LRR 1.1.4 Figura 6. Representación esquemática de la localización subcelular y los dominios estructurales de las proteínas codificadas por genes de resistencia modelo. N: sitio de unión a nucleótidos; LZ: cremallera de leucinas; LRR: repeticiones ricas en leucinas; TIR: semejante a proteína TOLL de D. melanogaster y receptor de interleuquina 1 de mamíferos. I2C-1 Respuesta a patógenos. Al igual que en muchas otras interacciones planta-patógeno, la resistencia a royas se manifiesta a nivel macroscópico como una mancha parda de tejido muerto que los genetistas han denominado reacción de hipersensibilidad (HR). En la década de 1990, se aislaron mutantes de Arabidopsis thaliana que simulan HRs sin estar en contacto con patógenos. Esos descubrimientos plantearon seriamente la posibilidad de que la HR, fuera una forma de muerte celular programada (PCD), controlada por la planta en respuesta a patógenos avirulentos como un modo de defensa (Greenberg et al., 1994). La HR se define como la muerte rápida y localizada de células de la planta en respuesta a un patógeno (Fig. 7). Figura 7. Autofluorescencia característica de células que responden al patógeno induciendo la reacción de hipersensibilidad. HR 20 m Introducción 7 Sin bien se ha postulado que la HR es un fenómeno particular de la respuesta a patógenos, no se han descripto características que permitan una definición unívoca para la misma. Varios procesos de muerte celular como la senescencia y la maduración de frutos tienen características compartidas con la HR (Heath, 2000). La participación de la HR en la resistencia a patógenos a sido puesta en duda recientemente. Varios casos de resistencia a patógenos no están mediados por una HR, mientras que algunas interacciones compatibles producen HRs sin que esto produzca ningún perjuicio al patógeno. Mientras que algunos autores sostienen que la HR es un mecanismo para contener al patógeno, aislarlo y eventualmente eliminarlo, otros sostienen que para muchos tipos de interacciones, las HRs funcionan como amplificadores de la señal de alarma hacia el resto de la planta que no ha entrado en contacto directo con el patógeno (Alvarez et al., 1998). Un abanico bastante amplio de cambios metabólicos caracterizan la HR. Los mejor estudiados son: activación de canales de entrada de calcio; aumento en las concentraciones de H2O2, ácido salicílico y óxido nítrico; producción de compuestos proteicos antibacterianos como fitoalexinas, glucanasas y quitinasas (Heath, 2000). Muchos de estos cambios fisiológicos son promovidos por modulación de la transcripción de genes (Chen et al., 2002). 1.1.5 Cambios de expresión génica durante la respuesta de las plantas a los patógenos. Después del contacto primario entre los patógenos y las plantas, se producen cambios en la expresión de varios genes que responden específicamente a la presencia del patógeno. (Bull et al., 1992; Dudler et al., 1991). Muchos de estos genes han sido denominados PR (Tabla 2). Tabla 2. Proteínas de respuesta a patógenos (PR). Familia de proteína PR-1 PR-2 PR-3 PR-4 PR-5 PR-6 PR-7 PR-8 PR-9 PR-10 PR-11 PR-12 PR-13 PR-14 Propiedades/Función Antifúngico, anti-Oomycete (1-3) β-Glucanasa Quitinasa Antifúngico Antifúngico, anti-Oomycete Inhibidor de proteasa Endoproteasa Quitinasa Peroxidasa Ribonucleasa Quitinasa Antifúngico Antifúngico Antifúngico Generalmente, los genes PR (genes de respuesta a patógenos) son inducidos tanto en las interacciones compatibles como en las incompatibles, pero la inducción siempre es más rápida en las interacciones incompatibles (Molina et al., 1999; Munch-Garthoff et al., 1997). Del mismo modo, la abundancia de transcriptos y proteínas PR siempre es mayor en las interacciones incompatibles que en las compatibles (Pritsch et al., 2000). Además de los genes PR, varios genes relacionados con la síntesis de ácido salicílico (SA) y otros involucrados en la Introducción 8 detoxificación de compuestos fenólicos, especies reactivas de oxígeno (ERO) y peroxidación de lípidos, cambian su expresión durante la interacción. Estudios recientes de expresión génica en Arabidopsis thaliana usando microarrays, han determinado que un número sorprendentemente elevado de genes cambia su expresión en respuesta a patógenos, lo cual indica que ocurre un reordenamiento metabólico a gran escala ante la situación de estrés biótico (Scheideler et al., 2002). 1.1.6 Participación de las especies reactivas de oxígeno (ERO) en el estrés producido por patógenos. Si bien el O2 es estable y relativamente inofensivo, las ERO son capaces de oxidar toda clase de componentes celulares, incluyendo proteínas, lípidos y DNA (Noctor and Foyer, 1998). Las ERO son especies químicas muy reactivas e inestables que resultan de la transferencia de electrones desde diferentes dadores hacia el O2 (Mittler, 2002). Existen tres formas, dependiendo del grado de reducción: anión superóxido (O2 ), peróxido de hidrógeno (H2O2) y - 1 radical hidroxilo (HO ). Una cuarta especie reactiva denominada oxígeno singulete ( O2) resulta 1 de la excitación del O2. El O2 y el HO son extremadamente peligroso ya que, a diferencia del O2- y H2O2, no existen mecanismos enzimáticos para detoxificarlos. Varios procesos celulares producen ERO como productos secundarios. Entre ellos los más importantes son la fotosíntesis, la respiración, la fotorespiración y la β-oxidación de ácidos grasos (Asada, 1999). En años recientes, se identificaron nuevas fuentes de ERO entre las que se incluyen NADPHoxidasas, amino-oxidasas y peroxidasas de membrana plasmática (Hammond-Kosack and Jones, 1996). Notablemente, éstas últimas fuentes están fuertemente reguladas y participan en la producción de ERO en procesos tales como la muerte celular programada (PCD) y la defensa contra patógenos (Hammond-Kosack and Jones, 1996). Los principales mecanismos de remoción de ERO incluyen a las enzimas superóxido-dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión-reductasa (GR), glutatión-S-transferasa (GST), glutatión peroxidasa (GPX) y ascorbato peroxidasa (APX) (Fig. 8). Figura 8. VÍas de detoxificación enzimática de ERO. APX: ascorbato peroxida; SOD: superóxido dismutasa; DHAR: dihidroascorbato reductasa; MDHAR: monodihidroascorbato reductasa; GR: glutatión reductasa; AA: ácido ascórbico; MDA: monodihidroascórbico; DHA: dihidroascórbico; GSSG: glutatión oxidado; GSH: glutatión reducido. Citosol Transportador Apoplasto Pared Celular Transportador Introducción 9 Mientras que la CAT es específica de los peroxisomas, las demás enzimas se encuentran en varias organelas y en el apoplasto. Mientras que la CAT tiene una baja afinidad por el H2O2 (rango mM), la APX une H2O2 con alta afinidad (rango μM). Estas y otras evidencias sugieren que la CAT remueve el exceso de H2O2 en condiciones de estrés severo, mientras que la APX modula finamente la concentración de H2O2 requerida para los procesos de señalización (Mittler, 2002). Durante la respuesta a patógenos, la producción de ERO se incrementa debido a la activación de las enzimas NADPH-oxidasa, amino-oxidasa y peroxidasas extracelulares. La explosión oxidativa que ocurre después del contacto con el patógeno tiene dos fases en las interacciones incompatibles y sólo una fase en las compatibles. La primera fase de aumento en la concentración de H2O2 ocurre independientemente del destino de la interacción, mientras que un segundo aumento de la concentración, de mayor magnitud y más sostenido en el tiempo que el primero, es propio de las interacciones incompatibles (Levine et al., 1994). El H2O2 producido en este proceso, junto con el ácido salicílico (SA) y el óxido nítrico (NO), difunden hacia en citoplasma. Paralelamente, las actividades CAT y APX son inhibidas por SA y NO, lo cual contribuye al aumento de la concentración de H2O2 necesario para inducir la HR (Mittler et al., 1998). La ejecución de la muerte celular programada (PCD) mediada por H2O2 involucra la regulación transcripcional de genes homólogos a los que participan en la apoptosis en animales, como MAP-kinasas (Kovtun et al., 2000). Además de una función señalizadora, el H2O2 ejerce una participación directa en el fortalecimiento de la pared celular, lo cual tendría un efecto negativo sobre el patógeno al dificultarle la disponibilidad de nutrientes. 1.2 Estrés abiótico. Durante el transcurso de la vida de una planta, varios tipos de factores físicos pueden afectar su normal desarrollo. La falta o el exceso de agua, el frío o el calor, la composición mineral del suelo, y aún la luz, pueden ser factores causantes de estrés. En el trigo, el efecto promedio causado por todos los factores antes mensionados puede producir pérdidas de hasta un 82 % en el rendimiento de las cosechas respecto de los niveles máximos de productividad establecidos para un determinado cultivar comercial (Bray, 2000). La luz proveniente del sol es la fuente primaria de energía de la biosfera terrestre. A través de la fotosíntesis, la luz es convertida en energía química. Entonces, resulta sorprendente que la fotosíntesis pueda ser dañada por la luz. Las plantas disponen de varios mecanismos para disipar el exceso de energía que entra al sistema en forma de luz (Niyogi, 1999). Entre otros mecanismos, la transferencia de electrones hacia el O2 es utilizado para disipar parte de la energía excedente de los fotosistemas. Sin embargo, la utilización del O2 como sumidero de electrones es una estrategia peligrosa, ya que genera grandes cantidades de ERO. En consecuencia, las plantas poseen potentes sistemas antioxidantes que permiten el control de las ERO y el normal funcionamiento de la fotosíntesis (Asada, 1999). Introducción 10 1.2.1 Fotosíntesis oxigénica. La fotosíntesis oxigénica es un proceso de oxido-reducción en el que la luz es utilizada para oxidar el H2O. Los electrones provenientes del H2O son utilizados a su vez para sintetizar hidratos de carbono mediante la fijación del CO2 atmosférico. En las plantas, todas las reacciones requeridas para la fotosíntesis ocurren en los cloroplastos. Los cloroplastos son organelas rodeadas por dos membranas que poseen en su interior una matriz llamada estroma y un sistema membranoso llamado tilacoide. Las membranas tilacoidales se organizan en granas y son el lugar de residencia de los componentes encargados de la captación de luz, el transporte de electrones, la producción de ATP y la síntesis de NADPH (Fig. 9). estroma lumen tilacoidal Figura 9. Componentes del sistema de transporte de electrones acoplado a la síntesis de ATP y NADPH. PSII: fotosistema II; PSI: fotosistema I; PQ: plastoquinona oxidada; PQH: plastoquinona reducida; Cyt b6f: citocromo b6-f; PC: plastocianina; Fdx: ferredoxina; FNR: ferredoxina reductasa; CF0 y CF1: particulas F0 y F1 de la ATP sintetasa, respectivamente. El NADPH funciona como transportador de electrones entre la membrana tilacoidal y el estroma del cloroplasto. En el estroma del cloroplasto residen las enzimas necesarias para fijar CO2 a través del ciclo de los ácidos tricarboxilicos o de “Calvin-Benson”. El poder reductor necesario para fijar CO2 proviene del NADPH generado al final de la cadena de transporte de electrones del tilacoide. El proceso fotosintético comienza con la captación de luz en los complejos antena que rodean al fotosistema dos (PSII) y al fotosistema uno (PSI). Las luz que entra en el complejo antena del PSII es utilizada para oxidar el H2O en el centro reactivo del PSII. Esta reacción produce + protones (H ), O2 y electrones. Los electrones cedidos por el H2O viajan a través de varios componentes de la cadena de transporte de la membrana tilacoidal hasta llegar al sitio aceptor Introducción 11 de electrones del PSI. Los complejos antena que rodean al PSI también capturan luz y transfieren electrones directamente al sitio aceptor del PSI. El PSI finalmente transfiere + electrones a la ferredoxina (Fx) y ésta a la NADP -Reductasa para producir NADPH (Bowyer and Leegood, 1997; Malkin and Niyogi, 2000). Entre el PSII y el PSI hay varios componentes + que liberan H hacia el interior del espacio tilacoidal, lo cual genera un gradiente electroquímico que es utilizado por la ATP-Sintetasa para producir ATP en el lado estromático de la membrana tilacoidal (Fig. 10). Figura 10. Representación esquemática del flujo de electrones entre los fotosistemas II y I. P680 : clorofila del centro reactivo del PSII; Ph: feofitina ;QA: plastoquinona A ;QB: plastoquinona B; PQ y PQH2: plastoquinona oxidada y reducida, respectivamente; cyt-bL, cyt-b H, cyt-b F, FeS: componentes del complejo citocromo b6-f; PC: plastocianina; P700: ; A0: primer aceptor “clorofila a monomérica”; A1: segundo aceptor “clorofila a monomérica”; FeSx y FeSA,B: componentes del cluster hierro-azufre; Fd: ferredoxina. 1.2.2 Mediciones de fluorescencia aplicadas al estudio del transporte de electrones en la fotosíntesis. Variadas situaciones ambientales producen cambios en la cantidad de energía que entra a los fotosistemas y en la cantidad de electrones que se transportan a través del PSII y el PSI. Estos cambios pueden estudiarse a través de mediciones de fluorescencia de clorofila. En términos generales, la energía que entra en los fotosistemas puede seguir tres caminos: puede convertirse en calor, puede viajar en forma de electrones a través de los fotosistemas (fotoquímica), o puede reflejarse en forma de energía fluorescente. Las tres variables están estrechamente relacionadas de manera que la sumatoria de todas ellas es igual a la cantidad de energía que incide sobre la hoja. Los parámetros más utilizados para estudiar el transporte de electrones son: a) la proporción de luz absorbida por los complejos antena que es utilizada Introducción 12 para transportar electrones (φPSII); b) la cantidad de centros reactivos del PSII que están efectivamente transportando electrones en un momento dado (qP); c) la cantidad máxima potencial de centros reactivos del PSII eventualmente disponibles para transportar electrones (Fv/Fm); d) la proporción de energía que incide sobre la hoja que es disipada como calor (qNP). Cada uno de estos parámetros se calcula a partir de mediciones de fluorescencia que requerirá de diferentes protocolos en el tratamiento de las plantas para la obtención de un parámetro en particular (Fig. 11). Una vez obtenido los valores de fluorescencia, se calculan los parámetros deseados (Maxwell and Johnson, 2000). Figura 11. Esquema del perfil de fluorescencia de clorofila. MB: encendido del fluorómetro; SP: pulso de luz saturante; AL: luz utilizable para realizar fotosíntesis; F0: fluorescencia mínima; Fm: fluorescencia máxima; F´m: fluorescencia máxima en estado estacionario de transporte de electrones; F´0: fluorescencia mínima después del transporte de electrones; Ft: fluorescencia en estado estacionario. 1.2.3 Producción de ERO en la fotosíntesis. Los principales sitios de producción de ERO en el cloroplasto son: las moléculas de clorofila en el complejo antena del PSII, el centro reactivo del PSII, y el sitio dador de electrones del PSI. En el complejo antena del PSII, la absorción de luz causa un estado de excitación en las moléculas de clorofila (Chl). La energía de excitación se transfiere por resonancia entre las 1 1 3 moléculas de Chl excitadas (Chl ). La Chl pueden lograr un estado mayor de excitación (Chl ) 3 antes de ceder su energía al centro reactivo del PSII. La Chl tiene una vida media más larga 1 1 que la Chl , y puede excitar O2 produciendo O2. Este fenómeno no se produce en el PSI Introducción 13 porque la vida media de la Chl1 en el PSI es menor que en el PSII, con lo cual no alcanza el 3 estado de Chl (Niyogi, 1999). Los dímeros de Chl del centro reactivo del PSII (P680), son excitados por los electrones 1 1 provenientes del H 2O produciendo P680 . Al igual que en el complejo antena del PSII, el P680 puede sobreexcitarse y producir tripletes de P680 (P6803) que a su vez pueden excitar al O2 1 con la consecuente producción de O2. En el PSI este fenómeno no ocurre porque sus aceptores de electrones (Phylloquinone y Ferredoxina) son más eficientes que los del PSII (Plastoquinone QA y QB). + El sitio dador de electrones del PSI, además de reducir NADP vía Fx, transfiere electrones al O2 a través de la vía pseudocíclica (también llamado ciclo agua-agua) produciendo O2 . El O2 es reducido a H2O2 mediante la actividad SOD y posteriormente a H2O mediante la actividad - APX (Asada, 1987). Sin embargo, si no son removidos adecuadamente, el O2 puede reaccionar con el H2O2 (reacción de Fenton) para dar OH . 1.2.4 Daño oxidativo producido por las ERO. El PSII se considera como el blanco principal del estrés oxidativo. Cuando la entrada de 3 fotones al PSII excede la capacidad de transporte de electrones, los tripletes P680 disparan la degradación proteolítica de las proteínas D1 y D2 ( componentes centrales del PSII) a una velocidad que excede la tasa de reparación y recambio, con lo cual el PSII entero queda inutilizado para captar y vehiculizar electrones. Este fenómeno, denominado fotoinhibición, es un caso extremo de daño fotooxidativo (Anderson and Andersson, 1988; Barber and Andersson, 1992). Las membranas tilacoidales son ricas en lípidos insaturados 1 extremadamente sensibles a las ERO. La producción de O2 en el PSII, puede oxidar lípidos, pigmentos y cofactores proteicos esenciales para el funcionamiento de los fotosistemas. El sitio dador de electrones del PSI, produce grandes cantidades de O2- y H 2O2 (Asada, 1994). Si bien el PSI es más resistente a la fotoinhibición que el PSII, en condiciones de baja temperatura puede ser dañado por las ERO (Fryer et al., 1995; Tjus et al., 1998). El H2O2 producido a la salida del PSI, en el lado estromático de la membrana tilacoidal, tiene efecto inhibitorio sobre la actividad de enzimas que usan tiol como grupo prostético. Entre varias otras enzimas del metabolismo del carbono, la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (RUBISCO), la fosforibulokinasa, la fructosa-1-6-bifosfatasa y la NADP-gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, son inhibidas o directamente degradadas por H2O2 (Desimone et al., 1996; Ishida et al., 1999; Kingston-Smith, 1997) . 1.2.5 Mecanismos de control de las ERO en el cloroplasto. Las producción de ERO durante la fotosíntesis es inevitable aún a irradiancias bajas. Altas irradiancias lumínicas aumentan la producción de ERO y paralelamente en muchos casos Introducción 14 aumentan también el poder antioxidante del cloroplasto. En ciertas condiciones de estrés abiótico aún a bajas irradiancias el aumento en la concentración de ERO sobrepasa la capacidad antioxidante del cloroplasto con el consecuente daño oxidativo (Noctor, 1998). Los pigmentos carotenoides (xantófila, anteraxantina, violaxantina, neoxantina, luteina, 1 loroxantina) absorben la energía de excitación del O2 generado en el complejo antena o en el 1 centro reactivo del PSII. Estos pigmentos, al tomar energía del O2 cambian su conformación liberando energía en forma de calor. Este fenómeno de disipación de energía se denomina “quenching” no fotoquímico (qNP) (Niyogi, 1999). 1 - - La vitamina E (α-tocoferol) puede tomar energía del O2, o detoxificar O 2 y OH . A diferencia de las xantófilas que están acopladas a proteínas de la membrana tilacoidal, el α-tocoferol es soluble en lípidos y se mueve libremente a través de las membranas. El ácido ascórbico (AA) y el glutatión son antioxidantes solubles. Ambos tienen un rol antioxidante fundamental a través de la absorción directa de energía proveniente de las ERO. 1 - - 1 - Mientras el AA directamente detoxifica O2, O 2 y HO , el glutatión puede detoxificar O2 y HO . Además, ambos participan en la regeneración de α-tocoferol y otros compuestos que intervienen en la detoxificación de ERO. Así mismo, el AA tiene un rol central en la detoxificación de ERO mediada por las enzimas violaxantina de-epoxidasa y APX. El glutatión además, participa en la regeneración de AA a través del ciclo glutatión-ascórbico (Foyer, 1976). 1.2.6 Las APX y el ciclo agua-agua. Las enzimas con actividad Ascorbato Peroxidasa (APX) son las principales encargadas de la remoción de H2O2 en las plantas puesto que se encuentran en todos los compartimientos subcelulares, mientras que la CAT sólo lo hace en los peroxisomas y glioxisomas. Se han identificado tres grupos de isoenzimas APX localizadas en el citosol (cAPX) (Mittler and Zilinskas, 1992), en los glioxisomas (gAPX) (Bunkelmann and Trelease, 1996) y en los cloroplastos (chAPX) (Miyake, 1992). Las chAPX existen en dos formas: a) la forma tilacoidal (tAPX), anclada a membrana tilacoidal, y b) la forma estromática (sAPX), soluble en el estroma del cloroplasto. En el cloroplasto, la transferencia de electrones desde el PSI hacia el O2 - produce grandes cantidades de O 2 que es dismutado a H2O2 mediante la enzima SOD. El H 2O2 es reducido a H2O a través de la transferencia de electrones desde el AA catalizada por las chAPX (Asada, 1992). Este movimiento de electrones, que comienza con la producción de O2 y la transferencia de electrones desde H2O hacia el PSII, y termina con el consumo de O2 y la producción de H2O en el PSI, se denomina vía pseudo-cíclica de electrones o ciclo H2O-H2O (Asada, 1999)(Fig. 12). Introducción 15 Figura 12. Representación esquemática del ciclo H2O-H2O acoplado al ciclo glutatión ascórbico. PSI: fotosistema I; tAPX: ascorbato peroxidasa tilacoidal; sAPX: ascorbato peroxidasa estromática; CuZn-SOD: superóxido dismutasa cloroplástica; Fd: ferredoxina; FNR: ferredoxina reductasa; DHAR: dihidroascorbato reductasa; MDHAR: monodihidroascorbato reductasa; GR: glutatión reductasa; AsA: ácido ascórbico; MDA: monodihidroascórbico; DHA: dihidroascórbico; GSSG: glutatión oxidado; GSH: glutatión reducido. Las APXs y las citocromo-c-peroxidasas (CPX) son hemoenzimas con actividad peroxidasa de tipo procariota (Clase I) probablemente derivadas de una catalasa/peroxidasa ancestral que se encuentra en cianobacterias y bacterias fotosintéticas (Welinder et al., 1992). Las APXs se diferencian de las guaiacol peroxidasas (Clase III), como la peroxidasa de rabanito (horseradish peroxidase, HPX), por su secuencia y función fisiológica. Las GPX no detoxifican H 2O2 sino que participan en la biosíntesis de lignina. Por el contrario, las APX son enzimas especializadas en la detoxificación de H2O2. Ya que el cloroplasto no contienen CAT, las PAX son las principales encargadas de mantener el H2O2 en niveles de acumulación que no resulten peligrosos para la maquinaria fotosintética. Si bien las cAPX y las chAPX comparten ciertas características funcionales, la homología de secuencias de aminoiácidos no es en promedio mayor al 50%. Mientras que las cAPX funcionan como dímeros y pueden usar otros dadores de electrones además del AA, las chAPX funcionan como monómeros y sólo usan AA para reducir H2O2. Las concentraciónes de tAPX y sAPX en el tilacoide y en el estroma son de aproximadamente 1 mM y 40 μM, respectivamente (Asada, 1999). Las proporciones de las dos isoformas varían de una especie a otra. En espinaca y zapallito, las dos isoformas se transcriben a partir del mismo Introducción 16 gen por escisión alternativa del último exon que codifica para el ancla a la membrana tilacoidal ; se desconoce la regulación del este proceso (Mano et al., 1997) (Ishikawa et al., 1997). El mecanismo catalítico de las APX es de tipo ping-pong: se forma un "compuesto intermediario I" entre un residuo W de la enzima (conservado en todas las chAPX), el Fe (III) del grupo hemo y el H 2O2. Seguidamente los electrones del AA son utilizados para producir el "intermediario II" y finalmente otra molécula de AA es utilizada para volver la APX al estado inicial: + APX-Fe(III)-W+ H2O2 → APX-Fe(IV)=O-W + H2O (intermediario I) + APX-Fe(IV)=O-W + AA → APX-Fe(IV)=O-W + MDHA (intermediario II) APX-Fe(IV)=O-W + AA → APX-Fe(III)-W + MDHA+ H2O El MDHA generado durante este proceso es regenerado nuevamente a AA directamente por la Fdx o enzimaticamente por el ciclo Glutation-Ascórbico. 1.2.6.1 Rol fisiológico de las chAPX. El rol “in vivo” de las chAPX y su participación en el ciclo agua-agua ha sido inferido principalemente de estudios bioquímicos y más recientemente del análisis de plantas transgénicas que sobreexpresan enzimas antioxidantes en el cloroplasto. Plantas transgénicas de algodón que sobreexpresan APX en el clorplasto son más resistentes al estrés producido por frío, lo cuál sugiere que estas enzimas son componentes fundamentales de la defensa antioxidante. Sin embargo, estudios con plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresan CAT en el cloroplasto, sugieren que las chAPX son componente dispensables de la defensa antioxidante. Trabajos pioneros con plantas trangénicas que sobreexpresan SOD, han demostrado que la sobreexpresión de enzimas antioxidantes altera las actividades antioxidantes endógenas de varias enzimas. Por lo tanto, la información recabada de estos estudios podría no revelar la función “in vivo” de las APX, ya que la actividad alterada de otras enzimas antioxidantes podría enmascarar la función de las chAPX. Hasta el presente no se ha reportado la existencia de plantas mutantes para genes chAPX. La disponibilidad de mutantes para estos genes sería fundamental para dilucidar su función “in vivo”. Objetivos 17 2. Objetivos Caracterizar molecular y fisiológicamente una línea de trigo delecionada en la región distal del cromosoma 6BL. a) Aislar y caracterizar genes expresados diferencialmente entre las líneas isogénicas de trigo R-SV8 y S-SV8. b) Generar marcadores moleculares para la región distal del cromosoma 6BL. c) Estudiar el rol de los genes aislados en la determinación del fenotipo de la línea mutante. Materiales y métodos 18 3. 3.1 Materiales y Métodos. Material vegetal. La línea Sinvalocho-MA (R-SV8) es una línea standard de trigo hexaploide (Triticum aestivum) producto del cruzamiento entre la línea Sin Rival (semillero Klein, Argentina) y la línea número 8 del Ministerio de Agricultura de la Nación Argentina (8-MA). La línea R-SV8 lleva el locus Lr3 de resistencia a roya de la hoja en la región telomérica del cromosoma 6BL. La línea S-SV8 es una línea propagada por autofecundación de una planta mutante espontanea derivada de R-SV8 que fue identificada en un screening de plantas susceptibles a la raza 66 de Puccinia recondita. S-SV8 es una mutante espontanea por deleción, a la cual le falta el 20% del brazo largo del cromosoma 6 (6BL) que incluye la región telomérica y por lo tanto al locus Lr3. La línea Gama-6 es susceptible a la raza 66 de Puccinia recondita. Gama-6 fue obtenida 51 por la irradiación con rayos-γ (Co ) de plantas R-SV8. Una de las plantas descendientes de R-SV8 irradiada, que perdió la resistencia a la raza 66 de Puccinia recondita, se denominó Gama-6 y se propagó por autofecundación. Las líneas de trigo Chinese Spring Nulitetrasómicas fueron aisladas en el John Innes Center, Norwich, UK. Las plantas fueron cultivadas en macetas con tierra en condiciones controladas y regadas periódicamente con H2O. El fotoperíodo fue de 16 h de luz y 8 de oscuridad. La temperatura se mantuvo entre 15 y 25 grados dependiendo de la época del año. Las diferentes irradiancias lumínicas se consiguieron regulando la distancia entre las plantas y la fuente de luz artificial, o bien regulando la posición de las plantas dentro del invernáculo. 3.2 Medición de la irradiancia lumínica. Se tomaron lecturas de irradiancia lumínica (entre 400 nm y 700 nm) con un radiómetro “LiCor” modelo Li-185 provisto de los filtros adecuados. Las lecturas del radiómetro en unidades de flujo de fotones llamadas “μ einsteins” fueron convertidas 1 a 1 en “μmoles de -2 -1 fotones m s “, unidad ampliamente utilizada para medir el flujo de fotones que incide sobre la hoja. 3.3 Inoculación con royas. Dos semanas después de la germinación (estadio de segunda hoja) las plántulas fueron pulverizadas con 0,01 % de Tween-20 en agua o con la misma solución conteniendo 1 g/l de esporas de la raza 66 de Puccinia recondita para las condiciones control e inoculada, respectivamente. Después del rociado, las plantas fueron mantenidas en una cámara húmeda durante toda la noche. Plantas inoculadas de ambas líneas fueron mantenidas Materiales y métodos 19 durante 10 días en invernáculo hasta la aparición de los síntomas de susceptibilidad o resistencia. 3.4 3.4.1 Mediciónes de crecimiento y biomasa acumulada. Elongación de la hoja. Se rotularon plantas individuales y se registró la longitud de la lámina de la hoja cada día a la misma hora durante 20 días. Dado que el crecimiento fue lineal para la primer y segunda hojas, se calculó la longitud promedio de crecimiento por día. 3.4.2 Peso fresco. Se pesaron tubos falcon vacíos de 15 ml ; se cortaron las plántulas a la altura de la expansión de la lámina de la primer hoja ; se colocó una plántula dentro de cada tubo y se tapo herméticamente; se calculo la diferencia de peso. 3.4.3 Peso seco. Se cortaron las plántulas a la altura de la expansión de la lámina de la primer hoja ; se mantuvieron en estufa a 60ºC durante una semana sobre papel para deshidratarlas y se pesaron. 3.5 Tratamiento con Metil Viologeno y exceso de luz. Estos experimentos se realizaron durante días frescos (15ºC-20ºC) y soleados. Plántulas -2 en estadio de segunda hoja cultivadas a 200-400 μmoles de fotones m -2 s -1 fueron -1 expuestas a la luz solar directa (1800 μmoles fotones m s , al mediodía). Las plantas control fueron rociadas con una de solución 0,01 % de Tween-20 en agua, mientras que las plantas tratadas con MV fueron rociadas con la misma solución conteniendo MV 20 μM. 3.6 Aislamiento de RNA y DNA genómico. Los diferentes tejidos fueron pulverizados en N2 líquido con mortero. Se le agregó el volumen necesario de Trizol-Reagent (Gibco-BRL, Cat. Nº 10296) y se dejo fundir. Después de fundida la mezcla se mortereó nuevamente. El resto del protocolo se hizo siguiendo las instrucciones del fabricante. El RNA polyadenilado se obtuvo a partir de RNA total con las columnas de purificación “PolyA-Track mRNA Purification System” (Promega, Cat. Nº Z5310) siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA genómico se obtuvo a partir de 1 g de hojas. Se pulverizó el tejido en N 2 líquido con mortero. Se transfirió el polvo a un tubo de 50 ml y se le agregaron 25 ml de Sol.BE. Se incubó la mezcla durante 1 h a 60ºC mezclando suavemente a intervalos de 10 Materiales y métodos 20 minutos. Se agregaron 25 ml de cloroformo : alcohol isoamilíco (24 :1). Se invirtió suavemente el contenido durante 2 minutos. Se centrifugó la mezcla a 5000 x g para separar las fases acuosa y orgánica. Se recuperó la fase acuosa y se le agregaron 25 ml de cloroformo : alcohol isoamilíco (24 :1) y se repitió el procedimiento anterior. Se recuperó la fase acuosa y se precipitó el DNA genómico contenido en la fase acuosa con el agregado de 25 ml de isopropanol a temperatura ambiente. Se recuperó el DNA precipitado con una varilla de vidrio. Se lavó el DNA con etanol al 70% en agua. Se dejó secar al aire y se resuspendió en H2O. Sol.BE : 100 mM Tris-Cl (pH 7,5), 700 mM NaCl, 50 mM EDTA (pH 8), 1% (p/v) CTAB, 140 mM β-Mercapto-etanol. 3.7 3.7.1 mRNA-Differencial Display. Tratamiento del RNA total con DNAasa-I. Las reacciones conteniendo 30 μg de RNA total de hojas se incubaron a temperatura ambiente con Deoxyribonuclease-I (GIBCO-BRL, Cat. Nº 18047-019) durante 30 minutos en 100 mM de Acetato de Na (pH 5,2) , 5 mM MgCl2 siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.7.2 Síntesis de cDNA. Se usó como primer 3´ el oligonucleótido T12MC. Se utilizaron como templado 5 μg de RNA total (libre de DNA genómico) de hojas 48 después del tratamiento control o de la inoculación con roya. La síntesis de la primer hebra de cDNA se realizó a 42ºC con la - Retro-transcriptasa murina modificada “SuperScript-II RNAasaH ” (Gibco-BRL, Cat. Nº 18064-014) siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.7.3 Reacciones de PCR. Se hicieron reacciones de PCR (10 μl) en tubos de 200 μl de pared delgada en un ciclador térmico Biometra-UNO-II siguiendo el protocolo publicado por Liang y Pardee (1992)(Liang and Pardee, 1992). Como primer 3´ se utilizó el oligonucleotido T12MC, donde la M representa cualquier nucleótido excepto Timidina. Como primers 5´ se utilizaron los oligonucleótidos comerciales de 10 bases de longitud (decámeros) de secuencia arbitraria de las series OPA, OPB y OPZ (Operon-Tecnology). 3.7.4 Separación de los productos de PCR. 35 Los productos marcados con ATP-S se sometieron a electroforesis en geles verticales desnaturalizantes (urea 40% p/v) de acrilamida : bis-acrilamida (38 :2) al 6% (p/v). Los geles se fijaron con Metanol 5% v/v : Ácido Acético 5% v/v. Se secaron a 80ºC durante 2 h Materiales y métodos 21 y se pusieron en contacto con placas radioautográficas X-OMAT-AR (Kodak) a temperatura ambiente durante una noche. 3.7.5 Clonado de los cDNAs del mRNA-DD. Las bandas diferenciales se recortaron alineando la placa radioautográfica con el gel. El bloque de papel con poliacrilamida se rehidrató en 50 μl H 2O a 100ºC durante 5 minutos. Se centrifugó a 20000 x g y se tomaron 5 μl del sobrenadante para usar como templado en una reacción de PCR con los mismos primers que dieron origen a la banda diferencial siguiendo el protocolo de reamplificación de Liang y Pardee (1992) (Liang and Pardee, 1992). Los productos de PCR fueron clonados en los sitios EcoRI del plásmido “pGEM-TEasy Vector Systems” (Promega, Cat. Nº A1360) siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.7.6 Secuenciación de clones. La secuencia de nucleótidos se obtuvo por el método de di-deoxynucleotidos fluorescentes de Sanger. Los productos de la reacción fueron separados y analizados en un secuenciador automático ABI-377 (Applied Biosystem). Para el inicio de la síntesis de DNA se utilizaron los primers comerciales Forward -40, Reverse 1233, T7 y T3. 3.7.7 Análisis de las secuencias. Las secuencias fueron analizadas mediante el programa BLASTX o BLASTN (Altschul et al., 1997) para buscar homologías con secuencias depositadas en el GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/). También se utilizaron los programas EMOTIF (http://motif.stanford.edu/emotif/) y BLASTP para identificar dominios funcionales en las proteínas putativas codificadas por los cDNAs. 3.8 3.8.1 Purificación de DNA. Extracción de DNA de geles de agarosa y purificación de productos de PCR o digestión con enzimas de restricción. El DNA se purificó con el kit “QIAX II” (QIAGEN, Cat. Nº 20051) siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.8.2 Minipreparación de plásmidos. El DNA plasmídico se purificó con el kit “Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System” (Promega, Cat. Nº A1330) siguiendo las indicaciones del fabricante. 3.9 5´RACE. La síntesis de la primer hebra del cDNA TaAPX-6B se realizó usando como templado 100 ng de RNA poliadenilado de hojas de plantas R-SV8 48 después del tratamiento control y Materiales y métodos 22 el oligonucleótido 5´-AAGCATTGCATTTGTTTCA-3´ como primer antisentido. La síntesis de cDNA se realizó a 65 ºC con la retrotranscriptasa aviana modificada “ThermoScript TM RT- PCR System” (GIBCO-BRL, Cat. Nº 11146-016) siguiendo las instrucciones del fabricante. El agregado de las Guaninas 5´ (tailing) a la primer hebra de cDNA, la purificación del producto de tailing y la 1º y 2º PCRs, se realizaron con el kit “5´ RACE System” (GIBCOBRL, Cat. Nº 18374-058) siguiendo las indicaciones del fabricante. El oligonucleótido 5´CATCTTGCATGCCGACCAAT-3´ fue utilizado como primer 3´ en la 1º PCR. En la 2º PCR el oligonucleótido 5´- ATGGTTAATTACAGAAGATGA-3´ fue utilizado como primer antisentido. Los oligonucleótidos comerciales AAP y AUP, provistos por el kit, fueron utilizados como primers 5´ en la 1º y 2º PCRs, respectivamente. 3.10 3´RACE La síntesis de la primer hebra de cDNA se realizó a 42ºC con la Retro-transcriptasa murina - modificada “SuperScript-II RNAasaH ” (Gibco-BRL, Cat. Nº 18064-014) y el oligonucleótido 5´- GCCCATATCATCTAGTCACTT(T)18 -3´ como primer 3´ usando 500 ng de RNA total de hojas de R-SV8. El oligonucleótido 5´- GCCCATATCATCTAGTCACTT-3´ se usó como primer 3´ en la PCR. El oligonucleótido 5´- GGAATTCCATATGAGGATCCGATGCATGGCGGCGT-3´ conteniendo el ATG del cDNA TaAPX-6B se uso como primers 5´. 3.11 Hibridación sobre filtros de DNA. El DNA genómico se sometió a electroforesis en gel de agarosa 0,8 % (p/v) y se transfirió por capilaridad a membranas de nylon Hybond-N (Amersham Pharmacia) según el protocolo de Maniatis et al. (1989). La prehybridación, la hibridación y los lavados se realizaron a 65 ºC. El primer lavado se hizo a temperatura ambiente durante 20 minutos en Sol.I. El segundo lavado se hizo a 65 ºC. Los lavados de bajo rigor se hicieron en Sol.I a 65 ºC durante 10 minutos. Los lavados de máximo rigor se realizaron a 65 ºC en Sol.II. durante 10 minutos. Solución de prehibridación e hibridación: 6 ml de 5X HSB, 3 ml de Denhart III, 0,5 mg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. 5X HSB: 3% (p/v) PIPES (pH 6,8), 3 M ClNa, 0,02 M EDTA-Na2. Denhart III: 2 % (p/v) BSA fracción V, 10 % (p/v) SDS, 2 % (p/v) Ficol-400, 2% (p/v) PVP360, 5 % (p/v) Na4P 2O7 x 10 H2O. Soluciones de lavado: Sol.I) 2X SSC, 1 % (p/v) SDS ; Sol.II) 0,2X SSC, 1 % (p/v) SDS. 3.12 Hibridación sobre filtros de RNA. El RNA se desnaturalizó en buffer de siembra y se sometió a electroforesis en gel de agarosa 1%. La trasferencia por capilaridad a filtros de nylon se hizo según el protocolo de Maniatis et al. (1989). Después de la transferencia los filtros se alinearon con una regla y se Materiales y métodos 23 fotografiaron bajo luz U.V. para visualizar los RNAs ribosómicos teñidos con Bromuro de Etidio. La prehibridación, la hibridación y los lavados se hicieron en las misma condiciones que los filtros de DNA. Buffer de siembra desnaturalizante: 750 μl de formamida deionizada 37 % (p/v), 15 μl de buffer MOPS 10X, 240 μl de formaldehido 99 % (p/v), 200 μl de glicerol 50 % (p/v), 8 μl de azul de bromo fenol 10 % (p/v), 10 μg de Bromuro de Etidio. Buffer MOPS 10X: 0,2 M MOPS, 50 mM acetato de sodio, 10 mM EDTA (pH 7). Buffer de electroforesis: 1X MOPS. 3.13 Preparación de sondas. Las sondas radiactivas se prepararon mediante la incorporación de α-dCTP-P 32 en reacciones de extensión de primers hexameros arbitrarios (Random Priming) con el fragmento largo de la enzima DNA polimerasa-I (Klenow, GIBCO-BRL) usando como templado 50 ng de plásmido. Las sondas se purificaron con Sephadex-G50 (Pharmacia) empacado en pipetas pasteur de 1 ml. La incorporación de radiactividad de verificó con un detector de radiación-β (Gaiger). Las sondas se desnaturalizaron durante 5 minutos a 100 ºC en presencia de 5 mg de DNA de esperma de salmón y seguidamente se llevaron al hielo por 2 minutos. Solución SL10 para Random Priming: 250 μl 1M HEPES (pH 6.6), 250 μl DTM, 7 μl OL, 63 μl T1E1. Solución DTM: 100 mM Adenina, 100 nM Ganina, 100 mM Timidina, 250 mM Tris-Cl (pH 8), 25 mM MgCl 2, 50 mM DTT (ditiotreitol). Solución OL: 1 OD (unidad óptica) de hexámeros arbitrarios (BioLabs, UK) en 14 μl de H 2O. T1E1: 1 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Reacción de marcación: a) a 11,4 μl de LS10 se le agregaron 5 μl de templado (10 ng/μl), se hirvió la mezcla por 5 minutos y se dejó en hielo. Se le agregó 1 μl de BSA 100X (BioLabs, UK), 1 μl de enzima Klenow (5 U/μl) y 5 μl de. Se Incubó como mínimo 4 h a 37 ºC. 3.14 Screening diferencial. Los cDNAs fueron amplificados por PCR usando 10 ng de plásmido como templado y los primers comerciales Forward -40 y Reverse 1233. Los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa 1% y transferidos por capilaridad a filtros de nylon Hybond-N (Amersham, Pharmacia) según el protocolo de Maniatis et al. (1989). La prehibridación, la hibridación y el lavado de los filtros fue idéntico al procedimiento utilizado en las hibridaciones sobre filtros de DNA genómico. La síntesis de cDNA total marcado fue idéntica a la síntesis normal de la primer hebra de cDNA con SperScript II RT (GIBCO-BRL, Cat. Nº 18064-014) excepto que la mezcla de dNTPs 2,5 mM no contuvo dCTP frío que fue 32 reemplazado por αP -dCTP (5 μl= 16 nmoles = 50 μCi). Materiales y métodos 24 3.15 RT-PCR semicuantitativa. Se uso cDNA total simple hebra como templado en las reacciones de PCR. La determinación del punto exponencial de aparición de producto de PCR se obtuvo 32 mediante la incorporación de pequeñas cantidades αP -dCTP (2,5 μCi = 0,8 pM final/ reacción). La síntesis se interrumpió a 15, 20, 25 y 30 ciclos de PCR. Los productos radiactivos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida 6%. El gel se expuso a placas radioutográficas y se escaneó la imagen para medir la señal de cada producto mediante el programa de cuantificación densitométrica “ImageQuantifier”. Cada amplicón (producto de amplificación generado por una pareja de primers) puede requerir un número distinto de ciclos de PCR para llegar a la fase exponencial. Una vez obtenido el Nº de ciclos necesarios para que cada amplicón se encuentre en la fase exponencial de la PCR, se hicieron diluciones seriadas al medio del templado original hasta observar la desaparición del producto de PCR en geles de agarosa 3% teñidos con Bromuro de Etidio. Las cantidades de templado en las diferentes muestras fue normalizado mediante la amplificación de actina de trigo siguiendo el protocolo antes descripto. Considerando que el mRNA de actina se encuentra igualmente representado en todas las muestras a comparar, cualquier diferencia entre el número de diluciones requeridas para que desaparezca el producto del gen problema respecto de actina, es atribuida a diferencias de expresión del gen problema entre las distintas muestras. Los oligonucleotidos 5´- ATGTGGATATCAGGAAGGA-3´ y 5´-CTCATACGGTCAGCAATAC-3´ fueron usados como primers 5´ y 3´, respectivamente, para la detección de la expresión de actina de trigo. 3.16 Mapeo físico. El DNA genómico de las líneas R-SV8 y S-SV8 fue digerido con las enzimas de restricción HindIII, EcoRI, BamHI, BglII, EcoRV, SalI, SmaI, PstI, PvuII, SacI, XhoI, XbaI, HincII, ApaI, NcoI, KpnI, NarI y SphI en reacciones de 50 μl con el buffer apropiado y las condiciones necesarias para cada enzima siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Los productos de digestión fueron sometidas a electroforesis en geles de agarosa 0,8% teñidos con Bromuro de Etidio. Los geles fueron transferidos por capilaridad a filtros de nylon (HybondN, Amersham), prehibridados, hibridados y lavados como se describe en “Hibridación sobre filtros de DNA”. 3.17 Análisis de ligamiento genético. ta Se obtuvo DNA genómico (de 2 hojas) de 109 plantas F2 en estadio de 5 hoja. Las 109 plantas F2 provienen de la autofecundación de plantas F1 de un cruzamiento R-SV8 (resistente) x Gama-6 (susceptible). El DNA fue digerido con BamHI y analizado por la técnica de RFLPs. El patrón de RFLPs del clon TaRr16 se comparó con el fenotipo de reacción a la raza 66 de Puccinia recondita de cada planta F2. Dado que la infección con Materiales y métodos 25 royas es destructiva en plántulas susceptibles y la inoculación debe realizarse en estadio da de 2 hoja (lo cual dificultaría la obtención de DNA genómico para el análisis), el fenotipo de las plantas F2 se determinó analizando el fenotipo de reacción a roya de aproximadamente 20 plantas F3 provenientes de la autofecundación de cada una de las plantas F2. 3.18 Detección específica de los genes TaAPX. Para la detección específica de TaAPX-6A se realizaron reacciones de PCR a 50 ºC de temperatura de annealing con los oligonucleótidos 5´-GATCAGTGATCTAATGTTCT-3´ y 5´AATGATGAAAACTTAAGACA-3´ como primers específicos. La detección específica de TaAPX-6B se realizó con los oligonucleótidos 5´-GCATTCTTGACGTCTCTGGTC-3´ y 5´CATCTTGCATGCCGACCAAT-3´ como primers específicos a una temperatura de annealing de 65 ºC en la PCR. Para la detección específica de TaAPX-6D se usaron los oligonucleótidos 5´-GTGGTCCGACGAGTCTGTCT-3´ y 5´-TGCTCATCTTGCATGTCGAT-3´ como primers específicos en la PCR a 69 ºC de temperatura de annealing. 3.19 Expresión de proteínas recombinantes en E. coli. El plásmido “pGEM-T easy” conteniendo el cDNA TaAPX-6B fue digerido con EcoRI para liberar el inserto. El inserto se purificó de gel de agarosa y se subclonó en el sitio EcoRI del vector de expresión pTrcHis-C (Invitrogen®). Se uso el plásmido “pGEM-T easy” conteniendo el cDNA TaAPX-6B como templado en una reacción de PCR con los oligonucleótidos 5´GGAATTCCATATGAGGATCCGATGCATGGCGGCGT-3´ TCATTAGAATTCTCATTATTCTTGTAGGAGTATTTGGC-3´como y primers 55´ y 3´, respectivamente, para obtener una versión de TaAPX-6B sin la región hidrofóbica de anclado a membrana tilacoidal. El producto de PCR fue purificado y digerido con las enzimas BamHI (se introdujo en el diseño del primer 5´) y EcoRI (se introdujo en el diseño del primer 3´). El producto de digestión purificado de gel de agarosa se ligó en el sitio BamHI-EcoRI (marco de lectura +2) del vector pTrcHis-C. Se transformaron bacterias XL1Blue competentes por choque térmico. Los clones orientados en la posición correcta se identificaron por PCR y se cultivaron durante la noche a 37 ºC en medio líquido LB 200 mg/l de ampicilina. Se hizo una dilución 1:50 en medio líquido LB ampicilina fresco y se incubaron durante 2 h (OD=0,8 aprox.). Se indujo la producción de proteína recombinante con el agregado de IPTG 1mM final durante 4 h. Los pellets de bacterias se resuspendieron en 50 mM Tris-Cl (pH 7,6) y se sonicaron durante 30 segundos por tres veces a intervalos de 1 minuto en hielo. Los productos de lisis se centrifugaron y las fracciones solubles e insolubles se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida 12 % (29:1). Los geles se tiñeron con Coomasie Brillant Blue-250. Materiales y métodos 26 3.20 Medición de actividades enzimáticas. 3.20.1 Ascorbato Peroxidasa. Extracción: se cortaron y pesaron hojas frescas de plantas individuales de entre 100 mg y 200 mg de peso. Se colocaron dentro de tubos falcon de 15 ml y se molieron en nitrógeno líquido dentro con varilla de plástico. A la molienda se le agregaron 2 ml de BEAPX. Todos los procedimientos posteriores se realizaron a 4 ºC. Después de fundidas, las muestras se licuaron durante 1 minuto con un homogeneizador (T25-basic IKA Labortechnike). BEAPX : 50 mM MES/KOH (pH 7), 40 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1% (p/v) PVP, 1 mM Acido Ascórbico (AA). APX total: se agregó Triton X-100 (0,1% v/v) a las muestras para solubilizar membranas. Se invirtieron los tubos cabeza-cola durante 30 minutos. Se centrifugaron a 4500 x g durante 2 minutos. Se tomaron alicuotas del sobrenadante para medir la actividad APX foliar. tAPX: las muestras se centrifugaron a 4500 x g durante 2 minutos. El pellet se resuspendió en BEAPX y se le agregó Triton-X100. APX recombinante: los pellets de bacterias se resuspendieron en BEAPX y se lisaron por sonicación. Se centrifugaron a 20000 x g. Se separó el pellet del sobrenadante y se midió la actividad en ambos. Medición: Se tomaron 50 μl de proteínas en BEAPX y se agregaron a 950 μl de BMAPX. La actividad APX se siguió midiendo el descenso de la absorbancia específica del AA a 290 nm en un espectrofotómetro Beckmann DU-650 a 30 ºC en la fase lineal de la cinética durante 3 minutos. La autooxidación del AA en presencia de H 2O2 se descontó de los valores de actividad de las muestras. La actividad APX se calculó con un coeficiente de -1 -1 extinción de 2,8 mM cm . BMAPX : 50 mM KH 2PO 4/K 2HPO 4 buffer (pH 7), 500 μM AA, 0,1 mM H2O2. 3.20.2 Monodehidroascorbato Reductasa. Extracción: hojas frescas de plantas fueron molidas en morteros con buffer BE. Los homogenatos se filtraron a través de una malla de 20 mm y se centrifugaron a 12000 x g durante 10 minutos. La actividad enzimática se determinó en el sobrenadante. BE: 0,1 M Bicina (pH 7,5), 1 mM EDTA, 10 % glicerol, 4 mM cisteina e inhibidores de proteasas ( 25 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo y 2 mM leupeptina). Medición: Se siguió la oxidación del NADPH midiendo el decenso de la absorbancia a 340 nm durante 1 minuto en la fase constante de la pendiente. A 900 μl de buffer BMDHAR se le agregaron hasta 100 μl de homogenato (7 mg proteína/ml). La actividad MDHAR se -1 -1 calculó con un coeficiente de extinsión 6,2 mM mM cm para el NADPH cmBMDHAR : 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,15 mM NADPH, 0,5 mM glutatión oxidado (GSSG), 3 mM MgCl2. 3.20.3 Dehidroascorbato Reductasa. Extracción: Se utilizó el mismo procedimiento que para MDHAR. Materiales y métodos 27 Medición: la actividad DHAR se midió siguiendo el incremento de absorbancia a 265 nm producida por la formación de AA dependiente del consumo de GSH. A 900 μl de buffer BDHAR se le agregaron hasta 100 μl de homogenato (50-100 μg de proteína). La reacciones se iniciaron con el agregado de 1 mM DHA. La tasa de reducción no enzimática del DHA se resto de la actividad de las muestras. La actividad DHAR se calculó con un -1 -1 coeficiente de extinción 14 mM cm para el GSH. BDHAR : 0,1 M buffer fosfato (pH 6,2), 2 mM GSH. 3.20.4 Glutatión Reductasa Extracción: Se utilizó el mismo procedimiento que para MDHAR. Medición: la actividad GR se midió siguiendo la disminución de absorbancia a 340 nm producida por la oxidación del NADPH. A 900 μl de buffer BGR se le agregaron hasta 100 μl de homogenato (50-100 μg de proteína). La actividad GR se calculó con un coeficiente -1 -1 de extinción 6,2 mM mM cm para el NADPH. BGR: 50 mM Tris-ClH (pH 7,6), 0,15 mM NADPH, 0,5 mM GSSG y 3 mM MgCl2. 3.21 Fluorescencia de clorofila. Plantas cultivadas en diferentes irradiancias se sometieron a la obscuridad por 30 minutos de manera que todo el sistema de transporte de electrones estuviera oxidado al tiempo “0” del experimento. La medición de la fluorescencia en ese estado es el Fo. Al aplicar un pulso -2 -1 de luz saturante (3000 μmol de fotones m s ) de alta frecuencia (flash) se obtuvo el valor o de la fluorescencia máxima (F m= F m-Fo). Seguidamente se aplicó luz actínica (para hacer fotosíntesis) durante 5 minutos y sin apagarla se aplicó un nuevo pulso de luz saturante de donde se obtuvo F´ m (fluorescencia en la luz). Después del pico de fluorescencia F´ m los valores vuelven al punto anterior o de estado estacionario en presencia de luz actínica (Ft ). Seguidamente se apagó la luz actínica y se obtuvo el valor F´ o, que es el valor mínimo de fluorescencia. Después de apagada la luz actínica la fluorescencia sube levemente por un periodo corto de tiempo como resultado del transporte cíclico de electrones que vuelven desde el PSI. Los valores obtenidos se utilizaron para calcular los parámetros siguientes : qP : (F´m-Ft )/(F´m-F´o) o qNP : (F m-F´m)/ F´m PSII : (F´m-Ft )/F´m Fv/Fm : (Fm-Fo)/Fm Materiales y métodos 28 3.22 Asimilación de CO2. La incorporación de CO2 se midió con un analizador de gas infrarrojo Li-Cor Li-6250 en una -2 -1 cámara de asimilación de 1l, a 750 μmoles de fotones m s , 25 ºC y 340-360 partes por millón de CO2. 3.23 Carbonilación de proteínas 3.23.1 Extracción de proteínas. Las hojas se molieron en mortero con buffer de extracción SDS-PAGE (Tris-HCl 65mM, pH 6.8; SDS 2%; MeSH 5%; glycerol 5% ) más inhibidores de proteasas: fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) 40 ug/ml; leupeptina 0.5 ug/ml y pepstatina 0,7 ug/ml. 3.23.2 Derivatización. Los homogenatos de hojas fueron mezclados con un volumen de SDS 12 % y después con dos volúmenes de 20 mM dinitro-fenil-hydrazina disuelta en ácido trifluoro-acético 10 % (v/v). La mezcla se incubó durante 30 min. a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con el agregado de 1,5 volúmenes de 2M Tris/ glicerol 30 % (v/v). 3.23.3 Western blot. Las proteínas derivatizadas se sometieron a electroforesis en gel de SDS-PAGE al 12 % y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Los filtros se bloquearon con 5 % leche descremada en TBS-T (Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,02 % Tween 20) durante 30 min. Se cambio la solución de bloquéo y se le agregó el anticuerpo anti-DNP de conejo (Sigma). Se incubaron los filtros durante 1 h con el anticuerpo primario. Se lavaron los filtros dos veces durante 15 min. con TBS-T. Seguidamente se incubaron con el anticuerpo secundario (anticuerpo de oveja anti-IgG de conejo conjugado a horseradish peroxidase). Los filtros se lavaron tres veces durante 15 min. con TBS-T. Se incubaron los filtros con el reactivo quimioliminiscente (Renaissance TM, DuPont, Boston, MA) y se expusieron a placas radioautográficas X-OMAT-AR (Kodak). 3.34 Bibliotecas sustractivas de cDNA. Las bibliotecas se construyeron con el kit “CLONTECH PCR-select TM cDNA Subtraction Kit” (Cat. Nº K1804-1) a partir de RNA polyadenilado de hojas de plantas R-SV8 y S-SV8 después de 48 hs de inoculación con roya, siguiendo las instrucciones del fabricante. Resultados 29 4. Resultados 4.1 4.1.1 Clonado y caracterización de cDNAs expresados diferencialmente entre R-SV8 y S-SV8. mRNA-Differential Display La técnica de “mRNA-Differential-Display” (mRNA-DD) ha sido utilizada exitosamente para el clonado de genes diferencialmente expresados. Un requisito fundamental para la aplicación de esta metodología, es que las muestras cuya expresión de genes se desea comparar sean lo más idénticas posible. Las líneas de trigo utilizadas en esta tesis son isogénicas, con lo cual es altamente probable que cualquier diferencia en la expresión de sus genes tenga alguna relación con las diferencias fenotípicas analizadas. En el presente trabajo se comparó la expresión de genes en hojas de plantas R-SV8 y S-SV8 en dos condiciones: control e inoculadas con la raza 66 de P. recondita. La comparación de los controles entre la línea parental y la mutante, nos permite detectar diferencias de expresión génica en ausencia del patógeno y nos da un marco de referencia para observar la respuesta al patógeno de cada línea en la condición de inoculación. Las diferencias de expresión génica en las condiciones control entre ambas líneas podrían estar relacionadas con: a) una diferente predisposición a la interacción con el patógeno; b) el fenotipo de crecimiento reducido observado en las plantas mutantes que se manifiesta independientemente de la presencia o ausencia del patógeno. Las diferencias de expresión génica en las condiciones de inoculación entre ambas líneas, podrían estar relacionadas con una respuesta diferente al patógeno, que eventualmente podría ser decisiva para definir la interacción. Se hicieron reacciones de mRNA-DD usando 60 combinaciones de primers para las cuatro condiciones: R-SV8 control, R-SV8 inoculada, S-SV8 control y S-SV8 inoculada. Cada combinación produjo un promedio de 100 productos diferentes visualizados como bandas de distintas tamaños. Considerando que todos los productos corresponden a mRNAs de genes diferentes, se analizó en total la expresión de 6.000 genes. La uniformidad de expresión observada entre ambas líneas refleja su parentesco genético. Las pocas diferencias observadas en los geles de poliacrilamida correspondieron a genes expresados sólo en la línea R-SV8 48 h después de la inoculación con royas (Fig. 13-B, C, D y E), con la sola excepción de un producto que mostró expresión constitutiva en R-SV8 mientras que no se detectó en S-SV8 (Figura 13-A). No se detectaron bandas diferenciales en la línea SSV8, lo cual sugiere que no hay cambios cualitativos de expresión génica en la línea susceptible luego de la interacción con el patógeno. Aunque se observaron diferencias de intensidad (cuantitativas) de algunos productos entre las cuatro condiciones, dado que el mRNA-DD no es una técnica cuantitativa, esos productos no fueron considerados en el análisis posterior. De las 60 combinaciones de primers usados, 16 mostraron bandas diferenciales. Resultados 30 A B C D E 600 Figura 13. Perfiles representativos de expresión génica obtenidos con la técnica de mRNA Differential Display con el primer 3´T12 MC y diferentes primers decámeros 5´: (A) OPA-10 , (B) OPA-4, (C) OPA-6, ( D) OPA18 y (E) OPA-19. Las cuatro calles de cada combinación de primers corresponden de izquierda a derecha a: R-SV8 control, R-SV8 inoculado, S-SV8 control y S-SV8 inoculado, respectivamente. A la izquierda se indica el tamaño de los productos en pares de bases. Las bandas diferenciales estan indicadas con flechas. 500 400 300 200 100 Después del clonado y la secuenciación, se observó que muchas de las bandas diferenciales contenían más de una secuencia nucleotídica de cDNA. En 5 combinaciones de primers se observaron dos o tres bandas diferenciales a diferentes alturas del gel. Interesantemente, 3 de estas 5 combinaciones mostraron bandas diferenciales conteniendo cDNAs con la misma secuencia nucleotídica, producidas a partir del annealing del primer 5´ en el mismo sitio y el primer 3´ (T12MN) sobre diferentes sitios del mismo mRNA, lo cual sugiere que son productos diferencialmente expresados. De las 60 combinaciones de primers se obtuvieron 34 clones de cDNA de los cuales 19 no mostraron homología de secuencia de nucleótidos ni aminoácidos con ningún gen o proteína depositado en los bancos públicos de genes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Esta observación puede explicarse considerando que la técnica de mRNA-DD, debido a su diseño, produce principalmente cDNAs provenientes de extremos 3´ no traducidos (3´UTRs) de RNAs mensajeros. Las secuencias de nucleótidos de los cDNAs sin homología de secuencias se muestran en el Anexo. Sin embargo, 15 de los cDNA analizados mostraron homología de nucleótidos y aminoácidos con secuencias depositadas en los bancos de genes (Tabla 3). Resultados 31 Tabla 3. Análisis de las secuencias de los cDNA aislados. cDNAa Primer 5´ Tamaño del inserto (bp) Homologíab TaRr01 TaRr02 TaRr03 TaRr04 c OPA-6 OPA-6 OPA-6 OPA-18 377 491 491 228 TaRr05 TaRr06 TaRr07 TaRr08 TaRr09 c TaRr10 TaRr11 TaRr12 TaRr13 TaRr14 TaRr15 OPA-20 OPB-8 OPB-8 OPB-9 OPB-18 OPB-18 OPZ-1 OPZ-6 OPZ-7 OPZ-7 OPZ-7 436 187 165 386 229 410 487 279 394 368 371 Serin/Treonin-Kinasa de proteínas Proteína hipotética Deacetilasa de histonas Factor de elongación de la traducción cloroplástico Fosfoshikimato-1-Carboxivinil Transferasa Transcriptasa Reversa Proteína de 4kD del centro reacctivo del PSII Prolil-Hidroxilasa Mono-oxigenasa del citocromo p450 Cadena β de la ATP-sintetasa del cloroplasto + Bomba H ATPasa Proteína hipotética Proteína L1 de la subunidad 60s ribosomal d Proteína de choque térmico 70 cloroplástica Proteína del ciclo de división celular 48 d Valor (P) del e blastx 2 e-10 1 e-15 1 e-11 1 e-13 5 e-34 1 e-12 1 e-12 1 e-30 2 e-6 7 e-28 2 e-19 1 e-7 1 e-11 4 e-13 2 e-18 a Las secuencias de los cDNAs fueron comparadas con las secuencias depositadas en los bancos de genes mediante los programas BLASTX y BLASTP. Las secuencias de nucleótidos de estos cDNAs se encuentran disponibles en el GenBank con los números de acceso BI502693 al BI502707. b Independientemente del uso de BLASTX o BLASTP, cada cDNA traducido mostró homología con la misma proteína. Todos los cDNAs , excepto TaRr09, mostraron mayor homología usando el BLASTP que BLASTX. c cDNA amplificado a partir del primer decámero solamente. d Se identificaron dominios de actividad conservados usando BLASTP. e No se incluyeron los cDNAs con valores P menores a 1 e -5. 4.1.1.1 Análisis confirmatorios de la expresión diferencial de los genes clonados. Sin bien la metodología de mRNA-DD se ha aplicado con éxito en el análisis de la expresión diferencial de genes, un problema recurrente de esta metodología es la baja reproducibilidad de los resultados y la producción de un alto porcentaje de “falsos positivos”. Son considerados falsos positivos aquellos genes para los cuales se detecta expresión diferencial en los geles de mRNA-DD pero no se detecta expresión diferencial cuando son analizados por técnicas más reproducibles como la hibridación sobre filtros con RNA (Northern Blot) o sobre filtros con cDNA (Differential Screening). 4.1.1.1.1 Differential Screening. Se analizó la expresión de los genes correspondientes a los 34 cDNAs usando la metodología de Differential Screening. La mayoría de los genes no mostró diferencia de expresión entre las 4 condiciones analizadas, mientras que otros no fueron detectados, presumiblemente debido a sus bajos niveles de expresión. Considerando la redundancia de genes en el genoma hexaploide del trigo, es posible que exista expresión redundante de genes, lo cual dificultaría el seguimiento particular de la expresión de un gen debido a la hibridación cruzada con mRNAs transcriptos a partir de genes homólogos. Por tal motivo, el Resultados 32 “Differential Screening” podría no ser una técnica apropiada para validar en trigo los resultados obtenidos del mRNA-DD. 4.1.1.1.2 RT-PCR semicuantitativa. Dependiendo del grado de homología existente entre los genes con secuencias homólogas expresados, parece más factible diseñar primers específicos para un cDNA que conseguir por azar una región de cDNA específico para usar como sonda en experimentos de hibridación de ácidos nucléicos. Los primers específicos se pueden utilizar para analizar la expresión de un gen mediante la técnica de RT-PCR semicuantitativa. En tal sentido se diseñaron parejas de primers para los clones TaRr01, TaRr03, TaRr14 y TaRr15, por tener homología con genes de interés. Los experimentos de RT-PCR semicuantitativa no reprodujeron la expresión diferencial observada en los experimentos de mRNA-DD. Sin embargo, es posible que los primers utilizados no fueran específicos para el cDNA recuperado de los geles del mRNA-DD. En las reacciones de mRNA-DD, se utilizan oligonucleótidos decámeros de secuencia arbitraria como primers 5´. Aún después de conocer la secuencia nucleotídica de los cDNAs provenientes del mRNA-DD, es imposible diseñar primers específicos (de aprox. 20 nucleótidos) que contengan la secuencia del decámero arbitrario, ya que desconocemos la secuencia río arriba del primer 5´. Por tal motivo, es probable que muchas de las diferencias de expresión observadas en el mRNADD, no puedan ser reproducidas por RT-PCR semicuantitativa, a menos que por azar las secuencias de los primers utilizados sea tan específicas como el decámero arbitrario. Por lo tanto, al igual que la técnica de “Differencial Screening”, la RT-PCR semicuantitativa no sería óptima para reproducir los resultados obtenidos en el mRNA-DD. 4.1.2 Bibliotecas sustractivas. La técnica de hibridación sustractiva de cDNAs seguida de la amplificación por PCR permite detectar diferencias de expresión génica de tipo cuantitativa. Numerosos trabajos han reportado la aplicación exitosa de ésta técnica en el clonado de genes diferencialmente expresados entre dos muestras de diferentes tejidos o condiciones en plantas (Barbacar et al., 1997; Li et al., 1998). Considerando que el mRNA-DD no es una técnica diseñada para detectar diferencias cuantitativas, se construyeron dos bibliotecas sustractivas para identificar genes con diferentes niveles de expresión entre las plantas R-SV8 y S-SV8 en respuesta al patógeno. Una de las bibliotecas se construyó con cDNA de hojas de plantas R-SV8 después de 48 h de inoculación con roya, sustraída con cDNA de hojas de plantas S-SV8 después de 48 h de inoculación (biblioteca R). Por lo tanto, esta biblioteca debería estar enriquecida en cDNAs sobrerepresentados en las plantas resistentes inoculadas respecto de las susceptibles inoculadas. La otra biblioteca se construyó sustrayendo el cDNA de S-SV8 inoculada con cDNA de R-SV8 inoculada, con lo cual debería estar enriquecida en cDNAs Resultados 33 sobrerepresentados en el “pool” de cDNAs de las plantas susceptibles respecto de las resistentes (biblioteca S). Uno de los cDNAs secuenciados al azar de la biblioteca B, tiene homología con el gen Lls1 de maíz, que ha sido reportado como un supresor de muerte celular programada. La regulación de la muerte celular programada (PCD) de las plantas en respuesta a patógenos, implica cambios en la expresión de genes que se coordinan para producir el resultado final (Piffanelli et al., 2002). Varios de los genes que se sobreexpresan en respuesta al patógeno han sido identificados como reguladores positivos de la HR, mientras que otros se han considerado reguladores negativos (Shirasu and Schulze-Lefert, 2000). La susceptibilidad a roya de las plantas mutantes podría deberse a una regulación alterada de este tipo de genes, como por ejemplo la sobreexpresión de reguladores negativos (supresores) o la subexpresión de reguladores positivos de la HR (estimuladores), de manera que estuvieran impedidas de responder al patógeno mediante la HR. La estrategia que hemos utilizado para la construcción de las bibliotecas de trigo nos permitirá identificar genes de ambas clases. Hasta el presente, se han obtenido y ordenado en placas de 96 pocillos 250 clones de cDNA de cada biblioteca que están siendo analizados por métodos de hibridación y secuenciación. Resultados preliminares indican que ambas bibliotecas contienen cDNAs diferentes, lo cual sugiere que la metodología de sustracción ha funcionado y que cada línea de plantas sobreexpresa o subexpresa genes diferentes. 4.2 4.2.1 Mapeo de los clones aislados del mRNA-DD. Mapeo físico. Las plantas utilizadas en esta tesis nos brindan una alternativa para continuar con la búsqueda de genes involucrados en la determinación de las diferencias fenotípicas observadas entre ambas líneas. Comparando los patrones de hibridación sobre DNA genómico (Southern) producidos por la hibridación con cada uno de los cDNAs, podemos establecer si alguno de los cDNAs corresponde a genes delecionados en el genoma de la línea mutante, o sea, genes que mapean físicamente en la región telomérica del cromosoma 6BL. Aún cuando la sonda reconozca varios genes con alto grado de homología, es probable que los fragmentos de restricción que los contienen sean de tamaños diferentes lo cual nos permitirá detectar si alguno de los fragmentos que contienen al gen de interés está ausente en la línea mutante. La mayoría de los cDNAs mostraron tres bandas de hibridación en ambas líneas, lo cual sugiere que son genes de copia única. Se consideran genes de copia única aquellos que estan representados sólo una vez por cada genoma diploide, por lo cual suman tres genes por genoma hexaploide. Los clones TaRr01 y TaRr16, mostraron polimorfismos de restricción de DNA genómico (RFLPs). Mientras que el cDNA TaRr01 reveló tres bandas de hibridación en R-SV8, sólo se observaron dos bandas en S-SV8 (Fig. 14-A). El cDNA Resultados 34 TaRr16 reveló tres bandas de hibridación en la línea parental y sólo dos en la mutante (Fig. 14-B). Estos patrones de RFLPs indican que los genes TaRr01 y TaRr16 son genes de copia única y que una de las copias esta ausente en la línea mutante delecionada. Los RFLPs detectados para TaRr01 y TaRr16 podrán ser utilizados directamente como marcadores moleculares para mapear genéticamente los caracteres de interés. A B BamHI HindIII kpb R S R BamHI S R S HindIII R S Kpb 9,4 - Figura 14. Mapeo físico sobre DNA genómico. (A) Clone TaRr01. (B) Clon TaRr16. R: R-SV8; S: S-SV8. Las bandas ausentes en S-SV8 estan indicadas con flechas. 9,4 - 6,5 6,5 4,3 - 2,3 4,3 2Disponiendo de las secuencias de nucleótidos, se pueden diseñar parejas de primers para seguir la herencia de estos genes en experimentos de mapeo genético usando la PCR (SCARs) en lugar de la hibridación de Southern. Se utilizaron los primers diseñados para el cDNA TaRr01 en reacciones de PCR sobre DNA genómico. Se observó un producto de amplificación en ambas líneas, lo cual indica que al igual que en las reacciones de RT-PCR semicuantitativa, estos primers reconocen las dos copias de TaRr01 que no están delecionadas en S-SV8 (datos no mostrados). Para el clon TaRr16, se observó un producto de PCR en la línea parental pero no en la mutante, lo cual indica que estos primers son específicos para el gen correspondiente al clon TaRr16 delecionado en S-SV8 (Fig. 15), y que por lo tanto localizado en la región telomérica del cromosoma 6BL. B R S producto Figura 15. PCR sobre DNA genómico con primers específicos para el clon TaRr16. B: blanco sin templado, R: R-SV8, S: S-SV8. primers 4.2.1.1 Análisis de la expresión de TaRr16. En el análisis de expresión realizado previamente mediante la técnica de “Differential Screening” no se detectó la expresión de TaRr16. Considerando su bajo nivel de expresión, se purificó mRNA de las cuatro condiciones analizadas en el mRNA-DD y se hicieron hibridaciones de Northern Blot sobre filtros de mRNA. El patrón de expresión Resultados 35 observado correspondió exactamente al patrón observado en el mRNA-DD. TaRr16 tiene expresión constitutiva en R-SV8 mientras que no se detecta expresión en S-SV8 (Fig. 16). Dado que el análisis de RFLPs para TaRr16 reveló la presencia de dos genes en la línea mutante es probable que los dos genes remanentes no sean lo suficientemente activos para ser detectados por hibridaciones de Northern Blot. R S TaRr16 Figura 16. Expresión del clon TaRr16. De izquierda a derecha: R-SV8 control, R-SV8 inoculada, S-SV8 control y S-SV8 inoculada, respectivamente. Actina 4.2.2 Análisis de ligamiento genético entre los marcadores TaRr01, TaRr16 y el gen de resistencia a roya. El análisis de ligamiento genético nos permite obtener información de las distancias físicas existentes entre dos o más marcadores y el o los genes responsables de un fenotipo. Ya que la transformación genética de trigo es muy dificultosa, el análisis de ligamiento genético es una alternativa para determinar la concordancia entre un fenotipo y un gen. Para realizar un análisis de ligamiento usando marcadores moleculares, se necesitan plantas que difieran en el fenotipo de interés y que sean polimórficas para los marcadores utilizados. En este caso, los marcadores disponibles fueron los RFLPs generados por los clones TaRr01 y TaRr16. Las plantas S-SV8 no pueden utilizarse en los análisis de ligamiento de genes localizados sobre la región telomérica del cromosoma 6BL, ya que esa región cromosómica esta ausente en estas plantas y por lo tanto nunca podríamos observar eventos de recombinación ni calcular distancias. Desafortunadamente, las únicas plantas disponibles con fenotipo "crecimiento reducido" son las S-SV8, lo cual impide el análisis de ligamiento genético entre los marcadores TaRr01, TaRr16 y este fenotipo. Una línea derivada de R-SV8 llamada Gama-6, es susceptible a la raza 66 de P. recondita y ha sido utilizada previamente para mapear genes en el cromosoma 6B. Un requisito para el análisis de ligamiento es disponer de marcadores moleculares polimórficos entre los genotipos a comparar. En el caso de TaRr01, no se detectaron polimorfismos entre R-SV8 y Gama-6 usados primers en PCRs sobre DNA genómico. En consecuencia, se ensayaron 18 enzimas de restricción sobre DNA genómico, pero tampoco se detectaron RFLPs (polimorfismos) entre R-SV8 y Gama-6, lo cual impidió el análisis de ligamiento con el gen de resistencia. En el caso de TaRr16, los primers utilizados no detectaron polimorfismos entre R-SV8 y Gama-6. Sin embargo, se detectaron RFLPs para TaRr16 con las enzimas EcoRI, HindIII y BamHI entre R-SV8 y Gama-6 para la copia de TaRr16 localizada en la región telomérica del cromosoma 6BL (Fig. 17). Se Resultados 36 analizaron 109 plantas F2 provenientes de la autofecundación de plantas F1 obtenidas de un cruzamiento entre R-SV8 y Gama-6. Se observó un 100% de co-segregación entre el patrón de RFLPs de Gama-6 y el fenotipo de susceptibilidad. Del mismo modo, el patrón de RFLPs generado para R-SV8 segregó completamente ligado al fenotipo de resistencia a roya, lo cual indica que el gen correspondiente al clon TaRr16, está en una posición cromosómica próxima al locus Lr3. A B Gama-6 Suceptible X BamHI R-SV8 Resistente G R S Parentales Cruzamiento Suceptibles 9,4 - 6,5 - F1 4,3 Autofecundación Suceptibles F2 Suceptibles Resistentes 2,3 2,0 - Figura 17. Mapeo genético del clon TaRr16. (A) Esquema del cruzamientos realizado para el mapeo del clon TaRr16. (B) Polimorfismo entre R-SV8 y Gama-6 utilizado para el mapeo. G: Gama-6, R: R-SV8, S: S-SV8. Las flechas indican la posición de la banda ausente en S-SV8 y polimorfica en Gama-6. 4.2.2.1 Obtención del cDNA completo correspondiente al clon TaRr16. La secuencia de nucleótidos del clon TaRr16 no reveló homología con ninguna secuencia disponible en los bancos de genes o proteínas. Mediante la técnica de amplificación rápida de extremos 5´ de moléculas de cDNA (5´RACE), se obtuvo un producto de 1253 nucleótidos. La secuenciación de este producto reveló que el clon TaRr16 corresponde al extremo 3´UTR de un mensajero que codifica para una enzima con actividad Ascorbato Peroxidasa anclada a la membrana tilacoidal del cloroplasto (tAPX), que por su localización cromosómica se ha denominado TaAPX-6B (GenBank AF532972). El análisis de su secuencia predice un marco de lectura codificante para una proteína de 367 aminoácidos que tiene todas las características distintivas de las APX tilacoidales descriptas previamente Resultados 37 en dicotiledoneas, incluyendo aminoácidos del sitio activo y ancla de unión a membrana tilacoidal. Sin embargo, a diferencia de todas las tAPX clonadas de dicotiledoneas, TaAPX6B tiene una secuencia específica cercana al ancla hidrofóbica (Fig 18). * Trigo Arabidopsis Tabaco Zapallito Espinaca 50 50 50 50 50 Trigo Arabidopsis Tabaco Zapallito Espinaca 100 100 100 100 100 Trigo Arabidopsis Tabaco Zapallito Espinaca 150 150 150 150 150 Trigo Arabidopsis Tabaco Zapallito Espinaca * * 200 200 200 200 200 Trigo Arabidopsis Tabaco Zapallito Espinaca 250 250 250 250 250 Trigo Arabidopsis Tabaco Zapallito Espinaca 300 276 276 276 276 Trigo Arabidopsis Tabaco Zapallito Espinaca 344 318 323 323 323 Trigo Arabidopsis Tabaco Zapallito Espinaca 367 341 346 346 346 Figura 18. Comparación de la secuencia de aminoácidos de proteínas tAPX de dicotiledoneas y TaAPX-6B de trigo. La homología está indicada con cajas. Los asteriscos indican los residuos escenciales para la actividad enzimática . El dominio de anclado a membrana está subrayado. La identidad con otras tAPX va desde el 70 % al 80 %. Cabe mencionar, que río arriba de la putativa M inicial de TaAPX-6B, el marco de lectura codifica para 7 aminoácidos. Esos 7 aminoácidos probablemente correspondan al péptido señal que lleva la proteína inmadura desde el citoplasma (donde se traduce) hasta el cloroplasto. La proteína madura descripta en dicotiledoneas comienza a la altura de la M considerada como inicial en TaAPX-6B. En bancos de “secuencias expresadas” de trigo (ESTs) se encontraron dos cDNAs (100% homólogos) correspondientes a TaAPX-6B que codifican para 30-60 aminoácidos río arriba de la M inicial de la proteína madura, pero ninguno de ellos contienen la M inicial del péptido señal. Las secuencias 5´de estos ESTs son ricas en pares de nucleótidos G y C, lo cual explicaría la dificultad para obtener moléculas completas de cDNA, debido a que la síntesis de cDNA se aborta prematuramente a consecuencia de las estructuras secundarias de alta energía que le impiden proseguir hasta el final del mRNA. Resultados 38 4.3 Análisis de la función fisiológica del gen TaAPX-6B en relación al fenotipo de crecimiento reducido de las plantas S-SV8. Considerando la función de las enzimas tAPX en la detoxificación de H2O2 en el cloroplasto, y teniendo en cuenta que el estrés oxidativo en el cloroplasto podría estar relacionado con el fenotipo de las plantas mutantes, se realizaron estudios tendientes a dilucidar el rol del gen TaAPX-6B en la reducción de crecimiento y productividad de la línea S-SV8. 4.3.1 Clonado de cDNAs homólogos a TaAPX-6B. Considerando la redundancia de secuencias genómicas en trigo, y sabiendo que probablemente las otras dos copias homologas a TaAPX-6B pueden expresarse, se aplicó la técnica de amplificación de extremos 3´de mensajeros (3´RACE) para clonar cDNAs relacionados con TaAPX-6B. Dado que las familias de genes relacionados suelen diferir mayoritariamente en la secuencia de sus 3´UTRs, se utilizó un primer 5´ posicionado sobre la M “inicial” de TaAPX-6B y un primer 3´posicionado sobre la cola de poliadeninas, lo cual nos permitió amplificar por PCR todos los cDNAs que comparten homología de secuencia con TaAPX-6B a nivel del primer 5´. Se obtuvieron dos cDNAs homólogos a TaAPX-6B, denominados TaAPX-6A (GenBank AF532973) y TaAPX-6D (AF532974 GenBank), que difieren mayoritariamente en sus 3´UTRs (Fig. 19). Las proteínas codificadas por estos cDNAs tienen una identidad mayor al 97 % respecto de TaAPX-6B. TaAPX-6B 48 TaAPX-6D 50 TaAPX-6A 41 TaAPX-6B 81 TaAPX-6D 83 TaAPX-6A 91 TaAPX-6B 93 TaAPX-6D 95 TaAPX-6A 141 TaAPX-6B 112 TaAPX-6D 114 TaAPX-6A 182 Figura 19. Comparación de la secuencia no traducidas de los cDNAs tAPX de trigo. La homología está indicada con cajas. 4.3.2 Localización cromosómica de los genes tAPX. Los estudios de mapeo físico y genético del clon TaRr16, revelaron que el gen correspondiente esta localizado sobre la región telomérica del cromosoma 6BL. El patrón de RFLPs generado por el cDNA TaAPX-6B coincide con el generado por el clon TaRr16 (Fig. 20-A). Lavados a alta concentración de sal (bajo rigor) revelaron la presencia de las bandas previamente observadas más tres bandas de menor intensidad (Fig. 20-B) en cada Resultados 39 línea, lo cual indica que ambas líneas tienen tres genes relacionados a los genes tAPX y que ninguno de ellos esta ausente en S-SV8. A B BamHI HindIII BamHI HindIII R R R R S S S S - 9,4 - Figura 20. Patrón de RFLDs del gen TaAPX-6B. (A) Hibridación sobre DNA genómico lavado con baja sal. (B) Hibridación sobre DNA genómico lavado con alta sal. Las flechas indican la copia ausentes en S-SV8. R: R-SV8. S: S-SV8. - 6,5 - - 4,3 - La localización cromosómica de TaAPX-6A y TaAPX-6D, se realizó usando primers específicos para detectar por PCR la presencia o ausencia de estos genes en líneas de trigo Nuli-Tetrasómicas. La línea Nuli6A-Tetra6D es una línea aneuploide que carece del cromosoma 6A, mientras que la Nuli6D-Tetra-6A carece del cromosoma 6D. Sobre el DNA genómico de R-SV8, las parejas de primers para los tres genes tAPX dieron producto de PCR. El producto de PCR correspondiente a la amplificación del gen TaAPX-6A no se detectó sobre el DNA genómico de la línea Nuli6A-Tetra6D. La misma situación se observó para el gen TaAPX-6D sobre el DNA genómico de la línea Nuli6D-Tetra6A, lo cual indica que los genes TaAPX-6A, TaAPX-6B y TaAPX-6D están localizados en el grupo 6 de cromosomas y por lo tanto son genes homeólogos (Fig. 21). B R 6A 6D TaAPX-6A Figura 21. Localización cromosómica de TaAPX-6A y TaAPX-6D. B: blanco sin templado. R: R-SV8. 6A: Nuli6A. 6B: Nuli6B. TaAPX-6B TaAPX-6D 4.3.3 Estudios de expresión de los genes tAPX. Dado que el gen TaAPX-6B esta ausente en S-SV8, se analizó la expresión de los otros dos genes para determinar si la deleción en la línea mutante tiene algún efecto deletéreo sobre la expresión de TaAPX-6A y TaAPX-6B. Se detectó la expresión de los dos genes en hojas de S-SV8, lo cual indica que la transcripción de estos genes no es afectada por la deleción en la línea mutante (Fig. 22-A). Se aisló RNA de diferentes órganos de las plantas R-SV8 para analizar la localización de la expresión de los tres genes. Se detectó la Resultados 40 expresión de los tres genes en órganos aéreos pero no en raíces. Mientras que la expresión de TaAPX-6B y TaAPX-6D se detectó en todos los órganos analizados, la expresión de TaAPX-6A no se detectó en los órganos reproductivos ni en las vainas foliares (Fig. 22-B). A R C B S C A G Ra P V L Ro TaAPX-6A TaAPX-6B TaAPX-6D actina Figura 22. Expresion de los genes TaAPXs. (A) Detección de la expresión de los genes tAPX en hojas de plantas R-SV8 (R) y S-SV8 (S) . (B) Localización de la expresión de los genes tAPX en plantas R-SV8; C: control sin templado; A: antera; G: gineceo; Ra: raquis floral; P: paleas y glumas; V: vaina foliar; L: lámina foliar; Ro: raiz. Estos resultados indican que TaAPX-6B y TaAPX-6D se expresan en forma solapada en todos los órganos aéreos, mientras que TaAPX-6A tiene una expresión más restringida. Esta distribución de la expresión de los tres genes coincide con los niveles de homología de sus 3´UTRs. 4.3.4 Genes tAPX en otras monocotiledoneas Dado que los cDNAs TaAPXs corresponden a los primeros genes tAPX aislados en monocotiledoneas, se analizó el número de copias y grado de homología entre los genes tAPX de otras especies del mismo grupo. Se usó TaAPX-6B como sonda en experimentos de Southern blot sobre DNA genómico de cebada, maíz y arroz. Se observó una banda principal de hibridación y varias de menor intensidad, lo cual sugiere que estas tres especies contienen un sólo gen tAPX (Fig. 23). A 9,4 6,5 - 4,3 2,3 - 2,0 - M C Figura 23. Análisis del número de copias de genes tAPX en monocotiledoneas. A: arroz; M: maiz; C: cebada. Resultados 41 4.3.5 Caracterización del fenotipo de "crecimiento reducido" de las plantas S-SV8. Las plantas S-SV8 cultivadas a campo o en invernadero, son más pequeñas y livianas que las plantas R-SV8 y producen una menor cantidad de semillas. Si bien este fenotipo fue registrado desde el momento de su aislamiento en la década de 1980, nunca se caracterizó previamente. Puesto que las enzimas APX son componentes importantes en la detoxificación de H 2O2, pareció razonable que el fenotipo de retardo de crecimiento pudiera tener alguna relación con la detoxificación de H2O2 en el cloroplasto. Para poner a prueba esta hipótesis, plantas R-SV8 y S-SV8 fueron cultivadas bajo diferentes irradiancias lumínicas que producen diferentes cantidades de H2O2. No se observaron diferencias significativas en la acumulación de peso fresco entre plantas cultivadas en la oscuridad, mientras que las plantas R-SV8 acumularon mayor peso fresco que las mutantes cultivadas en alta irradiancia (Fig. 24-A). No se observaron diferencias significativas en la acumulación de peso seco entre las plantas R-SV8 y S-SV8 cultivadas a una irradiancia de 200 μmoles de -2 -1 -2 -1 fotones m s . Sin embargo, a irradiancias medias (400 μmoles de fotones m s ) o altas -2 -1 (800 μmoles de fotones m s ), las plantas S-SV8 acumularon menos peso seco que las plantas R-SV8 (Fig. 24-B). Peso Fresco (mg) A Figura 24. Efecto diferencial de la intensidad lumínica sobre el crecimento de R-SV8 y S-SV8. (A) Acumulación de peso fresco en plantas cultivadas en alta irradiancia (HL) o en oscuridad (O). (B) Acumulación de peso seco en platas cultivadas a diferentes irradiancias. Las columnas representan la media (más el error estandar) de 10 plantas de cada línea en dos experimentos independientes . Las barras blancas corresponden a plantas R-SV8 y las negras a plantas S-SV8. Los asteriscos indican diferencias significativas entre plantas parentales y mutantes (p< 0,05). * HL O B Peso seco (mg) * 200 * 400 μmol fotones 800 m2 s1 Resultados 42 El área foliar de las plantas mutantes fue menor que el de las plantas parentales. Las plantas de ambas líneas emergieron y desarrollaron sus hojas al mismo tiempo, lo cual indica que no hay diferencia entre la edad ontogenética de ambas líneas. Sin embargo, las hojas de las plantas S-SV8 cultivadas en alta irradiancia se elongaron más lentamente y alcanzaron una longitud menor que las hojas de las plantas R-SV8, lo cual sugiere que el fenotipo de las plantas mutantes se debe a un problema de velocidad de crecimiento y no a un problema de desarrollo (Fig. 25-B). A * (cm2) Area foliar (cm2) Area foliar * 200 Elongación foliar (cm/día) (cm) Elongación foliar 800 μmol fotones m2 s1 B * 1° hoja 4.3.6 400 Figura 25. Efecto diferencial de la irradiancia lumínica sobre la expansión de la hoja. (A) Desarrollo de área foliar a distintas irradiancias. (B) Elongación de la primer y segunda hoja en plantas cultivadas en alta irradiancia. Las columnas representan la media (mas el error estandar) de 10 plantas de cada línea en dos experimentos independientes . Las barras blancas corresponden a plantas R-SV8 y las negras a plantas SSV8. Los asteriscos indican diferencias significativas entre plantas parentales y mutantes (p< 0,05). * 2° hoja Análisis de la expresión de los genes TaAPX en respuesta a la luz. Dado que el gen TaAPX-6B esta ausente en la línea S-SV8, se profundizó el análisis de la expresión de TaAPX-6B en las plantas R-SV8 con el propósito de establecer su participación en el fenotipo de “crecimiento reducido” observado en las plantas mutantes. Se analizó su expresión por RT-PCR semicuantitativa en plantas R-SV8 cultivadas en diferentes condiciones de luz. En plantas etioladas (cultivadas en ausencia de luz) se detectó una expresión muy baja, mientras que aumentó dos o cuatro veces en plantas -2 -1 cultivadas en baja (50-100 μmoles de fotones m s ) o alta irradiancia (700-1000 μmoles -2 -1 de fotones m s ), respectivamente (Fig. 26-A). Resultados 43 La expresión de los genes TaAPX-6A y TaAPX-6D fue 6 o 7 veces menor que la expresión del gen TaAPX-6B y sus niveles de mRNA no respondieron a las diferentes irradiancias lumínicas. A cDNA templado TaAPX-6B O Actina TaAPX-6B LL Actina TaAPX-6B Actina Figura 26. Expresión de TaAPX-6B en plantas R-SV8 cultivadas a diferetes irradiancias lumínicas. (A) Irradiancias no estresantes; en oscuridad (O), en baja irradiancia (LL) o en alta irradiancia (HL). (B) Estres por exceso de luz (EL) o aplicadión de Metil Viológeno (M). HL B TaAPX-6B EL Actina TaAPX-6B Actina _M Estudios previos en espinaca indican que el estrés oxidativo producido en el cloroplasto por la aplicación de Methyl Viologen (Paraquat) sobre las hojas, no modifica la expresión de los genes tAPX. En concordancia con esas observaciones, la expresión de TaAPX-6B no -2 -1 cambió respecto de la condición de luz inicial (200-400 μmoles m s ) después de 1 h, 2 h -2 -1 o 4 h de tratamiento con exceso de luz (1800 μmoles m s ) y paraquat (Fig. 26-B). Del mismo modo, la expresión de los genes TaAPX-6A y TaAPX-6D no fue afectada por estos tratamientos. Dado que el exceso de luz y el paraquat producen estrés oxidativo en el cloroplasto, estos resultados indican que los genesTaAPX no responde al estrés oxidativo al menos en una ventana temporal de 4 h. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que los tiempos requeridos para la modulación génica por este tipo de estrés sean mayores a 4 h. 4.3.7 Actividad enzimática de la proteína recombinante TaAPX-6B. Dos versiones recombinantes de la proteína madura TaAPX-6B se clonaron en el vector "pTrcHis". Una de las versiones contiene la región hidrofóbica que funciona como ancla a la membrana tilacoidal (rAPX-1), mientras que en la otra versión esta región fue delecionada Resultados 44 (rAPX-2). Dado que las tAPX descriptas previamente son hemoproteínas, se realizaron ensayos en cultivos réplica de E. coli en presencia o ausencia de Hemina (fuente de grupos hemo). La proteína rAPX-1 se recuperó de los cuerpos de inclusión, mientras que la rAPX-2 permaneció en estado soluble (Fig. 27). pTrcHis kDa 98 66 - P S rAPX-1 P S rAPX-2 P S 34 - * Figura 27. Localización de diferentes versiones recombinantes de la proteína TaAPX-6B sobreexpresada en E. coli. pTrcHis: plásmido control sin inserto; rAPX-1: TaAPX-6B recombinante; rAPX-2: TaAPX-6B recombinante sin el dominio de anclaje a la membrana tilacoidal . P: pellet; S: sobrenadante de la lisis. 18 - La actividad APX se detectó únicamente en el sobrenadante de la lísis proveniente de la sobreexpresión de rAPX-2 en presencia de Hemina, lo cual sugiere que TaAPX-6B, al igual que todas las APX, es una hemoproteína (Tabla 4). Tabla 4. Efecto de la hemina en la actividad de la TaAPX-6B recombinante. Los valores corresponden a la media de 3 mediciones de 2 experimentos endependientes. APX Activity (μmol/min-1/mg total protein-1) Clone pTrcHis rAPX-1 rAPX-2 pTrcHis rAPX-1 rAPX-2 Hemine + + + Pellet 0.008 (0.001) 0.003 (0.002) 0.002 (0.009) 0.004 (0.002) 0.005 (0.002) 0.007 (0.006) Supernatant 0.003 (0.002) 0.006 (0.001) 0.005 (0.002) 0.005 (0.003) 0.001 (0.002) 0.332 (0.025) rAPX activity (μmol/min-1/mg rAPX-2-1) N/D N/D N/D N/D N/D 26.425# Dado que la versión rAPX-2 es activa, resulta evidente que la región hidrofóbica carboxyterminal no es requerida para la actividad enzimática, lo cual concuerda con el hecho de que las APX de espinaca y zapallito localizadas en el estroma del cloroplasto, son idénticas a las isoformas tilacoidales pero carecen del ancla. Comparando la actividad de las proteínas recombinantes con las de las proteínas nativas purificadas, resulta evidente que las condiciones heterólogas de expresión en E. coli no son óptimas para la actividad APX. Esta especulación se ve reforzada por el hecho de que el suministro endógeno de grupos hemo por parte de E. coli no alcanza para producir una cantidad suficiente de enzima con actividad detectable. Resultados 45 4.3.8 Análisis de la actividad APX en plantas. La actividad “in vitro” de la proteína TaAPX-6B recombinante indica que el gen ausente en S-SV8 codifica una proteína que efectivamente participa en la detoxificación de H 2O2. Se midió la actividad APX en hojas de plantas parentales y mutantes cultivadas en diferentes condiciones para determinar si la ausencia de TaAPX-6B afecta la actividad APX de las plantas S-SV8. No se detectaron diferencias significativas en las actividades APX de plantas R-SV8 y S-2 SV8 cultivadas en ausencia de luz o a baja irradiancia (50-100 μmoles m s-1). Sin embargo, en plantas S-SV8 cultivadas en alta irradiancia (700-1000 μmoles m-2 s-1) se detectó un 15% menos de actividad APX que en las plantas parentales, lo cual indica que la ausencia de TaAPX-6B en S-SV8 tiene incidencia sobre la actividad APX foliar (Fig. 28A). A * B * Figura 28. Actividad APX en homogenatos de hojas. (A) Actividad APX foliar de plantas cultivadas en oscurridad (O), en baja irradiancia (LL) o en alta irradiancia (HL). (B) Actividad APX tilacoildal de plantas cualtivadas en alta irradiancia. Las columnas representan la media (mas el error estandar) de 10 plantas de cada línea en 3 experimentos independientes (actividad foliar) y 3 plantas de 2 experimentos independientes (actividad tilacoidal). Las barras blancas corresponden a plantas R-SV8 y las negras a plantas S-SV8. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las plantas parentales y mutantes (p< 0,05). Dado que TaAPX-6B codifica para una APX de membrana tilacoidal, se aislaron las fracciones insolubles de homogenatos de hojas conteniendo membranas y se midió la actividad. Se detectó un 40% menos de actividad APX en las plantas S-SV8 que en las R- Resultados 46 SV8 cultivadas en alta irradiancia, lo cual sugiere que TaAPX-6B se localiza en las membranas tilacoidales (Fig. 28-B). La menor actividad APX tilacoidal de las plantas S-SV8 indica además que las copias remanentes en el genoma de las plantas mutantes, si bien aportan actividad, no compensan la actividad tAPX perdida como consecuencia de la falta de TaAPX-6B. El tratamiento con paraquat o exceso de luz (EL) produce estrés oxidativo en el cloroplasto. -2 Plantas cultivadas a irradiancia media (200-400 μmoles m -1 s ) se sometieron a un -2 -1 tratamiento corto con paraquat y EL (1800 μmoles m s ) para analizar el efecto del estrés a corto plazo sobre la actividad APX. Después de 4 h de tratamiento con EL, las plantas SSV8 disminuyeron su actividad enzimática, mientras que las plantas R-SV8 no se vieron afectadas (Fig. 29). Mientras que la actividad APX foliar de las plantas R-SV8 disminuyó recién a las 4 h de tratamiento con MV, la actividad de las plantas S-SV8 se inhibió drásticamente después de 1 h de tratamiento. Actividad APX foliar (μmol/min/gFW) * * * Figura 29. Efecto del estrés oxidativo sobre la actividad APX foliar. Las columnas representan la media (mas el error estandar) de 10 plantas de cada línea en dos experimentos independientes . Las barras blancas corresponden a plantas sometidas a EL y las negras a EL+MV. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las plantas sometidas a EL y EL+ MV (p< 0,05). La inhibición de la actividad APX foliar de las plantas S-SV8 tratadas con EL, sugiere que las plantas mutantes son menos resistentes que las parentales al estrés oxidativo producido en el cloroplasto. Los porcentajes de inhibición sobre la actividad APX producidos sólo por EL o EL+MV son idénticos, lo cual sugiere que los componentes enzimáticos afectados en un caso y en otro son los mismos. Resultados 47 4.3.9 Contenido de ácido ascórbico y medición de las actividades enzimáticas del ciclo glutatión-ascórbico. Varias condiciones de estrés oxidativo que afectan la actividad APX producen cambios en las actividades de otras enzimas antioxidantes. Trabajos previos demuestran que las enzimas del ciclo glutatión-ascórbico incrementan sus actividades en condiciones de estrés. Recientemente se demostró que en espinaca el stress oxidativo en el cloroplasto disminuye la actividad APX debido a un descenso en la concentración de AA como consecuencia de la disminución de las actividades de las enzimas del ciclo glutatión-ascorbico encargadas de regenerar AA. No se detectaron diferencias entre R-SV8 y S-SV8 en el contenido de AA de las hojas. Tampoco se detectaron diferencias significativas en las actividades DHAR, MDHAR y GR, lo cual sugiere que el metabolismo del AA no esta afectado en las plantas mutantes (Tabla 5). Tabla 5. Contenido de AA y actividad de las enzimas del ciclo Glutatión-ascóbico. Contenido de AA y actividad de las enzimas del ciclo Glutatión-Ascórbico contenido AA Plantas (μmol g-1 d.wt.) DHAR MDHAR GR -1 -1 (nmol. mg protein . min ) R-SV8 16.9 (1.7) 193.4 (9.7) 91.5 (9.4) 77.0 (6) S-SV8 19.8 (0.8) 191.3 (8.1) 83.2 (2.7) 77.4 (6) Actividad de las enzimas Dihidroascorbato Reductasa (DHAR), Monodihidroascorbate Reductasa (MDHAR) y Glutatión Reductasa (GR) en hojas -2 -1 de plantas R-SV8 y S-SV8 cultivadas a 700-1000 μmol fotones m s (HL). Medias de 3 mediciones de 4 experimentos independentes. Entre paréntesis se muestra el error estandar. 4.3.10 Análisis del transporte de electrones y actividad fotosintética. Dado que el H 2O2 se produce en grandes cantidades en el sitio dador de electrones del PSI, es posible que algunos componentes del sistema de transporte de electrones este afectado por la menor actividad tAPX en las plantas mutantes. No se detectaron diferencias significativas en qNP entre las plantas R-SV8 y las S-SV8 cultivadas a 700-1000 -2 -1 μmoles de fotones m s . Sin embargo se detectaron diferencias significativas en φ PSII y qP, lo cual indica que las plantas mutantes transportan menos electrones que las parentales (Tabla 6). Resultados 48 Tabla 6. Actividad fotosintética medida como asimilación de CO2 , transporte de electrones y disipación térmica de energía. Fotosíntesis Plantas (μmol CO2 m-2 s-1) φPSII qP qNP R-SV8 36.4 (0.7) 0.41 (0.03) 0.56 (0.03) 0.30 (0.05) S-SV8 32.0 a (1,3) 0.32 a (0.02) 0.44 a (0.04) 0.36 (0.04) Actividad fotosintética (asimilación de C02), rendimiento cuántico del PSII (φPSII), "quenching" fotoquímico qP y no fotoquímico qNP de la fluorescencia de la clorofila en hojas de plantas R-2 -1 SV8 y S-SV8 cultivadas a 700-1000 μmol fotones m s (HL). Media de 10 mediciones (plantas) de 2 experimentos independientes. Entre paréntesis se muestra el error estándar. a Diferencias significativas (p<0.05). Además, se determinó que las diferencias en el transporte de electrones medidas como φ PSII se observan sólo a altas irradiancia, lo cual sugiere una relación entre la producción de H2O2 y la disminución en el transporte de electrones en la mutante (Tabla 7). Tabla 7. Rendimiento cuántico dependiente de la irradiancia. -2 -1 Rendimiento cuántico (μmol fotones m s ) Plantas 200 400 800 R-SV8 0.65 (0.01) 0.66 (0.02) 0.53 (0.04) S-SV8 0.64 (0.03) 0.62 (0.02) 0.47 a (0.04) Rendimiento cuántico del PSII (φPSII) en hojas de plantas R-SV8 y S-SV8. Las mediciones se hicieron en plantas de dos semanas cultivadas a 200, 400 u 800 -2 -1 μmol fotones m s . Medias de 8 mediciones (plantas) de 2 experimentos independientes. Entre paréntesis se muestra el error estándar. a Diferencias significativas (p<0.05). Para analizar la resistencia al estrés oxidativo de ambas líneas, se cultivaron plantas a una -2 -1 irradiancia de 700-1000 μmoles de fotones m s y se las sometió súbitamente a 1800 -2 μmoles m s-1. El parámetro Fv/Fm es afectado directamente por el fenómeno de fotoinhibición que sufre el PSII a consecuencia del estrés oxidativo, causado por un incremento súbito de irradiancia. En estas condiciones, el Fv/Fm disminuyó en ambas líneas, pero se observó un diferencia significativa en la disminución de las plantas mutantes respecto de las parentales, lo cual indica que S-SV8 es menos resistente al estrés oxidativo que las plastas R-SV8 (Tabla 8). Resultados 49 Tabla 8. Fotoinhibición medida como Fv/Fm Plantas HL EL R-SV8 0.819 (0.004) 0.652 (0.018) S-SV8 0.816 (0.004) 0.540 (0.030) a Mediciones de Fv /Fm en plantas R-SV8 y S-SV8. Plantas cultivadas a 700-1000 μmol fotones m -2 s-1 (HL) fueron -2 -1 expuestas a 1800 μmol fotones m s (EL) durante 4 h. Medias de 10 mediciones (plantas) de 2 experimentos independientes. Entre paréntesis se muestra el error estándar. a Diferencias significativas (p<0.05). Dado que el sitio dador de electrones del PSI se encuentra sobre el lado estromático de la membrana tilacoidal, el H2O2 disuelto en el stroma puede afectar seriamente la actividad de las enzimas del ciclo de Calvin. Si el H 2O2 no es detoxificado correctamente, puede inhibir las enzimas encargadas de asimilar CO2. La asimilación de CO2 fue significativamente menor en las plantas S-SV8 que en las R-SV8, lo cual sugiere que el H 2O2 en las plantas mutantes no es detoxificado en forma apropiada. Una alternativa a esta posibilidad es que la menor actividad fotosintética se deba al menor flujo de electrones de las plantas mutantes, lo cual deriva en un menor suministro de NADPH y ATP necesario para la fijación de CO2. 4.3.11 Análisis del daño oxidativo. En varias situaciones que producen estrés oxidativo, se observan niveles de carbonilación de proteínas de hasta 10 veces por encima de los valores normales. Dado que la menor asimilación de CO2 en las plantas mutantes podría ser consecuencia del daño oxidativo en el cloroplasto, se midieron los niveles de carbonilación de proteínas en ambas líneas de plantas. No se observaron diferencias entre los niveles de carbonilación, lo cual indica que las plantas S-SV8 no sufren un estrés oxidativo severo. Por lo tanto, la menor asimilación de CO 2 debe ser una consecuencia de la reducida actividad fotoquímica de las plantas mutantes. También cabe la posibilidad de que las plantas deficientes en actividad tAPX estén sometidas a un estrés oxidante local, que reduzca la transferencia de electrones y de esa manera disminuya la producción de ROS evitando un daño oxidativo masivo. Discusión 50 5. Discusión 5.1.1 La técnica de mRNA-DD aplicada al clonado de genes diferencialmente expresados en trigo y a la obtención simultánea de marcadores moleculares. 5.1.2 Eficiencia de la estrategia utilizada para la obtención de marcadores moleculares. La disponibilidad de marcadores moleculares para un carácter de interés agronómico como la resistencia a royas es de gran importancia para asistir planes de mejoramiento genético. El mRNA-DD ha permitido la obtención de dos marcadores moleculares para la región telomérica del cromosoma 6BL, hasta entonces desconocida. Considerando que la región delecionada en la línea S-SV8 representa el 0,5 % del genoma hexaploide (20% del cromosoma 6BL), y asumiendo que los genes de trigo están distribuidos homogeneamente en sus cromosomas, la chance de clonar por azar un cDNA cuyo locus se localice en esa región cromosómica es de 1 en 200 (0,005). La frecuencia observada en este trabajo es de un orden de magnitud mayor (0.058). Evidentemente la estrategia utilizada desvió fuertemente la búsqueda hacia los genes de interés. En un trabajo reciente, se comparó la expresión de genes entre dos líneas de trigo, una parental y una mutante delecionada en el cromosoma 5AL (0,5 % del genoma hexaploide), mediante el uso de la técnica de amplificación por PCR de fragmentos polimórficos de digestión de cDNA (cAFLP). Cuatro clones de los 27 analizados (0,148) mapearon sobre la deleción (Kojima et al., 2000). La mayor eficiencia del cAFLP respecto del mRNA-DD podría deberse a que el cAFLP es más reproducible y produce menor número de falsos positivos. Dado que las secuencias codificantes de proteínas están más conservadas que las regiones genómicas no codificantes, se postula que las probabilidades de encontrar diferencias entre dos genotipos casi idénticos son mayores si se buscan en el DNA genómico. Por otro lado, la ventaja obvia de las técnicas que analizan la expresión de genes es que una vez obtenido el polimorfismo se puede disponer inmediatamente de información sobre la posible función del gen correspondiente, puesto que los cDNAs obtenidos suelen ser secuencias codificantes. En un trabajo previo, usando 400 primers arbitrarios mediante la técnica de amplificación al azar de polimórfismos de DNA genómico (RAPDs) no se detectaron polimorfismos entre R-SV8 y S-SV8 (Sacco, F., resultados no publicados). Cada reacción de RAPDs produjo en promedio 6 productos de PCR, con lo cual se analizaron aproximadamente 2400 loci genómicos. En el presente trabajo, 60 combinaciones de primers permitieron analizar la expresión de 6000 genes. La mayor cantidad de productos obtenidos con el mRNA-DD es probable que sea la causa del éxito de esta técnica respecto de la de RAPDs. Dado que la mayoría de las técnicas para obtener marcadores moleculares tienen un fuerte componente estocástico en la base de su diseño, el problema en la obtención de polimorfismos debe ser estadístico. Discusión 51 5.1.2 Eficiencia de la estrategia aplicada al clonado de genes con expresión diferencial en trigo. En los últimos 20 años se han aportado pruebas que sugieren fuertemente que un mecanismo de evolución muy difundido en las plantas es la duplicación de su genoma y los reordenamientos cromosómicos a gran escala. Esta estrategia evolutiva produce una gran redundancia de genes. A. thaliana posee uno de los genomas más pequeños del reino vegetal y sin embargo el 65% de sus genes pertenece a familias multigénicas (Lin et al., 1999; Mayer et al., 1999). El trigo es un caso extremo de esta tendencia, lo cual lo convierte en una especie problemática para el clonado de genes específicamente involucrados en la producción de un fenotipo. De los 34 genes que mostraron expresión diferencial en los geles de mRNA-DD, solo se pudo confirmar la expresión diferencial de TaAPX-6B. Analizando la secuencia de nucleótidos de los cDNAs TaAPX-6A, TaAPX-6B y TaAPX-6D, resulta evidente que la expresión diferencial del gen TaAPX-6B pudo ser comprobada por PCR debido a la disponibilidad de primers específicos y a la baja expresión de los dos genes remanentes en la línea mutante. Si los primers diseñados sobre la secuencia del cDNA TaRr16 se hubieran apareado a una zona de alta homología entre los cDNAs de los tres genes TaAPX, y si los genes TaAPXs se expresaran en igual medida o hubiera efectos compensatorios por parte de TaAPX-6A y TaAPX-6D en S-SV8, no hubiera sido posible comprobar la expresión diferencial de TaAPX-6B. La homología de secuencias entre los cDNAs TaAPX es tan alta (mayor al 95%) que la probabilidad de diseñar por azar primers específicos para TaAPX-6B, es casi nula. Extendiendo este razonamiento a los decámeros arbitrarios usados en el mRNA-DD, la situación no parece ser muy diferente. Sin embargo, el cebado de la síntesis de DNA en las condiciones de PCR del mRNA-DD requiere sólo del apareamiento de los 6 nucleótidos del extremo 3´ del decámero. Por lo tanto, parece más probable encontrar por azar un primer decámero que se aparee a una región específica de un cDNA, que diseñar al azar una pareja de primers largos (21-25 nucleotidos) que reconozcan una región específica. Esto se ve claramente reflejado en el caso del cDNA TaRr01, que a pesar de estar ausente en la línea mutante, no se pudo confirmar su expresión diferencial. Se usaron dos parejas de primers diferentes para TaRr01 pero no se detectaron diferencias de nucleótidos entre las secuencias de los clones obtenidos por PCR sobre cDNA o DNA genómico de R-SV8 y S-SV8. Teniendo en cuenta estas consideraciones, es probable que los resultados obtenidos en el mRNA-DD no puedan ser facilmente reproducidos mediante experimentos de RT-PCR semicuantitativa. Siguiendo esta línea de razonamiento, también resulta evidente que las técnicas de hibridación de nucleótidos tienen menos chances aún de ser resolutivas respecto de la expresión diferencial de un cDNA específico. Sin embargo, se confirmó la expresión diferencial de TaAPX-6B, debido a que la expresión de las copias remanentes en la línea S-SV8 no fue detectada por Northern Blot usando TaRr16 como sonda. Discusión 52 5.1.3 Expresión diferencial de genes entre R-SV8 y S-SV8 en respuesta al patógeno. Numerosos artículos han reportado la inducción de genes en respuesta al ataque de patógenos (Benito et al., 1996; Bertinetti and Ugalde, 1996). Los cambios en la expresión de ciertos genes de trigo parecen ser esenciales para el destino de las interacciones con patógenos (Bull et al., 1992; Dudler et al., 1991). Los genes PR (pathogen response), que codifican para enzimas que hidrolizan compuestos de la pared de celular de hongos y bacterias o para metabolitos antimicrobianos, se inducen en respuesta a patógenos (Molina et al., 1999; Munch-Garthoff et al., 1997). Los genes que codifican las enzimas Fenilalamnina-Amonio-Liasa (PAL) y Chalcona-Sintetasa (CHS) entre otros involucrados en el metabolismo del ácido salicílico, también son componentes de la respuesta. En varias interacciones, los genes de enzimas antioxidantes como la Glutation-S-Transferasa (GST), la Lipooxigenasa (LOX), la Ascorbato Peroxidasa citosólica (cAPX), ect., son inducidos después del contacto primario entre la planta y el patógeno (Dudler et al., 1991) (Kolomiets, et al., 2000) (Mittler et al., 1998). En la mayoría de los casos, los mismos genes responden al patógeno tanto en las interacciones incompatibles como en las compatibles (Pritsch et al., 2000). Sin embargo, la respuesta de las plantas resistentes esmás rápida e intensa que la respuesta de las plantas susceptibles. Todos los genes que modificaron su expresión en respuesta a royas en este trabajo, fueron de la línea R-SV8. No se detectaron cambios de expresión en la línea S-SV8. En ninguna de las dos líneas se detectaron genes que repriman su expresión después de la exposición al patógeno. Ha sido reportado que los genes PR de trigo se inducen en respuesta a patógenos de una manera semejante a la observada en otras especies. Sin embargo, un trabajo reciente ha probado que la inoculación control (sin patógeno) también produce un aumento, aunque menor, en los niveles de estos mRNA. Debido a que la técnica de mRNA-DD no detecta diferencias cuantitativas de expresión génica, es probable que ambas líneas respondan al patógeno con diferentes niveles de expresión de varios genes entre los que podrían estar los PR. De hecho, la expresión de PR1 fue detectada en estos materiales con niveles de expresión semejante en las cuatro condiciones. De todas maneras, algunos de los cDNAs aislados codifican para proteínas involucradas en la resistencia a patógenos en otras especies: a) una Citocromo p450-Monooxigenasa de Arabidopsis thaliana esencial para la resistencia contra un patógeno fúngico (Zhou et al., + 1999); b) una ATP-Sintetasa acoplada a bomba de H involucrada en la respuesta a oidio de cebada y a diversos patógenos de tomate (Zhou et al., 2000); c) una Prolyl-Hidroxilasa de poroto que se induce en respuesta a la inoculación con un compuesto de la pared celular de un hongo patógeno (Bolwell et al., 1985); d) una Deacetilasa de Histonas de maíz, que es el blanco de una toxina producida por un patógeno fúngico (Brosch et al., 1995). Aunque la expresión diferencial de estos genes no fue reproducida por otros métodos, su homología con genes involucrados en la resistencia y/o respuesta a patógenos sugiere que podrían participar también en la interacción trigo-roya. Discusión 53 Aunque no se han obtenido cDNAs homólogos a genes de resistencia, el cDNA TaRr01 (aunque incompleto), tiene homología con kinasas de proteínas. Varios genes de resistencia a patógenos de diferentes especies codifican para proteínas con dominios kinasa involucradas en la fosforilación de otras proteínas integrantes de la cadena de transducción de señales (Hammond-Kosack and Jones, 1997). No se consiguió extender el cDNA TaRr01 mediante las técnicas de 5´RACE y 3´RACE, por lo cual se desconoce si existe homología con genes de resistencia por fuera del dominio kinasa. Tampoco se pudo confirmar su expresión diferencial y además no se obtuvieron RFLPs para mapear genéticamente a TaRr01. Sin embargo, el mapeo físico indica que el gen correspondiente esta localizado en la misma región cromosómica que el gen Lr3 de resistencia a la raza 66 de Puccinia recondita. Su localización cromosómica y su homología de secuencia, convierten a TaRr01 en un candidato interesante para futuros estudios. 5.1.4 Diferencias de expresión entre R-SV8 y S-SV8 en condiciones control Sólo uno de los cDNA aislados por mRNA-DD correspondió a un gen expresado diferencialmente entre las líneas parental y mutante en ausencia del patógeno. Se ha postulado en varios trabajos que los genes de resistencia a patógenos tienen expresión constitutiva debido a su rol en el censado del patógeno. De hecho, el gen de lino L6 que confiere resistencia a la roya de la hoja, tiene expresión constitutiva (Ayliffe et al., 1999). Por esta razón, las diferencias constitutivas de expresión entre ambas líneas podrían corresponder a genes de resistencia a royas. Otra posibilidad es que las diferencias constitutivas de expresión correspondan a genes involucrados en la producción del fenotipo de retraso de crecimiento en S-SV8, ya que este fenotipo es independiente de la inoculación con royas. Efectivamente, el cDNA TaRr16 resultó ser el 3´UTR del gen TaAPX6B posiblemente involucrado en el crecimiento reducido de las plantas S-SV8. 5.2 La ausencia de TaAPX-6B en las plantas mutantes S-SV8 produce una menor actividad fotosintética y una reducción en el crecimiento. Desde la década de 1980, numerosos trabajos bioquímicos han aportado un gran caudal de evidencias que indican que las chAPX tienen un rol esencial en la detoxificación del H2O2 producido durante la fotosíntesis (Asada, 1987; Nakano, 1981). Puesto que los cloroplastos carecen de la enzima CAT, las chAPX sería las principales enzimas detoxificantes del H 2O2 producido en esta organela. La transferencia de electrones desde el PSI al O2 le permite al sistema fotosintético disipar hasta un 30 % de la energía circulante (Asada, 1999). Sin embargo, este mecanismo de disipación de energía es muy peligroso ya que se generan grandes cantidades de ERO. Se postula que la función de las tAPX es permitir que este mecanismo de disipación de energía funcione normalmente sin producir Discusión 54 daño oxidativo. El flujo de electrones desde el PSI al O 2 se incrementa dramáticamente en plantas expuestas a diferentes condiciones de estrés, generando grandes cantidades de ERO, lo cual conduce al daño oxidativo si el poder antioxidante del cloroplasto es sobrepasado (Foyer, 1994). Recientemente se ha analizado la relevancia de las enzimas tAPX en condiciones normales de crecimiento o bajo estrés oxidativo usando plantas transgénicas. Los resultados obtenidos con plantas de algodón que sobreexpresan APX en el cloroplasto indican que las APX son esenciales para resistir el estrés oxidativo, mientras que plantas de tabaco que sobreexpresan CAT en el cloroplasto indican lo contrario (Miyagawa et al., 2000; Payton et al., 2001; Shikanai et al., 1998). La significancia fisiológica de estos resultados es dudosa ya que la sobreexpresión de enzimas antioxidantes puede modificar y/o enmascarar la actividad de las enzimas antioxidantes endógenas, como se ha demostrado en trabajos pioneros en esta materia (Gupta et al., 1993; Gupta et al., 1993). 5.2.1 El reducido transporte de electrones en el PSII y la menor actividad fotosintética de las plantas mutates puede ser atribuida a la ausencia de TaAPX-6B. Dado que la región distal del cromosoma 6BL puede contener varios genes, no se puede descartar la posibilidad de que otros genes ausentes en las plantas S-SV8 estén involucrados en la reducción del tamaño de estas plantas. Sin embargo, algunos análisis previos indican que las líneas R-SV8 y S-SV8 son casi idénticas. A pesar de la deleción, ambas línea no parecen tener grandes diferencias a nivel del contenido ni de la expresión de genes: a) no se han detectado polimorfismos de DNA genómico en 2,400 loci genómicos obtenidos por RAPDs (Sacco et. al, resultados no publicados); b) se analizó la expresión de 6000 genes y sólo se detectó la expresión diferencial del gene TaAPX-6B entre las dos líneas (Danna et al., 2002); c) el análisis de la expresión de TaAPX-6A y TaAPX-6D indica que ambos genes son expresados normalmente y de hecho contribuyen a la actividad tAPX remanente en las plantas mutantes; d) el análisis de las actividades enzimáticas MDHAR, DHAR y GR indica que las plantas S-SV8 no están experimentando un desequilibrio redox masivo. Estos datos sugieren que el fenotipo de reducción del tamaño de las plantas S-SV8 se debe a la ausencia de TaAPX-6B. 5.2.2 La redundancia funcional de las tAPXs de trigo facilitarían la sobrevida de las plantas mutantes. Las plantas S-SV8 son las primeras mutantes para genes tAPX descriptas hasta hoy, lo cual probablemente refleje el rol esencial que estas enzimas desempeñan. Varios cDNAs y genes, como así también las proteínas chAPX nativas de varias especies de plantas dicotiledoneas, han sido caracterizados molecular y bioquímicamente. La mayoría de estos estudios se han desarrollado en espinaca y zapallito, cuyos genomas contienen un sólo gen para chAPX a partir del cual las isoformas estromática y tilacoidal se Discusión 55 producen por la excisión alternativa del último exón del mRNA que codifica para el ancla a membrana tilacoidal (Ishikawa et al., 1997; Mano et al., 1997). El análisis de los genomas de cebada, arroz y maíz indica que también en estas monocotiledoneas existe una sola copia del gen tAPX. En arabidopsis la tAPX y la sAPX están codificadas por genes independientes (At1g77490 y At4g08390). Recientemente, una línea de arabidopsis interrumpida con T-DNA en el gen tAPX se ha depositado en el banco de líneas mutantes de Arabidopsis thaliana del Salk-Insititute de San Diego-California (http://signal.salk.edu/cgibin /tdnaexpress). A diferencia de estas especies, el trigo contiene 3 copias, como es de esperar para un gen de copia única en un genoma hexaploide. Ya que no se han detectado otros genes homólogos a TaAPX-6B ausentes en S-SV8, la diferencia de actividad tAPX entre las plantas mutantes y parentales debe corresponder a la contribución que TaAPX-6B hace al conjunto de enzimas con actividad APX en el tilacoide. Si existe alguna compensación por parte de los genes homeólogos TaAPX-6A y TaAPX-6D, no alcanza el 100% de actividad observada en las plantas R-SV8. Los estudios “in vitro” de la proteína TaAPX-6B recombinante demuestran que efectivamente TaAPX-6B codifica una proteína con actividad APX, lo cual aporta una prueba adicional de que la deficiencia de actividad tAPX en las plantas S-SV8 se debe a la ausencia de TaAPX-6B. Aunque TaAPX6A no se expresa en los órganos reproductivos y en las vainas de las hojas, TaAPX-6B y TaAPX-6D se expresan en forma solapada en todos los órganos aéreos. Esta redundancia de expresión se refleja en la actividad tAPX remanente de la línea mutante. Es probable que esta redundancia funcional facilite la supervivencia de las plantas S-SV8. La comparación de las tAPX de trigo con las proteínas homónimas de especies dicotiledoneas, revela la existencia de un alto porcentaje de identidad entre las tAPX de estos dos grandes grupos de plantas. Se ha propuesto que la región hidrofóbica del extremo carboxilo terminal de las tAPX de espinaca y zapallito no es necesaria para la actividad enzimática y funcionaría como dominio de anclado a la membrana tilacoidal (Ishikawa et al., 1997; Mano et al., 1997). Los estudios “in vitro” con la proteína TaAPX-6B recombinante coinciden con lo observado en dicotiledoneas. 5.2.3 La expresión de TaAPX-6B y la actividad foliar APX están reguladas por la irradiancia a la cual se cultivan las plantas. En un estudio previo en trigo se demostró que la actividad foliar APX de plantas cultivadas en alta irradiancia es mayor que la actividad de plantas cultivadas en baja irradiancia lumínica. Además, la actividad enzimática aumenta al trasferir las plantas desde condiciones de baja a alta irradiancia (Mishra et al., 1995). Sin embargo, no se disponía de información respecto de la regulación de los genes APX de trigo. Aunque en espinaca se demostró que la expresión de tAPX y los niveles de proteína no se corresponden con los cambios de actividad enzimática en situaciones de estrés lumínico, la expresión génica y actividad tAPX no fueron analizados en condiciones de luz no estresante (Miyagawa et al., 2000). En el trigo, el gen TaAPX-6B se induce en presencia de luz y además, sus niveles Discusión 56 de expresión en plantas cultivadas en luz normal están modulados por la irradiancia aplicada durante el cultivo. Notablemente, la expresión de TaAPX-6B y la actividad APX foliar están moduladas por la irradiancia de luz, lo cual sugiere que este gen podría ser un contribuyente importante de las diferencias de actividad APX observadas entre plantas de trigo cultivadas a diferentes irradiancias lumínicas. Contrariamente a lo observado en irradiancias de luz no estresante, la exposición de las plantas por períodos cortos de tiempo al estrés oxidante producido por MV o exceso de luz, no modifican la expresión de TaAPX-6B, lo cual concuerda con observaciones previas hechas en espinaca (Yoshimura et al., 2000). 5.2.4 La deficiencia en la actividad tAPX conduce a la inhibición masiva de la actividad APX foliar cuando las plantas son sometidas a un estrés súbito. En espinaca se ha demostrado que las chAPX son rápidamente inhibidas por el estrés oxidativo producido por el tratamiento con MV (Mano et al., 2001; Shikanai et al., 1998). En el presente trabajo se observó que el estrés producido por MV inhibe drásticamente la actividad APX foliar de ambas líneas de plantas, sin embargo las plantas mutantes son menos resistentes al estrés. El exceso de luz, aunque más lentamente, tienen el mismo efecto inhibitorio que el MV sobre las plantas S-SV8, mientras que la actividad APX aumentó con el exceso de luz en las plantas R-SV8. Una explicación para es observación, sería que la menor actividad tAPX de las plantas mutante fuese sobrepasada fácilmente por la explosión oxidante que tienen lugar en el sitio dador de electrones del PSI a consecuencia del tratamiento con MV o exceso de luz. En ese escenario, la concentración de H 2O2 se eleva rápidamente y supera la limitada capacidad antioxidante de la tAPX de las plantas S-SV8. Una vez ocurrido esto, la oxidación del resto de los componentes celulares no puede ser detenida por otras enzimas antioxidantes, con lo cual, la inhibición del 30% de la actividad APX foliar podría corresponder no sólo a la actividad tAPX sino a la inhibición de otras isoenzimas APX de otros compartimientos subcelulares. 5.2.5 El daño oxidativo sería evitado mediante la reducción del transporte de electrones con una penalización en el crecimiento en las plantas S-SV8. El PSI, a pesar de sermás resistente que el PSII a la inhibición mediada por luz, es muy sensible a las ERO generadas en su sitio reductor. En plantas de maíz, el estrés por MV produce una reducción en la cantidad de proteína psaA (una subunidad del PSI) mucho mayor que la reducción de RUBISCO, PEPcarboxilasa o que la proteína D1 del PSII (Kingston-Smith and Foyer, 2000). Por lo tanto, la inactivación del PSI mediada por las ERO puede reducir la tasa de re-oxidación de Q A, con el consecuente descenso en los valores de qP y de la actividad fotosintética de las plantas S-SV8 (Maxwell and Johnson, 2000). La reducción del transporte de electrones en las plantas mutantes depende de la irradiancia lumínica, lo cual sugiere que el funcionamiento del aparato fotosintético es Discusión 57 afectado cuando la formación de H2O2 en el sitio reductor del PSI supera la limitada actividad tAPX de las plantas mutantes. Además, el desarrollo de las hojas y la acumulación de biomasa de las plantas S-SV8 se ve afectada por el aumento de la irradiancia lumínica, lo cual sugiere que estas plantas son sensibles al aumento de ERO. La transferencia súbita de las plantas S-SV8 al exceso de luz, efectivamente revela que son más sensibles a la fotoinhibición que las plantas parentales. El estrés súbito producido por exceso de luz o MV, también revela la mayor sensibilidad al estrés oxidativo de las plantas S-SV8. La menor acumulación de biomasa sería una consecuencia de la menor actividad fotosintética de las plantas S-SV8, lo cual explicaría también su reducido tamaño y productividad. La sobreexpresión de SOD en cloroplastos de plantas transgénicas de maíz produce una mayor acumulación de materia seca y un aumento en el tamaño de las plantas transgénicas respecto de las salvajes, lo cual sugiere que un mayor poder antioxidante en el cloroplasto aumenta el crecimiento de las plantas y que a su vez una ineficiente detoxificación de ERO reduciría la acumulación de biomasa (Van Breusegem et al., 1999). El reducido transporte de electrones podría tener un efecto protector en las plantas mutantes debido a la menor transferencia de electrones al O2 y a su vez a la menor producción de ERO. De hecho, las plantas S-SV8 no parecen sufrir un estrés oxidativo masivo, ya que los niveles de carbonilación de proteínas (indicativos de estrés oxidativo) de estas plantas son iguales a los de las plantas parentales. Sin embargo, la menor actividad fotoquímica de las plantas S-SV8 estaría penalizada por una menor acumulación de biomasa y un reducido crecimiento y productividad. 5.2.5.1 Reducción del transporte de electrones de las plantas mutantes. Plantas R-SV8 cultivadas en baja irradiancia tienen un flujo limitado de electrones y una actividad tAPX apropiada para detoxificar el H2O2 producido a la salida del PSI. La producción de ATP y NADPH es proporcional al flujo de electrones utilizados en el transporte lineal (Fig. 30). Discusión 58 ATP NADPH H2O H2O2 PSI PSII O2- tAPX O2 - Transferencia de e Figura 30: Representación esquemática del transporte de electrones en plantas R-SV8 cultivadas en baja irradiancia. Cuando esas plantas son sometidas a una irradiancia mayor, aumenta el flujo lineal de electrones entre los fotosistemas y paralelamente aumenta la producción de ATP y NADPH y aumenta también la actividad tAPX con lo cual los niveles de H2O2 permanecen en valores normales (Fig. 31). ATP NADPH H2O H2O2 PSI - O2 PSII tAPX O2 Transferencia de e- Figura 31: Representación esquemática del transporte de electrones en plantas R-SV8 cultivadas en alta irradiancia. En cambio, cuando las plantas S-SV8 son sometidas a alta irradiancia, el flujo de electrones derivados hacia el O 2 aumenta pero la actividad tAPX no, lo cual deriva en la elevación transitoria de la concentración local de H2O2. El H2O2 en exceso actúa diminuyendo aún más la actividad tAPX y afectando componentes del sistema de transporte de electrones, posiblemente psaA, lo cual disminuye la reoxidación de Q A (Fig. 32). Discusión 59 H2O H2O2 PSI O2- PSII tAPX O2 Transferencia de e- Figura 32: Representación esquemática del transporte de electrones en plantas S-SV8 sometidas a alta irradiancia. En condiciones de crecimiento sin estrés, el rendimiento cuántico y la asimilación de CO 2 están relacionados directamente. Paralelamente a la reducción del rendimiento cuántico, las plantas S-SV8 muestran una reducción en la cantidad de centros PSII involucrados en el transporte de electrones (qP). Dado que el qP estima el estado redox del primer aceptor del PSII, Q A, el menor qP sería una consecuencia de la ineficiente re-oxidación de Q A, lo cual llevaría a la imposibilidad de transportar electrones. Al aumentar el “pool” de plastoquinona reducida, se activan procesos que reducen la entrada de electrones al PSII, tales como la migración de los complejos antena desde el PSII hacia el PSI o la degradación de proteínas del PSII (Anderson and Andersson, 1988; Aro et al., 1993; Escoubas et al., 1995). Por lo tanto, la reducción en la actividad fotosintética de las plantas mutantes debe ser una consecuencia de la reducción del transporte de electrones, y este a ATP su vez del daño oxidativo NADPH al PSI. El estrés oxidativo incipiente H2O2 PSI PSII O O2 2 tAPX pronto evitado mediante reducción del flujo es la de electrones hacia el PSI. Al disminuir el flujo de electrones derivado hacia el O2 se descenso Transferencia de e- produce de un la concentración de H2O2 (Fig. 33). Figura 33: Representación esquemática de la disminución del transporte de electrones en plantas S-SV8 sometidas a alta irradiancia. Conclusión 6. 60 Conclusiones. a) La técnica de mRNA-DD aplicada a dos líneas isogénicas de trigo resultó adecuada para la obtención de marcadores moleculares para el gen Lr3. b) El mRNA-DD es una técnica apropiada para identificar genes de respuesta a patógenos en trigo, aunque los resultados obtenidos son difíciles de reproducir por otras metodologías. c) La estrategia utilizada resultó exitosa para la identificación de genes involucrados en el fenotipo de "crecimiento reducido" de las plantas S-SV8. d) La línea S-SV8 es la primer mutante en un gen tAPX descripta hasta el presente. e) La expresión del gen TaAPX-6B, que codifica para una enzima con actividad ascorbato peroxidasa, es inducida y modulada por la luz. f) La plantas mutantes S-SV8 tienen un 40% menos de actividad tAPX que las parentales RSV8. g) La deficiente actividad tAPX de las plantas mutantes produce una reducción de la captación y transporte de electrones en el PSII, lo que se traduce en una menor actividad fotosintética. h) La reducción del tamaño y la productividad de las plantas mutantes es probable que sea una consecuencia de la menor actividad fotosintética. Anexo 61 7. Anexo. Secuencias sin homología en los bancos publicos de genes. Entre paréntesis se indica el oligonucleótido decámero utilizado en el mRNA-DD. Los asteriscos indican los clones que fueron recuperados de diferentes alturas del gel de poliacrilamide dependiendo del sitio de pegado del primer T12MC. TaRr16 (OPA10). GTGATCGCAGGATTGGCATTCTTGACGTCTCTGGTCGGGAACTAAGAGCGGTGCTCTGACG AGTCTGTTTTTTTTTCATCTTCTGTAATTAACCATTTTCCAGGGATTGGTCGGCATGCAAGAT GAGCATGTGAAACAAATGCAATGCTTTTGGGCAAAAAAAAAAAAAAA TaRr17 (OPA15) (*). TTCCGAACCCACGGCAAAAGCGATTTTGTCACTGCTTGAGAAGCTTTTACTTTCGGTGCTTG CTCTTGTGCGCGAAGGTGGGANAGGGACTTATCACATCATACATGGGCCTGTAGGTGTACN TATNACTGTTGTAGATATAAAGGGGCCTCTTGTCTGGAGGATGTACGCGGAANAAAGGTAAA ACTCATTAGTGTTGACGAGATGTNNAAGAAGTTGCTTTTCAAGGACTATTGTCTTTTCTTTATA ATTCACTAACCGCAATGCACGCCACAAAGACATNAATATCTTTTGACCACGGTGTCTGATGC AAAAAAAAAAAAAA TaRr18 (OPA16). AGCCAGCGAACATGCGTTGTGTAAATGTGTATCAACTATCAAGTACTAGCAGTATATACTGTA ATCGTGCATAATTGCTTATATACATGTGACTGTGTGAGTTGTGATGTTGGGTGTGTAGCATTC TTTTTGACAGTTATTATGAATAATATAAAGTGATTGTAATGTGCAAAAAAAAAAAAAA TaRr19 (OPA16). AGCCAGCGAACATGCGTTGTGTAAATGTGTATCAACTATCAAGTACTATNTCAGTATATACTG TAATCGTGCATAATTGCTTATATACATGTGACTGTGTGAGTTGTGATGTTGGGTGTGTAGCAT TCTTTTCGACNGTTATANGAATAATATAAAGTGGTTGCAAAANAAAAAAAAA TaRr20 (OPA16). AGCCAGCGAACCAAGACATAATTTTGAACGTTTGGTAGTATGTGAACTGGGTTTTGTATGGC TCATTAGGTTCTTCGCCCTGTGATTCAGAGTACCTCTTGTTGTCTGAGATATCATCTTGAATT TTCGTCGCCCTCTGGTGTGTTGCGCTGGATTGGATATTTGCAAAAAAAAAAAAAAAA TaRr21 (OPA16). AGCCAGCGAACAGGATATCACTGAAGCGGTAGTAGAGGAGATAGCCAGCGAACCTTGATCG ACATGGTCATCTAAACTTTTGTTCGTTAATCTTGATATCACTAGTTGTCTCTTTCTTGTGAACC AACAGACTATTGATATTACCTACGGTGACATGTTTTGGGCAAAAAAAAAAAAAAA TaRr22 (OPA18) (*). AGGTGACCGTCCAGGGTTTGCTAAATAAGGAACCGAAGCAGAGTGGTGTTATGACACCGGA GTTGCTTATTTTGGAAAGTTATGTCCTAACCTTTTTGGTGGGCANGTACTATGATGTTTGANT TTTATCAGGGGTTGCTTGTCACCTGTTATGCAAAGTACTATTTTGCTTGAACTCCATAATAAAT Anexo 62 CGGCATTTATGCATCTTGTATGCACATGCCANGTGTAATGAACTAGTAATACATTTCTTGTAT GCATCATGGTAGTATCACGCGCGAATGAGAGAGACAAATCCTGTGCAAAAAAAAAAAAAAA TaRr23 (OPA18). AGGTGACCGTTATTATACGACTCGGTGAGCCATGATGTACCTGTTGTGTTGGAAATAATGGA AACAACCAAATTGTCCGTATCCAAGTATATATGAGAACGGTTGGTTGTTTTTCCTATTTGCAG TACTCTAGTCGTACCGTGTATGTGGGTGTTAACTTATGATCTTGAGTCGGTTTGTATCTTCCG TGTAAGTTATGATAAGCAGTACTAGTTTCTACGTACATGCTATAAATGAAAAGGGAGTGGTTT TGCAAAAAAAAAAAAAAA TaRr24 (OPA18). AGGTGACCGTGTAAAGGGGCAAGATGTTAAGACGGAACTGTAGAGTACAGGCGCCTTGTGC CGCGACGACCTTGGATCAGGACTGACATGTGGACACTAACCTTGGGTGTTTTTGTGCCTAG GCTTGGTGACTGGTGAGCGANGTTTGCTGATGTTCTTGGTTTTTACGAGAGACTTTCTTGAG TGAAACTCCCGTGTTCCCGTGTATCTTCTTTGAACTGTTAGTTAAATGCCTAAAAATCGGTGT ACTGTGTGCAAAAAAAAAAAAA TaRr25 (OPA18). AGGTGACCGTCCGAAGAAGAAGTGGTCATTAGTGAGTGCGGGGAGCTTCCAGTGGTCTGAG TTTTATTTAGATGGCTATCACCTTCCATCTGCGCATCTTGATTTTGCTGTGGACTTGTTACTTT CTTTCTCCAAGTAGTTAGAGACCGCGCTGAGTTGAACTCGAGATTTCTACTCAGAGGCATAC GGCATTCATCAACTGTTCGACTGGAATAAGAATGTGATTGCTTTACTGAACCTGTTTTGTAGC AAAAAAAAAAAAAAA TaRr26(OPA19). GTTGCGATCCAGAAGAGGCTTGAGAGATGGAATACAATAAATATGGTTTTATGGACTATACTA CTGTCTGCTCTTGTTGGGTATTCACTATACCAGAAAAGACGTCATTAACAAGTCNCAAGATTG ACTCAAACAAACCACGCCAGGATTTTTCTTTATTTCCAGATGTTTTGGCATGGTTGATGAACC NAATCATTTGACAGTTTATTGATAGGTTAGTGCATATAAAATCATGGTGTTAGTTTCGGAGTT GACATGCAAAGTCNTNCNTNCCACAGGTNTNCTGTACTTTAGTTGCGANTGCTAATTGAAAA TAAAGAAGATGTTCGTTATACATANTGCTGTCAGANTTATTCTTGACATANCCTTTCTNCAAA GGGACANATGAACTGTGATTGTTTTCCTGAAGAAAANGGGGGCATTATTTGGCAAAAAAAAA AAAA TaRr27 (OPB4). GGACTGGAGTAAGTTAATCCCAGAGCCTCAAGGGAATATGATGGTCAGCTACAAGAGACNC CAGCTGCTAGGATAGCTTGCTCTATATATCATTTGCATGAAGANCACCGGCTTGCATGCTTG TGTTTGTATGGGTGCATCACTTATTACTTGTACTCGTGTATGTTTTTATGATTGTAATAATTTT CAGTAACCCTTGGAAAAAAAAAAAAA TaRr28 (OPB8). GTTTACACGGGGCGGGGTGAAGTGATCCTTCCACGGCGCCTTGGTTTGGCCTCCGTTTGAA TAAGAACGATGTGTGTGTATGTTATGATGCTGTGTGTATCAACGTGTGCGCCTAGCGCTTGT TTGTGGAGAGTCCGTATCATATTAGTATTATATTGNTTGGCTAGATATAATTTGTTTGTGTGTT GCGAACTTGCAATACAGACACAAATATTCCGNATGTAATGGCAAAAAAAAAAAAAAA TaRr29 (OPZ1). Anexo 63 TCTGTGCCACTGAAGACATCCTGGATGAAGTTGAGTACGTTCGTCGACTCAANATTGGGAGT AAGCGTAAATTTGATTCATGTGTTGAAGATAGCTCCTCAAGCCAGGGCATTGGTACTTCATCA ANTTTGACTATCCCGGGCCCTTTAAGTAAACTTCTGAAGGAAAATGTGACCAAGATAGAAGA ACTTATTGAGAAAGTACATAAAACTATTGAATCGGCAAGCCTGCAAAGCAACAATGGAAGTG ACAAACGTATAGCCACCTACTACNGCNAAAAAAANAAAAAAAAAA TaRr30 (OPZ6) (*). GTGCCGTTCAACATGTACATAAAAGCAGGATACGACATTGTTCAGACTGACAGTATCCTTGTT TGGCTGAGCCTCCAGAAGCGCAAGCACTTGATGCGCAAGGAATTACCGCAAGTTTCTGTTG GTAGTGATGTACAACCTTAGAATTTTGAGGGGCTGAACATGCCATANCACCATCAGGTAAAC ATAAGTTGAATCTTGTGTGTAAATCTTATGCTTCTAGTTAGCCCTAATTGACNTGTGCATATNT ACTACTGTATTCCCCNTGTCAACTGGGCAAAAAAAAAAAAAAA TaRr31 (OPZ7). CCAGGAGGACAAACAGGGCTGGGTGGTGAGATCAAAGGCTCCGTCCAAGAAACTGATCGA GTTGGGTGTTCGTTTCACCCCATTCGACAAGACTGTCAGGGAGACGGTGGATTGCTTAAGG AGCAAAGGGGAAATCTAGCCTGCNAACAAATGTACATTTGCAGGAATAAATTCTGCTGGAAA ACTGTTCGCCGTGCATANACATAAAGTGAATAAAGTTGAGTTGAATTACTATGTGGGGATGTT GTACAATGGCGCTTCACGGGTTTTTACNGTNATCCNAATTGGAATNANTCGCACTTTGTCTT GGGGGTGATATCCNTAATTTTCCTANTAAGGGCACTCNTCCTTGGATTGTCTTNAGGANATTT TAATGAAATTTTATGCTCTTTGCAAAAAAAAAAA TaRr32 (OPZ7). CCAGGAGGACAAAACCCACAGGGNATATGGTGCAGGAAATTACAATGGTGGGACCGGCGG TGCCTACAAAGGCAAAAGATGTTATGGCGTCCACTGTCAAAATGGTGGGACCGGCGGTGCC TACACTGGCAGAGGATGTTATGGCGTCCACTGTCAAAATGGTGGTTGTCACTGTTGACAATA AATATGGTATATATCTATATAAAATAAGGCTTGTNTTTGATCAGCTCCAGCACGGGCTGACTA NAAGGAAGTTTCTTCGCCAGCAATACNTATTTTTAAGGTGCAANTNTNTTATCTCGTNNTATG CACNATATNTNCTGGGATTCCANATGATGNTGACAACGGTTGTGTACTTGTTTACGANCTTAT ATGCATNAATTTCCAAGTCAGCTTTGCAAAAAAAAAAAAA TaRr33 (OPZ7). CCAGGAGGACAAAACCCACAGGGATATGGTGCAGGAAATTACAATGGTGGGACCGGCGGT GCCTACAAAGGCAAAAGATGTTATGGCGTCCACTGTCAAAATGGTGGGACCGGCGGTGCCT ACACTGGCAGAGGATGTTATGGCGTCCACTGTCAAAATGGTGGTTGTCACTGTTGACAATAA ATATGGTATATATCTATATAAAATAAGGCTTGTATTTGATCAGCTTCAGCACGGGCTGACTAA AAGGAAGTTTCTTCGCTAGCAATACATATATTAAGGTGCAAAAAAAAAAAAAAA TaRr34 (OPZ2). AGTTACCACAAACTGCAGATTATNTCCAAGTCATTCAAGAAAAGGTACAGGTNTCCCCTGAAT ATACAAGTACAACTCTAAATCTGAGAATAGAGCACATAACAAGTAGACAGACAGGCATCATG ATAAGCGCAATGCTCCAGTNTTGCAAACATGAWAGAANMWATGNGACCACCTAANGGTGGA WACTTGCAATCCTGAAGTAGTCACTCGCTGCTTCCAGGTGCGCCCAATATCAACCCGACCT CACAGGAGATGCAGAGCGGGATAAGCTCCTGCTCCGAGGGCTTCTGCTCACGGATTTTCCA GAAACCAATGAAACAGGAGACCGAGATCTTGATGGTGACATCCACATTTGTCATGCCAACCT CTTTGCATGTACACTTGCCCCATAAAACCATTGCCCTTCATCCTTCTCTATCCAGTTGTTAAT GCCAACCTCTTAGCTCCCGCAAAAAAAAAAAAA Bibliografía 64 8. Bibliografía. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D. J. (1997). 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