Universidad Veracruzana Memorias Foro Intrauniversitario de Investigación en Salud 2007 Universidad Veracruzana Memorias Foro Intrauniversitario de Investigación en Salud 2007 ISBN: 970-9939-02-5 Memorias Foro Intrauniversitario de Investigación en Salud 2007 Instituto de Salud Pública Universidad Veracruzana Primera edición, Xalapa, Ver. Se imprimió en los talleres de DOCUMASTER S.A de C.V Av. Coyoacán 1450 Bis Col. Del Valle CP. 03220 México DF. El contenido de los artículos es responsabilidad de los autores. La edición se basó en los trabajos originales proporcionados por ellos. Se admite la reproducción parcial o total de esta publicación con la condición de que sea mencionada la fuente. Correspondencia: Instituto de Salud Pública. Universidad Veracruzana. Av. Castelazo Ayala s/n. Col. Industrial Ánimas. C.P. 91190. Xalapa, Ver. Universidad Veracruzana Comité Evaluador 2007 Dr. Raúl Arias Lovillo Rector Dr. Ricardo Corzo Ramírez Secretario Académico Dr. Ramón Flores Lozano Secretario de la Rectoría Lic. Víctor Aguilar Pizarro Secretario de Administración y Finanzas Dr. Jesús Samuel Cruz Sánchez Director General de investigaciones Dr. Porfirio Carrillo Castilla Director General de Estudios de Posgrado Dr. Agustín Aguirre Pitalúa Director General del Área Académica de Ciencias de la Salud Mtra. Leticia Rodríguez Audirac Directora General de Apoyo al Desarrollo Académico Área Biomedicina Comité Organizador 2007 Alejandro Cuervo Vera Coordinación de Especialidades Médicas Enrique Hernández Guerson Instituto de Salud Pública María Del Carmen Soto Olivares Dirección General de Investigaciones Patricia Pavón León Instituto de Ciencias de la Salud Patricia Rosa Linda Trujillo Mariel Instituto de Medicina Forense Federico Roesch Dietlen Instituto de Investigaciones Médico-Biológicas María Cristina Ortiz León Instituto de Salud Pública Graciela Mendoza Margain Coordinación de Especialidades Médicas Daniel Reyna Méndez Coordinación de Especialidades Médicas Gustavo Adolfo Vargas Merino Instituto de Salud Pública Juan Santiago García Enrique Juárez Aguilar Fabio Alfredo García García Mario Caba Vinagre Roberto Zenteno Cuevas Área Clínica María Graciela Carrillo Toledo Jairo Carrasco Rivas Israel Castañeda Andrade Sonia Rojas Carrera Magdalena Domínguez Jesús Manuel Flores González Área Salud Pública Sandra Areli Saldaña Ibarra Gabriel Riande Juárez Edit Rodríguez Romero Cecilia Sofía Cortes Salazar María Del Pilar González Arroyo Evangelina Montes Villaseñor Comité Editorial Dra. Dulce María Cinta Loaiza Editor Dr. Jaime Morales Romero Co- Editor Mtra. Elsa Ladrón de Guevara Morales Mtra. Edit Rodríguez Romero Dra. Elizabeth Bonilla Loyo Mtro. Manuel Salvador Luzanía Valerio Administradora C.P. Angélica Tapia Vázquez Diseño Editorial Lic. María Elena López Vázquez Presentación 7 Capítulo I Biomedicina Ácido linoléico conjugado y síndrome metabólico II Membrana plasmática adipocitaria y acido linoleico conjugado (CLA) 11 19 Presencia de Trypanosoma Cruzi en localidades rurales del Municipio de Tezonapa; Veracruz 31 Actividad amebicida y anti-inflamatoria del extracto acuoso de Conyza Filaginoides Análisis de la interacción entre el receptor tipo toll y el virus de dengue 2 en monocitos humanos “Efecto de la Estrategia de Visita de Profesores en la Aptitud Clínica de Médicos Familiares” Densidad prostática del ARNm del receptor a estrógenos β en respuesta a la conducta sexual de la rata Análisis de los patrones de expresión de metaloproteasas de matriz y sus inhibidores en respuesta al activador farmacológico PMA en fibroblastos de ratón C3H10T½ en cultivo 39 47 61 69 79 Capítulo II Clínica Índice CPOD en embarazadas y no embarazadas adscritas a la UMF No. 19 87 Capítulo III Salud Pública Análisis de Cluster de Leucemia Aguda en niños de la ciudad de México en el 2006 99 Prevalencia de obesidad abdominal en adultos participantes al curso “Escuela sana” 107 “Incidencias de Hiperlipidemia y/o Hipertensión y su probable correlación con el IMC y Diabetes Mellitus 2 en personas que acuden al puesto de sangrado del hospital general Córdoba, Veracruz” 113 “Determinación de un patrón somatométrico propio de los recién nacidos sanos de término del Hospital Regional de Poza Rica SES VER en el periodo 20042006” 119 Colposcopía asistida por computadora: un enfoque temporal 125 . Presentación María Cristina Ortiz León Instituto de Salud Pública En el año 2007 se celebró el ”Primer Foro Intrauniversitario de Investigación en Salud” con los objetivos de reconocer, promover y difundir la investigación en el campo de la salud; así como contribuir al fortalecimiento y consolidación de la investigación al interior de la Universidad Veracruzana. La sede del evento fue la Unidad de Servicios Bibliotecarios y de Información <USBI-Xalapa> con video transmisión en las zonas restantes. Los días del 29 de noviembre al 1° de diciembre de 2007 Dirigido a docentes, investigadores y estudiantes de nivel de pregrado y posgrado del área de Ciencias de la Salud y de otras áreas que hubieran desarrollado trabajos de investigación directamente relacionados con la salud. La convocatoria se extendió a las cinco zonas que conforman la Universidad Veracruzana. Las áreas dentro del campo de la salud que se consideraron fueron: • Investigación Biomédica: Se incluían todas las investigaciones dirigidas a un mejor conocimiento de los mecanismos moleculares y celulares de funcionamiento del ser humano y de sus alteraciones en circunstancias patológicas. • Investigación Clínica: Dirigido a aquellos estudios sobre la eficacia de procedimientos preventivos, diagnósticos y terapéuticos, que incluya la participación de seres humanos. • Investigación en Salud Pública: Se consideraron aquellos trabajos caracterizados por mejorar, promover, proteger o restaurar la salud de la población por la acción colectiva y, que abarcaran alguna de las Funciones Esenciales de la Salud Pública. Se recibieron un total de 97 resúmenes, el 48% de éstos fueron del área de la Salud Pública. Vislumbrando un futuro prometedor, ya que el 42% de los trabajos recibidos fueron de estudiantes de licenciatura, quienes posiblemente se dediquen a la investigación en este campo. Participaron 17 evaluadores, los cuáles seleccionaron 24 trabajos para ser expuestos en modalidad oral, participando por ocho primeros lugares (en cada área convocada), los cuáles recibieron un premio en efectivo. Respecto de los trabajos que se recibieron, se pudo observar que los escenarios de investigación fueron sumamente diversos, tanto por los sitios como por las temáticas que se desarrollaron, así como por sus protagonistas. En cuanto a los sitios, fueron sujeto de estudio: comunidades, unidades médicas de primer nivel, hospitalarias y laboratorios, por solo mencionar algunos. Con referencia a los temas, se presentaron desde procesos educativos hacía personal médico, estudios experimentales que descubrieron diversas relaciones en virus o membranas, hasta el estudio de diversas técnicas de diagnóstico y tratamiento en seres humanos, entre otros. En relación a los protagonistas, fueron estudiantes que junto con docentes e investigadores empiezan a conformar grupos de investigación. De los 24 trabajos finalistas, se invitó a los autores a participar en la publicación del presente libro, de los cuáles 14 aceptaron esta invitación: Área de Biomedicina: · Ácido linoléico conjugado dietario y síndrome metabólico II · Membrana Plasmática Adipocitaria y CLA. · Presencia de Trypanosoma Cruzi en localidades rurales del municipio de Tezonapa, Veracruz. · Actividad Amebicida y Anti-inflamatoria del extracto acuoso de Conyza Filaginoides · Análisis de la interacción entre el receptor Tipo Toll y el virus de Dengue 2 en Monocitos Humanos · Efecto de la estrategia de visita de profesores en la aptitud clínica de los médicos familiares · Densidad prostática del ácido ribonucleico mensajero del receptor a estrógenos beta en respuesta a la conducta sexual de la rata · Análisis de los patrones de expresión de metaloproteasas de matriz y sus inhibidores en respuesta al activador farmacológico PMA en fibroblastos de ratón C3H10T1/2 en cultivo Área Clínica: · Índice CPOD en embarazadas y no embarazadas adscritas a la UMF no. 19, Banderilla, Ver. Área de Salud Pública: · Análisis de Cluster de Leucemia Aguda en niños de la ciudad de México en 2006. · Prevalencia de obesidad abdominal en adultos participantes al curso “Escuela Sana” · Incidencia de hiperlipidemia y/o hipertensión y su probable correlación con el IMC Y Diabetes Mellitus 2 en personas que acuden al puesto de sangrado del Hospital general Córdoba, Veracruz · “Determinación de un patrón somatométrico propio de los recién nacidos sanos de término del hospital regional de Poza Rica SESVER en el periodo 2004 - 2006” · Colposcopía asistida por computadora: un enfoque temporal. 7 Capítulo I Biomedicina Ácido linoléico conjugado y síndrome metabólico II Pulido, E.1, López, J.2, Hernández, G.3, Alexander, A.4, Soto, I.5, y García, H.6 1 Egresada. Facultad de Bioanálisis. Universidad Veracruzana 2 Técnico Histipatólogo. Facultad de Medicina Universidad Cristobal Colón 3 estudiante de Doctorado. UNIDA. Instituto Tecnológico de [email protected] 4 Técnico Académico. Facultad de Bioanálisis. Universidad Veracruzana. [email protected] 5 Técnico Académico. Facultad de Bioanálisis. Universidad Veracruzana. [email protected] 6 Profesor Investigador. UNIDA. Instituto Tecnológico de Veracruz. [email protected] RESUMEN 1. INTRODUCCIÓN El síndrome metabólico (SM) es un problema de salud que aparece de forma simultánea o secuencial en un mismo individuo, cuyas manifestaciones clínicas y metabólicas favorecen la intolerancia a los glúcidos, la disminución de colesterol HDL, el aumento de lipólisis y la resistencia a la insulina; esta última, propicia disfunción endotelial y conduce a la hipertensión arterial, a la vasoconstricción y a la formación de aterosclerosis. Se ha demostrado que el ácido linoléico conjugado (CLA), es un ácido graso de cadena larga poliinsaturada con propiedades benéficas en la salud al actuar como regulador metabólico con efectos hipocolesterolémicos, antiaterogénicos, anticarcinogénicos y antioxidantes. El objetivo de este estudio fue determinar los efectos histológicos del ácido linoléico conjugado dietario en aorta e hígado de ratas con SM. Se utilizaron 16 ratas Wistar macho espontáneamente hipertensas formando dos grupos, uno con una dieta de aceite de girasol 7.5%, y el otro con (CLA) 7.5%. El grupo testigo se integró por 10 ratas Kyoto Wistar machos alimentadas con una dieta rica en aceite de girasol 7.5%. Después de ocho semanas de experimentación los animales se sacrificaron y la aorta y el hígado se fijaron en formaldehído al 10 %, procesándose con las técnicas de H-E y de Aceite de Rojo Oleoso para lípidos. La tinción de H-E reveló en el tejido de la aorta del grupo de animales que recibieron la dieta de aceite de girasol una proliferación de fibras elásticas y de colágena en las capas íntima y media. La técnica de Aceite de Rojo oleoso evidenció células adiposas en la capa adventicia. En este mismo grupo, se evidenció fibrosis, engrosamiento del epitelio de la vena central hepática e hiperplasia hepatocitica y, con la tinción de aceite de Rojo oleoso, se observó ligera esteatosis. Estos hallazgos histológicos no se encontraron ni en el grupo de animales alimentados con CLA, ni en el grupo testigo. Se concluye que el (CLA) mejora la disfunción endotelial, reduce la esteatosis y la hiperplasia celular en ratas con SM. 1.1. Origen y causas del Síndrome Metabólico La evolución de la forma de vida de la raza humana cambió las condiciones de salud en nuestros antecesores, cuando se convirtieron de nómadas a sedentarios; de incivilizados a civilizados y de incultos a cultos. Los cambios se produjeron fundamentalmente por el sedentarismo, un exceso de comida y factores socioculturales se desarrollaron e implementaron con el tiempo; además una predisposición genética se hizo manifiesta al menos en los últimos cinco a 10 mil años1. La evidencia que han dejado los habitantes de las cavernas de esas épocas, permite apreciar en dibujos rupestres la existencia del problema de la obesidad. Posteriormente en épocas más recientes, en pinturas o esculturas se muestra como el exceso de comidas y bebidas, sobre todo en personajes económicamente pudientes desarrollan obesidad, y muertes prematuras1. Por ello, la obesidad es quizá el trastorno metabólico y nutricional más antiguo que se conoce en la historia de la humanidad. Los cambios del estilo de vida que promueven la escasa actividad física ocasiona un incremento de peso y depósito de grasa corporal, el cual, en la actualidad es considerado un factor de riesgo para la salud, tanto en la población de países industrializados como en los que se encuentran en desarrollo2. En nuestro país la ingesta calórica ha aumentado en los últimos 40 años. Este aumento obedece a un elevado consumo de grasas así como a la poca actividad física, que alcanza el 90%. No es de extrañar, por ello, que el 60% de nuestra población presente sobrepeso u obesidad lo que promueve un aumento en problemas de salud, tales como diabetes, hipertensión y dislipidemia3. El síndrome metabólico (SM) fue reconocido hace más de 80 años; en la literatura médica ha recibido diversas denominaciones a través del tiempo. En las primeras descripciones de este síndrome asociaban diversas situaciones clínicas, como la diabetes mellitus, 11 la hipertensión arterial, y la dislipidemia. Sin embargo, es hasta 1988 cuando Reaven4 establece que estos factores tenían que presentarse en un mismo individuo en forma de un síndrome que denominó “síndrome X”. Actualmente lo podemos definir como una condición patológica asociada a la resistencia a la insulina e hiperinsulinemia que presenta un alto riesgo de desarrollar diabetes mellitus tipo 2 y enfermedad cardiovascular aterosclerótica5 Figura 1. Colesterol HDL bajo < 40 mg/dL o < 1,03 mmol/L en hombres y < 50 mg/dL o < 1,4 mmol/L en mujeres Hipertensión arterial =130/=85 mmHg Hiperglucemia en ayuno =110mg/dL o 6,1 mmol/L La prevalencia del síndrome metabólico depende de la definición empleada para determinarla, así como de la edad, el sexo, el origen étnico y el estilo de vida. Cuando se emplean criterios semejantes a los de la OMS, la prevalencia del síndrome metabólico varía del 1,6 al 15 % dependiendo de la población estudiada y del rango de edad. En poblaciones de alto riesgo, donde un familiar o varios son diabéticos, la prevalencia aumenta considerablemente hasta el 50 %, alcanzando el 80 % en personas diabéticas y el 40 % en personas con intolerancia a la glucosa7. En México aunque existe una limitada información acerca de la prevalencia de este síndrome se ha logrado establecer por medio de la Encuesta Nacional de Enfermedades Crónicas8 que incluyó 14, 682 sujetos con edades entre 20 y 69 años, que cerca de 14 millones de individuos pueden ser catalogados como afectados por el síndrome metabólico. 1.2. Atención metabólico Recientemente, el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos, a través del III Panel de Tratamiento del Adulto (ATP IIl) del Programa Nacional de Educación en Colesterol (NCEP) presentó una tercera versión de las guías para el diagnóstico y atención de las dislipidemias, donde se considera al síndrome metabólico como una entidad separada y establece una definición clínica basada en los factores de riesgo (Tabla 1) que resulta de muy fácil aplicación tanto en estudios epidemiológicos como en la práctica clínica diaria, pues a diferencia de la definición del grupo de trabajo de la Organización Mundial para la Salud no necesita demostrarse directamente la resistencia a la insulina. DEFINICIÓN Obesidad abdominal Circunferencia de la cintura > 102 cm (40 pulg) en hombres y > 88 cm (35 pulg) en mujeres Triglicéridos altos del Síndrome La atención terapéutica del síndrome metabólico comprende dos fases íntimamente relacionadas: a) para la reducción de la obesidad, se contempla promover cambio en el estilo de vida saludables que se traducen en una alimentación apropiada asi como estimular la actividad física y b) un tratamiento para disminuir el riesgo cardiovascular de los pacientes con síndrome metabólico que de acuerdo con su evolución puede considerarse el uso de fármacos. Esto comprende un control de la hiperglicemia en los diabéticos y de la presión arterial en los hipertensos. Del mismo modo para el tratamiento de la dislipidemia actualmente se recurren a medidas no farmacológicas con dieta baja en carbohidratos y evitando bebidas alcohólicas, asi como el tabaquismo. Sin embargo, si no se logra la disminución de los triglicéridos se debe proponer una terapia combinada de fármacos con estricta vigilancia médica5. Generalmente el tratamiento farmacológico se inicia con estatinas, y de ser necesario puede combinarse con fibratos y derivados del ácido nicotínico7. Tabla 1. Identificación clínica del síndrome metabólico propuesta por el ATPIII6 FACTOR DE RIESGO terapéutica 1.3. Aspecto socioculturales de la alimentación México Analizando la evolución del síndrome metabólico en nuestro país se puede constatar que uno de los factores = 150 mg/dL o = 1,7 Mohs/L 12 asociados con un mayor riesgo de desarrollar este síndrome es el sobrepeso. Hasta principios y mediados del siglo pasado se consideraba a la desnutrición como una de las primeras cinco causas de mortalidad infantil9; aunado a esto, otros trabajos señalan que la obesidad en nuestro país se encuentra en franco ascenso ya que más de la mitad de la población tiene sobrepeso y más del 15 % son obesos, demostrando que esta tendencia se está acentuando entre los niños. Esto se constata con los datos de la Encuesta Nacional de Salud3, que registró que en mujeres de 20-59 años la prevalencia de sobrepeso y obesidad fue de 36% y 28% y en los hombres de mismo del mismo grupo etáreo fue de 41% y 19%. Una de las causas que permiten explicar el fenómeno de sobrepeso y obesidad en la población mexicana son los cambios demográficos, esto es que a principios del siglo XX la población rural del país era del 75 al 80% y la urbana era de tan solo un 20 a 25%. Pero en la mitad del mismo siglo la proporción se había invertido ya que sólo un 20 % de la población continuaba habitando en zonas rurales. Otros factores asociados a la presencia de sobrepeso y obesidad son los relacionados con cambios socioculturales, debido en gran medida, a la creciente incorporación de nuestro país a un modelo económico internacional, mismo que obliga a la población a adoptar un nuevo estilo de vida poco saludable, ya que se advierte una tendencia al sedentarismo y la adopción de patrones de alimentación basados en el consumo de productos de origen animal como fuente principal de proteína y productos industrializados ricos en grasas y azúcares refinados, lo que limita el consumo de alimentos con un aporte de fibra digestiva como los vegetales y las frutas10. Desde el punto de vista de Casanueva11 la dieta de los mexicanos es en promedio equilibrada El predominio de cereales y leguminosas, asi como el consumo abundantes frutas y verduras acompañada de pequeñas cantidades de alimentos de origen animal la hacen mas recomendable que la comida industrial, constituida principalmente por productos de origen animal, cereales refinados y productos energéticos. Sin embargo, actualmente existe en nuestra sociedad una tendencia a la promoción de un nuevo concepto de alimento y de dieta, fomentada principalmente por la economía consumista y por diferentes instrumentos publicitarios. Por último la creciente urbanización somete a los individuos a un ritmo de vida acelerado limitando la posibilidad de realizar actividades físicas que coadyuven a mejorar su salud y calidad de vida. cadenas hidrocarbonadas de entre cuatro y 36 carbonos. Su clasificación se realiza de acuerdo al número de carbonos y a la presencia o no de ligaduras entre cadenas hidrocarbonadas. En algunos ácidos grasos, la cadena se encuentra totalmente saturada, por lo que se denominan ácidos grasos saturados; o bien, pueden presentarse dobles ligaduras y se les llama ácidos grasos insaturados. Son ejemplos de ácidos grasos saturados el palmítico (16 átomos de C) y el esteárico (18 átomos de C) que suelen ser sólidos a temperatura ambiente. Los ácidos grasos insaturados los cuales tienen uno o varios enlaces dobles, denominándose poliinsaurados, están representados por el ácido oléico (18 átomos de C y un doble enlace) y el linoléico (18 átomos de C y dos dobles enlaces) suelen ser líquidos a temperatura ambiente. Los mamíferos son capaces de sintetizar sus propios ácidos grasos saturados y monosaturados, pero no los poliinsaturados, por lo que estos últimos suelen denominarse ácidos grasos esenciales o ácidos grasos dietarios esenciales. Este tipo de ácidos grasos incluyen a dos familias la familia n-6 cuyo precursor es el ácido linoléico (18:2 n-6) y la familia n-3, en donde el precursor es el ácido α linolénico (18:3 n-3)12. Los ácidos grasos dietarios de la familia n-6 se encuentran principalmente en las grasas vegetales como los aceites de maíz, girasol y soya; están presentes también en carne y pescados, pero en cantidades mínimas. Los ácidos grasos dietarios de la familia n-3 se encuentran en animales marinos con un elevado contenido de grasas13. 1.5.Características conjugado de ácido linoléico La mayoría de los ácidos grasos poliinsaturados de los tejidos animales tienden a distribuir sus dobles enlaces guardando una distancia de 3 carbonos entre dos dobles enlaces, existiendo un carbono intermedio que no participa en ningún doble enlace como por ejemplo es ácido linoléico. Sin embargo, en algunas circunstancias, asociado a procesos de hidrogenación de los ácidos grasos, estos dobles enlaces se pueden ubicar a una distancia de tan solo dos carbonos, de tal manera que existen cuatro carbonos consecutivos que participan en los dobles enlaces; a este tipo de doble enlace se le denomina conjugado. El ejemplo más claro de este tipo de ácido graso es el ácido linoléico conjugado (CLA)14, término que generalmente refiere a una mezcla posicional y geométrica conjugada de isómeros diénicos del ácido linoléico. Los dos isómeros de CLA más estudiados son cis-9, trans-11 y trans-10, cis-12; los cuales se producen en el rumen de los rumiantes por la biohidrogenación bacteriana de los ácidos linolénico y linoléico. Se puede encontrar en otros alimentos como por 1.4. Ácidos grasos Los constituyentes más abundantes de las grasas y los aceites son los ácidos grasos, ácidos carboxílicos con 13 ejemplo granos, forrajes y aceites de origen vegetal, sin embargo su cantidad es mínima15. de 23°C. Después de una semana de aclimatación los animales fueron divididos aleatoriamente en 3 grupos experimentales; de las 16 ratas Wistar macho hipertensas espontáneas (HSR) se formaron dos grupos. Al primer grupo de ratas hipertensas espontáneas se le administró una dieta de aceite de girasol 7.5%, y al segundo grupo se le ofreció una dieta con (CLA) 7.5%. El grupo testigo (KW) se integró por 10 ratas Kyoto Wistar machos alimentadas con una dieta en aceite de girasol 7.5%. Todos los animales recibieron la dieta y agua ad libitum durante un período de ocho semanas (Tabla 2). 1.6. Aspectos biológicos del CLA Las cualidades beneficiosas del CLA para la salud han sido atribuidas principalmente a dos de los sus isómeros: el cis9-trans 11 y el trans10-cis-12. La forma más común de analizar los efectos biológicos del CLA es utilizando los isómeros puros, aplicándolos a modelos in vitro (cultivo de células) o in vivo en animales ó en estudios clínicos en humanos16. La función biológica del CLA y sus beneficios para la salud datan desde los 80´s, cuando Ha y colaboradores17 observan que éste ácido inhibe el desarrollo de cáncer en la piel de ratones. Este descubrimiento da pauta para que en estudios posteriores se examine un efecto protector del CLA en cáncer, modulación del sistema inmune, aterosclerosis, asi como efectos antidiabéticos y antiobesidad. Siendo la obesidad y la diabetes dos de los factores de riesgo mas relevantes en el diagnóstico del síndrome metabólico, se han diseñado estudios en modelos animales que permiten analizar si el CLA ejerce algún cambio beneficio en la salud de ratas que manifiestan obesidad e hiperglicemia; sin embargo, se desconoce el efecto por el consumo de CLA en tejidos histológicos de ratas con síndrome metabólico. Por tanto el objetivo del presente estudio fue determinar los efectos histológicos del ácido linoléico conjugado dietario en riñón y encéfalo de ratas con síndrome metabólico. En base a los antecedentes se considera que el CLA dietario tiene efecto benéfico sobre los tejidos de la aorta e hígado en ratas con síndrome metabólico. Tabla 2. Descripción de la dieta administrada a los grupos experimentales 2.3. Procesamiento de las muestras Al término de las ocho semanas de administrar las diferentes dietas a los animales estos se sacrificaron por punción cardiaca con el propósito de recuperar todos los tejidos; la sangre se centrifugó a 1086xg por 10 minutos para separar el suero mismo que se dividió en alícuotas de 100µl, conservándose en tubos ependorff a -70°C. El hígado y la aorta se retiraron para fijarse en dos soluciones fijadoras; la mitad de los órganos de cada grupo se fijaron en formol neutro al 10% y la otra mitad se fijó en una solución formol 10% diluido en una solución al 2% de acetato de calcio. Los órganos fijados en formol neutro se incluyeron en parafina para obtener cortes de 4-6 micras con ayuda de un micrótomo Minot (American Optical), y posteriormente se tiñieron con la técnica de Hematoxilina – eosina. Con los hígados y las aortas conservados en formol 10% diluido en una solución al 2% de acetato de calcio se realizaron cortes (12-15 micras) por congelación en un criostato marca MICROM 505 y posteriormente se procesaron con la técnica histoquímica de Aceite de Rojo Oleoso, la cual es una técnica específica para lípidos19. La observación e interpretación de los cambios histológicos se realizó con un microscopio marca Olympus BX51 equipado con una cámara digital (Camedia C3040ZOOM, 2. METODOLOGÍA 2.1 Material Todos los solventes y reactivos químicos fueron grado analítico; los colorantes y reactivos se solicitaron a Sigma (Mexico, DF.). Diez ratas macho de la cepa KyotoWistar (KW) y 16 ratas macho de la cepa hipertensas espontáneas (SHR) junto con los ingredientes para la dieta de estos animales se solicitaron a Harlan Teklad (Madison, WI, USA). 2.2 Diseño experimental Los 26 animales se conservaron en condiciones de bioterio como lo describe la NOM. 062-ZOO-199918; se ubicaron en jaulas de aluminio individuales con un ciclo de luz obscuridad 12/12 hrs a una temperatura 14 Olympus America, Melville, NY). Cabe señalar que todas las imágenes se tomaron con un aumento de 10X y 50X. Figura 2. Efecto de diferentes dietas (Control, Aceite de girasol y CLA) (d) Aorta en el grupo testigo (KW); (e) evidencia de depósitos de lípido en la capa media(e), (m) en el grupo vegetal (AG) y (f) ausencia de lípidos en el endotelio (e) y capas media (m) y adventicia (a) en el grupo CLA. Aceite de Rojo Oleoso 50X. 3. RESULTADOS La tinción de H-E reveló en el tejido de la aorta del grupo de animales que recibieron la dieta de aceite de girasol una proliferación de fibras elásticas y de colágena en las capas del endotelio y media, como se puede apreciar en la Figura 1-b; Con la técnica de Aceite de Rojo oleoso se evidenció en la aorta de este mismo grupo de animales, depósito de lípidos en la capa adventicia, (Figura 2-e). En el tejido hepático del grupo alimentado con aceite de girasol, se evidenció inflamación lobulillar y portal, caracterizada por un infiltrado inflamatorio predominantemente de neutrófilos con algunos linfocitos, macrófagos y con hepatocitos de forma globosa, (Figura 3 h-i). Del mismo modo se observó fibrosis, engrosamiento del epitelio de la vena central hepática (esclerosis central), hiperplasia hepatocitica y esteatosis caracterizada por hepatocitos cargados de grasa, (Figura 4-l). Estos hallazgos histológicos no se evidenciaron ni en el grupo de animales alimentados con CLA, ni en el grupo testigo, como se aprecia en las imágenes correspondientes a este grupo de animales en las Figuras del 1- 4. d f Figura 1. Efecto de diferentes dietas (Control, Aceite de girasol y CLA) (a) Aorta en el grupo testigo (KW); (b) evidencia de fibrosis en las capas del endotelio y media(e), (m) en el grupo vegetal (AG) y (c) recuperación del endotelio (e) y capas media (m) y adventicia (a) en el grupo CLA. H-E 50X. a e Figura 3. Efecto de diferentes dietas (Control, Aceite de girasol y CLA) (g) vena porta (VP) y parénquima hepático normal en el grupo testigo (KW); (h) evidencia de infiltrado inflamatorio (II) y hepatocitos globosos (HG) y (i) esteatosis en el grupo vegetal (AG) (j) vena porta (VP) y recuperación del parénquima hepático en el grupo CLA. H-E 50X. g h i j b c 15 ácido poliinsaturado beneficia la funcionalidad celular y disminuye el estado de resistencia a la insulina22. Esta aseveración, permite suponer la ausencia de un proceso aterogénico y una recuperación de la aorta de los animales enfermos alimentados con CLA. Asimismo, Arzaba23 reportó en ratas hipertensas que el CLA provoca cambios estructurales que influyen en las propiedades fisicoquímicas de la membrana del adipocito mejorando su fluidez y viscosidad. Estos cambios estructurales de la membrana, también pudieron limitar la formación del ateroma, en los animales del grupo CLA, como se demuestra en las Figuras 1-c y 2-f. Aunado a lo anterior, se ha demostrado que el consumo de CLA dietario disminuye la presión arterial23, lo que sugiere que el CLA participa en la regulación de la presión arterial y que ello, repercute mejorando la disfunción endotelial. Por otro lado, en la patogenia observada en el parenquima hepático de los animales experimentales alimentados con aceite de girasol (Figura 3 hi) caracterizada por un infiltrado inflamatorio predominantemente de neutrófilo; se han propuesto como factores etiológicos, un aumento en la oxidación mitocontrial hepática de los ácidos grasos libres, asi como un aumento del estrés oxidativo; este último proceso, se caracteriza por secreción de las células inflamatorias presentes en el parénquima hepático de óxido nítrico que dilata la microvascularización y promueve la relajación del músculo liso modificando el “tono” vascular de los vasos sanguíneos que irrigan al hígado. Del mismo modo promueve la peroxidación lipídica de la membrana celular provocada principalmente por efecto de los radicales libres de oxígeno24. Otro factor etiológico es la resistencia a la insulina, fenómeno en el que se observa una disminución en la sensibilidad de la misma o bien, una disminución en la respuesta a la acción de esta hormona4. Los resultados obtenido por Riviello25, muestran que la administración dietaria de CLA normalizar los niveles de insulina lo que permite proponer un mecanismo alternativo para la disminución de niveles de triglicéridos, debido a que, al disminuir la insulina disminuye la esterificación de los ácidos grasos libres en triglicéridos en el hígado. Este fenómeno permite explicar la esteatosis en el tejido hepático de los animales que recibieron la dieta de aceite de girasol (Figuras 3-h i y 4-l). Del mismo modo, la presencia de lípidos en el citoplasma de los hepatocitos de los hígados del grupo alimentado con aceite de girasol, pudo deberse a cambios en la permeabilidad de la membrana plasmática, ya que si en su composición predominan los ácidos grasos saturados la permeabilidad es menor. Esto se ha logrado demostrar al comparar la composición de los ácidos grasos de la Figura 3. Efecto de diferentes dietas (Control, Aceite de girasol y CLA.) (k) vena porta (VP) y cordones hepáticos normales (CP) en el grupo testigo (KW); (l) evidencia de esteatosis por depósitos de lípidos (L) en el grupo vegetal (AG) (m) vena porta (VP), cordones hepáticos (CP) y recuperación del parénquima hepático en el grupo CLA. Aceite de Rojo Oleoso 50X. k l m 4. DISCUSIÓN Los cambios histológicas observados en la aorta de los animales del grupo de aceite de girasol (Figuras 1 y 2), coinciden con lo descrito por Libby y colaboradores20, quienes señalan que el crecimiento de tejido fibroso se debe a un exceso de partículas de LDL que se acumulan en la pared arterial promoviendo la diferenciación de los monocitos en macrófagos, y la proliferación de fibras de colágena, las cuales posteriormente, encapsularán a los macrófagos atrofiados favoreciendo los depósitos de grasa y la formación del ateroma. Se ha reconocido que las células endoteliales liberan óxido nítrico el cual, relaja las células musculares de las paredes de los vasos, permitiendo que la sangre fluya con mayor libertad21. Algunos lípidos como el ácido araquidónico, regulan y reducen el óxido nítrico propiciando un inadecuado tránsito de sustancias a través del endotelio; esto, puede explicar la presencia de los depósitos de grasa en el endotelio de la aorta de los animales alimentados con aceite de girasol (Figura 2-e). En años recientes se ha observado que la administración de grasas poliinsaturadas, como el CLA en la dieta de animales con SM mejora los parámetros bioquímicos del colesterol y triglicéridos, ya que este 16 membrana de adipocitos de grasa epididimal en ratas hipertensas espontáneas, a las que se les ofrecieron dos dietas diferentes, una con aceite de canola y otra a base de aceite de pescado rica en ácidos grasos omega 326; en los animales que recibieron esta dieta se observó un aumento en la composición de ácidos grasos poliinsaturados en la membrana plasmática de los adipocitos de la grasa epididimal, mejorándose su permeabilidad; además, la misma dieta permitió por un lado, normalizar la presión arterial y por otro, disminuir los niveles de ácidos grasos libres. En otro estudio23 se observó que el CLA también promovió un efecto similar sobre la composición de ácidos grasos en las membranas de células adiposas, mejorando con ello su permeabilidad y fluidez. Estos resultados permiten suponer que en las células del tejido hepático del grupo que recibió la dieta de CLA se promovió un efecto semejante, impidiendo con ello la formación de esteatosis Figuras 3-j y 4-m. En este mismo sentido, estudios recientes a nivel molecular establecen que existen reguladores de genes que pueden ser activados por ácidos grasos dietarios27, por lo que probablemente la ausencia de esteatosis en el parénquima hepático del grupo CLA, puedo deberse también a que genes reguladores lograron activarse ante la presencia de ácidos grasos poliinsaturados; sin embargo, es necesario continuar con futuras investigaciones que permitan demostrarlo. 6. Expert Panel on detection, evaluation and tretment on high blood cholesterol in adults:executive summary of the third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert panel on detection, evaluation and treatment on high blood cholesterol in adults 8 Adult Treatment Panel III) JAMA 2001; 285:2486-97. 7. 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Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio. México, D.F.: SAGDPA. Norma Oficial Mexicana: NOM-062-ZOO1999. 5. CONCLUSIÓN En el modelo animal con SM utilizado en este estudio se evidenció por medio del análisis histológico que la administración dietario del CLA mejora la disfunción endotelial, reduce la esteatosis y la hiperplasia celular en ratas con SM. REFERENCIAS 1. Quibrera, I. R. Concepto e historia del Síndrome Metabólico. En: Síndrome metabólico y enfermedad cardiovascular. Ed. Intersistemas. México D.F. 2004 p.1-6 2. Hernán, D.C. La obesidad: un desorden metabólico de alto riesgo para la salud. Colomb Med 2002; 33: 72-80 3. Encuesta Nacional de México (ENSA-2000).Secretaría de Salud, México, D.F. 4. Reaven GM 1988 Role of insulin resistance in human disease. Diabetes 37:1595–1607 5. Maíz, GA. El Síndrome metabólico y riesgo cardivascular. Boletín de Escuela de Medicina. 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Nutr Res; 22:817-824. 18 Membrana plasmática adipocitaria y acido linoleico conjugado (CLA) Arzaba Villalba A.1, Hernández Díaz G.2, Alexander Aguilera A.3, Soto Rodriguez I.4, García Galindo H.5 1,2,5 3 Instituto Tecnológico de Veracruz, Miguel Ángel de Quevedo 2779 Col. Formando Hogar, CP.91879, Veracruz, Ver. [email protected] Universidad Veracruzana, Facultad de Bioanálisis, Iturbide s/n esq. Carmen Serdán, Col. Centro CP. 91700, Veracruz, Ver. Escuela de Medicina, Universidad Cristobal Colón. Campus Calasanz, Veracruz, Ver. 4 Universidad Veracruzana, Facultad de Bioanálisis, Iturbide s/n esq. Carmen Serdán, Col. Centro CP. 91700, Veracruz, Ver. RESUMEN plasmática como biomarcador de cambios dietarios como dogma de la relación estructura-función de un organelo, en este caso, un modelo animal de Síndrome Metabólico, utilizando ratas hipertensas espontáneamente y el tejido adiposo epididimal como material biológico para la obtención de la membrana plasmática, la extracción de los ácidos grasos y su análisis por cromatografía de gases a partir de los cuales se establecieron las conclusiones pertinentes del presente estudio. El Síndrome Metabólico (SM) junto con sus componentes como la Hipertensión y la obesidad constituyen las primeras causas de muerte a nivel mundial. El fenómeno fisiopatológico que determina las manifestaciones clínicas del síndrome es la resistencia a la Insulina (RI), que aparece años antes del síndrome. Los mecanismos moleculares de la Resistencia a la Insulina se llevan a cabo a diferentes niveles celulares como son: la expresión génica, cascada de señalización y cambios en la composición bioquímica de la membrana plasmática de los tejidos bajo efectos dietarios. Los cambios en la composición de la membrana plasmática son utilizados como un biomarcador de efectos dietarios como tratamiento alternativo del síndrome tanto en animales como en humanos, esto se ha estudiado con el aporte de ácidos de origen marino y de oliva pero no del Ácido Linoléico Conjugado (CLA). En base a lo anterior el presente trabajo tiene como finalidad analizar el perfil de ácidos grasos de la membrana plasmática de adipocitos de ratas con SM bajo el efecto de CLA. Se obtuvieron cambios significativos en la composición lipídica de membrana a nivel de ácidos grasos y de manera particular el CLA en ratas alimentadas con el mismo; aportando y contribuyendo al conocimiento básico sobre los mecanismos moleculares de resistencia celular a la insulina. Los resultados anteriores derivan del trabajo de extracción de membrana plasmática de tejido adiposo epididimal, extracción de ácidos grasos y análisis por cromatografía de gases. 1.1 Síndrome Metabólico Un síndrome es el conjunto de síntomas y signos que en general se agrupan para definir un cuadro clínico o una enfermedad. El síndrome metabólico es un concepto clínico que se vincula fisiopatológicamente con hiperinsulinemia por resistencia a la insulina, y cuyas características clínicas se necesitan detallar ampliamente para poder entender la complejidad de este síndrome. El síndrome metabólico fue reconocido hace mas de 80 años en la literatura médica y ha recibido diversas denominaciones a través del tiempo1. Las primeras descripciones de la asociación existente entre diversas situaciones clínicas como la diabetes mellitus (DM), la hipertensión arterial (HTA) y la dislipidemia (DLP) datan de los años 20 del pasado siglo.2 Sin embargo, hace 15 años, Gerald Reaven describió la asociación entre hiperinsulinemia y enfermedad cardiovascular (ECV).3 Estos pacientes presentaban lo que denominó síndrome X, formado por un conjunto de alteraciones patológicas, destacando entre ellas la intolerancia a la glucosa y la diabetes mellitus tipo 2, hipertensión arterial y una dislipidemia caracterizada por hipertrigliceridemia y niveles bajos de colesterol de HDL (C-HDL)1. En los últimos años se han agregado otros atributos: obesidad, visceroabdominal, aumento de lipoproteínas LDL pequeñas y densas, hiperuricemia, aumento del factor inhibidor del plasminógeno (PAI-1) y del fibrinógeno, hiperandrogenismo y ovario poliquístico en mujeres en edad fértil, hígado graso con esteatosis no alcohólica, marcadores pro-inflamatorios y disfunción endotelial (Fig. 1).4, 5 INTRODUCCION En el presente trabajo de investigación se analizó la composición lipídica de membrana plasmática de adipocitos de ratas con síndrome metabólico bajo efecto del Ácido Linoléico Conjugado como posible mecanismo implicado en el desarrollo de resistencia celular a la insulina, dada la importancia de este fenómeno fisiopatológico en el desarrollo del Síndrome Metabólico. Se abordan los aspectos teóricos de la membrana 19 y factores asociados al estilo de vida, especialmente la sobrealimentación y la ausencia de actividad física; de forma que el exceso de grasa corporal (particularmente la abdominal) y la inactividad física favorecen el desarrollo de resistencia a la insulina, así mismo algunos individuos están genéticamente predispuestos a padecerla. 6,7 El interés por este síndrome esta dado fundamentalmente por su asociación con la disminución en la supervivencia, debido al aumento de el riesgo de diabetes, ataques cardiacos y enfermedad cerebrovascular.5 El incremento insidioso en los elementos del SM, obesidad, insulinorresistencia (IR) y dislipidemia, son los responsables de la actualmente considerada epidemia mundial de diabetes tipo 2.8,9 Recientemente, el Instituto Nacional de Salud de los EUA, a propósito del III Panel de Tratamiento del Adulto (ATP III) del Programa Nacional de Educación en Colesterol (NCEP) presentó una tercera versión de las guías para el diagnóstico y atención de dislipidemias donde, por primera vez se considera al SM como una entidad separada y establece una definición clínica basada en los factores de riesgo (Tabla 1) que resulta de muy fácil aplicación tanto en estudios epidemiológicos como en la práctica clínica diaria, pues a diferencia de la definición del grupo de trabajo de la OMS no necesita demostrar directamente la resistencia a la insulina.1 1.2 Criterios diagnósticos del SM En 1998, un grupo consultor de la OMS propuso que se denominara síndrome metabólico (SM) sugirió una definición de trabajo que seria la primera definición unificada del mismo, “regulación alterada de la glucosa o diabetes y o resistencia a la insulina (definida como una captación de glucosa por debajo del cuartel inferior para la población en estudio, bajo condiciones de hiperinsulinemia y euglucemia).1 Además, dos o más de los siguientes componentes: • Tensión arterial elevada (140/90 mmHg) • Triglicéridos plasmáticos elevados (1, 7 mmol/L; 150 mg d/L) y/o colesterol • HDL bajo< 0.9 mmol/L (35 mg d/L) en hombres; < 1.0 mmol/L, (39 mg d/l) en mujeres. • Obesidad central ( relación cintura cadera > 0.90 para hombres y > 0.85 para mujeres) y/o índice de masa corporal (IMC) > 30 kg/m2. • Microalbuminuria (excreción 20 μm/min o relación albúmina: creatinina en orina 30 mg/g). 1.3 .Fisiopatología del síndrome metabólico El avance en las técnicas de biología molecular e inmunología ha permitido conocer los aspectos fisiopatológicos de múltiples enfermedades, principalmente los eventos subcelulares a nivel citosol y nuclear, así como la funcionalidad de receptores de membrana involucrados en cascadas de señalización que rigen la homeostasis celular.10 De esta manera, se considera al SM como una constelación de factores de riesgo lipídicos y no lipídicos que pueden aparecer de forma simultánea o secuencial en un mismo individuo como manifestaciones de un estado de resistencia a la insulina. No se trata de una simple enfermedad sino de un grupo de problemas de salud causados por la combinación de factores genéticos 1.4. Resistencia a la insulina La resistencia a la insulina se define como una condición caracterizada por una menor actividad 20 biológica de la hormona (insulina) que se expresa en sus diferentes acciones metabólicas, siendo la más evidente en el metabolismo de la glucosa. Esto se manifiesta en órganos y tejidos como el hígado, tejido adiposo y muscular y también en el endotelio.11 La resistencia a la insulina (RI) constituye un rasgo temprano y fundamental dentro del grupo de desordenes que han sido definidos como Síndrome metabólico. Dicha resistencia es un rasgo común entre la obesidad y la Diabetes Mellitus en los tejidos diana de la insulina como el músculo esquelético. También se ha observado resistencia a la insulina en personas con antecedentes familiares de obesidad, hipertensión arterial, Diabetes Mellitus y dislipidemias.11, 12 La insulina ejerce diversas acciones, principalmente sobre el metabolismo de carbohidratos, de grasas y de proteínas, participa en el desarrollo, diferenciación y supervivencia celular e influye en el equilibrio hidroelectrolítico y en la función endotelio.12 Este grupo se encuentra constituido por al menos siete proteínas transmembrana homólogas denominadas GLUT-1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 que se encuentran codificadas por distintos genes. Las proteínas Glut tiene distinta especificidad de sustrato, propiedades cinéticas y distribución en los tejidos, lo que da origen a diferentes funciones.11, 13 El Glut 4 es el principal transportador de glucosa estimulado por insulina y se encuentra localizado principalmente en las células musculares y adipocito.10 La reducción en el consumo de glucosa estimulado por insulina en el músculo esquelético de sujetos obesos y en aquellos con diabetes, se encuentra asociada con un deterioro en el movimiento de Glut 4 de las vesículas intracelulares a la membrana plasmática.14, 15, 16 1.4.3. Patogenia de la resistencia a la insulina Un posible mecanismo de producción de la resistencia a la insulina es la mutación del receptor de insulina, fenómeno bastante raro que determina algunos síndromes genéticos específicos.16 Más frecuentes son los defectos de los transportadores de glucosa, como la disminución del Glut 4, y las alteraciones de la fosforilación, que pueden ocurrir tanto en el receptor como en los sustratos intracelulares. Cabe señalar que en el problema de la resistencia a la insulina se comprometen las vías metabólicas, no las vías mitogénicas.14 Actualmente se han descrito nuevos mecanismos que estarían participando en la resistencia a la insulina. Uno de ellos es la acción de algunos factores o moléculas que actuarían sobre la fosforilación del receptor de insulina, como el factor de necrosis tumoral (TNF), que actuaría sobre la fosforilación de los receptores intracelulares, de tal manera que en vez de fosforilarse el residuo tirosina se fosforila un residuo serina. Se ha demostrado que el TNF está aumentado en el suero de personas resistentes a la insulina, diabéticos tipo II o portadores de obesidad androide, los que además tienen una mayor expresión del TNF en su tejido adiposo. Por otra parte, se ha descrito que algunos polimorfismos del TNF se asocian con una menor sensibilidad a la acción de la insulina.14, 15 Otro problema fisiopatológico del paciente insulinorresistente, que ocurre principalmente en los obesos, es el aumento del nivel de ácidos grasos libres provenientes de la lipólisis aumentada del tejido adiposo intraabdominal o visceral. Este aumento de los ácidos grasos produce resistencia a la acción de la insulina a nivel muscular, lo que se traduce en una disminución de la síntesis del glicógeno y, por otra parte, determina un aumento de la secreción de insulina en la célula beta como mecanismo 1.4.1. Sitios celulares de resistencia a la insulina Los sitios celulares potenciales como causantes de resistencia a la insulina se pueden agrupar en dos categorías: los relacionados con alteraciones en el sistema activador del transporte de glucosa, y alteraciones en el receptor de insulina y de la cascada de señalización que se origina a partir de su autofosforilación. Recientemente se ha implicado al receptor FAT/CD36 en el desarrollo de resistencia a la insulina tanto en modelos animales como en humanos. 12 1.4.2 .Mecanismos de resistencia a la insulina La insulina inhibe la secreción de glucógeno y disminuye la concentración sérica de los ácidos grasos libres, que contribuyen a una disminución brusca de la producción hepática de glucosa. Debido a que los lípidos conforman la membrana celular son impermeables a los carbohidratos, se requiere de un sistema de transporte transmembranal de carbohidratos. Hasta el momento se han clonado dos familias moleculares distintas de transportadores celulares: una de glucosa y otra de hexosas, como fructuosa y lactosa. 11, 13 Los transportadores de glucosa están acoplados a sodio y se encuentran restringidos al intestino y al riñón, donde transportan glucosa activamente contra un gradiente de concentración por medio del cotransporte del sodio que utilizan como sustrato energético. El otro grupo de transportadores ejerce su función por difusión facilitada bajo un gradiente de concentración de glucosa. 21 compensatorio a la resistencia periférica. Si esta situación se perpetúa en el tiempo, la gran resistencia que se produce en la periferia provoca la claudicación de la célula beta y aparece la intolerancia a la glucosa y, posteriormente, la diabetes tipo II.15 Desde el punto de vista molecular, hay un aumento del malonil-CoA, que en condiciones fisiológicas aumenta como un mecanismo de defensa frente a situaciones de privación prolongada de nutrientes, con el fin de obtener energía a partir de la oxidación de los ácidos grasos libres y disminuir la oxidación de la glucosa, para preservar el aporte de ésta al sistema nervioso central. Se ha observado que en los obesos ocurre este mismo mecanismo, aun en presencia de una ingesta adecuada de nutrientes, y que el aumento de malonil-CoA no se inhibe con los niveles de glucosa y de insulina aumentados, lo que finalmente perpetúa el aumento de los niveles de ácidos grasos libres.16, 17 que se presenta con marcada resistencia a la insulina y conduce al desarrollo de diabetes mellitus tipo II.19 Numerosos estudios establecen la asociación que existe entre el sobrepeso, la obesidad y la resistencia a la insulina; sin embargo, se ha observado que las alteraciones en el metabolismo de carbohidratos son reversibles con la perdida de peso, aunque se sabe que la obesidad está asociada directamente al desarrollo de diabetes mellitus tipo II.18, 19 1.5. Diabetes mellitus, obesidad e hipertensión En la composición química de la membrana plasmática se encuentran lípidos, proteínas y glúcidos en proporciones aproximadas de 40%, 50% y 10% respectivamente .22 1.6. Membrana plasmática La célula está rodeada por una membrana, denominada membrana plasmática, la cual delimita el territorio de la célula y controla el contenido químico de esta.20, 21 1.6.1. Composición química La asociación que existe entre hiperinsulinemia y presión sanguínea varía dependiendo de distintos factores, y aunque esta asociación tiene un componente genético, sus manifestaciones varían dependiendo del grupo étnico que se trate. Estudios longitudinales con individuos normotensos, prehipertensos, y en hijos de pacientes hipertensos, tratan de explicar la inherte pérdida de la sensibilidad a la insulina y el aumento de la presión sanguínea. Existen diversos factores cardiovasculares y metabólicos que relacionan a la hiperinsulinemia con la hipertensión; desde el punto de vista cardiovascular interviene el gasto cardiaco y la resistencia cardiovascular, y desde el punto de vista metabólico se tienen los niveles séricos de glucosa e insulina. Se han propuesto algunos mecanismos para explicar cómo algunas alteraciones fisiológicas influyen sobre el aparato cardiovascular, que pueden ser los cambios estructurales y/o funcionales en la vasculatura, la estimulación del sistema nervioso simpático y el transporte de iones intracelulares.13, 18 En pacientes con hipertensión, la elevación de la insulina o la disminución en la sensibilidad a esta hormona indica la presencia de un conjunto de anormalidades que frecuentemente se acompañan de intolerancia a la glucosa, elevación de triglicéridos, disminución de los niveles de colesterol-HDL, aumento de LDL densas pequeñas séricas, elevación del factor 1 inhibidor del plasminógeno (PAI-1), microalbuminuria, y niveles altos de Sodio y Litio; cada una de estas anormalidades son factores de riesgo para el desarrollo de enfermedad cardiovascular aterosclerótica.18 Por otro lado, la obesidad se considera como uno de los desórdenes orgánicos más importantes del síndrome metabólico, 1.6.2. Lípidos Podemos encontrar tres tipos de lípidos: fosfolípidos, glucolípidos y colesterol. Todos tienen un carácter anfipático; es decir, que tienen un doble comportamiento, parte de la molécula es hidrófila y parte de la molécula es hidrófoba por lo que forman una bicapa lipídica. La membrana plasmática no es una estructura estática, sus componentes tiene posibilidades de movimiento y fluidez. Los movimientos que puede realizar son: rotación (sobre su propio eje), de difusión lateral (longitudinal), flip flor (de una monocapa a otra) y de flexión (producidos por colas hidrófobas de fosfolípidos).20 La fluidez es una de las característicos más importantes de la membrana y depende principalmente de factores como la naturaleza de los lípidos, la presencia de lípidos insaturados y de cadena corta (Figura 4);por el contrario la presencia de colesterol endurece las membranas, reduce su fluidez y permeabilidad.20, 21 1.6.2.1.Ácidos esenciales grasos poliinsaturados Los ácidos grasos son compuestos orgánicos que juegan un papel fundamental en el desarrollo del síndrome metabólico22. Pueden ser saturados e insaturados, estos últimos tienen en su estructura dobles enlaces. Los ácidos grasos insaturados se clasifican a su vez, en monoinsaturados y poliinsaturados. Los ácidos grasos 22 poliinsaturados (AGPI) se definen como aquellos ácidos que contienen dos o más dobles ligaduras.22 En los mamíferos, los AGPI se clasifican en dos grandes categorías, los esenciales y los no esenciales. Los AGPI esenciales son aquellos que deben ser ingeridos en la dieta, ya que no pueden ser sintetizados a partir de otros precursores carbonados en los sistemas celulares. A esta categoría pertenecen los ácidos grasos linoléico (18:2 n-6) y alfa-linoléico (18:3 n-3). 21 Los ácidos grasos poliinsaturados esenciales incluyen a dos familias de ácidos grasos: la familia n-6, cuyo precursor es el ácido linoléico (18:2 n-6), y la familia n-3, en donde el precursor es el ácido alfa linoléico (18:3 n-3). En los AGPI n-3, la primera doble ligadura se localiza en el tercer carbono a partir del grupo metilo Terminal de la cadena hidrocarbonada, y en los n-6, se localiza en el sexto carbono. Estas dos familias son interconvertibles entre sí, lo que le confiere a cada una un carácter y funciones especificas. 22 carcinógenas mutantes en la carne durante la cocción. Por accidente M. Pariza encontró una sustancia en la grasa de la carne que contrarrestaba el cáncer. Esta fue identificada como ácido linoléico conjugado (CLA) y consisten en isómeros posicionales y geométricos de ácido linoléico.25, 27 El Ácido Linoléico Conjugado (CLA) es un ácido graso esencial formado por varios tipos de ácidos grasos todos ellos con estructura química semejante(López Bote 2004). Se cataloga al CLA como una mezcla de isómeros del ácido linoléico (cis 9, trans 11 y trans 10, cis 12) (Fig. 5). El termino conjugado se refiere a que los dobles enlaces se encuentren separados por un solo átomo de carbono, al que están unidos por enlaces simples.25, 26 1.6.3. Proteínas Las proteínas de la membrana se encuentran entre las moléculas de los fosfolípidos y de manera selectiva permiten el transito de sustancias a través de la membrana plasmática.24 La selectividad de los canales de las proteínas le permite a la célula controlar la salida y entrada de sustancias así como los transportes entre compartimientos celulares. Las proteínas de la membrana además de ser selectivas utilizan el transporte activo para la transporte tanto de iones como de otras biomoleculas . Así mismo pueden presentarse proteínas integrales que atraviesan la bicapa lipídica o proteínas periféricas que se encuentran uniendo proteínas localizadas tanto en el citosol como en el medio extracelular.22 1.7.1. Fuentes de CLA El CLA es producido por la flora gastrointestinal de los rumiantes, a partir de ácido linoléico. En el ser humano y algunos mamíferos también se produce, pero en muy pequeñas cantidades en el hígado a partir del ácido linoléico.26, 27 El CLA se encuentra en pocas proporciones en los aceites vegetales, mientras que su concentración es particularmente alta en la carne de los animales rumiantes así como su leche y derivados.28, 29 1.6.4. Glúcidos 1.7.2. Propiedades del CLA Se sitúan en la superficie externa de las células eucariotas por lo que contribuyen a la asimetría de la membrana. Estos glúcidos son oligosacáridos unidos a lípidos (glucolípidos), o a las proteínas (glucoproteínas). Constituyen la cubierta celular o glucocálix que protege las células de posibles lesiones, presenta propiedades inmunitarias e intervienen en los procesos de adhesión entre el óvulo y el espermatozoide.20 En 1990 se publicó por primera vez información relacionada con los posibles efectos benéficos del CLA obtenido de la leche de vaca. Se le atribuyen efectos sobre el peso corporal, reduciendo la masa de grasa total; reduce los niveles de colesterol (LDL y HDL) así como los triglicéridos; eleva el potencial del sistema inmunitario y tiene efectos antioxidantes ya que posee una gran capacidad para captar radicales libres.30, 31, 32 Se han realizado estudios similares utilizando como unidades de investigación a ratas, ya que el comportamiento, anatomía y fisiología es similar al de los humanos. 1.7. Ácido linoléico conjugado (CLA) A fines de la década de los 70, científicos de la universidad de Wisconsin investigaban formaciones 23 1.8. Ácidos grasos omega 3 incluye a todas las clases de lípidos, especialmente a las VLDL. Existen tambien otros modelos experimentales de ratas diabéticas, como las ratas SHHF7/Mcc-fa, o la cepa no obesa BHE/cdb.35 Se encuentra en los pescados grasos como el salmón, en la soya, las nueces, los caracoles de tierra, los higos y en las verdolagas, un vegetal similar a las acelgas. 33 El Ácido graso ω-3 se destaca su intervención en la formación de las membranas de las células; conforman la mayor parte de los tejidos cerebrales siendo que las células nerviosas son ricas en ácidos grasos Omega-3; y se convierten en prostaglandinas, sustancias con un papel importante en la regulación de los sistemas cardiovascular, inmunológico, digestivo, reproductivo y que tienen efectos antinflamatorios.34 Los ácidos grasos omega 3 tienen un efecto protector cardiovascular variable, pero está claro que previenen las arritmias, ya que un corazón con células ricas en ácidos grasos omega 3 es mucho más estable, en términos eléctricos, y soporta mejor un infarto agudo de miocardio.18 Además, mejoran la vasodilatación, ya que disminuyen la producción de elementos vasoconstrictores como el tromboxano 2, mejoran la función endotelial, probablemente por la producción de óxido nítrico, y disminuyen la secreción de VLDL. Tal vez no disminuyan el número de partículas, pero sí la cantidad de triglicéridos que ellas contienen.28 1.10 Ratas Kyoto-Wistar Las ratas Kyoto-Wistar son albinas normales, es decir, sin hipertensión, sin componentes del SM se utilizan como testigo sano de las ratas hipertensas expontneamente.19 METODOLOGIA 1.9. Ratas hipertensas espontáneamente (HSR) Las ratas utilizadas para el estudio experimental de síndrome metabólico son ratas hipertensas espontáneamente, derivadas de la cepa KyotoWistar, que son un modelo de síndrome metabólico con hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, obesidad abdominal e hipertensión sistólica (> 200 mmHg), además de la intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina.19 Recientemente se identificó una delección en el gen que codifica para el receptor/transportador de ácidos grasos FAT/CD36 de membrana plasmática de adipocitos en estos roedores hipertensos, y se observó que se encuentra asociado con el conjunto de signos y síntomas que caracterizan al síndrome metabólico.35 Existen otros modelos experimentales de ratas que presentan hipertensión, hipertrigliceridemia e hiperinsulinemia como las ratas Dahl sensibles a la sal, la cepa de ratas hipertensas Milan (MHS), que presentan elevaciones en los niveles plasmaticos de insulina, triglicéridos y colesterol, y desarrollan hipertensión por un defecto en la reabsorción de Sodio; la rata obesa Zucker (OZR) es un modelo de obesidad, resistencia a la insulina e hiperinsulinemia caracterizadas por hiperlipidemia que . Peso corporal El peso corporal se determinó semanalmente en una bascula de la marca OHAUS, inmovilizando a los roedores en un cilindro de acrílico para evitar interferencias en la lectura del peso. 24 Administración de la dieta experimental Magnesio y se centrifugó a 16 000 rpm durante 10 min a 4° C., el sobrenadante fue desechado, y el precipitado se almacenó a -70° C. 35 Los roedores fueron distribuidos en cuatro grupos: el grupo testigo que recibió una dieta a base de aceite de girasol (7.5%), y agua para beber; el segundo grupo denominado hipertensas, que recibió la misma dieta que el testigo sano con aceite vegetal; el tercer grupo bajo la dieta a base de Acido Linoléico Conjugado (Girasol 6.0% y CLA 1.5%) y el cuarto grupo bajo dieta de aceite de pescado (omega-3 7.5%) (figura 8). Las dietas se prepararon de acuerdo a la composición indicada en la tabla 2, conteniendo un 7.5% de lípidos, utilizándose aceite de girasol para dos modelos experimentales (Kyoto Wistar y SM), ácido linoléico conjugado (SM) y aceite de pescado (SM). Extracción de lípidos de membranas celulares Los lípidos de las membranas celulares se extrajeron por el método de Folch. Las membranas celulares precipitadas fueron descongeladas y resuspendidas con una minima cantidad de amortiguador Tris-cloruro de magnesio pH 7.5. A 1 ml de la preparación de membranas se le adicionó 16 ml de la mezcla de Folch (Cloroformo-metanol 2:1 v/v). Después se agitó 1 min en vortex. Se añadió 3ml de cloruro de sodio 0.73% y se volvió a agitar en vortex 1 min, se centrifugó a 16 000 rpm a 4° C durante 20 min. Se recuperó la fase inferior en la cual se ubican los lípidos. A la fase recuperada se le adicionaron 7.5 ml de una mezcla de cloroformo-metanolCloruro de sodio 0.73% (3:48:47 v/v/v), con el fin de eliminar lastrazas de proteínas. Se agitó vigorosamente con vortex durante un minuto y se dejó separar a 4°C durante 4 hr. La fase superior fue desechada, y la fase inferior fue filtrada a través de sulfato de sodio anhidro, colocado en un embudo de vidrio con un papel filtro Watman, con la finalidad de eliminar impurezas y restos de agua. El filtrado fue recuperado en un matraz de bola, llevado previamente a peso constante, y evaporado al vacío en un rotavapor a 30°C, y posteriormente con flujo de nitrógeno. La diferencia en el peso del matraz vacio y después de la evaporación se usó para calcular la cantidad de lípidos extraídos.35 El extracto fue resuspendido con cloroformo (BHT 0.02%) en una proporción de 10 mg de lípidos por ml de cloroformo, y conservados a -20°C para su utilización. Obtención de membranas celulares de tejido adiposo El tejido adiposo que se obtuvo de las ratas fue pesado, cortado en pedazos pequeños y homogenizado en un homogenizador de vidrio con pistilo de teflón, sobre hielo, adicionado con un amortiguador de Bouskella Ringer-Tris pH 7.4 (NaCl 120 mM, CaCl 1.4 mM, KCL 5.2 Mm MgSO4 1.4 mM, Tris 5 Mm) a 4° C. El homogenizado fue filtrado a través de dos capas de gasa, y centrifugado a 40 000 rpm durante 40 min. a 4° C. El sobrenadante y la capa de grasa formada serán desechadas, y el precipitado se resuspendio, con la ayuda del pistilo de teflón, en 5 ml de amortiguador Krebs-Ringer ph 7.4 y 125 ml de Percoll. centrifugar a 16 000 rpm 15 min a 4° C. y se recupero la capa blanca de la interfase, donde se localizan las membranas celulares. Esta fue diluida con amortiguador de Tris-Cloruro de 25 Composición de ácidos grasos de los lípidos totales de membrana plasmática de adipocitos Análisis estadístico Se realizó análisis estadístico de varianza (ANOVA), utilizando la prueba de rango múltiple de Tukey (para estimar la diferencia significativa entre medias, para cada grupo y cada parámetro medido) con una p< 0.05 por medio de un software estadístico (MINITAB 4.2). A cada grupo experimental se le practicó el ANOVA para compara si existe una diferencia significativa entre un grupo y otro, y poder así observar si el CLA tuvo un efecto favorable sobre los parámetros sanguíneos característicos del síndrome metabólico. La composición de ácidos grasos de los lípidos totales fue analizada por medio de cromatografía de gases, previa metilación de los mismos. Metilación de ácidos grasos Para el análisis cromatogáfico los ácidos grasos se transmetilaron con ácido sulfúrico, a las muestras resuspendidas en cloroformo (BHT 0.02%) se les adicionó 3 ml de H2SO4 al 2% en metanol y 0.5 ml de benceno, antes de la incubación a 90°C durante una hora. La extracción de los ácidos grasos metilados se realizó con hexano y agitación vigorosa con flujo de nitrógeno, el producto de la extracción se resuspendió en 0.5 ml de cloroformo y se almacenó a -20°C.35 RESULTADOS A continuación se detallan los resultados obtenidos de la determinación de la composición lipídica de membrana plasmática de adipocitos de ratas con síndrome metabólico bajo el efecto del acido linoléico conjugado (CLA) dietario. Se determinó la composición de ácidos grasos saturados (AGS), ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) y ácidos grasos polinsaturados de dos tipos omega 6 y omega 3 (AGPI n-3 y n-6) y finalmente el contenido de acido linoléico conjugado total así como del isomero cis9, trans-11 y el trans-10, cis-12. Todos los resultados obtenidos en el grupo experimental (CLA) fueron comparados con respecto al grupo testigo sano (KW), grupo aceite de pescado (AP) y un grupo testigo enfermo (AV); lo cual permitió establecer los cambios en la composición lipídica de manera particular ácidos grasos, como un biomarcador celular de efectos dietarios. No se encontraron diferencias estadísticas significativas en el contenido de ácidos grasos saturados entre los grupos: experimental recibiendo el aporte de Cromatografía de gases Los esteres metílicos fueron separados por medio de cromatografía de gases, e identificados por la comparación de sus tiempos de retención con los de los estándares puros metilados, a partir del cual se obtuvo el porcentaje de cada ácido graso encontrado. El grupo testigo determinó los valores de referencia. Se utilizó un cromatógrafo de gases marca Hewlett Packard modelo 6890 equipado con una columna capilar tipo Carbowax con una longitud de columna de 30 m y un detector de ionización bajo las siguientes condiciones: Temperatura de inyección de 250°C, temperatura del detector de 250°C, hidrógeno como gas acarreador, programación de la temperatura de la columna de 100 °C a 210 °C a una velocidad de 2°C/min, longitud de la columna: 30 m, tiempo de 90 min. 26 Ácido linoléico conjugado (CLA) con respecto al testigo sano, grupo enfermo (AV) y aceite de pescado (AP) manteniéndose una proporción semejante de los ácidos palmítico y esteárico encontrados en mayor proporción. Sin considerar que se encontraron fracciones mínimas pero presentes de acido mirístico, pentadecánoico, heptadecánoico y araquídico (Tabla 3). En relación a los ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) se encontró diferencia significativa en el contenido total de ellos en el grupo recibiendo el aporte de acido linoléico conjugado el cual mostró una menor proporción con respecto al testigo sano (KW) y enfermo (AV), es importante destacar que los cambios en la composición de ácidos grasos correspondió en este caso al acido oleico, como principal acido graso monoinsaturado, encontrándose en proporciones menores el acido palmitoleico y el acido nervónico (Tabla 4). En relación a los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) se analizó la determinación de la composición de los ácidos grasos omega 6 y de los omega 3. en cuanto a los ácidos grasos poliinsaturados omega 6 se encontró una menor incorporación en el grupo CLA en proporción similar al grupo testigo mientras que el grupo testigo enfermo mostró una marcada elevación de este tipo de ácidos grasos. Los ácidos grasos omega 6 encontrados en mayor proporción en estos grupos correspondió al acido linoléico y al acido araquidonico (Tabla 5). Por otro lado se analizó la composición del otro tipo de ácidos grasos poliinsaturados en este caso omega 3 (AGPI n-3) encontrando una disminución poco significativa de omega 3 en el grupo de ratas recibiendo el aporte de acido linoléico conjugado con respecto al grupo testigo sano (KW), aceite de pescado (AP) y enfermo (SM). Las fracciones encontradas en baja proporción correspondieron al linolénico, acido eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico proveniente del aceite de pescado aportado (Tabla 6). Analizando el total de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) se encontró una disminución significativa en el total de ellos, considerando omega 6 y omega 3 en el grupo recibiendo CLA, mientras que el grupo testigo enfermo mostró un aumento significativo de los mismos con respecto al grupo testigo (Tabla 7). Realizando un análisis del contenido de ácidos grasos tanto saturados (AGS) monoinsaturados (AGMI) y poliinsaturados (AGPI) totales, se encontró mayor incorporación de grasa saturada seguida de la poliinsaturada y finalmente grasa monoinsaturada (grafico 1). Finalmente, se analizó la incorporación del acido linoléico conjugado total derivado de la determinación de los isomeros cis-9, trans-11 y trans-10, cis-12 obteniéndose una incorporación significativa con respecto al grupo testigo sano (KW), dieta de pescado (AP) y enfermo (AV), los cuales no mostraron incorporación como era de esperarse de este ácido (Tabla 8). 27 KW AV CLA AP clínicas como la obesidad, la hipertensión y los accidentes cerebrovasculares, constituyen las primeras causas de muerte a nivel mundial y en nuestro país. El fenómeno fisiopatológico que determina las manifestaciones clínicas del síndrome se conoce como resistencia celular a la insulina, el cual aparece muchos años antes que el síndrome.1, 8 Este mecanismo fisiopatológico corresponde a una serie de eventos moleculares que se llevan a cabo a diferentes niveles celulares como son la regulación de la expresión génica, la cascada de señalización celular, manifestaciones de Así mismo, en el modelo murino que recibió el aporte de CLA se encontró mayor incorporación del isomero cis-9, trans-11 tres veces mas que el isomero trans-10, cis-12 del ácido linoléico conjugado (CLA). DISCUSION El síndrome metabólico junto con sus manifestaciones 28 respuesta inflamatoria celular, así como también los cambios en la estructura molecular de los organelos celulares y de manera particular la composición lipídica de la membrana plasmática de diferentes tejidos, principalmente aquellos implicados en la resistencia a la insulina como lo son el tejido adiposo, el muscular y el hepático. En el presente trabajo se evaluó el efecto del acido linoléico conjugado dietario sobre la composición lipídica de membrana plasmática de tejido adiposo como un biomarcador y por lo tanto de un posible mecanismo molecular implicado en la reversión del fenómeno fisiopatológico de resistencia a la insulina a nivel celular por efectos dietarios del CLA. En el presente diseño experimental se encontró que las ratas hipertensas espontáneas (SM) recibiendo el aporte de CLA mostraron cambios en su composición lipídica de membrana, indicando la relación directa en la ingesta del ácido y la estructura molecular del organelo, teniéndose una incorporación de 24.68% de CLA (Tabla 6) en comparación con ácidos grasos saturados (Tabla 1), de 47.55% en comparación con ácidos grasos monoinsaturados (Tabla 2) y 35.72% en comparación con ácidos grasos poliinsaturados (Tablas 3 y 4). Lo anterior muestra claramente la presencia del acido linoléico conjugado proveniente de la ingesta dietaria indicando que los cambios estructurales necesariamente influirán en las propiedades fisicoquímicas de la membrana como: la fluidez y la microviscosidad, las cuales están relacionadas con las funciones celulares de receptores como la insulina y Glut 4 de la célula. El grupo experimental antes detallado muestra variabilidad a su vez en el contenido de grasa saturada, monoinsaturada y poliinsaturada, teniéndose una disminución de 46.67% de grasa monoinsaturada con respecto a la saturada y una disminución de 30.91% de la poliinsaturada con respecto a la saturada (Grafica 1). Las variaciones anteriores en la composición de los ácidos grasos de membrana son muy similares al del grupo control sano exceptuando la nula presencia de CLA, encontrándose una disminución de 43.18% de grasa monoinsaturada con respecto a la grasa saturada y una disminución de 31.81% de grasa poliinsaturada con respecto a la grasa saturada. Los resultados anteriores varían en la incorporación de ácidos grasos poliinsaturados tanto en el grupo testigo enfermo como en el grupo recibiendo el aporte de aceite de pescado en el cual incorpora mayor proporción de ácidos grasos omega 3 con el ácido eicosapentanoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA) que al igual que el grupo testigo sano mantuvo a las ratas sin síndrome metabólico, debido a que los ácidos grasos omega 3 tienen un efecto protector cardiovascular variable, previenen las arritmias, ya que un corazón con células ricas en ácidos grasos omega 3 es mucho más estable, mejoran la vasodilatación, ya que disminuyen la producción de elementos vasoconstrictores como el tromboxano 2, mejoran la función endotelial, probablemente por la producción de óxido nítrico, y disminuyen la secreción de VLDL.1 CONCLUSIONES La membrana plasmática de adipocitos de ratas con síndrome metabólico responde a los efectos dietarios de la administración de CLA: 1.- Incorporándolo como parte de la composición lipídica de este organelo 2.- Reflejando la relación directa de la ingesta de una dieta con la estructura molecular de un organelo 3.- Sugiriendo que el cambio en la estructura molecular de membrana conlleva un cambio en la funcionalidad de la misma (fluidez y microviscosidad) que pudiera estar reflejado con el evento fisiopatológico de la resistencia celular a la insulina. 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Effects of fish oil on hypertension, plasma lipids, and tumor necrosis factor-α in rats with sucrose-induced metabolic syndrome. J. Nutr. Biochem. 2004 30 Presencia de Trypanosoma Cruzi en localidades rurales del Municipio de Tezonapa; Veracruz Guzmán-Gómez Daniel1, Torres-Morán Arturo1, Pérez-Yepez Eloy Andres1, Morán-Utrera Yadira1, 2, Torres Montero Jesús1, 2, López-Monteon Aracely1, 2 y Ramos-Ligonio Angel.1, 2 1 Estudiantes de la Licenciatura. Programa educativo de Químico Farmacéutico Biólogo. Facultad de ciencias Químicas, Universidad Veracruzana. LADISER Inmunología y Biología Molecular. Prolongación de Oriente 6 Mo. 1009 Col. Rafael Alvarado, CP. 94340. Orizaba, Ver. 2 Estudiantes de Posgrado. Instituto de Ciencias de la Salud. Doctorado en Ciencias Biomédicas-UV. Avenida Luis Castelazo s/n Col. Industrial Ánimas CP. 91190. Xalapa, Ver. 1,2 Profesores de Tiempo Completo Titular “C”. Facultad de Ciencias Químicas, Universidad VEracruzana. LIDISER Inmunología y Biología Molecular. Prolongación de Oriente 6 Mo. 1009 Col. Rafael Alvarado, CP. 94340. Orizaba, Ver. Antecedentes infectados naturalmente por T. cruzi.8, 9 Estudios recientes encaminados a la infestación de domicilios en zonas rurales por vectores de la enfermedad de Chagas 10, 11 o estudios basados en la determinación de anticuerpos antiT. cruzi en zonas rurales, 12-15 no reflejan la situación actual de la epidemiología de la enfermedad ni de la presencia y distribución de los vectores en el país. Para identificar a los insectos triatominos que son portadores del parásito, muchos autores opinan que la técnica de PCR en donde se amplifica minicírculos de DNA, es mucho más sensible que otras ocupadas para la identificación del parásito 16. Estos minicírculos, junto con los maxicírculos son estructuras del cinetoplasto. El cual constituye una red de DNA extranuclear localizada en un punto específico de la mitocondria. Esta red representa una proporción importante del DNA total celular, ya que, dependiendo de la especie, puede contener del 10-20% del DNA total en la célula. Los minicírculos forman la mayor parte de la estructura. Como su nombre lo indica, son moléculas circulares de DNA con una longitud de 100- 2,500 pb, estos se encuentran organizados dentro de 4 regiones conservadas de 120 pares de bases. Por muchos años se dudó sobre su función, ya que no contienen información genética evidente. Ahora se sabe que codifican para RNAs pequeños que participan en el procesamiento de RNAs mensajeros mitocondriales. Los maxicírculos son moléculas mayores de DNA, que contienen una longitud de 30,000- 50,000 pb. Se encuentran en mucho menor número que los minicírculos. Representan el equivalente al DNA mitocondrial de otros eucariontes, pues codifican RNAs de proteínas, RNAs ribosomales y de transferencia. 16 El desarrollo de una prueba de amplificación de DNA, puede llenar los requisitos para tener una prueba confiable de diagnóstico parasitológico. En términos generales, si los oligonucleótidos son específicos y son empleados a la temperatura de reconocimiento adecuada, el producto de amplificación debería ser específico. T. cruzi presenta La enfermedad de Chagas o tripanosomiasis Americana, es causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi, los vectores naturales de este parásito son chinches del género Triatoma. Este agente patógeno es transmitido al huésped mamífero cuando la chinche se alimenta y excreta heces infectadas, lo que permite que T. cruzi penetre a través de las heridas o mucosas. La transmisión vectorial es la forma normal de infección entre los animales y es la más común en el hombre, pero se puede adquirir también mediante transfusión sanguínea o transplante de órganos de personas infectadas, por vía congénita y, más raramente, por la ingestión de sustancias contaminadas e infección accidental en el laboratorio 1. Esta enfermedad representa un problema principal de salud pública en América Latina, en donde la Organización Mundial de la Salud estima que aproximadamente 100 millones de habitantes están en riesgo de infección, y por lo menos entre 16-18 millones de personas están infectadas, 2 y de acuerdo a los datos proporcionados por el comité de expertos de la WHO en el año 2002 se estima que de 8-9 millones de personas se encuentran infectadas con el parásito y 25 millones de personas se encuentran en riesgo de adquirir la infección en países de América central incluyendo a México y enfatizan la necesidad de sostener y extender las estrategias de control para esta enfermedad 3. En México la enfermedad de Chagas es endémica en varias regiones, pero se conoce muy poco acerca de la epidemiología de la enfermedad 4. La información sobre la prevalencia de la enfermedad es escasa y la importancia en salud pública de esta enfermedad permanece en constante controversia 5-7. Se han realizado pocos estudios entomológicos sobre los vectores de esta enfermedad, en los que se han reportado que 39 especies de insectos triatominos están presentes en México, de las cuales 20 se han observado que pueden ser 31 dos genomas distintos, situados en dos compartimientos celulares bien definidos como el núcleo y la mitocondria. El análisis por PCR para la detección de T. cruzi en vectores y en pacientes, es una técnica alternativa para la detección por microscopía directa, usando “oligonucleótidos” complementarios a la región conservada del DNA mitocondrial. Otros ensayos de PCR para la detección del T. cruzi han sido desarrollados usando “primers” que son complementarios al DNA satelital o a otras regiones del DNA de cinetoplasto (kDNA). El ensayo de la PCR se basa en la amplificación de minicírculos que se encuentran en el kDNA, estos se encuentran presentes en 10,000-20,000 copias por parásito. Recientemente, se ha mostrado que el ensayo de la PCR utilizando “primers” para las regiones conservadas de los minicírculos del kDNA que puede detectar aproximadamente 100 minicírculos en 100 microlitros de muestra. Por lo tanto, la mayoría de las pruebas de amplificación para el diagnóstico de T. cruzi, son basadas en secuencias provenientes del kDNA. 18 La búsqueda de anticuerpos en suero contra componentes de T. cruzi ha sido de los principales soportes para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Sin embargo, casi todos los métodos utilizan extractos completos o fracciones semipurificadas de T. cruzi, lo que significa una considerable variación en la reproductibilidad y confiabilidad de los resultados obtenidos con los diferentes métodos 19. Otro problema vinculado a la existencia de resultados positivos son los debidos a las reacciones cruzadas con otras enfermedades parasitarias tales como leishmaniasis e infecciones con T. rangeli 20. Por lo anterior, antígenos recombinantes de T. cruzi pueden proveer una herramienta para mejorar los métodos de diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas 21, 22. En relación a estos antígenos recombinantes, la proteína MBP::Hsp70 se deriva de una proteína nativa de aproximadamente 80 kDa, la cual se encuentra presente tanto en tripomastigotes, epimastigotes, como en amastigotes, pero su ubicación no pudo ser precisada por ensayos de inmunofluorescencia, lo que sugiere la necesidad de utilizar metodología de alta sensibilidad como pueden ser la inmunoprecipitación de proteínas membranales marcadas con iodo radiactivo o bien la microscopia electrónica, dirigida a caracterizar la localización celular en el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Por otro lado, la proteína nativa codificada por Hsp70 es de 80 kDa y se encuentra conservada en diferentes aislados de Trypanosoma cruzi y en Crithidia luciliae, pero no es compartida por los miembros de género Leishmania. Siendo precisamente el mejoramiento de la calidad del serodiagnóstico de la enfermedad de Chagas, uno de los principales objetivos del uso de la tecnología recombinante en T. cruzi, y basados en los resultados obtenidos en la evaluación parcial del péptido MBP:: Hsp70 de alta inmunogenicidad, y con la ausencia de una proteína homóloga en el género Leishmania, la posibilidad de poder producir el péptido recombinante en cantidad y calidad adecuada, se esperaban datos alentadores respecto a su aplicabilidad en el inmunodiagnóstico de ese padecimiento. Los resultados en los ensayos de inmunoelectrotransferencia dirigidos a la evaluación del reconocimiento del péptido MBP::Hsp70 por sueros de individuos con enfermedad de Chagas, y a confirmar la ausencia de reactividad con sueros de individuos con leishmaniasis cutánea localizada, cutánea difusa y visceral, permitieron concluir que la proteína tipo Hsp70 es inmunogénica, y al no presentarse reacciones cruzadas con enfermos de leishmaniasis, su aplicación diagnóstica es muy factible. El sistema ELISA-MBP::Hsp70 tiene indicadores excelentes: valor predictivo positivo de 96.2%, valor predictivo negativo de 95.8% y un índice Kappa de 0.9023. El objetivo de este trabajo fue el de determinar la prevalencia actual y el riesgo potencial de infección por T. cruzi en habitantes que residen en comunidades rurales del municipio de Tezonapa, Veracruz. MATERIALES Y MÉTODOS Obtención de vectores Los vectores fueron recolectados por los habitantes de las 12 comunidades rurales del municipio de Tezonapa, los cuales fueron encontrados intra o Peridomiciliar, y canalizados a sus unidades médicas rurales, para posteriormente ser analizados. Obtención de muestras Todos los vectores que fueron recolectados, se les realizaron lavados estomacales, con agua desionizada utilizando una jeringa de insulina, las muestras obtenidas de los lavados, fueron sometidas a ebullición en un baño con recirculación a una temperatura de 95°C durante 10 minutos. Análisis de la infección de vectores por PCR El DNA obtenido de los vectores por el proceso de lavado y ebullición sirvió de templado para la PCR, la mezcla de reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 µl, conteniendo agua desionizada estéril, amortiguador de reacción 1x; 2.5 mM de MgCl2; 2.5 mM de dNTP’s; 32 20 pMoles de cada uno de los primers, los cuales son dirigidos contra el kDNA 24; 5U de Taq polimerasa; 5 µl de muestra de DNA obtenido previamente. La amplificación se llevo a cabo en un termociclador Mastercycler personal, (eppendorf), con las siguientes condiciones de ciclado: 3 minutos a 94°C; 35 ciclos de: 1 minuto a 94°C; 1 minuto a 55°C; 1 minuto a 72°C; y por último, un ciclo de 10 minutos a 72°C como extensión final para los productos amplificados. Las muestras fueron analizadas en geles de agarosa al 1.8% y los productos obtenidos fueron visualizados por la tinción con bromuro de etidio, y con la ayuda de un transiluminador. Como control positivo se utilizo DNA de una cepa de referencia donada del Laboratorio de Biología Molecular a cargo del Dr. José Luis Rosales Encina, y el control negativo fue una muestra de DNA no relacionado. de un anticuerpo cabra antihumano (Zymed) acoplado a peroxidasa a una dilución de 1:5000 en PBS y las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de ocho lavados y uno adicional únicamente con PBS se adicionó 100 µl de la solución reveladora (citrato de sodio 100 mM pH4.2, H2O2 0.03%, 1 mg/ml de [2, 2,-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline)-6-sulfonicacid] (ABTS) (Zymed); después de 10 minutos, las placas fueron leídas a 415 nm en un lector de ELISA (Multyscan Lab System). El valor de corte (vc) para este ensayo se estableció mediante la media obtenida de una muestra de 25 sueros de sujetos sanos más tres desviaciones estándar. Para el caso de la proteína MBP::Hsp70, el valor de corte se fijó en 0.375 densidades ópticas (DO), mientras que para el extracto total de la cepa Y y de la cepa H1 fue de 0.415 y 0.420 DO respectivamente. Los sueros que arrojaron resultaron positivos mediante la prueba ELISA, fueron procesados para la determinación de anticuerpos contra T. cruzi empleando otra prueba serológica diferente. Preparación del extracto crudo de T. cruzi Los parásitos (epimastigotes) de la cepa Y y de la cepa H1 (donada por el Dr. Eric Dumonteil) de T. cruzi se cultivaron y propagaron en un medio (LIT), suplementario con 10% de suero fetal bovino (GIBO). Los parásitos en fase logarítmica fueron colectados por centrifugación, la pastilla obtenida se resuspendió en PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM y KH2PO4 1.4 mM, pH 7.4) y fueron sometidos a ciclos de congelación-descongelación para lisar a los parásitos. La concentración de proteína fue determinada por el método de Bradford. Ensayos de Western blot 200 µg del extracto crudo de T. cruzi (cepa Y) fue separado electroforéticamente en geles de poliacrilamidaSDS al 10% en presencia de un amortiguador de muestra (Glicerol 2%, SDS 4%, Tris-HCl 50 mM pH 6.8, β-ME 200 mM, azul de Bromofenol 0.2%) 25, y transferidos a papel de nitrocelulosa (BIO-RAD) para su inmunodetección 26, 27 . Los sueros de cada individuo positivo al ensayo de ELISA fueron utilizados como anticuerpos primarios a una dilución de 1:100 en TBS-T (NaCl 150 mM, Tween 20 0.05%, leche descremada 2%, Tris-HCl 10 mM pH 7.4). Los anticuerpos unidos a la membrana fueron detectados utilizando un segundo anticuerpo IgG cabra antihumano conjugado a fosfatasa alcalina (Pierce) a una dilución de 1:5000 y el complejo inmune fue revelado con NTB (nitroazul de tetrazolium) (sigma) y BCIP (5bromo-4cloro-3-indolfosfato) (sigma). Las muestras fueron consideradas positivas cuando se observó un reconocimiento igual o parecido al control positivo y por lo menos una banda de reconocimiento diferente a la del control negativo y de segundo anticuerpo (2° Ab). Como control negativo de este ensayo se utilizó una mezcla de sueros de pacientes chagásicos y como control negativo se utilizó una mezcla de sueros de personas aparentemente sanas. Identificación de anticuerpos anti-T. cruzi por el método de ELISA Se determinó la presencia de anticuerpos anti-T. cruzi en las 420 muestras de suero empleando como prueba tamiz la técnica de ELISA y utilizando como antígeno la proteína recombinante MBP::Hsp70 y extractos totales de la cepa Y y H1. Se utilizaron placas de fondo plano (Costar) las cuales se recubrieron con los antígenos a una concentración de 2 µg/ml en amortiguador de carbonatos 0.1 M, pH 9.6, se incubaron durante toda la noche a 4°C. Posteriormente se descartó el antígeno no unido y se bloquearon las placas con 200 µl de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM y KH2PO4 1.4 mM, pH 7.4) conteniendo 5% de leche descremada y se incubaron durante 30 min a 37°C. Las placas se lavaron 2 veces con PBS-Tween 0.05% (PBST), y se incubaron con 50 µl de cada uno de los sueros a una dilución final de 1:200 por triplicado.Al término de la incubación las placas se lavaron cuatro veces con PBST. Después de los lavados, se agregó a cada uno de los pozos 50 µl Obtención del índice de Infección natural El índice de infección natural se obtuvo dividiendo el número de triatominos infectados entre el total de 33 triatominos analizados, el resultado obtenido finalmente se multiplicó por 100. Tezonapa, la presencia de T. cruzi fue monitoreada por la amplificación del DNA de cinetoplasto mediante PCR y la aparición de un producto de amplificación de 235 pb fue considerada como un resultado positivo. (Figura 2) De los insectos obtenidos, 35 mostraron presencia del parásito, identificándose la procedencia de los mismos y un índice de infección natural del 14.83% en el municipio de Tezonapa, cuando se analizó el índice de infección por localidad estudiada se encontró que la localidad del Palmarito posee un índice de infección natural del 1.28%, San Agustín del Palmar con 1.70%, Rancho Nuevo con 3.40%, Las Josefinas con 0.84%, Paraíso la Reforma con 0.84%, Monte Alto con 0.84%. (Figura 3). RESULTADOS El municipio de Tezonapa (Figura 1), se encuentra ubicado en la zona centro del estado de Veracruz en la región de las grandes montañas, en las coordenadas 18° 36’ latitud norte y 96° 41’ longitud oeste a una altura de 220 metros sobre el nivel del mar. Limita al norte con Omealca, al este y sur con el estado de Puebla, Su distancia aproximada al sur de la capital del Estado, por carretera es de 219 Km. Tiene una superficie de 351 km2, Se encuentra regado por los ríos el San Jerónimo y Santiago que son tributarios del Tonto, que a su vez es afluente del río Papaloapan, Su clima es templadohúmedo-regular, con una temperatura media anual de 20°C, su precipitación pluvial media anual es de 2,723 mm, y pertenece a la Jurisdicción Sanitaria No. 7 del Estado de Veracruz. Figura 2. Análisis de la infección de triatominos por T. cruzi mediante PCR. A partir de una muestra obtenida por el por lavado estomacal se amplifico DNA de cinetoplasto de T. cruzi utilizando oligonucleótidos específicos. Los productos obtenidos se analizaron en geles de agarosa al 1.8% tenidos con bromuro de etidio. (1) Marcadores de tamaño, (2) control positivo utilizando DNA de T. cruzi, (3) Control negativo utilizando un DNA no relacionado, (4) Control negativo sin DNA. La flecha indica la presencia de un producto de amplificación de 235 pb específico de T. cruzi. Figura 1. Ubicación geográfica del municipio de Tezonapa, Ver. Análisis de la infección de triatominos Para analizar la presencia de la infección por T. cruzi en triatominos provenientes de localidades rurales del municipio de Tezonapa, se obtuvieron 236 triatominos en 12 localidades rurales del municipio de 34 dos diferentes técnicas. Para confirmar la positividad de las muestras obtenidas por ELISA se realizó un ensayo de Western blot (Figura 5) en donde lo sueros se reaccionaron contra un extracto total del parásito, observándose que solamente 59 (14.0 %) muestras mostraron reconocimiento de proteínas que se encuentran en un rango desde los 180-20 kDa similar al observado por el suero utilizado como control positivo. Figura 3. Índice de infección natural por localidad rural DISCUSIÓN Debido a la escases y discrepancia de datos serológicos con los que se cuenta acerca de la enfermedad de Chagas en el país, este trabajo muestra un panorama actual de la presencia de dicha enfermedad en las comunidades rurales del municipio de Tezonapa; Veracruz, y en vista de que esta enfermedad está considerada con un problema de salud pública en varios países de América Latina, la principal medida de control sobre esta enfermedad está basada en el control vectorial, debido a que estos vectores son la principal causa de infección en estas comunidades rurales. Parte de nuestro estudio fue el de conocer la distribución del vector para definir las áreas de riesgo, y así en conjunto con las autoridades de Salud poder identificar las localidades con población de triatominos portadores de la enfermedad de Chagas y prevenir así la infección de personas con el parasito T. cruzi. Figura 4. Determinación de anticuerpos anti-T. cruzi por el método de ELISA. Los sueros de los pacientes (dilución 1:200) fueron reaccionados con diferentes antígenos, (♦) Proteína recombinante MBP::TcHsp70 (■) Extracto total de T. cruzi cepa Y, (▲) Extracto total de T. cruzi cepa H1. La línea punteada muestra la línea de corte para los antígenos. Esta figura es representativa de los ensayos realizados y muestra solamente 20 de las 113 muestras positivas al método de ELISA Figura 5. Determinación de anticuerpos anti-T. cruzi por Western blot. El extracto total del T. cruzi fue separado electroforéticamente y transferido a papel de nitrocelulosa. A (M) Marcadores de peso molecular, (+) Control positivo, (-) Control negativo (2° Ab) Control de segundo anticuerpo. B Suero de pacientes de las localidades rurales dilución (1:100). Los nombres en la parte superior del panel B indican la clave por localidad y número de las muestras. Esta figura es representativa de los ensayos de Western blot y solo se muestra 20 de las 113 muestras analizadas. Identificación de anticuerpos anti- T. cruzi Para identificar la presencia de anticuerpos específicos anti-T. cruzi, los 420 sueros recolectados se tamizaron mediante la técnica de ELISA (Figura 4), los antígenos usados en este ensayo fue un extracto total de la cepa Y, un extracto total de la cepa H1 y la proteína recombinante MBP::Hsp70 de T cruzi, para diferenciar los sueros positivos de los negativos se utilizó una línea de corte de 0.375, 0.415 y 0.420 D.O para cada antígeno respectivamente, encontrandose 113 (26.9 %) muestras positivas (Dato no mostrado). Ensayos de Western blot El diagnóstico de la enfermedad de Chagas se realiza por la búsqueda de anticuerpos por al menos 35 Los programas de control vectorial son de esta manera benéficos para el conocimiento derivado de las investigaciones moleculares, su principal contribución en el estudio de los triatominos ha sido la identificación y caracterización de las poblaciones de vectores introducidas en países de América central y del cono sur 28. Los datos encontrados en nuestro estudio confirman que la transmisión natural de la enfermedad ocurre en las localidades analizadas, ya que la presencia del vector en la zonas de estudio provee el entorno necesario para esta forma de transmisión, los resultados obtenidos en este trabajo muestran un índice de infección natural de triatominos de 14.83 % arriba del encontrado por otro trabajo relacionado 29 que fue de 10.6% para todo el estado de Veracruz. Estos resultados muestran que tan solo en una pequeña población del estado de Veracruz el índice de infección es mayor al reportado con anterioridad 29 , sugiriendo que la infección se lleva de forma activa y que el riesgo de adquirir la infección está latente. La fase aguda de la enfermedad de Chagas no es diagnosticada de forma regular, porque con frecuencia cursa de forma asintomática, sin embargo, la transmisión natural está bajo control en algunos países de América Latina, pero es necesario seguir con los monitoreos epidemiológicos en los países en donde este tipo de transmisión no ha sido controlada 30. El ensayo serológico es el método más común y práctico para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, en algunos países de América latina el riesgo de transmisión por T. cruzi es endémico y el diagnóstico se realiza por la búsqueda de anticuerpos por al menos dos diferentes técnicas 31 . En aquellos países en el que la enfermedad no es endémica, es aconsejable realizar ensayos serológicos para la búsqueda de anticuerpos en niños recién nacidos o en transfusiones sanguíneas de personas provenientes de lugares en donde la enfermedad es endémica 32. Los ensayos serológicos convencionales para diagnosticar la enfermedad de Chagas (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), Inmunofluorescencia indirecta (IFI), hemaglutinación indirecta (HAI)) usualmente emplean antígenos semipurificados de epimastigotes o antígenos crudos del parásito, de esta forma estos ensayos permiten un gran número de resultados inconclusos o de falsos positivos, principalmente cuando es asociada con una infección con el género Leishmania, 33 o bien si los sueros presentan un grado de hemolisis. El diagnóstico etiológico de la tripanosomiasis americana, está basado en la presencia de anticuerpos contra T. cruzi en el suero de individuos infectados. La inclusión de antígenos recombinantes y péptidos sintéticos para el diagnóstico serológico de la infección han mostrado avances en términos de la especificidad34. Sin embargo en nuestros ensayos se encontraron una gran cantidad de falsos positivos al método de ELISA, posiblemente debido a que las muestras que fueron proporcionadas para el ensayo algunos presentaban un grado de hemolisis y en algunos casos presentaban un estado lipémico. Sin embargo, cabe resaltar que los sueros que fueron positivos a los extractos también fueron positivos a la proteína recombinante teniendo una buena concordancia con los antígenos empleados. La incursión del Western blot como una prueba complementaria y confirmatoria a los estudios realizados por la serología convencional ha dado muy buenos resultados a otros autores 35, ya que es una prueba rápida y de fácil manejo sin la necesidad de utilizar equipo sofisticado, en relación a nuestras muestras, solo 59 de las 113 positivas al método de ELISA mostraron un reconocimiento similar al control positivo mediante el método de Western. Estos resultados permiten concluir en nuestro estudio que en doce comunidades rurales pertenecientes al municipio de Tezonapa existe una seroprevalencia del 14% la cual concuerda con lo reportado para el estado de Veracruz que fue de un 15% 29. Los datos sobre seroprevalencia en el país, controvertidos por años, se han consolidado y se acepta una seroprevalencia de 1.6%; llama la atención que en el año 2000 el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica sólo informó 11 casos nuevos. Esta discrepancia podría explicarse por que la enfermedad ha sido ignorada por las autoridades sanitarias en diversos niveles de gobierno y es desconocida para el médico promedio 4. Por lo cual, estos estudios son de vital importancia para conocer el estado actual de la enfermedad así como su distribución, para poder entonces, elaborar nuevas estrategias que permitan el control de dicha enfermedad y prevenir así un mayor número de nuevas infecciones. CONCLUSIÓN De los resultados obtenidos en este trabajo se puede concluir que la presencia del parásito T. cruzi está latente en zonas rurales del Estado de Veracruz y este hecho constituye una amenaza permanente para el estado de salud de sus habitantes, por lo que es necesario implementar nuevos programas de control que permitan un aseguramiento en la calidad de vida de dichos habitantes. 36 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 14. Sosa Jurado F, Zumaquero Rios JL, Reyes PA, Cruz Garcia A, Guzman Bracho C, Monteon VM. 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Depto. de Patología Experimental, CINVESTAV-IPN, Avenida Instituto Politécnico Nacional No. 2508 San Pedro Zacatenco CP 07630. México, D.F. ANTECEDENTES Conyza filaginoides es una planta originaria de México, conocida comúnmente como Simonillo, la cual se encuentra distribuida en los estados de Hidalgo, Oaxaca, Morelos, Michoacán, Guanajuato y Estado de México, el té de las ramas se usa para la diarrea, el dolor de estómago y la bilis. Desde tiempos inmemorables se ha utilizado para combatir enfermedades gastrointestinales24 . Se ha reportado que algunos componentes de C. filaginoides poseen actividad antiprotozoaria contra E. histolytica y G. lamblia5 y es muy utilizada dentro de la población de escasos recursos cuando se padece de trastornos intestinales como la diarrea (Figura 1). La medicina tradicional (MT) tiene muchas características positivas entre las que se incluyen: diversidad y flexibilidad; accesibilidad y asequibilidad en muchas partes del mundo; amplia aceptación entre muchas poblaciones de países en vías de desarrollo; aumento de la popularidad en países desarrollados, un costo comparativo relativamente bajo; bajo nivel de inversión tecnológica y una creciente importancia económica. Por este motivo, en los países de bajos ingresos, como el nuestro, es necesario realizar una serie de actividades para velar por la seguridad y eficacia de la medicina tradicional, dentro de las que se encuentran, establecer un comité nacional de expertos, formular reglamentaciones nacionales de las medicinas herbarias, dispensar autorizaciones para ejercer la MT y facilitar la ayuda a la investigación. Aunque la MT se utiliza ampliamente en la prevención, diagnóstico, tratamiento y gestión de enfermedades, muy pocos países han desarrollado una política nacional sobre MT. De acuerdo con este último punto, la Organización Mundial de la Salud (OMS), publicó un documento denominado “Estrategias de la OMS sobre Medicina Tradicional 2002-2005”, en donde se menciona que los más importantes temas a atajar se encuentran el de tener una política nacional y marcos de trabajo legislativos; seguridad, eficacia y calidad; acceso y uso racional. Dentro de las áreas prioritarias de investigación sobre MT, la OMS menciona el de estudiar los mecanismos de acción de las terapias individuales, incluyendo los patrones de respuesta al tratamiento. México no ha sido la excepción, ya que a partir de esta propuesta se comienza a replantear la investigación científica de las plantas utilizadas como medicamento por la población mexicana. Las medicinas con base de hierbas y la acupuntura son las terapias de la MT más ampliamente utilizadas.1 Figura 1. Conyza filaginoides Se tienen evidencias del uso de plantas medicinales que tienen propiedades amebicidas y no representan riesgos tóxicos para el usuario6-7. De la misma manera se han aislado compuestos bioactivos de éstas plantas con las mismas características de seguridad y eficacia8, 9. Desde tiempos inmemorables el hombre ha utilizado las plantas con fines terapéuticos. Tanto en los países pobres, donde la fitoterapia constituye 39 prácticamente la forma de tratamiento más económica y arraigada a la cultura popular, como en los países altamente industrializados, donde las plantas son fuentes de medicamentos. La importancia de las plantas medicinales, en el proceso para la obtención de nuevos medicamentos, es un hecho incontrovertible aceptado por la ciencia médica hace más de ciento cincuenta años. Un número importante de los fármacos de uso de la medicina contemporánea son obtenidos de vegetales o subproductos de éstos, sometidos a varios niveles de transformación química. En las últimas décadas del siglo pasado, en todo el mundo se ha incrementado el interés por el estudio y el uso de las plantas medicinales. Este interés está dirigido a descubrir nuevas moléculas biológicamente activas para la industria farmacéutica y en la adopción de extractos crudos de plantas para contar con tratamientos eficaces de bajo costo para la auto-medicación por el público en general10. Las plantas medicinales suelen utilizarse para tratar o prevenir dolencias y enfermedades, muchos de los consumidores utilizan las plantas medicinales como autotratamiento debido a la creencia común de que “natural” significa “inocuo”. Probablemente ignoran los posibles efectos secundarios y cómo y cuándo se pueden tomar las medicinas herbarias sin riesgo. En la mayoría de los países, o bien no existen sistemas de vigilancia de la seguridad o el sistema de vigilancia no abarca las medicinas herbarias11, de acuerdo con esto se han reportado casos de utilización indebida de preparaciones herbarias debido a la falta de controles de calidad y a la mala utilización por los consumidores. América Latina en conjunto con el resto de los países en vías de desarrollo enfrenta día a día problemas de Salud Pública, que se tornan cada vez más intensos y de más difícil control. En México, la diarrea es un serio problema de Salud Pública y es la segunda causa de enfermedad entre grupos de todas las edades12. Hasta el momento se han realizado estudios empleando diferentes plantas utilizadas en la MT mexicana para los desórdenes intestinales, sin embargo se han evaluado propiedades antibacteriales y no propiedades antiparasitarias13. Hasta el momento, la amibiasis se trata con diversos fármacos como el albendazol, metronidazol y sus derivados14. Los resultados han tenido eficacia en cuanto al control parasitario, sin embargo presentan un alto índice de toxicidad en el individuo y conllevan a interacciones medicamentosas con esteroides y antipiréticos, además del alto costo que generan estos tratamientos15. Por otro lado sabemos que las diarreas pueden ser causadas por diversos agentes etiológicos (bacterias, virus y parásitos), por tal motivo es de vital importancia investigar si estos extractos acuosos son capaces de eliminar directamente a los microorganismos causantes de diarrea o el mecanismo de eliminación es a través de la activación del sistema inmune. Por tal motivo el objetivo del presente trabajo fue el de estudiar el efecto del extracto acuoso de C. filaginoides sobre el crecimiento de E. histolytica. MATERIALES Y MÉTODOS Selección del material vegetal Conyza filaginoides (Simonillo) fue colectada en el mes de Octubre a orillas de la carretera en la comunidad del Guajolote, Municipio de Epazoyucan, Hidalgo, se colectó la parte aérea y una muestra de esta planta fue depositada en él Herbario Nacional MEXU del Instituto de Biología de la UNAM, para su identificación taxonómica. El material vegetal seleccionado se dejó secar a temperatura ambiente (en la sombra) y después se fragmento utilizando un molino eléctrico de engranes, con la finalidad de aumentar la superficie de contacto con los disolventes durante la extracción. Obtención de extractos acuosos El extracto acuoso de las plantas de uso terapéutico Conyza filaginoides, se preparó tal y como se utiliza en la terapéutica tradicional empleando el método de infusión. Se dejó hervir 100 ml de agua en una parrilla eléctrica y cuando el agua alcanzó el punto de ebullición, se procedió inmediatamente a agregar el material vegetal seco y molido (5 g), se dejó en ebullición por 10 minutos y se retiró del fuego, posteriormente se filtró pasando por papel Whatman para eliminar el material no disuelto y fue liofilizado para secar el extracto acuoso. El extracto acuoso se almacenó de 0-4° C hasta su uso. Preparación bioensayos de extractos acuosos para A partir del extracto acuoso obtenido anteriormente se preparó una solución de 100 mg/ml en amortiguador de fosfatos (PBS, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4.7H2O 4.3 mM y KH2PO4 1.4 mM, pH 7.4) se disolvió el extracto acuoso y posteriormente se adicionó ácido N-2-hidroxietil piperazina-N’-etanosulfónico 1M (HEPES), hasta neutralizar la solución. Luego se centrifugó por 5 minutos a 14,000 rpm. La fracción soluble fue esterilizada por filtración en membranas Millipore de 0.22 µm y finalmente se conservó en congelación hasta su uso. 40 Cultivo axénico de E. histolytica peritoneal. Al término del masaje se recolectó todo el fluido peritoneal posible y se depositó en tubos cónicos estériles de 50 ml (Costar) sobre hielo, la solución se centrifugó durante 10 minutos y se recolectaron las células peritoneales. La pastilla celular obtenida se lavó una vez con medio de cultivo y finalmente las células se ajustaron a la densidad deseada de acuerdo a las condiciones del experimento en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10%. La cepa de amibas HM1: IMSS fue donada amablemente por el Dr. José Luis Rosales Encina del CINVESTAV-IPN. Las amibas fueron cultivadas en medio TYI-S-33 suplementado con vitaminas y suero bovino adulto, a 37º C, y fueron colectadas a las 72 horas de cultivo16. Actividad anti-parasitaria sobre E. histolytica Determinación de óxido nítrico (ON) Las amibas de la cepa HM1:IMSS se cosecharon a las 72 horas de cultivo (fase logarítmica), se enfriaron en hielo aproximadamente de 20 a 30 min. Las amibas se colectaron por centrifugación a 1200 rpm durante 5 min, se retiro el sobrenadante y se lavaron 3X con PBS. En el último lavado se tomó una alícuota y las amibas se contaron en la cámara de Neubauer (Hematocitómetro) y se colocaron 1 × 104 trofozoíitos por cada tubo de cultivo, cada tubo contenía una concentración (0, 200, 400, 600, 800 y 1,000 µg/ml) adecuada del extracto acuoso de Conyza filaginoides, los tubos se incubaron a 37º C durante 7 días, al término de los cuales los tubos se colocaron en hielo para despegar las amibas, los tubos se centrifugaron y se determino el porcentaje de viabilidad por exclusión con azul tripano. A partir de las amibas interaccionadas con el extracto acuoso, se realizaron extractos proteicos. Las proteínas fueron separadas electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 10 % conteniendo SDS al 0.1% (SDS-PAGE) en presencia de amortiguador de muestra (Glicerol 2%, SDS 4%, Tris-HCl 50 mM pH 6.8, β-ME 200 mM, azul de bromofenol 0.2%), y fueron visualizadas por tinción con Azul de Coomassie y tinción con plata17. Una vez obtenidas las células residentes de peritoneo de los ratones normales, las células se ajustaron a una densidad de 3 x 105 células/pozo en medio de cultivo suplementado con 10% de suero fetal bovino, las células fueron plaqueadas en cajas de cultivo de 96 pozos, las células fueron estimuladas con diferentes concentraciones del extracto acuoso de C. filaginoides (31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 y 2000 µg/ml) en la presencia de L-NAME (4.6-300 µM) (Sigma) y fueron incubadas por 24 horas a 37º C en una atmósfera húmeda de 5% de CO2. Al término de la incubación se recuperaron 50 µl del sobrenadante del cultivo y se transfirieron a una placa de 96 pozos de fondo redondo (Costar)). Las muestras se trabajaron por triplicado. Posteriormente se agregaron 50 µl del reactivo de Griess (25 µl de sulfanilamida 1% más 25 µl de N-naftiletilendiammina 0.01% en H3PO4 al 2.5%) a cada muestra. Las muestras se incubaron durante 10 min y la densidad óptica se leyó a 550 nm en un Multiskan. Los valores de nitritos se obtuvieron por la interpolación de las densidades ópticas obtenidas con los valores de una curva estándar de NaNO2 (Sigma) (12.5-100 µM). Como control positivo de la inducción de ON, las células fueron estimuladas con interferón gamma (IFNγ) a una concentración de 100 U/ml, y como control negativo las células fueron estimuladas con una proteína irrelevante como ovoalbúmina (OVA) a una concentración de 10 µg/ml. Obtención de macrófagos de peritoneo Determinación de la expresión de iNOS Realización de extractos proteicos de E. histolytica Lo ratones de la cepa BALB/c de 4-6 semanas de edad fueron sacrificados según Kruisbeek18 por desnucamiento, posteriormente se limpió el abdomen con alcohol al 70% para esterilizar el área, se realizó una incisión en la línea media sobre la piel del peritoneo, luego se separó la piel con unas pinzas para exponer la pared peritoneal intacta y se introdujo una jeringa de 10 ml con medio de cultivo DMEM (Gibco-BRL) frío, una vez con el medio de cultivo en la cavidad peritoneal del ratón se procedió a dar masaje durante 10 minutos aproximadamente sin retirar la aguja de la cavidad • Por Western blot La determinación de la expresión de la enzima sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) se realizó en macrófagos de peritoneo de ratones de la cepa BALB/c tratados con el extracto acuoso. Para la detección los extractos proteícos de los macrófagos interaccionados con el extracto acuoso de Conyza filaginoides fueron separados en geles de SDS-PAGE al 10% en presencia de un amortiguador de muestra17 y fueron transferidos electroforéticamente a papel de nitrocelulosa (BIO-RAD) 41 para su inmunodetección19, 20. La iNOS fue detectada utilizando anticuerpos específicos contra la iNOS de ratón (Cayman) a una dilución de 1:5000 en TBS-T (NaCl 150 mM, Tween 20 0.05%, leche descremada 2% y Tris-HCl 10 mM pH 7.4). Los anticuerpos unidos a la membrana fueron detectados utilizando un segundo anticuerpo IgG cabra anti-ratón conjugado a fosfatasa alcalina (Pierce) a una dilución de 1:5000 y luego revelado con NBT (Nitroazul de tetrazolium) y BCIP (5-bromo-4-cloro-3 indolfosfato) (Sigma). • Para analizar a qué nivel estaba la inhibición de la producción de ON, a partir de los macrófagos de peritoneo que estuvieron en contacto con las diferentes concentraciones del EACf se obtuvo un extracto proteico el cual se separó electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 10% en condiciones desnaturalizantes, posteriormente las proteínas fueron transferidas a papel de nitrocelulosa, para realizar un Western blot con un anticuerpo anti-iNOS observándose que a manera que la concentración del EACf aumentaba, la expresión de la sintasa de óxido nítrico inducible disminuía (Figura 5A). Para confirmar que realmente la expresión de la enzima estaba disminuida se realizó el mismo procedimiento pero revelando la membrana con un sustrato más sensible como es el caso del luminol por medio de una reacción de quimioluminiscencia, observándose que efectivamente a una concentración de 500 µg/ml no existe expresión de la iNOS (Figura 5B). Por otro lado, para investigar el mecanismo por el cual el EACf estaba inhibiendo la producción de ON, se realizó el mismo ensayo pero adicionando a cada pozo un inhibidor competitivo de la enzima iNOS como es el caso del L-NAME, ya que al ser este un inhibidor competitivo de la enzima, la enzima debería de estar presente en las muestras (Figura 5C), los resultados mostraron que el EACf no posee inhibidores competitivos para la enzima iNOS, ya que en las Figuras 5A y 5B no se observó la expresión de la enzima, indicando que el EACf inhibe directamente la expresión de la enzima Por quimioluminiscencia Para la detección por quimioluminiscencia se realizó lo mismo que para el Western blot. La iNOS fue detectada utilizando anticuerpos específicos contra la iNOS de ratón (Cayman) a una dilución de 1:5000 en TBS-T (NaCl 150 mM, Tween 20 0.05%, leche descremada 2% y Tris-HCl 10 mM pH 7.4). Los anticuerpos unidos a la membrana fueron detectados utilizando un segundo anticuerpo IgG cabra anti-ratón conjugado a peroxidasa (Pierce) a una dilución de 1:5000 y luego revelado con luminol como sustrato (Pierce). RESULTADOS Con la finalidad de analizar el efecto que tenía el extracto acuoso de C. filaginoides (EACf) sobre el crecimiento de E. histolytica, se interaccionaron trofozoítos de este parásito con diferentes concentraciones del EACf, observándose que existe un efecto tóxico a una concentración de 800 µg/ml, ya que la viabilidad de las amibas fue del 43% (Figura 2). Para investigar si existía una proteína que se expresará por acción del extracto acuoso de C. filaginoides se recuperaron las amibas que estuvieron en contacto con el extracto acuoso y se observó que a una concentración de 400 µg/ml de extracto existe la expresión de una proteína de aproximadamente 97 kDa lo cual podría reflejar un mecanismo de defensa del parásito a la acción del extracto acuoso (Figura 3). Por otra parte, debido a que el macrófago es una de las células más importantes en la respuesta inmune inducida contra E. histolytica, en nuestro laboratorio hemos investigado si el extracto acuoso de Conyza filaginoides presenta algunas propiedades inmunomoduladoras, observándose que es capaz de disminuir la producción de ON en macrófagos de peritoneo de ratones BALB/c activados con IFNγ cuando estos son interaccionados in vitro con el EACf (Figura 4). Figura 2. Efecto del extracto acuoso de C. filaginoides. Tubos con medio TYI-S-33 fueron inoculados con 105 trofozoítos de E. histolytica de la cepa HM1:IMSS. Diferentes concentraciones del extracto acuoso fue adicionado a cada tubo (200-1000 µg/mL). La viabilidad de las amibas fue determinada por la exclusión con azul tripano después de 7 días de cultivo. 42 Figura 3. SDS-PAGE de trofozoítos de E. histolytica interaccionados con el extracto acuoso de C. filaginoides. Amibas interaccionadas con diferentes concentraciones del extracto fueron obtenidas por centrifugación y lisadas con amortiguador de muestra. (1) Trofozoítos de E. histolytica no interaccionados, (2-6) Interaccionados con 200, 400, 600, 800 y 1000 µg/mL. Las proteínas amibianas fueron separadas en SDS-PAGE al 10% y teñidas con azul de Coomassie. (M) Marcadores de bajo peso molecular. Figura 5. Detección de iNOS en macrófagos de peritoneo. Macrófagos peritoneales de ratones BALB/c fueron estimulados durante 48 h de la siguiente manera: (A y B), IFN-γ (100 U/mL) (1), OVA (10 µg/mL) (2), S/E (3) y diferentes concentraciones de extracto acuoso de C. filaginoides: 31.25 (4), 62.5 (5), 125 (6), 250 (7), 500 (8), 1000 (9) y 2000 µg/mL (10). (C) IFN-γ (100 U/mL) (1), OVA (10 µg/mL) (2), S/E (3) y estimulados con IFN-γ en presencia de diferentes concentraciones de L-NAME (4.6-300 µM) (4-10). Las células fueron lisadas y el extracto se separó electroforéticamente en SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a papel de nitrocelulosa. (A) Western blot y (B y C) ensayo de quimioluminiscencia con un anticuerpo a-iNOS 1:2500. DISCUSIÓN El siglo XX nos ha enseñado que el papel que juegan los recursos herbolarios en el contexto de las llamadas “medicinas tradicionales o indígenas es práctico o empírico en cuanto al fundamento de su aplicación y profundamente social por estar vinculado a diversos aspectos de la cultura. Es indiscutible que las plantas medicinales y las prácticas médicas tradicionales son un valioso recurso de la población de escasos recursos para hacer frente a sus problemas de salud, no obstante en su mayoría está destinado a resolver la enfermedad y no a prevenirla. Las estadísticas demuestran abrumadoramente que es en los países más pobres del mundo donde más se necesitan tratamientos baratos y eficaces. Más del 50% de las muertes infantiles en los países en vías de desarrollo se deben a enfermedades infecciosas. Al mismo tiempo, el acceso a los fármacos químicos modernos esenciales es limitado, debido a que existe financiamiento inadecuado y un aporte sanitario escaso. En los países en vías de desarrollo, sin embargo, la MT puede ser comparativamente barata, en este contexto, dentro de las estrategias de la OMS sobre MT se encuentran el realizar estudios de los mecanismos de acción de las terapias individuales, incluyendo patrones de respuesta al tratamiento1. Figura 4. Determinación de ON en macrófagos de peritoneo activados con IFN-γ. Macrófagos obtenidos por exudado peritoneal de ratones BALB/c fueron estimulados con IFNγ y OVA en la ausencia y presencia de diferentes concentraciones del extracto acuoso de C. filaginoides. La determinación de NO-2 se llevo a cabo en los sobrenadantes después de las 48 horas de cultivo mediante el método de Griess. Los resultados son representativos de tres experimentos realizados de manera independiente. 43 El interés en el estudio de las plantas medicinales como una fuente de compuestos farmacológicamente activos se ha incrementado en el mundo entero. Se sabe que en los países en vías de desarrollo, las plantas son la fuente medicinal principal para tratar las enfermedades infecciosas. En estos países las condiciones de vida son sumamente bajas y las condiciones de higiene son muy pobres, la diarrea y la disentería representa una de las principales causas de morbilidad y mortalidad13. Las diarreas causadas por parásitos resultan de vital importancia, en México, la amibiasis ocupa uno de los primeros lugares en parasitosis, aproximadamente 40 millones de personas desarrollan la enfermedad intestinal o la principal complicación extraintestinal (absceso hepático amibiano), y alrededor de 50,000 a 100,000 de individuos mueren de amibiasis anualmente21. La amibiasis intestinal se caracteriza por diarrea fulminante y hemorragia intestinal, y son precisamente estos trastornos los que permiten la diseminación de la amiba a sitios sistémicos, comúnmente el hígado, donde ocasiona el absceso hepático amibiano (AHA) (Figura 6)22. plantas (preparados acuosos) para curar las afecciones gastrointestinales y no los constituyentes de la planta. Actualmente no se han realizado estudios que permitan comprender el mecanismo de acción por el cual el extracto acuoso de Conyza filaginoides ejerce sus efectos contra los desordenes intestinales para los cuales son utilizados en algunos estados de México, asimismo se desconoce si este extracto realmente cura o solamente modula el proceso inflamatorio involucrado en estos desórdenes. Un paso importante en la eliminación del parásito E. histolytica es la activación del macrófago, éstos son activados por citocinas derivadas de la célula T. La susceptibilidad de las amibas a ser eliminadas por los macrófagos, indica que la modulación de la producción de citocinas y las funciones de célula efectora son un paso primordial para la sobrevivencia de los trofozoítos en el hígado. El TNFα juega un papel importante en el control de la amibiasis, ya que induce la liberación de óxido nítrico (ON) por parte del macrófago23 y de metabolitos del oxígeno (H2O2 y O-2), los cuales son importantes para eliminar parásitos. Aunque los trofozoítos de E. histolytica son susceptibles a la muerte por H2O2, la citotoxicidad del macrófago contra las amibas está mediada principalmente por el ON24. Las células T son una fuente importante de citocinas que activan al macrófago y pueden además directamente ser citotóxicos para las amibas, aunque el mecanismo no se conoce, también se ha mostrado que la eliminación de células T inhibe la capacidad de las células esplénicas para transferir inmunidad a animales receptores25. Por ello, la activación de células T específicas de antígeno, la producción de citocinas y la actividad citotóxica de ésta son componentes importantes de la inmunidad contra E. histolytica. En el presente trabajo se encontró que C. filaginoides tiene propiedades amebicidas, en respuesta la amiba secreta una proteína que puede fungir como un mecanismo de defensa del parásito a la acción del EACf. En E. histolytica se han descrito varios genes de multiresistencia a drogas (MDR) que codifican para glicoproteínas presentes en la membrana del parásito y que son los encargados de bombear la droga del citoplasma al exterior26. También se encontró que el EACf presenta propiedades anti-inflamatorias ya que existe disminución de ON a nivel de la expresión de la enzima, este mismo efecto se ha observado con otros extracto acuosos, en donde se ha visto que ciertos extractos acuosos suprimen la respuesta inflamatoria inducida por lipopolisacárido (LPS) a través de la inhibición en la producción de ON y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), esta inhibición Figura 6. Tipos de amibiasis. E. histolytica infecta al humano causando dos tipos de amibiasis: La amibiasis intestinal y la amibiasis extraintestinal, comúnmente llamado Absceso Hepático Amibiano (AHA). Hasta el momento, la amibiasis se trata con diversos fármacos como el albendazol, metronidazol y sus derivados14. Los resultados han tenido eficacia en cuanto al control parasitario, sin embargo presentan un alto índice de toxicidad en el individuo y conllevan a interacciones medicamentosas con esteroides y antipiréticos, además del alto costo que generan estos tratamientos15. Por otro lado se sabe que las diarreas pueden ser causadas por diversos agentes etiológicos (bacterias, virus y parásitos), por tal motivo es de vital importancia investigar si estos extractos acuosos son capaces de eliminar directamente a los microorganismos causantes de diarrea o el mecanismo de eliminación es a través de la activación del sistema inmune. Existen constituyentes de C. filaginoides que tienen propiedades anti-protozoarias5, sin embargo, la población de escasos recursos utiliza infusiones de las 44 está directamente relacionada con una disminución en la transcripción del factor nuclear NF-κB27, el cual está relacionado con la inducción de mediadores proinflamatorios que contribuyen a una respuesta inmune inflamatoria de tipo sistémico28, 29. 9. Di Stasi LC. Amoebicidal compounds from medicinal plants. Parassitologia 1995; 37(1): 29-39. 10. Houghton PJ. The role of plants in traditional medicine and current therapy. J Altern Complement Med 1995; 1(2): 131-143. 11. Medicina Tradicional, Informe de la Secretaría, 56ª Asamblea Mundial de la Salud, OMS; 2003. 12. Secretaria de Salud (SS). Manual de Vigilancia Epidemiológica, [en línea] 2003 DGE, México.URL disponible en: http://www.ssa.gob.mx/epide/2003/ sem49/cua4.1.html. 13. Alanís AD, Calzada F, Cervantes JA, Torres J, Ceballos GM. Antibacterial properties of some plants used in Mexican traditional medicine for the treatment of gastrointestinal disorders. J Pharmacol 2005; 100(1-2): 153-157. 14. Powell SJ, MacLead L, Wilmot AJ, Elsdon-Dew R. Metronidazole in amoebic dysentery and amoebic liver abscess. Lancet 1996; 17: 1329-1331. 15. Gujral S, Patel N, Chaudhuri SK, Seth P. Altered lipid profile in liver amoebiasis and its emendation with metronidazole treatment. Indian J Physiol Pharmacol 1982; 26(3): 240-245. 16. Diamond LS, Harlow DR, Cunnick CC. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg 1978; 72(4):431-432. 17. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 1970; 227(5259): 680-685. 18. Kruisbeek M Vogel N. Macrophages and Monocytes. In Current Protocols in Immunology, New York: Vol 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience; 1991. 19. Renart J, Reiser J, Stark GR. 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Los resultados de este estudio validan el uso de esta planta en la MT mexicana en el tratamiento de desórdenes gastrointestinales tales como la diarrea y la disentería y sugieren que parte de su acción es debida a propiedades inmunomoduladoras que le pueden permitir actuar como un agente terapéutico para enfermedades inflamatorias. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Organización Mundial de la Salud. Estrategia de la OMS sobre Medicina Tradicional 2002-2005. Ginebra, Organización Mundial de la Salud, (documento de referencia WHO/EDM/TRM/2002); 2002. 2. Martínez M. Las plantas medicinales de México, 6ª ed. México, DF Ediciones Botas; 1967. 3. Márquez C., et al. Plantas Medicinales de México II. Composición, usos y actividad biológica. México, DF UNAM; 1999. 4. Villavicencio MA, Pérez EBE. Plantas útiles del Estado de Hidalgo II. Pachuca, Hgo., México: UAEH; 2002. 5. Calzada F, Cedillo-Rivera R, Mata R. Antiprotozoal activity of the constituents of Conyza filaginoides. 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J Surg Res 1999; 83:89-94. 46 Análisis de la interacción entre el receptor tipo toll y el virus de dengue 2 en monocitos humanos Hernández Orta K1,2 , Vivanco Cid H1,2 , Alexander Aguilera A2 , Ruíz Pacheco J1 , Parissi Crivelli A.1 1 2 Laboratorio Estatal de Salud Pública, depto-Bioseguridad 3 Universidad Veracruzana, Facultad de Bioanálisis- Universidad Cristobal Colón. [email protected] INTRODUCCIÓN IL-8 e IL-12, no hubo diferencias al comparar las células estimuladas (con o sin bloqueo para TLR4) contra células control que no lo fueron (células sin estímulo). Finalmente se analizó la modulación en la expresión de TLR4 en monocitos humanos que fueron estimulados con Virus Dengue, encontrando que la estimulación induce disminución en la expresión de la proteína en superficie, lo cual fue visualizado por citometría de flujo. Estos resultados permiten proponer a TLR4 como un receptor necesario para inducir la síntesis de TNF-α, abren la posibilidad de que en un futuro, este conocimiento pueda sentar las bases para la intervención molecular en la enfermedad, directamente al inhibir la ruta de señalización que es activada a través de TLR4. El Dengue es una enfermedad infecciosa producida por alguno de los cuatro serotipos del virus Dengue (Familia Flaviviridae) y es transmitida al hombre por mosquitos vectores, principalmente Aedes aegypti. Clínicamente, la enfermedad puede manifestarse con fiebre llamada Fiebre por Dengue (FD), o como formas más severas denominadas Fiebre Hemorrágica por Dengue (FHD) y Síndrome de Choque por Dengue (SCD), las cuales llegan a ser fatales. En la infección por virus del Dengue, las células monocíticas son la principal población susceptible de ser infectada por el virus, y la principal fuente de citocinas de tipo inflamatorio, tales como TNF-α, IL-1β, IL-6 e IFN-γ. La producción no controlada de estas citocinas, propicia la aparición de las formas severas de FHD y SCD. Uno de los descubrimientos más importantes que han llevado a explicar los mecanismos moleculares que propician la respuesta inflamatoria inducida por moléculas de origen microbiano, así como a comprender más el origen de cuadros patológicos que se presentan como consecuencia de una respuesta exacerbada, lo fue el descubrimiento de los receptores tipo Toll o TLRs. Estos receptores localizados en la superficie de células fagocíticas, participan en la respuesta inmune innata a través del reconocimiento de moléculas presentes en patógenos El objetivo del presente trabajo, fue evaluar la interacción de un miembro de la familia de TLRs: El receptor TLR4, con el serotipo 2 del virus del Dengue en un modelo experimental in vitro de monocitos humanos. La estrategia metodológica que se siguió fue el bloqueo del receptor sobre esta población celular empleando un anticuerpo monoclonal antagonista y la posterior estimulación con el serotipo 2 del virus Dengue. Finalmente se evaluó como dicho bloqueo, influye en la activación y producción de mediadores inflamatorios inducidos por el virus en monocitos humanos. Los resultados mostraron que bloqueando al receptor TLR4 en monocitos humanos, se inhibe en un porcentaje significativo la producción de uno de los principales mediadores inflamatorios durante la infección por Dengue: TNF-α. El efecto de bloqueo fue selectivo para esta citocina, ya que al analizar la producción de JUSTIFICACIÓN En la actualidad el Dengue se constituye como una de las enfermedades re-emergentes más importantes en todo el mundo y sin duda la número uno como ejemplo de enfermedad transmisible por vector. La enfermedad es endémica ahora en más de 100 países del mundo, localizándose en regiones tropicales y subtropicales de África, América, Asia mediterránea sur oriental, el este y el pacifico occidental, siendo el continente americano uno de los mas afectados. Los esfuerzos internacionales para prevenir estas epidemias giran en torno a la vigilancia epidemiológica-virológica y el control del vector. En México el Dengue se constituye como una enfermedad endémica en algunas zonas donde no se ha podido erradicar el vector. En el último año el problema se ha agudizado aún más debido a que se han presentado cuadros de DH en las zonas del pacífico y del sureste del país. En relación al virus de Dengue poco se ha explorado con respecto a la relación temprana que se establece entre componentes o moléculas propios del patógeno y receptores de superficie celular tipo PRRs en el hospedero. El virus del Dengue como antígeno, se comporta como un potente inductor de los mecanismos de respuesta inmune innata, a través de la producción de mediadores inflamatorios tales como TNF-α MIP-1α, MIP-1β, IL8 etc. La liberación de estos mediadores inflamatorios juega un papel determinante en la inmunopatología de la enfermedad, sobre todo en las formas severas tal como 47 DH o SCD en donde son los responsables de fenómenos tales como el aumento en la permeabilidad vascular, activación de complemento, liberación de tromboplastina, insuficiencia circulatoria, etc. La participación de los receptores similares a Toll como probables PRRs involucrados en el reconocimiento y la señalización inducida por alguna de las moléculas presentes en el virus de Dengue no se había explorado. Esta interacción que se abordó en el presente trabajo podría explicar como el virus del Dengue genera una serie de señales de activación en células de estirpe mielode, que culmina con el cuadro inflamatorio tan particular de la enfermedad. Los datos generados contribuirán a entender mejor la inmunopatogénesis de la enfermedad y permitirán contar con el conocimiento necesario para explorar nuevos blancos terapéuticos para la intervención en esta patología. estratificación sobre una mezcla de Ficoll-hypaque, el cual es un polímero de carbohidratos y metrizamida, un compuesto denso que contiene yodo. Este procedimiento rinde en la interfase dos halos con células diferentes: las células polimorfonucleares al fondo del gradiente y las mononucleares (monocitos y linfocitos) que lo hacen sobre el gradiente de Ficoll-hypaque (73). Figura 1. Estratificación sobre una mezcla de Ficollhypaque quedando en la interfase dos halos con células diferentes: las células polimorfonucleares al fondo del gradiente y las mononucleares (monocitos y linfocitos) que lo hacen sobre el gradiente de Ficoll-hypaque. Fuente: www.bio.us.es/Departamentos/ INMUNOLOGIA/ Nueva%20carpeta/Neubauer.htm HIPÓTESIS El serotipo 2 del virus del Dengue utilizará al receptor TLR4 de monocitos humanos, como uno de los mecanismos implicados en el establecimiento de la inmunopatología. OBJETIVO GENERAL Estudiar si existe interacción entre el receptor TLR4 de monocitos humanos con el serotipo 2 del virus del Dengue como uno de los mecanismos moleculares de la patogenia. Procedimiento: Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana mediante separación en gradiente de Ficoll-hypaque y se sembraron en cajas para cultivo celular estériles de 25 cm2 (anexo 2). Las células se incubaron durante 2 horas a 37OC y 5% de CO2. Al término de este periodo, se retiró todo el sobrenadante y las células se lavaron con medio RPMI suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10 % para remover las poblaciones celulares no adherentes (Linfocitos T, B y NK). Los monocitos permanecen en la caja de cultivo gracias a su propiedad de adherencia al plástico. Después de lavarlos, los monocitos se despegaron empleando una solución de PBS-EDTA 5 mM en frío, incubando con esta solución durante 15 minutos. Las células fueron aspiradas, se recolectaron en un tubo cónico estéril de 15 mL y se centrifugaron, para después sembrar en una densidad de 1 x 106 células por pozo, en placas de 6 pozos, agregando un volumen final de 3 mL de medio RPMI suplementado con L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 µg/mL y suero fetal bovino al 10%. OBJETIVOS PARTICULARES 1.Investigar la participación de TLR4 como transductor de señales para el serotipo 2 del virus del Dengue, y su papel en la activación y producción de citocinas de tipo pro-inflamatorio TNF-α, IL-8 e IL-12. 2.Analizar la expresión de TLR4 en monocitos humanos, purificados de sangre periférica, e infectados in vitro con el serotipo 2 del virus del Dengue por citometría de flujo. METODO Ensayos de activación de monocitos con el serotipo 2 del virus del Dengue Fundamento: El primer paso en los estudios sobre monocitos consiste en su aislamiento a fin de estudiar su respuesta in vitro. Los monocitos humanos pueden aislarse de la sangre periférica con relativa facilidad mediante centrifugación en distintos gradientes de densidad. El método más empleado para su purificación es la Aislamiento y replicación del serotipo 2 del virus del Dengue en la línea celular C6/36 (Cepa de mosquito Aedes albopictus). 48 El virus del Dengue serotipo 2 empleado en el presente estudio, fue un aislado clínico realizado en Laboratorio Estatal de Salud Pública de Veracruz. Este virus fue propagado en la línea celular C6/36 permisiva de la infección, para incrementar el título viral. Brevemente: La línea celular C6/36 fue sembrada en cajas de cultivo celular estériles marca NUNC de 25cm2, a las cuales se les agregó 5 ml de medio D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) por caja, dejando crecer la línea celular durante un periodo de 72 horas, se les cambio el medio agregando 10% albúmina y 1.5% de bicarbonato de sodio, y a partir de un muestra de suero de un paciente positivo para el virus Dengue serotipo 2, confirmado por aislamiento viral y RT-PCR previas, se inoculó una alícuota de 100 μl de este suero en la línea celular y se dejó incubar durante 5 días, con lo cual se consiguió elevar el titulo viral en el sobrenandante celular. Este sobrenadante sirvió como nuestro antígeno problema para estimular los monocitos humanos. Los sobrenadantes fueron recolectados y congelados a 20 OC para mantener al virus viable. Se realizó a partir de una alícuota, la comprobación de la replicación viral mediante la extracción de RNA y RT-PCR. Fundamento: La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida. El color se genera por la interacción de un sustrato cromogénico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. La reacción inmunológica tiene lugar en la fase sólida, ésta puede ser de plástico, vidrio o nitrocelulosa. Actualmente los más usados son los de plástico, dentro de éstos los de poliestireno gamma irradiados y los de cloruro de polivinilo porque tienen mayor capacidad para formar enlaces estables que los de poliestireno no tratados. La estabilidad de los enlaces electrostáticos, el tiempo de incubación y la temperatura son factores importantes a tener en cuenta para evitar pérdidas de las proteínas y que pueden afectar la sensibilidad del ensayo (74). Procedimiento: Se realizó la determinación de TNF-α, IL-8 e IL-12, corriendo las curvas estándar de reactivo comercial y los sobrenadantes problema. Las placas de ELISA fueron sensibilizadas con un anticuerpo primario de captura, específico para cada una de las citocinas. Este anticuerpo fue preparado a una dilución 1:250 (para todos los anticuerpos) en solución de carbonatos, incubando toda la noche a 4ºC. Al día siguiente, se descarto el anticuerpo de captura, se lavo con solución de PBS con 0.05% de tween-20 en tres ocasiones y se agregó 300 microlitros de solución de bloqueo (PBS con 10% de SFB) a cada pocillo y se dejó incubando la placa durante 1 hora a temperatura ambiente, al termino de esta incubación se aspiró y lavó para un total 3 lavados nuevamente, retirando el exceso de la solución de lavado de la placa en un papel absorbente. Se preparó las diluciones de cada una de las citocinas recombinantes para realizar la curva estándar como a continuación se muestra: Evaluación de la activación de monocitos humanos vía TLR4 por virus del Dengue 2 Los monocitos purificados y ajustados a una densidad de 1 X 106 células por pozo en placa de 6 pozos, se pre-trataron con un anticuerpo antagonista específico anti-TLR4 humano. Este anticuerpo comercial ha sido empleado ampliamente en la literatura para realizar ensayos de bloqueo del receptor TLR4 y evaluar su participación en el reconocimiento de diferentes moléculas (ver información detallada del anticuerpo en anexo 1). Los monocitos humanos fueron incubados en ausencia o presencia de 20 µg/ml del anticuerpo bloqueador durante 1 hora antes de realizar el estímulo con virus Dengue. Este tratamiento con el anticuerpo previene que alguna molécula pueda interactuar con el receptor TLR4 e inducir activación celular. Posterior al bloqueo, las células fueron infectadas con virus Dengue (100 µL) durante 24 horas. Al término de estos tiempos se recolectó el sobrenadante de los cultivos para analizar la expresión de citocinas proinflamatorias como TNF-α, IL-8 e IL-12 mediante la técnica de ELISA. Preparación de la curva estándar: En una placa para ELISA de 96 pocillos (marca NUNC) se prepararon diluciones de las citocinas recombinantes (TNF-α, IL-8 e IL-12 en las siguientes concentraciones 500 pg/ml, 250 pg/ml,125 pg/ml, 62.5 pg/ml,31.25 pg/ml, 15 pg/ml y 7.5 pg/ml utilizando como diluyente PBS 1X suplementado con 10% de SFB para cada citocina. Se anexan esquemas de las diluciones para la preparación de las curvas estándar: Para TNF-α: Tubo inicial: Diluyente (995.5 µl) + 4.5 µl de citocina concentración final 500 pg/ml. A partir de este tubo se realizaron diluciones dobles colocando 500 µl del diluyente a cada tubo + 500 µl de la preparación de citocina del tubo previo. Análisis de expresión de citocinas pro inflamatorias TNF-α, IL-8 e IL-12 en monocitos estimulados con virus Dengue mediante la técnica de ELISA 49 un total de 7 lavados, retirando el exceso de la solución de la placa en un papel absorbente y se le agregó 100 μL de la solución de substrato TMB a cada pocillo y se dejó incubando 15 minutos. Por ultimo se agregó la solución de paro (H2SO4 2N) a cada pocillo y se realizó la lectura de absorbancia a una longitud de onda a 450 nm. Figura 2. Diluciones realizadas para determinar la curva estándar de la citocina TNF-α. 50 500pg/ml 0 µl 50 0 µ l 250pg/ml 50 0 µ l 125pg/ml 50 0 µ l 62.5pg/ml 500 µ l 50 0 µ l 31.25pg/ml 15pg/ml Extracción de RNA de Virus Dengue a partir de monocitos humanos infectados con virus Dengue o sobrenadante de la línea celular C6/36, empleando el reactivo comercial TRIZOL 7.5pg/ml Para IL-8: Tubo inicial: Diluyente (995 µl) + 5 µl de citocina concentración final 500 pg/ml. A partir de este tubo se realizaron diluciones dobles colocando 500 µl del diluyente a cada tubo + 500 µl de la preparación de citocina del tubo previo. El material empleado para el proceso de extracción de RNA: tubos marca Eppendorff de 1.5 mL, puntas para micropipetas de varios volúmenes, etc. se trataron con un potente inhibidor de Ribonucleasas (RNAsas) como lo es el Dietilpirocarbonato (DEPEC, marca sigma). El material fue sumergido en una solución de agua inyectable con DEPEC al 0.01%, y mantenido toda la noche en agitación constante. Posteriormente el material se escurrió y se colocó en cajas y frascos para su esterilización durante 20 minutos a 120OC. Sobrenadante de la línea celular C6/36 infectada con virus dengue o bien monocitos humanos que fueron estimulados con dicho sobrenadante durante 24 horas, fueron sujetos a extracción de ARN empleando 1000µL de TRIZOL, permaneciendo en contacto con este reactivo por un tiempo de 5 minutos. Después de transcurrido este tiempo, se agregó 200 µL de cloroformo, tapando los tubos y agitando durante 30 segundos. Estos tubos se centrifugaron a máxima velocidad en la micro centrífuga a 14,000 RPM durante 15 minutos. Al término de la centrifugación, se recuperó la fase acuosa (capa superior), colocando en otros tubos estéril. A partir de este paso se trabajo con esta fase, agregando 800µL de isopropanol-frío, agitando en el vortex durante 30 segundos y centrifugado durante 15 minutos a máxima velocidad (14,000 RPM). Al término de la centrifugación, se eliminó el isopropanol, decantando por inversión. Se agregaron 1000 µL de etanol absoluto y se agitó en el vortex durante 30 segundos y se centrifugó a máxima velocidad. Al término, se eliminó el etanol. Finalmente se resuspendió el RNA en 30 µL de agua inyectable y se congeló a –80º C, hasta su empleo. Figura 3. Diluciones realizadas para determinar la curva estándar de la citocina IL-8. 50 500pg/ml 0 µl 50 0 µ l 250pg/ml 50 0 µ l 125pg/ml 50 0 µ l 62.5pg/ml 500 µ l 50 0 µ l 31.25pg/ml 15pg/ml 7.5pg/ml Para IL-12: Tubo inicial: Diluyente (997.2 µl) + 2.8 µl de citocina concentración final 500 pg/ml. A partir de este tubo se realizaron diluciones dobles colocando 500 µl del diluyente a cada tubo + 500 µl de la preparación de citocina del tubo previo. Figura 4. Diluciones realizadas para determinar la curva estándar de la citocina IL-12. 50 500pg/ml 0 µl 50 0 µ l 250pg/ml 50 0 µ l 125pg/ml 50 0 µ l 62.5pg/ml 500 µ l 50 0 µ l 31.25pg/ml 15pg/ml 7.5pg/ml Se agregó 100 μL de cada dilución de citocinas recombinantes para la curva estándar al pocillo respectivo y se cargaron las muestras problema dejando incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. Al termino de las 2 horas se aspiró y lavó para un total 5 lavados; nuevamente se retiró el exceso de la solución de lavado de la placa en un papel absorbente y se agregó 100 μL del detector de trabajo (Ac de detección + Av-HRP) a cada pocillo y se dejó incubando durante 1 hora a temperatura ambiente. Al término de la incubación se aspiró y lavó para RT-PCR para la identificación del virus Dengue en el sobrenadante de células C6/36 y en monocitos humanos Fundamento: La PCR es un método in vitro de síntesis de ácidos nucleicos, por el cual un segmento particular de ADN es 50 específicamente replicado, dicho fragmento de interés es delimitado por dos iniciadores o cebadores. Estos iniciadores son polímeros de nucleótidos de longitud variable (de hasta 30 nucleótidos de extensión o menos), que son complementarios a una región de la secuencia de ADN que nos interesa amplificar. 3), TS4 (específico para Serotipo 4); 0.8 unidades de taq polimerasa (PROMEGA), MgCl2 50mM y agua c.b.p para 45 µL. Se colocaron los tubos en el termociclador para correr 18 ciclos (30 segundos a 94º C; 1 minuto a 55º C y 2 minutos a 72º C y finalmente un ciclo más de extensión de 7 minutos. a 72ºC. El producto de amplificación fue revelado mediante una electrofóresis en gel de agarosa al 2 %. Procedimiento: Se realizó el protocolo de RT-PCR descrito por Lanceotti (71) para analizar si había ocurrido la infección de los monocitos humanos a través de la demostración del RNA viral. Se tomo una alícuota de 5 µL de material obtenido por la técnica de trizol (ARN), colocándose en un tubo Eppendorf de 500 µL. Los tubos se calentaron durante 10 minutos a 75º C para posteriormente bajar la temperatura rápidamente a 4º C, agregando los siguientes reactivos: 45 µL de la mezcla A que contiene: 5.5 µL de amortiguador de PCR 10x; 200µM de dNTP´s; 50 mM de DTT; 20 pmoles de cada uno de los iniciadores: D1 y D2 primers genéricos; 6U de inhibidor de RNAsas; 0.8 U de Taq polimerasa; 1.6 U de RT; 50 mM de MgCl2 y agua libre de RNAsas y DNAsas. c.b.p 50 µL. Se colocaron los tubos en el termociclador corriendo un ciclo a 42ºC durante una hora. Después de transcurrido ese tiempo se corrieron 28 ciclos de amplificación (30 segundos a 94º C; 1 min. a 55o C y dos min. a 72º C por cada ciclo). Técnica de electrofóresis Concluidos los ciclos programados en el termociclador, se procedió a evaluar las muestras por medio de la técnica de electrofóresis, en gel de agarosa al 2%. Se prepararon los geles, depositando en un matraz, agarosa (tantos gramos como correspondía al volumen final a preparar). Se agregó TAE 1X (tantos mililitros como correspondan al volumen final a preparar) para ajustar a una concentración al 2%. Se procedió a calentar hasta disolver y fundir la agarosa. Después de atemperar, se agregó bromuro de etidio (3.5 µL de un stock cuya concentración es de 10 mg/ml), por cada gel, mezclando bien para que el colorante se distribuyera de manera homogénea en la solución. Se colocó en la cámara de electroforesis, dejando gelificar. Una vez gelificado se agregó buffer TAE 1X. Se colocó 8 µL de muestra (productos de amplificación) más 4 µL de solución de corrimiento (que contiene azul de bromofenol) mezclando bien en papel parafilm y se colocó en los pozos del gel, dejando el primer pozo libre para colocar el marcador de peso molecular de 100 pares de bases. Se conectó la cámara a la fuente de poder, aplicando 70 volts, durante 45 minutos. 9.- Una vez terminado el corrimiento de las muestras en el gel se analizaron las mismas en el fotodocumentador (analizador de imágenes), registrando e interpretando los resultados. Confirmación del serotipo 2 del virus del Dengue por PCR anidada Se tomo una alícuota de 5 µL del producto de amplificación previo y se depositó en un tubo Eppendorf de 200 µL, agregando: 45 µL de mezcla B que contiene: 5.5 µL de amortiguador de PCR 10X; 200 µM de dNTP´s; 20 pmoles del iniciador D1; 20 pmoles de los iniciadores TS1 (específico para la detección del Serotipo 1), TS2 (específico para Serotipo 2), TS3 (específico para Serotipo Tabla 1. Secuencia de iniciadores para serotipos del virus del Dengue Iniciador Secuencia posición Genómica Tamaño del producto amplificado en pares de bases D1 5’-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’ 134-161 511 D2 5’-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3’ 616-644 511 TS1 5’-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3’ 568-586 482 TS2 5’-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3’ 232-252 119 TS3 5’-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3’ 400-421 290 TS4* 5’-TGTTGTCTTAAACAAGAGAGGTC-3’ 502-524 389 51 bloqueo (PBS 1X suplementado con 1% de SFB y 4% de inmunoglobulinas humanas) y se incubaron a 4ºC durante 1 hora. Después de este tiempo las células fueron centrifugadas a 2500 rpm durante 3 minutos, se retiró el sobrenadante y posteriormente las células se incubaron con 50 µL del anticuerpo monoclonal para TLR4-PE, diluido 1:10 (de BD Pharmigen) con solución de tinción (PBS suplementado con 1% de SFB) a 4ºC durante 15 minutos y en oscuridad. Se realizaron 2 lavados con la misma solución amortiguadora (que consistieron en centrifugar a 2500 rpm durante 3 minutos y descartar el sobrenadante, mientras que el botón de células fue resuspendido y se agregó 100 µL de buffer de fijación (PBS 1X-4% de paraformaldehido) durante 15 minutos a 4ºC en oscuridad. Posteriormente las células se lavaron 2 veces y se resuspendieron en 400µL de solución de tinción para análisis por citometría de flujo. Protocolo de citometría de flujo Fundamento: La citometría (Cito=célula, metría=medición) es el análisis de las características de células ya sea mediante inspección al microscopio, o midiendo de manera automatizada propiedades particulares de las células. La citometría de flujo es una técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo de luz. Para su análisis por citometría de flujo, las células deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido. Las células pueden hacerse pasar a muy altas velocidades, pueden llegar a alcanzarse velocidades cercanas a las 100,000 células por segundo. Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con este causando dispersión de la luz, basándose en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que pasan y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o complejidad de estas. Además de la dispersión de la luz, si previamente a su análisis se coloca a las células en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados. El uso de moléculas fluorescentes distintas (distintos colores de fluorescencia) permite analizar la presencia de varios marcadores de manera simultánea. Los citómetros de flujo pueden analizar partículas en función de su fluorescencia y tamaño. Los conocidos como separadores o “sorters” pueden también purificar poblaciones de características determinadas. Los aparatos de citometría de flujo pueden hacer análisis multiparamétrico, es decir, pueden combinar las medidas de distintos parámetros medidos sobre la misma célula y relacionarlos (75). Análisis estadístico La significancia estadística de los resultados obtenidos para la producción de citocinas, fue determinada por el método de ANOVA de una vía y prueba de comparación múltiple de Bonferroni utilizando el software GranphPad PRISM 2.01. Los resultados del análisis individual son mostrados en anexos. RESULTADOS En la presente investigación se estudiaron monocitos humanos y células mononucleares in vitro para comprobar si existe interacción entre el receptor TLR4 con el serotipo 2 del virus del Dengue mediante la evaluación de la producción de mediadores inflamatorios tales como TNFα, IL-8 e IL-12 en el sobrenadante de monocitos humanos estimulados con el serotipo 2 del virus Dengue mediante el método de ELISA. Así mismo se investigó el efecto de la infección por Dengue en la expresión del receptor TLR4 en monocitos humanos. La primera parte del proyecto, consistió en la preparación del antígeno a investigar (virus del Dengue serotipo 2). Esta se realizó propagando a dicho virus a partir de una muestra clínica previamente identificada como positiva para Dengue. Se inoculó la muestra de suero en la línea celular C6/36 durante 7 días, visualizando la replicación del virus al observar el efecto citopático sobre la línea celular a medida que transcurrían más días de cultivo Al término de los siete días, se empleo este sobrenadante para inocular de nueva cuenta otro cultivo de células C6/36 para realizar un segundo pase del virus y aumentar el título viral en dicho sobrenadante. La presencia del virus en el sobrenadante fue confirmada mediante RT-PCR específica para virus Dengue como se Procedimiento: Para Investigar si existe modulación en la expresión del receptor TLR4 humano durante la infección por virus del Dengue, se siguió la siguiente estrategia experimental: Células mononucleares (1 x 106) fueron estimuladas con virus Dengue durante 24 horas en placas de 24 pozos. Después de este tiempo, las células fueron recolectadas y centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos en tubos de plástico. El sobrenadante fue alicuotado y congelado hasta la realización de los ensayos de ELISA para conocer la producción de citocinas inflamatorias, mientras que las células se resuspendieron en 200 µL de solución de 52 describe en materiales y métodos Estos sobrenadantes donde se demostró la presencia del virus propagado, fueron analizados para su capacidad de inducir la activación de monocitos humanos. Como indicador de activación, se evaluó la producción de una citocina proinflamatoria humana: TNF-α. Se probaron diferentes volúmenes del sobrenadante positivo para virus Dengue 2 (provenientes del segundo pase). El objetivo de emplear diferentes volúmenes de sobrenadante fue conocer cual era la dosis optima para inducir una activación y producción significativa de mediadores inflamatorios en monocitos humanos, sin provocar la aparición de un fenómeno citotóxico exacerbado en los monocitos. Al realizar la estimulación de monocitos humanos con diferentes volúmenes de sobrenadante, encontramos que con 100µL se inducía una buena cantidad de TNF-α por lo que se decidió trabajar con este volumen en los ensayos subsecuentes. Todas las muestras analizadas para estimar la concentración de citocinas se trabajaron en presencia de estándares apropiados. A partir de un estándar (citocina recombinante) se generaron las curvas respectivas para hacer los ensayos cuantitativos. Una vez establecida la dosis optima de antígeno para inducir activación y producción de mediadores inflamatorios, se procedió a realizar los ensayos de estimulación de monocitos humanos con ausencia o presencia de bloqueo para el receptor TLR 4 humano. Este bloqueo se llevó a cabo empleando el anticuerpo monoclonal específico mencionado en materiales y métodos. Este anticuerpo es capaz de inhibir hasta en un 50 %, la producción de TNF-α en células mononucleares humanas estimuladas con LPS (molécula que ha demostrado ser un ligando para TLR4). Este efecto de bloqueo por el anticuerpo puede ser visto en la figura 5. De esta forma monocitos humanos fueron estimulados en presencia o ausencia de bloqueo para TLR4, investigando la producción de TNF-α, en diferentes individuos (figura 9). Los resultados obtenidos demuestran claramente que al realizar el bloqueo del receptor TLR4, la producción de TNF-α inducida por el virus del Dengue, se abate considerablemente (estadísticamente significativo: p < 0.001) y de manera reproducible. Este fenómeno demostró ser independiente del origen de los monocitos humanos, así como del tiempo de estimulación (24 o 48 horas). La respuesta obtenida en cuanto a cantidad de TNF-α producido, fue variable para cada sujeto ensayado y en comparación con la cantidad de TNF-α que se observó con nuestro control positivo de LPS, mientras que los monocitos humanos que no fueron estimulados, no producen esta citocina. Figura 5.- Efecto del bloqueo del receptor TLR4 por el anticuerpo antagonista clona HTA125 previo a la adición del antígeno LPS. Barra morada: Producción de TNF-� en células sin estímulo. Barra Azul producción de TNF-� en células estimuladas con LPS. Barra Amarilla: Producción de TNF-� en células a las cuales se les bloquea el receptor TLR4 previo al estímulo con LPS (72). Figura 6.- Cuantificación de TNF-α por el método de ELISA en monocitos humanos purificados a partir de sangre periférica de diferentes individuos. A y B) determinación a 24 horas, C) Determinación a 48 horas post estímulo. Otra mediador inflamatorio que fue analizado, fue la quimiocina IL-8, la cual esta implicada en la defensa del huésped en los primeros momentos de la infección por el virus del Dengue. Al hacer el análisis de IL-8, se logra observar que monocitos humanos que permanecen sin estímulo, producen IL-8 en niveles detectables. A las 24 y 48 horas hay un ligero aumento en la producción de esta citocina al comparar los monocitos humanos estimulados con LPS y virus Dengue (con y sin bloqueo) contra el 53 control sin estímulo, sin embargo este aumento no fue estadísticamente significativo (> 0.05). La producción de IL-8 en células sin estímulo, es interpretada como una producción basal en los individuos seleccionados como donadores. A continuación, se realizó la medición de IL-12, una importante citocina que permite asociar la respuesta inmune innata con la respuesta inmune específica. Las mediciones de esta se realizaron a las 24 horas y 48 horas, observando que solo los monocitos humanos estimulados con el control positivo (LPS) producen esta citocina a estos tiempos. Las células estimuladas con virus Dengue, así como las que fueron pre-tratadas con el anticuerpo anti-TLR4 no producen esta citocina como se muestra en la figura 11. Estos resultados son validados por la producción de IL-12 en el control positivo de LPS, el cual es un potente inductor de esta citocina. Figura 8.- Cuantificación de IL-12 por el método de ELISA en monocitos humanos purificados a partir de sangre periférica de diferentes individuos. A y B) determinación a 24 horas, C) Determinación a 48 horas post estímulo Figura 7.- Cuantificación de IL-8 por el método de ELISA en monocitos humanos purificados a partir de sangre periférica de diferentes individuos. A y B) determinación a 24 horas, C) Determinación a 48 horas post estímulo. A continuación se analizó la expresión del receptor TLR4 por citometría de flujo. Los resultados de citometría obtenidos, muestran que la estimulación de monocitos humanos con el serotipo 2 del virus del Dengue, induce la desregulación del receptor TLR4 en la superficie celular a las 24 horas postestímulo, al favorecer la disminución en la expresión del receptor (proteína) en esta población celular. Esta desregulación en la expresión del receptor TLR4 esta en contraste con lo que se observó al realizar el análisis de monocitos humanos que permanecen sin estimular en presencia de medio de cultivo solamente (Figura 9). Figura 9.- el color Azul muestra la expresión de control de isotipo que es el control negativo, el color Rojo muestra la expresión de TLR4 en las células que no fueron estimuladas con el serotipo 2 del virus del Dengue y el color Verde muestra la expresión del receptor TLR4 en las células que fueron estimuladas con el serotipo 2 del virus del Dengue 54 DISCUSIÓN comparando contra la misma línea celular transfectada con estos receptores). Los resultados, abren la posibilidad de que en un futuro, este conocimiento pueda sentar las bases para la intervención molecular en la enfermedad, directamente al inhibir la ruta de señalización que es activada a través de TLR4. La inhibición en la producción de TNF-α, ha demostrado disminuir la severidad de los cuadros severos por Dengue. El efecto de bloqueo fue selectivo para la citocina TNF-α, ya que al analizar la producción de IL-8 e IL-12, no hubo diferencias al comparar las células estimuladas (con o sin bloqueo para TLR4) contra células control que no lo fueron (células sin estímulo) lo cual nos lleva a pensar que posiblemente el receptor TLR4 no participa en la producción de estos mediadores inflamatorios a diferencia de el LPS. Por otra parte, en este trabajo se encontró que el virus del Dengue promueve un cambio fenotípico de monocitos humanos, que no ha sido reportado previamente y que puede tener dos importantes interpretaciones biológicas: La disminución en la expresión de un receptor de alerta dentro del sistema inmune innato del hospedero como lo es TLR4 (al desaparecer el receptor sobre la superficie de los monocitos humanos), podría conferirle una ventaja al virus durante la infección, al dejar de inducir la producción sostenida de TNF-α, el cual ha sido descrito como un mediador clave para el combate de la infección). El disminuir la expresión del receptor TLR4, podría ser un mecanismo de protección natural de los monocitos humanos ante la infección, para evitar una producción sostenida y exacerbada de TNF-α, que en exceso, puede llevar a complicar la sintomatología del hospedero, confiriendo protección al hospedero. Finalmente, otro de los aportes de este trabajo, lo es el beneficio social que se desprende de la realización del mismo. Uno de esos beneficios, lo fue la estandarización de todas las técnicas que se requirieron para poder realizar este trabajo, ya que permitirán continuar con trabajos de investigación básica en el área de inmunología molecular, específicamente en el estudio de la respuesta inmune a virus Dengue, área en la cual, nuestro grupo de investigación es pionero en el estado de Veracruz. La generación de conocimiento, objetivo central de la investigación básica, es una de las áreas que en el campo de la salud pública, poco se había explorado en nuestro estado. Trabajos como el presente, contribuyen al incorporar precisamente este tipo de investigación en el quehacer diario, así como también en formar recursos humanos con las bases suficientes para continuar hacia estudios de postgrado. En el presente trabajo, se estudio desde el punto de vista de la respuesta inmune innata al virus del Dengue, el cual es uno de los principales agentes patógenos de nuestra entidad y es considerado en el campo de la salud pública, como un problema re-emergente a nivel mundial. Una de las principales motivaciones para realizar este estudio, lo fue la carencia de información acerca de los mecanismos moleculares que el virus emplea para inducir el cuadro inflamatorio sistémico tan característico de la enfermedad, así como la creciente información con respecto a la participación de una familia de receptores de respuesta inmune innata en el humano como lo son los receptores homólogos a Toll (TLRs). Para el planteamiento del trabajo, así como para sustentar la hipótesis del mismo, se tomó en cuenta algunos antecedentes importantes que nos hablan de la importancia que tiene TLR4 en asociación con otro receptor denominado CD14, en el reconocimiento de moléculas presentes en patógenos, tales como el LPS de las bacterias Gram negativas (40-50) y de algunos virus tales como el virus sincicial respiratorio (51). Así mismo otro antecedente importante para realizar este trabajo, fue el hecho de que el LPS en monocitos/macrófagos humanos, ha demostrado inhibir la entrada del virus por un mecanismo dependiente de CD14 y de un receptor no caracterizado al momento de realizado el estudio (70). Estos antecedentes fueron la base para pensar en una interacción entre el serotipo 2 del virus del Dengue y TLR4. Los resultados obtenidos en el presente trabajo son muy alentadores, ya que encontramos que bloqueando al receptor TLR4 en monocitos humanos empleando un anticuerpo antagonista (comercial) monoclonal y específico, se inhibió en un porcentaje significativo la producción de uno de los principales mediadores inflamatorios durante la infección por Dengue: TNF-α. La producción de TNF-α es un indicador inequívoco de activación celular en monocitos humanos y de hecho es una de las citocinas que como se describió en el marco teórico, participa en la inmunopatogénesis de la enfermedad. Las células que fueron pre-incubadas en presencia del anticuerpo bloqueador para TLR4 y después estimuladas con virus Dengue, no produjeron una cantidad abundante de TNF-α, a diferencia de las que no fueron bloqueadas, pero si fueron estimuladas con virus Dengue. Estos resultados son muy importantes y sientan las bases para profundizar más en esta línea de investigación, empleando otras estrategias experimentales (por ejemplo empleando líneas celulares que carezcan de la expresión de TLR4 y CD14 y 55 CONCLUSIÓN BIBLIOGRAFÍA Respondiendo la pregunta propuesta en el planteamiento del problema y de acuerdo a los resultados obtenidos mediante la estrategia experimental ya descrita, se concluye que: 1. McBride WJ, Bielefeldt-Ohmann H. 2000. Dengue viral infections; pathogenesis and epidemiology. Microbes Infect. 2(9); 1041-1050. 2. Gubler DJ. 1998. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev. 11(3); 480–496. 3. Gubler DJ. 2002. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social and economic problem in the 21st century. Trends Microbiol. 10(2); 100-3. 4. Kuhn RJ, Zhang W, Rossmann MG, Pletnev SV, Corver J, Lenches E, Jones CT, Mukhopadhyay S, Chipman PR, Strauss EG, Baker TS, Strauss JH. 2002. 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Los resultados obtenidos de la medición de IL8, sugieren que la producción de este mediador inflamatorio, no se da como una consecuencia del reconocimiento del virus a través de TLR4, pues al comparar células estimuladas que fueron además bloqueadas, contra las que no lo fueron, se obtuvo diferencias que no son estadísticamente significativas. 3. En el modelo evaluado (monocitos humanos) y bajo nuestras condiciones, no hubo producción de IL-12, tanto en células estimuladas sin bloqueo de TLR4, como en donde se bloqueo el receptor. 4. Los resultados obtenidos por citometria de flujo nos demuestran que la estimulación de monocitos humanos con el serotipo 2 del virus del Dengue, promueve un cambio fenotípico en esta población, al promover la disminución en la expresión del receptor TLR4, que no ha sido reportado previamente. 56 15. Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins NA, Takeda K, Akira S. 1999. TLR6: A novel member of an expanding toll-like receptor family. 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Citometrìa http://es.wikipedia.org/wiki/Citometr%C3%ADa 15 de agosto del 2006 59 “Efecto de la Estrategia de Visita de Profesores en la Aptitud Clínica de Médicos Familiares” Félix Guillermo Márquez-Celedonio1, Amparo López-García2, Ana Silvia Sabido-Siglher3, Aída Verónica Blanco-Cornejo4, Elizabeth Soler Huerta5, Manuel Saiz-Calderón Gómez6 1 Coordinador Clínico de Educación e Investigación en Salud. Unidad de Medicina Familiar No. 61, Instituto Mexicano del Seguro Social, Diaz Mirón s/n, Veracruz, Ver. 2 Residente de Medicina Familiar. Unidad de Medicina Familiar No. 61, Instituto Mexicano del Seguro Social, Veracruz, Ver. 3 Profesor de Residencia de Medicina Familiar, Unidad de Medicina Familiar No. 61, Instituto Mexicano del Seguro Social, Veracruz, Ver. 4 Coordinador delegacional de educación en salud. Instituto Mexicano del Seguro Social, Jalapa, Ver. 5 Coordinador delegacional de investigación en salud. Instituto Mexicano del Seguro Social, Jalapa, Ver. 6 Médico Familiar, Unidad de Medicina Familiar No. 61, Instituto Mexicano del Seguro Social, Veracruz, Ver. MARCO TEÓRICO esfuerzos en obtener un aprendizaje homogéneo. Estas tendencias educativas se fundamentan en un enfoque epistemológico que considera al conocimiento como único, uniforme, rígido, acabado y desvinculado de la práctica y el entorno del estudiante. Sin embargo, cada vez un mayor número de docentes del área médica implementan estrategias participativas de aprendizaje encaminadas a la elaboración del conocimiento que muestran resultados alentadores6, 7. El Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) otorga servicios de atención a la salud a cerca de la mitad de la población mexicana, de ello 85% se proporcionan en las unidades de medicina familiar lo cual corresponde a 65 millones de consultas al año8. El médico familiar es el eje de las actividades de atención médica y es responsable de la salud de aproximadamente 2400 derechohabientes adscritos a su consultorio con el objetivo de “proporcionar atención médica integral y continua con enfoque procesal que favorezca el trato humanista, la oportunidad, la calidad y la eficiencia, que propicie la modificación del estado de enfermedad a través del diagnóstico temprano con enfoque de riesgo, el tratamiento oportuno, la limitación del daño y la rehabilitación temprana; para su curación, mejoría, paliación y pronta reintegración a su medio familiar, laboral y social”9. Por lo anterior, se realiza un esfuerzo institucional de gran magnitud para satisfacer las necesidades de capacitación, actualización y formación de nuevos profesionales en el área de la salud que permite alcanzar este objetivo por medio del acceso de aproximadamente 25% de todo el personal a cursos de educación continua y 6000 especialistas en formación cada año4. Desde 1954 se han venido preparando médicos cuyos estudios son reconocidos a partir de 1964 por las principales universidades del país.1 Las unidades docentes de medicina familiar han jugado un papel destacado en el desarrollo del primer nivel de atención en nuestro país.1,3,8,10. A partir del año La aptitud clínica es entendida como una cualidad caracterizada por el perfeccionamiento de las acciones de diagnóstico y tratamiento que se enriquece con la experiencia clínica.1 Es también considerada como la capacidad del médico para resolver situaciones clínicas problematizada a partir de casos reales de complejidad variable donde debe discriminar y poner en juego su juicio clínico para optar entre alternativas de interpretación, decisión o acción. Esta estrategia nos permite asimismo evaluar los resultados del aprendizaje obtenido a través de cursos formativos2. El concepto se ha desarrollado a partir de la búsqueda para establecer estrategias participativas de aprendizaje y de evaluación que no sólo midan la información retenida a través de la memorización3. Se considera, por tanto, un elemento propio de la elaboración del conocimiento, específicamente dentro de las aptitudes prácticas relativas a ciertos ámbitos de la experiencia que implican la interacción e influencia deliberada sobre otras personas y la aplicación de capacidades complejas que van desde la obtención confiable de los datos a través del interrogatorio médico hasta la jeraquización apropiada de los problemas del paciente. Es evidente que alcanzar un elevado nivel de dominio de estas capacidades solo es posible con procesos educativos que se enfoquen a la elaboración del conocimiento a través de la vinculación teoría-práctica, discusión crítica e investigación4, 5. Sin embargo, hasta ahora, en los diferentes niveles educativos y formativos de médicos –desde la formación en las escuelas y facultades de medicina hasta el postgrado- las tendencias de aprendizaje se orientan en gran parte hacia un enfoque pasivo donde el profesor es el experto y depositario del saber y su responsabilidad trasmitir el conocimiento, o bien el profesor asume el papel de reproductor y asigna al alumno el rol de consumidor y centra por tanto sus 61 2000 el Instituto Mexicano del Seguro Social inició, con la participación de diversos actores un programa cuyo objetivo fue establecer una estrategia que llevará a la mejora en la calidad de los servicios que se ofrecen en Medicina Familiar. De esta forma se estructura el proceso de mejora de Medicina Familiar a partir del concepto de atención integral a la salud y la articulación de todos los servicios en la Unidad de Medicina Familiar10,11. La estrategia de educación médica continua denominada visita de profesores al mismo tiempo que la elaboración de 12 guías para el diagnóstico y manejo de los padecimientos de mayor demanda y trascendencia en la consulta del médico familiar son dos de sus elementos orientados a elevar la calidad técnica de los médicos familiares. La estrategia consistió en asesoría en el consultorio para resolver problemas de diagnóstico, lectura de la literatura médica para ampliar la información del tema revisado, discusión en el aula de casos clínicos problematizados, revisión con paciente-tutor para profundizar en la semiología y discusión del expediente clínico para valorar sus limitaciones y alcances 12. Teniendo en cuenta lo anterior consideramos que la estrategia de aprendizaje de la clínica implementada con la visita de profesores es algo más que aspectos instrumentales (objetivos, módulos o guías). Cuando se considera que además de las actividades clínicas (asesoría, paciente, tutor y discusión del expediente), se profundiza en la discusión de casos clínicos problematizados y el alumno progresa en su destreza para criticar la información poniendo en juego su juicio clínico en la aplicación de las capacidades complejas ya podemos hablar del desarrollo de la aptitud clínica13. Hasta el momento no existen publicaciones que muestren como ha influido este proceso en el desarrollo de la aptitud clínica de los médicos familiares. La presente investigación tiene como objetivo medir el impacto de la estrategia de visita de profesores en el desarrollo de la aptitud clínica de los médicos familiares evaluada a través de un instrumento elaborado y validado para este estudio. forma global la aptitud clínica en médicos familiares. Para evaluar la aptitud en el manejo de preeclampsiaeclampsia por médicos familiares Pérez Cervantes et al15 desarrollaron un instrumento con consistencia de 0.80. Otros instrumentos con confiabilidad aceptable han sido elaborados para evaluar la aptitud en el manejo de familia16, hipertensión arterial y diabetes mellitus 17. Este tipo de instrumento permite que el médico evaluado ponga en juego su capacidad para identificar situaciones clínicas variadas, discriminar entre decisiones y acciones útiles, pertinentes y oportunas y distinguirlas de aquellas perjudiciales, inoportunas o simplemente inútiles. Garcia Mangas JA y colaboradores8 en un estudio con diseño transversal evaluaron la aptitud clínica en 499 médicos de primer nivel de atención (generales, con especialidad en medicina familiar y médicos con funciones directivas) adscritos a unidades de medicina familiar con más de 10 consultorios. Cuatrocientos treinta médicos (86.2%) quedaron incluidos en la categoría de aptitud incipiente o menor; la puntuación mas alta fue entre los médicos familiares con especialidad (mediana de 178) y con funciones de jefe de departamento clínico (mediana 170) en comparación con médicos generales sin especialidad (mediana 153). No se encontraron diferencias por antigüedad de la práctica clínica, es decir la experiencia médica expresada en años de antigüedad no influyó en la aptitud clínica alcanzada en este estudio. Los autores consideraron que su investigación representa una aproximación al primer nivel de atención en el IMSS y que sus resultados no difirieren sustancialmente de los reportados en otras publicaciones. La aptitud clínica en preeclampsia-eclampsia fue explorado por Pérez-Cervantes, BA et al15 el diseño del estudio fue transversal e incluyó a 193 médicos familiares de once unidades de medicina familiar en el Distrito Federal. En la distribución de los médicos según grado de desarrollo de la aptitud, el mayor número se ubicó en nivel medio (51.8%) con solo siete (3.6%) en el rango alto. Adicionalmente, este estudio encontró una mayor aptitud en médicos con más de 15 años de antigüedad laboral (mediana 82), con especialidad en medicina familiar (mediana de 85 versus 76.5 de quienes no tenía especialidad) y capacitación en preeclampsia-eclampsia con tiempo menor a 5 años (mediana 85). El turno laboral y los años de egreso de la licenciatura no mostraron diferencias estadísticamente significativas. Se concluyó que la aptitud clínica en preeclampsia-eclampsia en el grupo de médicos estudiados alcanzó un nivel medio, mas alto del que se habían planteado en la hipótesis y de acuerdo con los investigadores, probablemente debido a la inquietud que provoca el padecimiento dada su elevada morbilidad y mortalidad. ANTECEDENTES CIENTIFICOS La aptitud clínica se ha medido en diferentes niveles académicos y especialidades; se ha explorado en médicos internos de pregrado, residentes de especialidades médicas y especialistas formados, tanto familiares como de otras ramas de la medicina. Asimismo a partir de la propuesta del concepto por Viniegra 14, diversos autores han elaborado, validado y aplicado instrumentos que miden diferentes aspectos de la aptitud clínica. García Mangas y Viniegra Velazquez8 elaboraron un instrumento con confiabilidad de 0.94 que mide en 62 Sabido-Siglher, C y Viniegra-Velázquez, L,17 encontraron en un estudio transversal un nivel de aptitud en diabetes mellitus bajo en el 57% de los médicos de primer nivel de atención incluidos; no hubo calificaciones de nivel alto o muy alto. Las puntuaciones obtenidas por indicador fueron superiores a 40% con excepción de reconocimiento de indicios clínicos y paraclínicos, integración diagnóstica y crítica al colega que obtuvieron 37 a 39. Los autores encontraron evidencias de un mayor desempeño clínico, estadísticamente significativo, en la unidad médica con menor carga de trabajo pero sin diferencias en la aptitud o competencia clínica. Concluyen que los resultados obtenidos por los médicos ante situaciones clínicas problematizadas muestran que su experiencia clínica no propicia el refinamiento y acuciosidad de sus acciones. El manejo de familia es una característica particular del perfil del médico familiar. La aptitud clínica en este campo fue abordado por Chávez-Aguilar V y AguilarMejía E., quienes elaboraron un instrumento con cinco casos familiares y 235 reactivos agrupados en once indicadores propios del estudio de la salud familiar: tipología familiar, ciclo de vida familiar, exploración del ámbito social, psicológico y biológico; factores de riesgo psicosocial, subsistemas familiares, funciones de los integrantes, comunicación familiar, vínculos familiares y funcionalidad familiar. El estudio incluyó a 560 residentes de segundo año del curso de especialidad en Medicina Familiar del IMSS de 37 sedes de todo el país quienes obtuvieron promedio de 91 de una puntuación de 235 reactivos que era la máxima esperada (rango de -22 a 154) y la mayor proporción, 368 (65,7%) alcanzó aptitud en el rango intermedio16. Los autores interpretan la baja calificación obtenida como reflejo de una escasa reflexión de la experiencia cotidiana en el manejo de la familia y consideraron que sus resultados son similares a los encontrados en otros estudios que han medido aptitud clínica en residentes de posgrado18. Existen estudios en otras especialidades; PérezCampos JP19 y colaboradores abordaron la aptitud para interpretación de imágenes gamagráficas en residentes de medicina nuclear. Los autores construyeron un instrumento específicamente para el estudio formado por siete casos clínicos tomados de la práctica cotidiana cada uno de los cuáles se acompañó de las imágenes respectivas. En total se constituyó con 90 enunciados en siete indicadores específicos del campo clínico, reconocimiento del control de calidad de la imagen, identificación de normalidad y anormalidad, asociación diagnóstica por imágenes, interpretación errónea por omisión, interpretación errónea por comisión, crítica a las acciones e integración diagnóstica global. En total 12 residentes (63.2%) obtuvieron un nivel de aptitud bajo aunque se observa una tendencia hacia aumento de la aptitud al incrementarse los años de formación. En el trabajo se concluyó que el instrumento fue apropiado para detectar el grado de refinamiento de la experiencia formativa y consideran que indagar el desarrollo de aptitudes es una aproximación para valorar los alcances de los procesos formativos y una alternativa que permite reorientar los esfuerzos educativos para obtener mejores resultados. Experiencias similares se han obtenido en estudios que han evaluado la aptitud de médicos residentes de anestesiología, pediatría, en internos de pregrado y en rotación por unidades rurales del sistema IMSS-Oportunidades18, 19. Se considera que los bajos niveles obtenidos en la aptitud clínica en diferentes categorías de médicos y grados de formación están asociados al predominio de tendencias pasivas de la educación en las escuelas y facultades de medicina que privilegian el aprendizaje memorístico desvinculado de la práctica y el entorno del estudiante sobre un aprendizaje participativo que fomente la reflexión y la crítica en un enfoque de elaboración del conocimiento. MATERIAL Y METODOS Población Se consideró como universo elegible la totalidad de los médicos familiares adscritos a la Unidad de Medicina Familiar No. 61 del Instituto Mexicano del Seguro Social en la ciudad de Veracruz, Ver., Los criterios de inclusión fueron: médicos familiares con adscripción a consulta externa de medicina familiar, de cualquier edad, sexo o antigüedad en el trabajo. Fueron eliminados los médicos familiares que no presentaron alguna de las dos evaluaciones y aquellos que su porcentaje de asistencia a la intervención fuera menor al 80%. Métodos Se realizó un estudio pre-experimental con diseño test-retest para determinar el efecto de una estrategia educativa basada en visita de profesores (variable independiente) sobre la aptitud clínica de médicos familiares (variable dependiente). Como objetivo intermedio se consideró la elaboración y validación de un instrumento con consistencia aceptable para medir aptitud clínica en los seis padecimientos incluidos en la estrategia educativa. La estrategia educativa consistió en visita de profesores expertos en cada una de las especialidades médicas relacionadas con los temas de la segunda 63 etapa del programa de Proceso de Mejora de Medicina Familiar. En total se realizaron seis cursos que incluyeron la evaluación, diagnóstico y manejo integral de dispepsia, urosepsis, osteoartrosis, lumbalgia, traumatismo de mano y tuberculosis. Cada curso tuvo una duración de 30 horas a la semana distribuidas en seis horas diarias durante las cuales el profesor tutor permanecía en el consultorio las cuatro primeras horas para proporcionar en forma conjunta la atención médica a los pacientes con la enfermedad y asesorar en forma directa al médico familiar. Dos horas de la jornada diaria se reservaron para actividades en aula que incluyeron revisión bibliográfica, discusión de las guías integrales de diagnóstico y manejo, análisis de expedientes clínicos y valoración con paciente tutor. Durante estas actividades se fomentó un ambiente de participación y reflexión crítica a partir de la experiencia individual y su contrastación grupal. Para medir la aptitud clínica se elaboró un instrumento que incluyó un caso clínico real obtenido de la consulta externa de medicina familiar de cada uno de los seis padecimientos considerados en la estrategia educativa. Para la validez de contenido se identificaron siete indicadores del proceso de la atención en medicina familiar: Reconocimiento de factores de riesgo, reconocimiento de síntomas clínicos, integración diagnóstica, uso de recursos de diagnóstico, uso de recursos terapéuticos, omisión y comisión iatropatogénica. Para cada indicador se diseñaron tallos de preguntas con items en sentido afirmativo y referidos al caso que tenían que ser respondidas como falso, verdadero o no se. Las respuestas correctas sumaban un punto, mientras que las incorrectas restaban uno y las no sé, no sumaban ni restaban. Para concluir el proceso de validación de contenido se paso a ronda de tres expertos en el tema y metodología participativa de aprendizaje permaneciendo el instrumento con 176 preguntas. Finalmente se determinaron el número de respuestas debidas al azar y la confiabilidad del instrumento. Wilcoxon. También se efectuó análisis comparativo entre los turnos para lo cual se empleó la Prueba U de Mann Whitney. El nivel de significancia estadística se estableció en 0.05. RESULTADOS De una población de 42 médicos familiares elegibles para el estudio se incluyeron 33 (78.6%) que reunieron los requisitos de ingreso y permanencia en la investigación. Con fines de comparación se integraron dos grupos según el turno al que estuvieran adscritos: turno matutino (n=17) y vespertino (n=16). La edad del grupo del turno matutino fue de 51.19 + 2.54 (media y desviación estándar) y del grupo del turno vespertino de 52.12 + 1.50 (p > 0.05). En el grupo del turno matutino 12 (70.6%) fueron de sexo femenino y en el vespertino 10 (62.5%) fueron mujeres (p > 0.05). El instrumento para medir la aptitud clínica de los médicos familiares obtuvo una consistencia de 0.80 con la Prueba de Kuder Richardson y el número de respuestas debidas al azar fue de 27 con la Prueba de Pérez Padilla-Viniegra. La aptitud clínica de los médicos familiares de ambos turnos antes de iniciar la intervención educativa se ubicó en azar y muy baja en 25 (75.8%) médicos y en la medición post-intervención la proporción de estas categorías fue menor con 15 (45.5%). Asimismo 13 (39.3%) médicos se ubicaron en rangos de regular a muy alto después de la aplicación de la estrategia educativa en comparación con 3 (9.1%) en la evaluación inicial (p < 0.05). La mediana y rango global de calificación pasó de 44 (26 – 70) en la medición previa a 58 (11 – 142) en la medición final. (Cuadro I). Los siete indicadores de aptitud clínica mostraron incrementos en la puntuación de las mediciones posterior a la aplicación de la estrategia de visita de profesores y excepto por reconocimiento de indicios clínicos las diferencias fueron estadísticamente significativas (p < 0.05). (Cuadro II) En el análisis comparativo entre los turnos de atención médica se encontró que antes de la aplicación de la estrategia de visita de profesores la aptitud clínica se ubicó en azar y muy bajo en 13 (76.47%) de los médicos familiares del turno matutino y 12 (75%) del turno vespertino, diferencia que no fue estadísticamente significativa (p > 0.05). En contraste después de la intervención educativa 10 (58.8%) y 8 (50%) médicos del turno matutino y vespertino respectivamente se ubicaron en las categorías de aptitud clínica de baja a muy alta. La mediana de calificación de 44 y 45 antes de la intervención y 58 y 57 después, para los turnos matutino y vespertino respectivamente con diferencia estadísticamente Análisis estadístico Las mediciones de la aptitud clínica se realizaron con el instrumento validado antes de iniciar la intervención educativa y al final. La calificación se obtuvo después de restar al total de respuestas correctas el número de las incorrectas y las puntuaciones se categorizaron en la siguiente escala: azar, muy bajo, bajo, regular, alto y muy alto. Para determinar el número de respuestas por azar se empleó la Fórmula de Pérez Padilla-Viniegra y La Fórmula de Kuder-Richardson para la consistencia del instrumento. Las puntuaciones obtenidas se expresaron en mediana y rango y la comparación para determinar significancia estadística se realizó con la Prueba de 64 significativa (p < 0.05) para los médicos matutinos. (Cuadro III). El análisis por indicador mostró incremento en las medianas de los siete indicadores de aptitud clínica en los médicos de ambos turnos, pero la diferencia fue estadísticamente significativa (p < 0.05) en el indicador de omisión iatropatogénica del turno vespertino (Cuadro IV). investigación son alentadores ante la posibilidad de que su aplicación y la incorporación de programas académicos basados en la crítica de la experiencia desde las etapas formativas de los futuros médicos y especialistas así como la mejora en los ambientes académicos podrían revertir la situación actual. Estamos de acuerdo con los autores citados en cuanto a que el bajo nivel de aptitud clínica que se ha obtenido en los estudios previos tanto en médicos familiares como de otras especialidades médicas y con diferentes grados de formación académica asi como en la valoración inicial del presente trabajo con médicos familiares se debe principalmente a la influencia de un aprendizaje tradicional que ha fragmentado el conocimiento en dimensiones (afectiva, psicomotora y cognoscitiva) o bien en objetivos de aprendizaje específicos separando la teoría y la práctica y dejando de lado la reflexión y la crítica. Sin embargo, este bajo nivel de aptitud clínica no necesariamente se correlaciona con un bajo nivel de desempeño técnico-médico o desarrollo insuficiente de las habilidades psicomotoras necesarias para la realización de procedimiento de diagnóstico o terapéuticos y su asociación con la calidad de los servicios médicos aún está pendiente de ser evaluada. En cambio, si creemos que una mejor aptitud clínica facilitará una práctica médica más comprometida a nivel individual y social, oportuna y apropiadas al paciente y ello se reflejará necesariamente en la calidad de la atención médica. Si bien el diseño del estudio fue adecuado para el logro de los objetivos de investigación al demostrarse la eficacia de la estrategia de visita de profesores para mejorar la aptitud clínica de los médicos familiares, el trabajo presenta limitaciones metodológicas que pueden ser consideradas en estudios posteriores. Es conveniente que nuevos proyectos establezcan una comparación no solo entre el antes y después de la intervención, sino además con un grupo control que sea intervenido con el enfoque tradicional. Los seis padecimientos seleccionados para la presente intervención son enfermedades frecuentes y trascendentes en el primer nivel de atención, sin embargo no son las que tienen mayor demanda de los servicios médicos. Es necesarios que nuevos estudios consideren una muestra representativa de los padecimientos del primer nivel de atención, se incorporen otros aspectos del perfil del médico familiar tales como la atención anticipatoria, continuada, integral y que considere los factores de la dinámica familiar. Con ello se obtendría un mayor acercamiento a lo que es la aptitud clínica en medicina familiar. Se concluye que la estrategia participativa de aprendizaje en la modalidad de visita de profesores tiene un efecto favorable en la aptitud clínica de los médicos familiares, sin importar el turno de adscripción. DISCUSIÓN La aptitud clínica es la capacidad del médico para analizar en forma reflexiva y crítica los eventos y procesos relacionados con el curso clínico de la enfermedad y las intervenciones de diagnóstico y tratamiento médicos sin dejar de considerar la valoración de los factores de riesgo. De la misma manera que estudios previos 8, 15, 19, la aptitud clínica de los médicos familiares previa a la intervención educativa fue baja o incipiente. Sin embargo, en la presente investigación educativa se encontró que la estrategia de visita de profesores, que incluye modelos participativos de aprendizaje se relacionó con un incremento de la aptitud clínica tanto global como en los indicadores de reconocimiento de factores de riesgo, reconocimiento de indicios clínicos, integración diagnóstica, uso de recursos diagnósticos y terapéuticos y comisión iatropatogénica. Con lo anterior podemos considerar que estrategias participativas de aprendizaje como las diseñadas en la investigación favorecen el desarrollo de capacidades complejas en el proceso de formación médica y facilitan la toma de decisiones oportunas y adecuadas en el campo de la atención clínica. Otrosestudios20hanmostradocomolaimplementación de microambientes educativos promotores de la discusión favorecen la interacción grupal e incrementan la discusión y el debate, elementos de elaboración del conocimiento. La intervención educativa que establecimos favoreció la interacción entre médico-docente y médico-alumno en situaciones reales de la atención médica; en las sesiones en aulas se reflexionó críticamente sobre el quehacer y la toma de decisiones en el proceso clínico, se dejaron atrás las posturas docentes tradicionales del profesor como único portador del conocimiento y del alumno pasivo y receptor de la información. Más que buscar un aprendizaje significativo la estrategia se enfocó a que el conocimiento elaborado tuviera sentido para el médicoalumno al referirse a su entorno clínico, administrativo, social y epidemiológico habitual. Los resultados del estudio concuerdan con los obtenidos por García Mangas y Leonardo Viniegra8, Soler Huerta, et al1 y Pérez Cervantes et al15, en el sentido de que la aptitud clínica tiene un nivel que no es el deseable o se encuentra poco desarrollada. Sin embargo los resultados obtenidos con la estrategia educativa que se aplicó en esta 65 Cuadro I. Aptitud clínica de Médicos Familiares antes y después de la Estrategia de visita de Profesores n = 33 Antes Después Azar 2 (6.1%) 6 (18.2%) Muy bajo 23 (69.7%) 9 (27.3%) Bajo 5 (15.2%) 5 (15.2%) Regular 3 (9.1%) 8 (24.2%) Alto 0 (0%) 3 (9.1%) Muy alto 0 (0%) 2 (6.1%) Mediana 44 58* Rango 26 - 70 11 - 142 * Valor de p < 0.05 en el análisis intragrupal con Prueba de Wilcoxon ** Valor de p = 0.07 en el análisis intragrupal con Prueba de Wilcoxon Cuadro II. Aptitud clínica por indicadores antes y después de la Estrategia de visita de profesores INDICADOR Items Antes Después Mediana Rango Mediana Rango Valor de p* Reconocimiento de Factores de Riesgo 23 5 (-5 a 15) 8 (-4 a 23) 0.042 Reconocimiento de Indicios clínicos 49 11 (-1 a 23) 19 (-9 a 47) 0.087 Integración diagnóstica 23 6 (-5 a 17) 11 (-3 a 21) 0.011 Uso de recursos diagnósticos 10 0 (-4 a 8) 2 (-2 a 10) 0.01 Uso de recursos terapeúticos 15 6 (2 a 11) 9 (1 a 15) 0.046 Omisión yatropatogénica 35 13 (3 a 23) 17 (5 a 33) 0.007 Comisión yatropatógenica 21 5 (-1 a 15) 7 (-7 a 21) 0.031 *Valor de p < 0.05 obtenido con Prueba de Wilcoxon 66 Cuadro III. Aptitud clínica de Médicos Familiares según turno de adscripción antes y después de la visita de Profesores Turno Matutino n Turno Vespertino = 17 n = 16 Antes Después Antes Después Azar 1 (5.9%) 3 (17.7%) 1 (6.3%) 3 (18.8%) Muy bajo 12 (70.6%) 4 (23.5%) 11 (68.8%) 5 (31.3%) Bajo 4 (23.5%) 4 (23.5%) 1 (6.3%) 1 (6.3%) Regular 0 (0%) 4 (23.5%) 3 (18.8%) 4 (25%) Alto 0 (0%) 2 (11.8%) 0 (0%) 1 (6.3%) Muy alto 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 2 (12.5%) Mediana 44 58* 45 57** Rango 26 - 70 11 - 142 26 - 64 11 - 158 * Valor de p < 0.05 en el análisis intragrupal con Prueba de Wilcoxon ** Valor de p = 0.07 en el análisis intragrupal con Prueba de Wilcoxon Cuadro IV. Aptitud Clínica por indicador antes y después de la Visita de Profesores Comparación según turno de adscripción Turno Matutino ** n = 17 Turno Vespertino** n = 16 INDICADOR Items Antes Después Antes Después Reconocimiento de Factores de Riesgo 23 3 7 5 9 Reconocimiento de Indicios clínicos 49 13 17 11 19 Integración diagnóstica 23 7 11 5.5 10 Uso de recursos diagnósticos 10 2 4 0 2 Uso de recursos terapeúticos 15 5 9 6 8 Omisión iatropatogénica 35 13 16 15 18* Comisión iatropatógenica 21 5 6 5.5 10 *Valor de p < 0.05 obtenido con Prueba de Wilcoxon **Valores expresados en medianas 67 REFERENCIAS 11. Pérez-Cuevas R, Ruiz-Hernández B, Reyes-Morales H, Pedrote-Navarro B, Massa-Camacho R, VargasAlencaster LD, et al, Implementación y evaluación del modelo experimental del proceso de mejora de medicina familiar. En García-Peña C, Muñoz O, Durán L, Vázquez F, La medicina familiar en los albores del siglo XXI. México, Instituto Mexicano del Seguro Social, 2006, p 65-68. 12. García-Mangas J. Una estrategia de educación continua orientada al aprendizaje de la clínica. Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2005; 43: 443-448. 13. Velázquez-Viniegra L. La postura del profesor ante la educación y su práctica docente. En VelázquezViniegra. La Investigación en la educación: papel de la teoría y de la observación. 2ª Edición, México, Instituto Mexicano del Seguro Social, 2000; p 35-50. 14. Sabido-Siglher MA, Viniegra-Velázquez L. Aptitud y desempeño en la evaluación del médico. En ViniegraVelázquez L. La Investigación en la educación: papel de la teoría y de la observación. 2ª Edición, México, Instituto Mexicano del Seguro Social, 2000; p 251269. 15. Pérez-Cervantes BA, García-Hernández A, Del Angel-Alfaro ME. Aptitud clínica de los médicos familiares en preeclampsia-eclampsia. Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2006; 44: 39-44 16. Chávez-Aguilar V, Aguilar-Mejía E. Aptitud clínica en el manejo de la familia, en residentes de medicina familiar. Rev Med IMSS 2002; 40: 477-481. 17. Sabido-Siglher MC, Viniegra-Velázquez L. Competencia y desempeño clínicos en diabetes. Rev Invest Clin 1998; 50: 211-216. 18. Rivera IDB. Evaluación de la aptitud clínica en médicos residentes de medicina física y rehabilitación. Rev Invest Clin 1998; 50: 341-346. 19. Pérez-Campos JP, Aguilar-Mejía E, ViniegraVelázquez L. La aptitud para la interpretación de imágenes gamagráficas en residentes de medicina nuclear. Rev Invest Clin 2002; 54: 29-35 20. Gónzalez-Cobos RP, Viniegra-Velazquez L. Comparación de dos intervenciones educativas en la formación de médicos residentes. Rev Invest Clin 1999; 51: 351-360. 1. Soler-Huerta E, Sabido-Siglher C, Sainz-Vázquez L, Mendoza-Sánchez H, Gil-Alfaro I, González-Solís R.: Confiabilidad de un instrumento para evaluar la aptitud clínica en residentes de medicina familiar. Archivos en Medicina Familiar 2005; 7: 14-17. 2. García-Mangas JA, Viniegra-Velázquez L: Evaluación de la aptitud clínica en residentes de medicina familiar. 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García-Mangas JA, Viniegra-Velázquez L, ArellanoLópez J, García-Moreno J., Evaluación de la aptitud clínica en médicos de primer nivel de atención. Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2005; 43: 465-472. 9. Ruiz-Hernández B, Reyes-Morales H, EstradaObregón C, Sánchez-López LF, Pedrote-Navarro B, Vargas-Alencaster LD, et al, La medicina familiar en el Instituto Mexicano del Seguro Social: Fortalezas y debilidades actuales. En García-Peña C, Muñoz O, Durán L, Vázquez F, La medicina familiar en los albores del siglo XXI. México, Instituto Mexicano del Seguro Social, 2006, p 43-55 10. Reyes-Morales H, Ruiz-Hernández B, EstradaObregón C, Pedrote-Navarro B, García-Nieto HU, Pacheco-Espejel A, et al, Diseño conceptual del proceso de mejora de medicina familiar. En GarcíaPeña C, Muñoz O, Durán L, Vázquez F, La medicina familiar en los albores del siglo XXI. México, Instituto Mexicano del Seguro Social, 2006, p 57-63. 68 Densidad prostática del ARNm del receptor a estrógenos β en respuesta a la conducta sexual de la rata José Locia Espinoza1, Abraham H. Soto Cid2, María Elena Hernández1, Milagros Silva1, Gonzalo E. Aranda1 y Jorge Manzo1 1 Instituto de Neuroetología. Dr. Luis Castelazo Ayala s/n, Col. Industrial Ánimas, CP. 91190, Xalapa, Ver. 2 Facultad de Química Farmacéutica Biológica. Calle La Pérgola, Circuito Universitario Gonzalo Aguirre Beltrán, CP. 91000, Xalapa, Ver. INTRODUCCIÓN proteasas, esterasas y fosfatasas, además, es la principal glándula productora de citrato del organismo2. La conducta sexual de la rata macho influye en la fisiología de glándulas sexuales accesorias tales como la próstata. Las hormonas esteroides participan tanto en la conducta sexual como en el funcionamiento normal de la próstata. Estas ejercen su efecto a través de sus receptores, los cuales pertenecen a la familia de receptores a hormonas esteroides localizados en el medio intracelular. Se ha mostrado que los andrógenos regulan los niveles de ARNm para su receptor en próstata ventral. El estímulo que ha originado variaciones de testosterona circulante, de ARNm para receptor a andrógenos y del receptor mismo ha sido la conducta sexual de la rata al realizar eyaculaciones consecutivas, observándose los niveles máximos entre la segunda y la tercera eyaculación. No obstante, se desconoce si hay variación del ARNm del receptor a estrógenos β en esta situación. La literatura sugiere que tal variación también es posible. Conducta sexual y funcionamiento prostático de la rata La conducta sexual de la rata involucra actividades de cortejo, de apareamiento y de respuestas posteyaculatorias3. En la rata macho, la actividad copulatoria implica la ejecución de respuestas conductuales cuya secuencia es muy específica, presentándose conductas de monta sin inserción peneana (montas), conductas de monta con movimientos característicos de la inserción peneana intravaginal (intromisiones) y conductas de monta con movimientos característicos de la inserción peneana vaginal y de eyaculación (eyaculación)4. Usualmente, las ratas macho inician la actividad copulatoria investigando las regiones facial y anogenital de la hembra mientras emite, al igual que esta; vocalizaciones ultrasónicas de 50 kHz. Posteriormente, el macho se aproxima a la parte trasera de la hembra y despliega la conducta de monta, que consiste en arremetidas poco profundas con su pelvis. Si detecta la vagina de la hembra, realiza una arremetida más profunda, insertando su pene en ella durante 200-300 mseg (intromisión). Entonces da un salto hacia atrás rápidamente y acicala sus genitales. La conducta de intromisión se repite 7 a 10 veces, después de lo cual la rata alcanza la eyaculación. Ésta se caracteriza por arremetidas mucho más largas y profundas (750-2000 mseg) y por una desmonta también más lenta. En la eyaculación hay contracciones rítmicas de los músculos bulboesponjoso e isquicavernoso en la base del pene, y del esfínter anal y los músculos esqueléticos. Después de la eyaculación, el macho acicala sus genitales y permanece casi totalmente inactivo durante un intervalo de aproximadamente 6-10 minutos antes de reiniciar la cópula. Este período de inactividad se denomina “Intervalo Poseyaculatorio” (IPE). Durante el IPE, usualmente el macho no copula otra vez y emite vocalizaciones ANTECEDENTES Estructura funcional de la próstata de rata La próstata de rata es un complejo formado por numerosas glándulas alveolares, que están inmersas en una mezcla de fibras de musculatura lisa y tejido conectivo denominado estroma. Estas glándulas vierten su contenido a los conductos excretores, los cuales se comunican con la uretra. La anatomía prostática de los roedores está organizada en los lóbulos individuales ventral (PV), lateral (PL) y dorsal (PD) localizados en posiciones específicas alrededor de la uretra pero no completamente circunscritas a ella. Algunos autores consideran a la glándula coagulante un cuarto lóbulo: el anterior1. La glándula prostática parece no ser esencial para la fertilidad del individuo, no obstante produce el 20% del fluido seminal y es responsable de la secreción de sustancias biológicamente importantes tales como las prostaglandinas, espermina, fructosa, inmunoglobulinas, 69 ultrasónicas de 22 kHz. Algunos machos pueden iniciar la cópula si se les presenta una nueva hembra o se les proporciona un estímulo medianamente doloroso. Por lo general, después de 7 u 8 eyaculaciones los machos alcanzan la saciedad y no copulan por 1-3 días. Por lo común, la habilidad copulatoria es adquirida por un individuo entre los 45 y los 75 días de edad5. e inician un descenso después de la tercera eyaculación; para regresar a valores no significativamente diferentes del control después de la cuarta eyaculación11. Influencia de la conducta sexual en la próstata de rata Teniendo en cuenta las fluctuaciones hormonales observadas durante la ejecución de la conducta sexual y el hecho de que las hormonas mencionadas afectan la fisiología de la próstata, parece razonable suponer la existencia de una relación entre esta conducta y el funcionamiento prostático. A pesar de esto, pocos son los estudios que existen sobre la influencia que la actividad sexual diaria ejerce sobre el funcionamiento normal de la próstata de rata. En 1979, se realizó un trabajo donde se mostró que la actividad sexual en ratas macho no se afecta por el hecho de remover completamente las vesículas seminales y la próstata12. De ello se concluyó que la ejecución de la conducta sexual no depende de la presencia de estas glándulas. Por otro lado, se sabe que la ejecución de la conducta sexual per se sí tiene efecto sobre el peso de la próstata. En ese sentido se ha observado que el diámetro de lúmen glandular de los animales sometidos a conducta sexual es mayor y que la secreción intraluminar se tiñe menos homogéneamente, ya que hay un mayor número de gránulos secretorios13. Adicionalmente, un trabajo reciente realizado en nuestro laboratorio9, 10 demostró la inducción de variaciones en el RA en próstata de rata que alcanza eyaculaciones consecutivas, tanto a nivel del ARNm como de la proteína. Estas variaciones consisten en incrementos significativos graduales en el ARNm después de una eyaculación, que alcanzan niveles máximos después de la tercera, para regresar a niveles semejantes a los del control después de la cuarta eyaculación; a la par de un incremento significativo en las concentraciones de la proteína después de la primera, la segunda la tercera eyaculaciones. Los cambios en el ARNm y la proteína RA se acompañan de incrementos significativos en los niveles de T sérica descritos con anterioridad en el presente trabajo. En conjunto, estos datos muestran claramente que la función sexual juega un papel importante en el desarrollo y funcionamiento de la próstata. Control hormonal de la conducta sexual de la rata macho La testosterona (T) es el principal andrógeno involucrado en regular la ejecución de la conducta sexual en la rata macho. A este respecto, se ha observado un decaimiento de esta conducta posterior a la eliminación de los testículos y una restitución de los parámetros de la misma por la administración exógena de testosterona6. Sin embargo, el decaimiento de la conducta sexual, no coincide con el de T. que es indetectable en las siguientes 24 horas de la castración, mientras que la habilidad copulatoria decrece gradualmente días o semanas después. La restitución obtenida mediante la administración de T requiere de 5 a 10 días de tratamiento5, pero la administración de Estradiol (E2) incrementa la quimioinvestigación y la monta en los siguientes 35 minutos de iniciado el tratamiento7, por lo tanto, efectos rápidos y probablemente basados en mecanismos que involucran receptores membranales pueden contribuir a la motivación sexual, pero los efectos genómicos a largo plazo se requieren para la completa reinstauración de la cópula por la T. Además, se sabe que para activar la conducta sexual, la T no actúa completamente como tal, pues es aromatizada mediante el complejo enzimático P450AROM a E2. La actividad de P450AROM es a su vez incrementada por T8. Así, la “teoría de la aromatización” propone que es el E2 obtenido por aromatización de la T quien activa la conducta sexual en machos5. Por otra parte, se sabe que la conducta sexual en sí ocasiona variaciones en los niveles plasmáticos de algunas hormonas. Este es el caso de la T y la prolactina (PRL). En cuanto a la primera, sus valores séricos normales de 2.7 ± 0.8 ng/ml muestran variaciones cuando los animales alcanzan eyaculaciones consecutivas. Se presenta un aumento en los niveles séricos después de la primera eyaculación, pero se requirieren dos eyaculaciones para alcanzar un valor máximo que se mantiene por lo menos hasta la cuarta eyaculación9, 10. La PRL también muestra fluctuaciones séricas en las ratas macho sometidas a eyaculaciones consecutivas. Los niveles basales de aproximadamente 18 ng/ml aumentan significativamente después de la primera eyaculación, alcanzan un máximo después de la segunda El papel de las hormonas esteroides en la próstata de rata La próstata es una glándula dependiente de testosterona para mantener su tamaño y función secretoria. La importancia de los andrógenos testiculares 70 se pone en evidencia con la castración; ésta provoca involución de la próstata mediante una combinación de atrofia y apoptosis, mecanismos que son revertidos con una terapia de restitución androgénica14. En la próstata de rata, la castración causa pérdida de peso seco, disminución de proteínas, del tamaño celular en los tres lóbulos, aunque el más afectado es el lóbulo ventral, que sufre un alto grado de apoptosis, lo que además puede relacionarse con las bajas cantidades de zinc (un inhibidor de la apoptosis) presentes en este lóbulo en comparación con los otros dos15. Por su parte, los estrógenos (de los que el más importante es el E2) parecen tener efectos negativos, al menos en dosis no fisiológicas. A saber, la administración de estrógenos en ratas neonatas, produce un incremento en la incidencia de metaplasia, displasia y formación tumoral en la próstata con la edad, efectos que son lóbulo específicos e involucran principalmente al lóbulo ventral16; también se observan efectos negativos sobre la diferenciación celular epitelial, morfogénesis ductal y crecimiento de la glándula cuando las ratas alcanzan la etapa adulta17. En animales adultos, el tratamiento a largo plazo con estrógenos lleva a neoplasia prostática17. Todos estos efectos pueden ser causados por una irrupción de los estrógenos en el eje hipotálamo-hipófisis-gónadas17, que ocasionaría una disminución en la producción de andrógenos18. También se ha propuesto una acción sinérgica entre los estrógenos y los andrógenos en la inducción de hiperplasia y displasia glandulares19. Es posible que los estrógenos tengan efectos directos sobre la próstata. Sin embargo, la acción directa de los estrógenos es complicada puesto que pueden actuar a través de los receptores a andrógenos19 y con dos tipos de receptores específicos distintos, que aparentemente median efectos distintos y en algunos contextos celulares, parecen ejercer acciones antagónicas entre sí20. El REβ, como los demás miembros de la superfamilia a la que pertenece posee dominios funcionales distintos: una parte N-terminal, que participa en la interacción del receptor con miembros del aparato transcripcional, un dominio de unión al ADN (DUA), una región de bisagra que proporciona cierto grado de flexibilidad y un dominio Cterminal involucrado en la unión a ligandos tanto agonistas como antagonistas, dimerización, localización nuclear de la proteína y activación de la transcripción. Esta última parte se denomina dominio de unión a ligando (DUL) 23, 24. En la rata, el REβ es una proteína de aproximadamente 485 aminoácidos, con un peso aproximado de entre 55 y 60 kD. Es ligeramente más pequeña que el REα (590600 aminoácidos en diferentes especies,) en virtud de que posee un extremo N-Terminal significativamente más corto25, 22, 26. En general, los RE presentan alta homología en sus DUA y DUL, mientras que la homología más baja se presenta en el dominio N-Terminal, la región de bisagra y una pequeña región en el dominio C-Terminal22, 26, 27, 23. Mecanismo de acción del REβ El mecanismo de acción a nivel genómico del REβ, al igual que el de los otros miembros de la familia incluye una serie de eventos que inicia con la unión del agonista al DUL del receptor (figura 1). Esta unión promueve su separación de las proteínas de choque térmico inhibitorias Hsp 90, y ulteriores dimerización, interacción con el ADN, reclutamiento de coactivadores y en última instancia la formación del complejo de preiniciación de la transcripción28. La interacción con el ADN se da a través del DUA. Esta región, como ya se ha mencionado, está altamente conservada en los miembros de esta familia de factores de transcripción. Existe una homología del 90% en el DUA de ambos receptores a estrógenos26, por lo que pueden unirse a los Elementos de Respuesta a Estrógenos (ERE) en los promotores de genes blanco con afinidad y especificidad similares20. Estos EREs consisten, con unas pocas variaciones entre los distintos genes, en repeticiones de la secuencia A/GGGTCANNNTGACC, donde N es un nucleótido cualquiera30, 27. La especificidad de la transactivación específica de receptor puede ser el resultado de una influencia del contexto genético de cada ERE sobre el receptor, lo que causaría un patrón de reclutamiento de coactivadores distinto20. Además, en tanto que la FA-1 es espreciable en el REβ, no lo es en el REα. La actividad de la FA-1 puede también influenciar el reclutamiento de coactivadores. En la activación del receptor por la unión de un ligando, es necesaria la dimerización para la unión con el ERE28. El dímero puede ser tanto un homo como un heterodímero, es decir, es posible la existencia de homodímeros REβ-REβ El receptor a estrógenos beta Las proteínas receptoras a través de las cuales los estrógenos ejercen sus efectos directos se denominan receptores a estrógenos (RE) y se encuentran codificadas por genes distintos. Los RE son proteínas intranucleares pertenecientes a la superfamilia de receptores nucleares para hormonas esteroides, hormonas tiroides, vitamina D y retinoides21. Inicialmente se pensaba que existía una única proteína con actividad de RE, sin embargo, en 1996 se reportó la existencia de la segunda proteína receptora22 en tejido de próstata y ovario de rata. Esta proteína fue denominada Receptor a Estrógenos Beta (REβ), para diferenciarla de la primera proteína que a partir de entonces fue conocida como REα. 71 y de heterodímeros REβ-REα21. Cuando ambos tipos de receptores a estrógenos se encuentran expresados en una célula, la formación de heterodímeros se ve favorecida sobre la de homodímeros20. El homodímero REα-REβ tiene una afinidad similar a la del homodímero REα-REα, pero mayor que la del homodímero REβREβ23. En general, existe un antagonismo funcional del REβ sobre las acciones del REα20. Distintos estudios describen represión dirigida por REβ de varios efectos mediados por REα, entre los que se incluyen la reducción de grasa y de la proliferación celular en el útero y la próstata20, 31, 23, 32. en la próstata de rata33 y muestra un patrón de expresión distinto del de REα. El REβ tiene una localización prominente en las células epiteliales y escasa expresión en las células del compartimento estromal23. Por su parte, el REα, es detectable en las células del compartimento estromal y parece no ser detectable en el epitelio17, 24. La expresión de REα es en términos generales, mucho más baja que la del REβ en la próstata33. El papel del Receptor a Estrógenos Beta en la próstata de rata La localización del REβ en la próstata de rata sugiere un papel en la regulación fisiológica de esta glándula. A este respecto, distintos estudios muestran que el REβ podría regular el crecimiento y la diferenciación de la próstata. Por ejemplo, en cepas de ratones que no expresan esta proteína (los ratones βERKO) existen focos hiperplásicos en la próstata ventral17 que aumentan con la edad19, 34, 20 e inician aproximadamente a los seis meses de vida35. Además, el porcentaje de células proliferativas en el epitelio de la próstata ventral es de 3.6 veces más alto y hay menos señales apoptóticas en ratones βERKO que en ratones normales, lo que sugiere que la apoptosis puede encontrarse suprimida. Por otro lado, las células epiteliales prostáticas muestran un patrón de diferenciación incompleto en esta cepa35, mientras que en ratas se observa relación entre el nivel de citodiferenciación y lumenización y la expresión de REβ en la próstata ventral16. Todos estos datos sugieren que el REβ podría tener un rol prodiferenciativo y negativo sobre el crecimiento de la próstata ventral de roedores, aunque no se ha determinado aún con exactitud sobre que genes podría actuar para ejercer los efectos observados. A este respecto, se ha postulado una acción sobre el receptor andrógenos (RA) mediante la cual el REβ reduce o limita el crecimiento de la próstata e induce una mayor diferenciación. Análisis en próstata ventral de ratones βERKO muestran una cantidad mayor de RA que en ratones normales17, lo cual parece ser el resultado de la ausencia del REβ, del que se ha constatado que es capaz de disminuir los niveles de RA, puesto que cuando un ratón normal es expuesto al estrógeno 5α-androstano-3β, 17β-diol que actúa a través del REβ, la cantidad del RA en la próstata disminuye24. Expresión del Receptor a Estrógenos Beta El REβ ha sido localizado en diferentes tejidos en la rata tanto a nivel del ARNm como de la proteína. En general, la expresión más alta del ARNm se encuentra en el ovario y la próstata ventral22, 26. En ésta última, hay una expresión prominente en las células epiteliales de los alveolos, mientras que en el estroma se tienen cantidades bajas21, 22. Además, se observa un gradiente de expresión a lo largo del eje ductal de los lóbulos de la próstata, con la mayor cantidad de expresión en los extremos distales y significativamente menor en los proximales16. La proteína muestra distribución similar. El receptor a estrógenos beta es el RE predominante Regulación de la expresión del Receptor a Estrógenos Beta La regulación de la expresión del REβ parece ser compleja. Distintos estudios muestran la implicación de las hormonas esteroides y de la prolactina en este proceso. Regulación por testosterona 72 En la etapa adulta de las ratas, la castración resulta en un declive marcado en el ARNm del REβ en próstata de rata, mientras que su expresión máxima se observa en el día 90 de edad, cuando los niveles de T en el adulto alcanzan también un máximo16; lo que concuerda con el hecho de que la castración reduce las cantidades de ARNm de REβ en este mismo tejido y la repleción exógena de T los restaura36. lúteo por la activación de Stat5b y no de Stat5a por la vía Jak2/Stat5. Estos autores demostraron también que ambos RE se ven influenciados por esta vía, pero que REα es responsivo tanto a Stat5a como a Stat5b. La falta de estimulación por Stat5a en REβ puede atribuirse a un simple nucleótido en su elemento de respuesta a Stat5. Por otro lado, aunque REβ puede no ser crucial para la función luteal, la habilidad de la PRL para estimularlo puede ser importante en otros tejidos en los que si tiene una función preponderante. Por todo lo anterior, el presente trabajo pretende demostrar la presencia de variaciones en el ARNm del REβ, específicamente una regulación a la alza; en el lóbulo ventral de la próstata de rata en respuesta a las fluctuaciones hormonales que se tienen durante las eyaculaciones consecutivas en la ejecución de la conducta sexual, teniendo en cuenta que en trabajos previos se ha demostrado este tipo de variación en los niveles de ARNm del receptor a andrógenos9, 10, cuya regulación en la próstata de rata parece estar ligada al REβ. Regulación por estrógenos Los estrógenos, por su parte; podrían estar regulando hacia abajo los niveles de REβ. Así, las ratas estrogenizadas neonatalmente muestran un declive en los niveles de ARNm de este receptor37, 24, mientras que el tratamiento con estrógenos en ratas castradas adultas también reduce la expresión del receptor en la próstata19. Por su parte, en tejido neural de ratones se produce un descenso de la inmunorreactividad de REβ en el tratamiento con E220. En la glándula mamaria de ratón, también se observa un decremento en el ARNm del REβ dentro de las doce horas siguientes a la administración de E2, efecto que es revertido con la ovarectomía18. En este último estudio, se demostró que el mecanismo de la regulación hacia abajo en la expresión del REβ por el E2, podría incluir la supresión de la fosforilación de las proteínas Stat, que tienen un elemento de respuesta en el promotor de ambos receptores a estrógenos, con el que interactúan después de una dimerización inducida por fosforilación. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN: ¿Las variaciones hormonales producidas durante la ejecución de la conducta sexual promueven variaciones en los niveles de ARNm del REβ en próstata ventral de rata? HIPÓTESIS La densidad del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) del receptor a estrógenos beta (REβ) en próstata ventral de rata aumenta con las eyaculaciones consecutivas al ejecutar la conducta sexual Regulación por prolactina Una de las vías de señalización que involucra a las proteínas Stat5a y Stat5b es la vía Jak2/Stat5, que es activada por la unión de la prolactina (PRL) (una hormona peptídica); a su receptor membranal. Esto involucraría pues, a esta hormona no esteroide en la regulación de la expresión del REβ. En efecto, Telleria y colaboradores38 encontraron que la hipofisectomía provoca un decremento significativo en la expresión de ARNm del REβ en el cuerpo lúteo de la rata, efecto que es totalmente revertido por la administración de PRL y de Lactógenos Placentarios I y II, lo que proporciona evidencia experimental de que la acción sinérgica ya descrita entre la PRL y el E2 puede involucrar a la estimulación prolactínica de los receptores a estrógenos. Una ulterior investigación del papel de la PRL en la regulación de la expresión del REβ fue llevada a cabo por Frasor y colaboradores en 200139. Este grupo demostró que la expresión del REβ está regulada al alza en cuerpo OBJETIVO Determinar la variación del nivel sérico de estradiol (E2) y la densidad de ARNm del REβ en el lóbulo ventral de la próstata de rata en eyaculaciones consecutivas. METODOLOGÍA Animales Se utilizaron ratas macho adultas sexualmente expertas de la cepa Wistar (de 200 a 250 g de peso) mantenidas en cajas colectivas de acrílico (50 x 30 x 20 cm) en un bioterio con temperatura controlada y en ciclo de luz-oscuridad invertido 12:00 h. Luz: 12:00 h. oscuridad, apagando la luz a las 8:00 a.m. El agua y el alimento balanceado se les proporcionó a libre demanda. 73 Entrenamiento conductual de la rata macho se centrifugó por 10 minutos a 3500 rpm, se decantó el suero en otro tubo y se volvió a centrifugar con las mismas especificaciones; se decantó el suero y se hicieron alícuotas de 400 µl. Estas fueron congeladas a –20 °C hasta el momento de cuantificar el E2. Los sujetos de experimentación adquirieron experiencia sexual sometiéndose a 4 pruebas conductuales 2 veces por semana, con un intervalo de 3 días entre cada prueba. El entrenamiento conductual se llevó a cabo durante el último tercio de la fase oscura del ciclo luz-oscuridad, fase óptima para la expresión de la conducta sexual en esta especie. Para las pruebas conductuales se utilizaron hembras adultas ovariectomizadas a las que se les indujo la receptividad administrando benzoato de estradiol (10 µg/0.1 ml de aceite vegetal) 48 horas antes de la prueba y progesterona (500 μg/0.1 ml de aceite vegetal) 4 horas antes de la prueba. Los animales realizon las pruebas conductuales en arenas de entrenamiento, que son cilindros de plexiglass de 60 cm de diámetro x 60 cm de altura con una base de aserrín. Al inicio de la prueba, se colocó al macho dentro de la arena de entrenamiento por un lapso de 5 minutos para su adaptación y después se introdujo en la arena una hembra receptiva. A partir de ese momento, se registró el tiempo necesario para que el macho alcanzara la primera eyaculación. Una vez concluidas las 4 pruebas de entrenamiento, se seleccionaron aquellos machos que tuvieron en promedio una latencia a la primera eyaculación de entre 5 y 10 minutos, considerando los criterios establecidos por Larsson6. Los animales seleccionados para el experimento (según criterios descritos anteriormente) se clasificaron en 5 grupos; A, B, C, D y E. Se sometieron a una sesión de registro conductual, en la cual se les permitió copular en presencia de una hembra receptiva, excepto al A que fue el grupo control. Los animales de los grupos B, C, D y E alcanzaron 1, 2, 3 y 4 eyaculaciones consecutivas respectivamente. Posteriormente, los animales fueron anestesiados con una dosis de 39 mg/kg de pentobarbital sódico y se procedió a la extracción de sangre y luego; mediante cirugía, a la extracción del complejo próstatavejiga urinaria-vesículas seminales Extracción de próstata Después de obtener las muestras de sangre se extrajó el complejo próstata-vejiga-vesículas seminales, colocándolo inmediatamente en solución salina fisiológica. Bajo un microscopio de disección (MEIJI, EMZ-TR) se realizó la disección prostática obteniendo los lóbulos ventral, dorsal y lateral, que fueron congelados en nitrógeno líquido y almacenados a –70°C hasta su uso en la técnica de RT-PCR. RT-PCR para Receptor a Estrógenos Beta (REβ) en el lóbulo ventral de la próstata de rata Obtención de ARN. El ARN total se obtuvo usando el reactivo TRIzol (Invitrogen Life Technologies) de acuerdo al protocolo del fabricante. En un tubo de plástico estéril se puso una porción de aproximadamente 100 mg de próstata ventral y se agregó un mililitro de TRIzol, se homogenizó con politrón y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se adicionaron 200 µl de cloroformo agitando vigorosamente, se incubó 3min a temperatura ambiente y se centrifugó a 8000 G bajo una temperatura de 8 ºC por 15 min. Se tomó la fase acuosa, que fue colocada en un tubo estéril de 1.5 ml. Precipitación de ARN. A la fase acuosa obtenida se adicionó alcohol isopropílico a una proporción 1:1, se homogenizó e incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente, centrifugándola posteriormente a 12000 G a 8 ºC por 10 minutos, con lo que se obtuvo un precipitado correspondiente al ARN. El sobrenadante fue removido del lado contrario a la pastilla; se lavaró la superficie de ésta una vez con etanol al 75 % y después se centrifugó a 7500 G a 8 ºC durante 5 minutos; se decantó el etanol y se secó al aire el precipitado. Se agregaron 50 µl de agua estéril disolviendo la pastilla de ARN con la punta de una pipeta. De esta disolución se tomó 1 µl y se mezcló con 999 µl de agua estéril libre de ARNasas obteniendo una dilución 1:1000 y se midió la densidad óptica de la dilución en un espectrofotómetro a 260 y 280 nm de longitud de onda. El cociente de las absorbancias a ambas longitudes de onda (260/280) que correspondía a un valor de entre 1.6 y 1.8, se usó como indicativo de que el ARN tiene una pureza adecuada. La concentración de ARN se calculó tomando en cuenta que una unidad de absorbancia a 260 nm corresponde a 40 µg de ARN por mililitro. Extracción sanguínea por punción cardiaca Una vez anestesiados los animales, se procedió a localizar con el dedo índice el latido cardiaco, con el objetivo de identificar la posición del corazón mediante palpación. Después se introdujo una aguja en esa dirección hasta que apareció una gota de sangre y se aspiró con el émbolo de la jeringa de plástico hasta obtención de 5 ml sangre. Ésta fue vertida en un tubo cónico donde se dejó reposar a temperatura ambiente para que coagulara. Transcurrido este tiempo 74 Transcripción reversa. En diferentes tubos Eppendorf de 0.2 ml se pusieron 3 µg de RNA (a partir de diluciones convenientes de la muestra de ARN obtenida); 1 µl de oligo dt, 1 µl de DNTP’s y 6 µl de agua estéril. Los tubos se colocaron en un termociclador a 70 ºC por 3 min. Después se agregaron 9 µl de un coctel de reactivos para completar 20 µl. El coctel contenía 5 µl de mix buffer 5X; 2 µl de DTT; 1 µl de inhibidor de ARNasa y 1 µl de enzima transcriptasa reversa MMLV por cada tubo. Las muestras fueron incubadas en el termociclador a 37 ºC durante 60 minutos y a 94 ºC durante 3 min, para finalizar a una temperatura de 4 ºC, al término de lo cual fue obtenido el molde de ADN complementario (ADNc) . Amplificación del ADNc. Se preparó un segundo cóctel de reactivos con 1 µl de dNTP’S; 5 µl de Buffer 10X (sin MgCl) ; 1.5 µl de Mg++ como MgCl2 ; 0.5 µl de Taq polimerasa y 30 µl de agua desionizada, por muestra amplificada. En un tubos eppendorf de 0.2 ml diferentes se puso 1 µl (50 pmoles) de oligonucleótido en sentido 5΄-3΄; 1 µl (50 pmoles) de oligonucleótido en contrasentido 3΄- 5΄; 10 µl de ADNc proveniente de cada una de las cantidades variables de ARN sometidas a retrotranscripción , 38 µl de cóctel y 2 gotas de aceite mineral; se colocaron las muestras en un termociclador y se sometieron al siguiente protocolo de amplificación: Etapa 1 1 ciclo de amplificación Paso 1 94 °C por 5 minutos Etapa 2 30 ciclos de amplificación Paso 1 94 °C por 5 minutos Paso 2 60 °C por 1 minuto Paso 3 72 °C por 2 minutos Etapa 3 1 ciclo de amplificación Paso 1 72 °C por 10 minutos Etapa 4 1 ciclo de amplificación Paso 1 4 °C infinito obtener productos de 228 pb. Los datos provenientes de las amplificaciones de actina se utilizaron para normalizar aquellos que se obtuvieron de las amplificaciones del REβ. Como control positivo se incluyó la amplificación tanto para REβ como para actina a partir de ARN de vermix de rata. Preparación del gel de agarosa. Se preparó TBE 3X (18.15 g de tris base, 9.25 g de ácido bórico y 1.116 g de Na2EDTA•2H2O en agua desionizada hasta aforar a 1 l), y se tomaron de él 16.66 ml, mismos que fueron agregados a 0.5 g de agarosa y disueltos hasta aforar a 50 ml con agua desionizada, con lo que se obtuvo una solución al 1% de agarosa en TBE a una concentración de 1 X. Posteriormente se calentó hasta disolver la mezcla, y se pasó posteriormente a un tubo eppendorf de 50 ml donde se le añadieron 4 µl de bromuro de etidio. Esta mezcla final fue vertida a una cámara de electroforesis para ácidos nucleicos, colocando los topes y el peine correspondientes para la obtención adecuada del gel con los pocillos donde fueron colocadas las muestras amplificadas, y se mantuvo a 4 ºC por 15 minutos para su solidificación. Preparación y corrimiento de las muestras. Se retiraron de la cámara el peine y los topes usados para la solidificación del gel. Se agregaron 200 ml del buffer de corrida 1X (66.66 ml de TBE 3X aforados a 200 ml con agua desionizada). En un pedazo de papel parafilm se colocaron 5 µl de glicerol-agua en una proporción de 1:1, y se agregaron 15µl de muestra amplificada, se procedió a mezclar con la punta de una pipeta y se cargaron 18 µl de ésta mezcla en uno de los pocillos del gel. Este procedimiento se realizó para cada muestra. En el primer pocillo se cargaron 5 µl de marcador de 100 pb (MPB) preteñido. Posteriormente se conectó la cámara a la fuente de poder a 100 V, deteniendo el corrimiento cuando el MPB recorrió ¾ partes del gel. Análisis densitométrico. Se obtuvieron imágenes de los geles mediante el programa Kodak 1D 3.6 a través de la estación de imágenes 440 CF de Kodak utilizando la lámpara UV y el filtro 4, capturadas con un tiempo de exposición de 8 segundos. Utilizando el mismo programa se realizó la densitometría respectiva de cada banda. Cuantificación de E 2. Se realizó un radioinmunoanálisis a cada una de las muestras de sangre obtenidas con radioisótopo I125. Análisis estadístico. Los datos obtenidos para cada prueba fueron comparados con un análisis de varianza (ANOVA) de una vía para grupos independientes y como prueba post hoc el método de Dunnett para comparar los grupos experimentales de animales contra su control correspondiente. al Los oligonucleótidos que se utilizaron para la amplificación de REβ fueron de 20 pb con las siguientes secuencias: GGGTGAAGGAGCTACTGCTG (sentido) y CCAATCATGTGCACCAGTTC (contrasentido) con lo que se esperaba obtener productos de 192 pb. Se realizó también, para cada tratamiento, una amplificación control de una porción del gen de actina β, para lo que se utilizaron los oligonucleótidos de 20 pb con las secuencias AGCCATGTACGTAGCCATCC (sentido) y AAGTGGTGGTGTCGACTCTC (contrasentido) para 75 RESULTADOS Concentraciones séricas de estradiol ARNm del REβ Las concentraciones séricas de estradiol se muestran en la gráfica 2. Se observa un decremento estadísticamente significativo (p<0.01) en todos los grupos de tratamiento (eyaculaciones consecutivas), con respecto al control de cero eyaculaciones. Se obtuvieron datos que corresponden al porcentaje de variación en la expresión del ARNm del REβ en próstata ventral de rata. Los datos se presentan en la gráfica 1, que corresponde a grupos de tratamientos de eyaculaciones consecutivas (1-4) con una n de 3. El porcentaje de variación en cada tratamiento se expresa con respecto al control de 0 eyaculaciones que representa el 100% de la expresión. Hay un aumento en la expresión de ARNm del REβ en todos los tratamientos. Sin embargo, este aumento es significativo después de la segunda eyaculación y regresa a valores cercanos a los del control después de las eyaculaciones tercera y cuarta. DISCUSIÓN Los datos presentados hasta el momento muestran que la conducta sexual produce un descenso en los niveles de estradiol sérico, así como también un incremento en el ARNm del REβ. Este incremento es máximo después de la segunda eyaculación pero regresa a valores cercanos a los del control después de 3 y 4 eyaculaciones consecutivas. Teniendo en cuenta que el estradiol suele provocar una regulación a la baja de la transcripción del REβ, es probable que el descenso en el ARNm de éste se deba inicialmente a los bajos niveles de estradiol provocados por las eyaculaciones consecutivas en el despliegue de la conducta sexual. Sin embargo, puesto que el ARNm del REβ no continúa elevándose, en tanto que el estradiol si continúa en descenso, es probable que en la segunda eyaculación se disparen mecanismos de regulación que no involucran a las concentraciones de estradiol en sangre. Es de notar el hecho de que en la segunda eyaculación se alcancen también incrementos máximos en las concentraciones séricas de PRL11 y de T, que inician un decremento -para el caso de la PRL- después de la segunda eyaculación9, 10 y que ambas hormonas tengan un papel en la regulación al alza de la expresión del ARNm específicamente en próstata para el caso de la T, y en cuerpo lúteo en el de la PRL, sin descartar su participación en la próstata16, 38, 39. Así pues, las fluctuaciones en los niveles séricos de estas dos hormonas, también podrían contribuir a las variaciones observadas en el ARNm del REβ. Agradecimientos El presente trabajo cuenta con el apoyo de becas para estudios de maestría otorgadas por el CONACyT a José Locia Espinoza, con número de registro 209152, y a Milagros Silva Morales, con número de registro 209402. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Hayashi N, Sugimura Y, Kawamura J, Donjacour A y Cunha G. Morfological and functional heterogeneity in the prostate in the rat prostatic gland. Biology of reproduction, 1991, 45:308-321. 76 2. Horseman. Prolactin. Boston: Kluwer Academic Publishers, 2001 3. Beach F, Paiker R. Effects of castration and subsequent androgen administration upon mating in castrated male rats. Endocrinology 1949; 45:1346-1350 4. Dewsbury D. Descrption of sexual behaviour in research on hormone-behavior interactions. En: Endocrine control of sexual behavior. New York: Raven press, 1979:3-32. 5. Hull E, Domínguez J. Sexual behavior in male rodents. Horm Behav, 2007, 52:45-55. 6. Larsson, K. 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These data confirm that most inducible Mmps and Timps behave as “late” activated, protein synthesis-dependent genes in fibroblasts. However, the requirement of protein synthesis for PMAinduction of MMPs is not universal, since it is abrogated for Mmp9, and its induction occurs in terms of hours. La familia de metaloproteasas de matriz (MMPs) en el ser humano incluye 24 genes que junto con sus cuatro inhibidores naturales, de sus siglas en inglés TIMPs son los responsables de la remodelación de la matriz extracelular. Mediante análisis de PCR en tiempo real cuantitativo evaluamos los patrones de expresión de estas familias en fibroblastos de ratón C3H10T½ en respuesta al activador farmacológico PMA, el cual estimula la proteína kinasa C. Investigamos el requerimiento de síntesis de proteínas utilizando cuatro inhibidores: anisomicina, ciclohexamida, emetina y puromicina. De todas las Mmps y Timps únicamente la transcripción de Mmp9, Timp1 y Timp3 se indujo después de 4.5 horas, y la inducción por PMA de todos los genes, excepto Mmp9, fue bloqueada por todos los inhibidores de síntesis proteínas probados. Estos datos confirman que la mayoría de las Mmps y todos los Timps inducibles por PMA tienen un patrón de expresión similar a la de un gen tardío, es decir, son dependientes de la síntesis de proteínas para su inducción y la activación transcripcional ocurre en términos de horas. MARCO TEÓRICO Los metaloproteasas de la matriz extracelular, de sus siglas en inglés MMPs, y sus inhibidores naturales, de sus siglas en inglés TIMPs, constituyen un sistema proteolítico cuya coordinación es crítica para el desarrollo, la homeostasis y la reparación tisular después de una lesión. La familia humana de MMPs abarca 24 endopeptidases dependientes de zinc que degradan los componentes de la matriz extracelular y también ejecutan rompimientos proteolíticos reguladores de factores de crecimiento, citocinas y quimiocinas (1, 2, 3, 4). La actividad de las MMPs y TIMPs es controlada finamente, observándose desregulación en numerosos estados patológicos como cáncer, artritis y enfermedades cardiovasculares. La regulación de la actividad de las MMPs ocurre en diversos niveles, incluyendo la transcripción, la estabilización post-transcripcional del ARNm, la eficacia de traducción, la compartimentalización, la secreción enzimática, la activación del zimógeno y la inhibición de la enzima activa por los cuatro TIMPs (2, 5, 6, 7). Para entender el control proteolítico a nivel celular es importante identificar los mecanismos compartidos y únicos empleados en la inducción y represión de la actividad de estas dos familias genéticas funcionalmente interconectadas. ABSTRACT The human matrix metalloproteinase (MMP) gene family includes 24 genes whose regulated expression, together with that of four tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs), is essential in tissue remodeling and cell signalling. Quantitative real-timePCR analysis was used to evaluate the shared and unique patterns of control of these two gene families in mouse C3H10T½ in response to the protein kinase C activator PMA. The requirement for ongoing translation was analyzed using four protein synthesis inhibitors, anisomycin, cycloheximide, emetine and puromycin. PMA induced Mmp9,Timp1 and Timp3 RNAs after 4.5 hours, ANTECEDENTES La transcripción es el principal nivel de control de la mayoría de las MMPs y TIMPs (8), con la implicación 79 de la familia de las cinasas MAPKs, el factor-KB nuclear y las rutas Smad-dependientes (2, 9, 10, 11, 12). Estas rutas de señalización inducen la fosforilación de factores trancripcionales y/o co-activadores transcripcionales, así como la activación de proteínas nucleosomales que conducen a la transcripción de una clase de genes llamados los genes “tempranos inmediatos”, de sus siglas en inglés IE genes (revisados en 13), que incluyen al gen c-fos y a las familias de c-jun, los cuales forman el complejo transcripcional AP1. Sitios cis para el factor AP1 están presentes en las regiones promotoras de muchos genes de MMPs y TIMPs, los cuales a menudo junto los elementos PEA3 están implicados en la inducción genética (2, 5, 6, 11, 14). Se ha establecido que los factores AP1 son esenciales para la activación transcriptional de varios genes de MMPs y de TIMPs en respuesta a diversos estímulos, incluyendo MMP1, MMP3 y TIMP1 (15, 16, 17, 18). Los genes IE se definen por ser activados rápida y transitoriamente en respuestaa a factores del crecimiento, el activador PMA y mediadores inflamatorios, sin la necesidad de la síntesis de proteínas. De hecho, los inhibidores de la síntesis de proteínas conjuntamente con el activador PMA produce la superinducción de los transcritos IE (13, revisado en 19). La transcripción de los genes IE constituye la respuesta primaria celular. En contraste, los genes MMPs y TIMPs han sido considerados como genes tardíos, puesto que sus transcritos se inducen generalmente después de varias horas y para algunos, por ejemplo, MMP3 y TIMP1, el requisito de síntesis de proteínas se ha documentado claramente (15, 20). Sin embargo, al momento no ha habido una evaluación sistemática de la cinética básica de la inducción los miembros de la familia de MMPs y TIMPs en fibroblastos de ratón, conocimiento necesario para entender las rutas de señalización que intervienen en su regulación. mínimo con suero vacuno fetal al 10%, glutamina al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, penicilina de 1000 IU/ ml y 100 mg/ml de estreptomicina (todos los reactivos para cultivo celular fueron adquiridos en Invitrogen, Paisley, Reino Unido). Las células fueron mantenidas en CO2 a 37oC. Para determinar si la síntesis de proteínas era necesaria para la inducción por PMA, las células confluentes fueron incubadas durante toda la noche en medio libre de suero, seguido por el estímulo de 10 mg/ ml de inhibidores y/o 10-7M de PMA por 4.5 horas (todos los inhibidores de síntesis de proteínas se adquirieron en Sigma Aldrich, Poole, Reino Unido). Extracción de ARNm. Se procedió a lisar y homogenizar las células en cultivo usando el sistema de extracción de ARN total de Promega, de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El posible ADN genómico que pudo contener las muestras de ARN fue eliminado mediante tratamiento con la enzima DNasa I incluida en este sistema de extracción. La pureza y cantidad del ARN se determinó mediante lectura de la densidad óptica de cada muestra a 260nm y 280nm usando Nanodrop ND espectrofotómetro (Labtech International). Reverso transcripción. Se realizó siguiendo el protocolo establecido en el laboratorio del Dr. Dylan R. Edwards (publicado en 21, 22, 23, 24, 25, 26,). Brevemente, 1µg o 0.5µg de ARN total fue incubado con hexámeros aleatorios (Roche) a 70oC por 10 minutos. Posteriormente se agregarón los nucleótidos (Roche), el inhibidor de RNasas (Promega), DTT (Invitrogene) y la enzima reverso-transcriptasa (Invitrogene) en un volumen final de 20µl. La reacción de reverso-transcripción se llevó a cabo por 1 hora a 42oC. En todas las reacciones de reverso-transcripción se usaron controles negativos para verificar la existencia de posible contaminación. Iniciadores y sondas. Taqman para PCRc. Se diseñaron, validaron y sintetizaron por la compañía Applied Biosystems, las secuencias pueden encontrarse en 21 y 23. Las sondas Taqman para análisis de expresión mediante PCRc poseen en sus extremos 5´ y 3´ una molécula excitadora y un fluorógeno respectivamente. En forma paralela la enzima Amplitaq Gold sintetiza el ADNc e hidroliza la sonda Taqman mediante actividad nucleasa 5´-3´. Cuando la molécula excitadora y el fluorógeno son separados se produce un notable aumento en la fluorescencia. El extremo 3´ de la sonda Taqman es bloqueado para prevenir cualquier extensión (27). Cuando fue posible, se diseñaron sondas Taqman que permitieran la determinación de tipo múltiple con la finalidad de evaluar en la menor cantidad de pruebas la expresión de un mayor número de genes. Técnica de PCR cuantitativo en tiempo real. Se prepararon curvas estándar de ADNc correspondientes HIPÓTESIS Las Mmps y Timps posen un patrón de expresión genética similar a la de los genes tradíos en fibroblastos de ratón C3H10T½ en cultivo. OBJETIVO GENERAL Determinar si las Mmps y Timps son genes tardíos que requieren la síntesis de proteínas para su inducción en fibroblastos de ratón C3H10T½ en cultivo. METODOLOGÍA Cultivo celular y tratamientos. Fibroblastos de ratón C3H10T½ fueron cultivados en medio esencial 80 a 20, 10, 5, 2.5, 1.25 y 0.625ng/10ul. En cada pozo se colocaron el equivalente a 10ng de ADNc. La cantidad relativa se determinó usando la curva estándar dividida entre la cantidad del gen que funcionará como control endógeno ARNr 18S. Cada reacción de PCRc contuvo 8.33µl de Taqman universal PCR master mix, 200nm de iniciador 1, 200nm de iniciador 2 y 100nm de sonda Taqman en un total de 25ul. Se emplearon placas de 96 pozos que fueron selladas con cubiertas ópticas y se sometieron al análisis de PCRc usando Abi Prism 7500 Real Time PCR System. En todas las reacciones de PCRc se usaron controles negativos para cada gene con la finalidad de verificar la existencia de posible contaminación. El sistema Abi Prism 7500 Real Time PCR System monitorea en tiempo real cada ciclo de la PCR, generándose datos de manera cuantitativa de forma exponencial, antes que los componentes de la reacción comiencen a ser limitantes. Durante cada ciclo de PCR se dirige un rayo láser mediante una fibra óptica a cada uno de los 96 pozos de la placa. La luz pasa a través del pozo excitando fluorógenos presentes en cada celda. Otra fibra óptica colecta la emisión generada entre 500 y 600nm de cada pozo aproximadamente cada 7 segundos. El incremento en fluorescencia es medido como una consecuencia directa de la amplificación del ADN blanco durante la PCR. Los datos son expresados como ciclo umbral (siglas en inglés CT de cycle threshold). El ciclo umbral representa el número de ciclo en el cual comienza a detectarse la fluorescencia, que a su vez es dependiente de la cantidad de ADN blanco al comienzo de la reacción. El ciclo umbral es asignado arriba de la fluorescencia de fondo (27). Análisis estadísticos. Las curvas estándar fueron usadas para convertir los datos de ciclo umbral y todos los análisis de expresión genética de las MMPs se harán con estos valores normalizados por ARNr 18S. Para evaluar las diferencias en expresión genética de los genes en diversas condiciones se usaron pruebas t. Cuantificación de la síntesis de proteína total mediante análisis de la incorporación de leucina3 H en C3H10T½. Fibroblastos confluentes de ratón C3H10T½ fueron incubados durante la noche en medio libre de suero, después 5 µCi de leucina-3H (Amersham) fue agregada, posteriormente se agregaron al medio los inhibidores de la síntesis de proteína 10 µg/ml y/o 107 M de PMA por 4.5 horas. Las células fueron lavadas tres veces con la solución de sales balanceada fría (Invitrogen), fijadas en 4oC por 5 minutos con ácido tricloroacético, tratadas con metanol y lisadas con 0.3 M de NaOH y SDS al 1% por 30 minutos en agitación a temperatura ambiente. Los lisados fueron mezclados y transferidos a los frascos del aparato de centelleo y resuspendidos con Optiphase (LAS Ltd, Reino Unido PerkinElmer). La síntesis de la proteína fue determinada mediante la cuantificación de la radiactividad detectada en el sistema el 1400TM (PerkinElmer) de Wallac. Análisis para evaluación de viabilidad celular. Las células fueron cultivadas a una densidad de 10,000 y 20,000 por pozo en placas de 96 celdas en un medio libre de suero durante toda la noche, al día siguiente se aplicó el tratamiento de PMA y/o los inhibidores de la síntesis de proteínas en las concentraciones y los tiempos utilizados para el análisis de PCRc. Para determinar el número de células viables después de 4.5 horas de tratamiento se agregó el reactivo MTT (Sigma) y las células fueron incubadas por 4 horas adicionales. El medio fue retirado y el precipitado formado fue disuelto en dimetil sulfóxido. La intensidad del color se determinó por lectura de las muestras a 550 nm y 690 nm, usando un espectrofotómetro de MRX (laboratorios de Dynatech, Chantilly, VA, E.U.). RESULTADOS Perfil de expresión de Mmps y Timps en respuesta a PMA en C3HT10½. Fibroblastos de ratón C3HT10½ en condición basal fueron inducidos con PMA y después de 4.5 horas de estimulación el ARNm fue colectado, reversotranscrito y el perfil de expresión de todas las Mmps y Timps fue analizado mediante la tecnología de PCRc. Pruebas t fueron aplicadas a los resultados, identificando así tres grupos: I) Genes inducibles significativamente por PMA; II) Genes no inducibles por PMA, y III) Genes no detectados y no inducibles por PMA (Tabla 1). El nivel de expresión basal varío considerablemente en las dos familias genéticas, detectándose un total de 11 Mmps y 4 Timps de las cuales 5 Mmps y 3 Timps fueron expresadas extremada, muy alto o altamente, 6 Mmps y Timp4 se expresaron de forma moderada, mientras que los niveles de 14 Mmps no fueron detectados (datos no mostrados). Tabla 1. Respuesta a PMA de la familia entera de Mmps y Timps en fibroblastos de ratón C3H10T½ en cultivo 81 Genes inducibles por PMA Genes no inducibles por PMA Genes no detectados y no inducibles por PMA Mmp9, Timp1, Timp3 Mmp2, Mmp11, Mmp14, Mmp15, Mmp16, Mmp17, Mmp19, Mmp21, Mmp28, Timp2, Timp4 Mcola, Mcolb, Mmp3, Mmp7, Mmp8, Mmp10, Mmp12, Mmp13, Mmp20, Mmp24, Mmp25, Mmp27 Requerimiento de síntesis de proteínas de los genes inducibles por PMA. Una vez identificados los grupos de genes con base a su respuesta al activador farmacológico PMA, se analizó el requerimiento de proteínas para su inducción. Fibroblastos de ratón C3HT10½ en condición basal fueron estimulados con los cuatro inhibidores de proteínas y después inducidos por PMA por 4.5 horas. El ARNm fue colectado, reversotranscrito y el perfil de expresión de Mmp9, Timp1 y, Timp3 fue analizado mediante la tecnología de PCRc, pruebas t fueron aplicadas a los resultados. Se identificó que Timp1 (datos no mostrados) y Timp3 (figura 1a) tienen patrones de expresión similares, la inducción por PMA de ambos genes fue afectada por todos los inhibidores empleados, estos datos sugieren que Timp1 (datos no mostrados) y Timp3 (figura 1a) requieren de la síntesis de proteínas para la inducción por PMA. Sin embargo, Mmp9 parecería ser independiente de síntesis de proteínas para la inducción por PMA (figura 1b), puesto que los mismos inhibidores de la síntesis de proteínas no bloquearon la inducción de PMA en fibroblastos C3HT10½ en cultivo. Interesantemente anisomicina, emetina y ciclohexamida, pero no puromicina, induce Mmp9 al mismo grado que PMA. por PMA; los datos fueron normalizados a ARNr 18S. El color blanco y obscuro representan los tiempos 0 y 4.5 horas respectivamente. Las barras de error representan el rango entre las muestras. a) Timp3, y b) Mmp9. 6 Timp3 / 18S (veces) a) 5 4 3 2 1 0 - PMA Anisomicina Emetina Ciclohexamida Puromicina - + - + - + - + - + + + - + + - + + - + + b) Mmp9 / 18S (veces) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 PMA Anisomicina Emetina Ciclohexamida Puromicina Efectividad de los inhibidores anisomicina, emetina, ciclohexamida y puromicina para bloquear síntesis de proteínas total en fibroblastos de ratón C3H10T½. Células C3H10T½ mantenidas en medio libre de suero por 18 horas fueron estimulandas con 10 µg/ml de anisomicina, ciclohexamida, emetina y puromicina en presencia o ausencia 10-7M de PMA por 4.5 horas, posteriormente se agregó al medio leucina-3H. Estos cuatro inhibidores de la síntesis de proteínas actúan por diversos mecanismos (17, 19). La cuantificación de la incorporación leucina-3H (datos no mostrados) después de 4.5 horas de tratamiento con inhibidores muestran que la traducción fue bloqueda al menos en un 95% comparada con la condición de PMA en fibroblastos de ratón C3H10T½ en cultivo. La viabilidad celular en estos estudios no fue comprometida significativamente, pues los análisis MTT indican que la disminución fue menor al 10% (datos no mostrados). - - + - + - + - + - + + + - + + - + + - + + DISCUSIÓN Bajo condiciones basales 11 Mmps y todos los Timps fueron expresados en diversos niveles en C3H10T½: 5 Mmps y 3 Timps fueron expresadas extrema, muy alta o altamente, 6 Mmps y Timp4 se expresaron de forma moderada, mientras que los niveles de 14 Mmps no fueron detectados. Estos datos sugieren un patrón único de expresión para C3H10T½ comparado con los reportados en la literatura (21, 22, 26). Previamente se ha demostrado que TIMP1, Timp1 y ciertas MMPs son genes tardíos que requieren la síntesis de proteínas para su inducción, en comparación con los genes IE que exhiben la superinducción cuando los inhibidores de la síntesis de proteínas se utilizan conjuntamente con un estímulo (17, 18, 29). Por lo tanto, es importante entender si la familia de Mmps y Timps comparten la descripción como genes tardíos, lo cual implicaría son componentes de una respuesta genética coordinada en procesos de remodelación tisular. En relación a la necesidad de la síntesis previa de proteínas para su inducción por PMA, este estudio coincide con lo reportado previamente para Timp1 (29) e incluye en este Figura 1 Efecto de los inhibidores de la síntesis de proteínas en presencia o ausencia de PMA en Timp3 y Mmp9 en células C3H10T½. Células de C3H10T½ en medio libre de suero por 18 horas fueron estimulandas con 10 µg/ml de diversos inhibidores de la síntesis de proteínas según se indica, en presencia o ausencia 107 M de PMA por 4.5 horas. El ARN total fue aislado y sujeto a análisis mediante PCRc para cada gen inducible 82 grupo a Timp3, sin embargo, para Mmp9 mostramos que es independiente de la síntesis de proteínas para su inducción en respuesta al estímulo por PMA usando como inhibidores anisomicina, emetina, ciclohexamida y puromicina después de 4.5 horas de tratamiento. Aunque se sabe que la inducción de MMPs y de TIMPs depende del tipo de tejido y del inductor (5, 15, 18, 28, 30, 31) los pocos reportes existentes en los que se ha documentado el requerimiento de síntesis de proteínas, indican que la mayoría de estos genes tiene como prerequisito para su inducción la síntesis previa de proteínas. Estos reportes incluyen: inducción Timp1 en fibroblasts de ratón por TGF-b (28, 29); PMA (29) y suero (32); inducción Timp3 en fibroblasts de ratón por PMA (30); inducción TIMP3 en condrocitos articulares de bovinos por TGF-b y Oncostatin M (33). De nuestro estudio es interesante observar que el requerimiento de síntesis de proteínas para la inducción por PMA puede variar dependiendo del Mmp o Timp, dado que todos los inhibidores de proteínas bloquearon la inducción de PMA para Timp1 y Timp3, pero no para Mmp9. 5. Edwards DR, Murphy G, Reynolds JJ, Whitham SE, Docherty AJ, Angel P, et al. Transforming growth factor beta modulates the expression of collagenase and metalloproteinase inhibitor. EMBO J. 1987; 6(7):1899-904. 6. Edwards DR, Rocheleau H, Sharma RR, Wills AJ, Cowie A, Hassell JA, et al. Involvement of AP1 and PEA3 binding sites in the regulation of murine tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) transcription. Biochim Biophys Acta. 1992; 1171(1):4155. 7. 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Agradecimientos Deseamos agradecer a C.J. Pennington, M.H. Handsley, A. Warn, a J. Zhong, A. Cullingford, E. Pineda Arredondo y S. de la Peña Cruz su apoyo. C.L.S.R fue becaria para estudios de doctorado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología México (CONACyT), Secretaría de Educación Pública México (SEP) y Secretaría de Educación de Veracruz México (SEV). Este trabajo fue financiado por el consorcio europeo del “Cancer Degradome” de la Unión Europea (LSHC-CT2003-503297). REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Chang C, Werb Z. The many faces of metalloproteases: cell growth, invasion, angiogenesis and metastasis. Trends Cell Biol. 2001; 11(11):S37-43. 2. Egeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer. 2002; 2(3):161-74. 3. López-Otín C, Overall CM. Protease degradomics: a new challenge for proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002; 3(7):509-19. 4. Puente XS, Sánchez LM, Overall CM, López-Otín C. 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Tissue inhibitor of metalloproteinase-3 is up-regulated by transforming growth factor-beta1 in vitro and expressed in fibroblastic foci in vivo in idiopathic pulmonary fibrosis. Exp Lung Res. 2006; 32(5):201-14. 26. Sampieri CL, Nuttall RK, Young DA, Goldspink D, Clark IM, Edwards DR. Activation of p38 and JNK MAPK pathways abrogates requirement for new protein synthesis for phorbol ester mediated induction of select MMP and TIMP genes. Matrix Biol. 2008; 27(2):128-38. 27. Applied Biosystems (EU). Absolute quantification using standard curve. Foster City (CA) : Applied Biosystems. Referido en Marzo 2007 e: URL : http:// www.appliedbiosystems.com/. 28. Hall MC, Young DA, Waters JG, Rowan AD, Chantry A, Edwards DR, et al. The comparative role of activator protein 1 and Smad factors in the regulation of Timp-1 and MMP-1 gene expression by transforming growth factor-beta 1. J Biol Chem. 2003; 278(12):10304-13. 29. Clark IM, Rowan AD, Edwards DR, Bech-Hansen T, Mann DA, Bahr MJ, et al. 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El diente y los tejidos de soporte y sostén, la mucosa oral entre ellos, constituyen blancos directos que pueden afectarse por este motivo, siendo las alteraciones más frecuentes a nivel oral: gingivitis, granuloma del embarazo, periodontitis y caries dental. 3 Un estudio en Madrid arrojo que las embarazadas presentaron mayor incidencia de caries que las no embarazadas en el periodo de embarazo y postparto. 4 Las embarazadas han sido consideradas como población de alto riesgo a la que debe otorgarse una atención especial, esta orientación se consolida aún más al incluir en la Norma Oficial Mexicana para la prevención y control de enfermedades bucodentales lo siguiente: “En relación a la caries dental, se puede decir, que la población de alto riesgo está principalmente representada por los menores de 0 a 15 años y las embarazadas. 5 Aunque en muchos países desarrollados ha habido una reducción en la prevalencia de caries en los últimos 20 años, en el ámbito mundial la prevalencia sigue siendo alta. 6 La caries tienen su inicio en la constante aposición sobre la superficie del diente de glicoproteínas que forman la placa bacteriana y por tanto la remoción de la misma es la premisa principal en la prevención. 7 La caries es la enfermedad bucal de mayor prevalencia en los países en vías de desarrollo y es considerada como una enfermedad multifactorial.8 Se define como caries dental a una enfermedad infecciosa de carácter crónico que afecta desmineralizando a los tejidos duros de los dientes en forma progresiva. Su etiopatogenia obedece a la interacción simultánea de factores como son: una flora microbiológica específica o placa bacteriana, que se caracteriza por su alta capacidad en la producción de ácidos, los que alcanzan rápidamente el pH crítico necesario para disolver el esmalte. La presencia de un sustrato (azúcar), que favorezca la colonización de estas bacterias y que sea metabolizado para la producción de ácidos orgánicos y, superficies dentarias susceptibles a esta disolución ácida. Sin embargo para que progresen las lesiones, debe actuar el factor tiempo sobre las variables de la tríada. 3,8 Se reconocen en la placa bacteriana cariogénica: especies de Streptococos mutans y sobrinus, otras bacterias asociadas a caries dental son Lactobacillus El embarazo es un estado fisiológico modificado que como otros (pubertad, menopausia y anticoncepción oral), no implican una situación patológica, sin embargo bajo dicha condición, el organismo reacciona temporalmente de manera distinta ante situaciones como son su propia biología. El organismo materno sufre una serie de ajustes hormonales, cardiovasculares, respiratorios, urinarios, gastroenterológicos y estomatológicos, todas ellas alteraciones adaptativas temporales, para dar cabida al feto en desarrollo. 1 El embarazo comienza cuando el espermatozoide de un hombre fecunda el óvulo de una mujer y éste óvulo se implanta en la pared del útero. Durante este período, hasta el parto, suceden una serie de acontecimientos totalmente nuevos llamados gestación o embarazo los cuales pueden llevar consigo la perturbación de la salud bucal de la futura mamá. 2 El embarazo constituye una etapa de importantes cambios en la mujer, no sólo por las repercusiones que supone el nacimiento de un hijo sino por todas las consecuencias que va a experimentar tanto a nivel general como bucal. Las alteraciones a nivel oral que puede presentar la mujer durante la gestación son variadas. Una serie de cambios, extrínsecos e intrínsecos, relacionados entre sí pueden hacerla vulnerable a padecer caries dental y enfermedad periodontal. Los cambios: en la producción salival, hormonales, dietéticos, microbiológicos y alteraciones en la respuesta inmunológica, constituyen factores que aumentan el riesgo a desarrollar las patologías ya señaladas durante este periodo. 2,10 Existe la creencia errada de que el embarazo le cuesta un diente o más a la embarazada. Se puede afirmar que durante el estado de gestación se producen cambios en los tejidos orales y cambios de conducta que pueden iniciar enfermedades bucodentales o agravar las ya establecidas, todo lo cual no valida la creencia antes señalada. 2,3 Durante el período de gestación, las alteraciones hormonales más significativas son el aumento en los niveles de estrógenos y progesterona aumentando gradualmente hasta los ocho meses de gestación. El incremento de estas hormonas constituye una condición sistémica particular que modifica las condiciones 87 acidófilo encontradas en caries dentinaria. La transmisión de S. mutans ocurre principalmente de madre a hijo. Las pacientes gestantes son un grupo prioritario, un estudio realizado en Venezuela concluyó, que las embarazadas presentaron un alto número de dientes cariados. 3,9 La lesión cariosa durante el embarazo es exactamente igual a la observada en otro tipo de pacientes. Es evidencia que en época de gestación y post parto se presenta un aumento en la cantidad de caries. La etiología del aumento de la incidencia de la caries se debe a: • Los cambios del régimen dietético. • Una tendencia a la disminución de hábitos de higiene bucal. • La erosión producida a consecuencia de los ácidos producidos por los vómitos presentes durante el embarazo. • La creencia del supuesto perjuicio que acarrea acudir a la consulta odontológica durante el embarazo. 9 Un estudio epidemiológico realizado en una población de 89 gestantes en Venezuela, mostró un índice CPOD promedio de 11. Las embarazadas con edades entre los 35-43 años promediaron 14 dientes con caries, seguidas por el grupo de 24-34 años cuyo promedio fue de 12 dientes con caries, y el grupo que presento el promedio mas bajo de 7 dientes con caries fueron las gestantes de 13-23 años. El índice CPOD es proporcional a la edad. 9 Por otro lado, en Chile se realizó un estudio en él, se reveló que la caries dental tuvo una prevalencia del 100% con un índice CPOD de 15.57 presentando las gestantes en promedio 11.84 piezas dentarias con caries y 2.24 de las piezas dentarias obturadas y 1.45 fueron piezas perdidas por caries. 3 En México se realizó un estudio similar examinando 103 pacientes, con una edad promedio de 26.7 años, en esta población la incidencia de caries dental fue de 99%, el índice CPOD fue de 13.8 correspondiendo 7.1 cariados, 2.4 perdidos y 4.3 obturados.5 Se realizó un estudio para conocer el perfil de las pacientes embarazadas y dio como resultado la falta de interés de la embarazada durante el periodo de gestación y cuando acuden es por odontalgia. 10 La población tiene, desde sus creencias y mitos, respuestas a los cambios orales que se generen durante el embarazo existe una asociación errónea entre gestación e incremento de caries. Por otro lado, muchas mujeres creen que el calcio es tomado de sus dientes durante la gestación y esta es la razón de aparición de caries. El esmalte dentario está compuesto por cristales de hidroxiapatita que no responden a los cambios bioquímicos del embarazo, o al cambio en el metabolismo de calcio. La caries dental es el resultado de repetidos ataques de ácidos sobre el esmalte dentario y no de repetidos embarazos. Las cantidades totales de calcio y fósforo que necesita el feto durante el embarazo solo representa 1/50 de la cantidad presente en los huesos maternos. 2,11 Durante el proceso gestacional ocurren una serie de fenómenos fisiológicos que favorecen el desarrollo de éstas patologías en la mujer. Por esto, es importante la prevención de la transmisión de la flora microbiana desde la madre al hijo. Afortunadamente, los efectos en la salud bucal durante el embarazo puede ser evitados con la entrega de información y habilidades acerca de la salud bucal y con ello, el mantenimiento de una correcta higiene oral. 3 Concluyendo que no existe relación alguna entre el embarazo y la incidencia o prevalencia de caries, por lo que no debe ser considerada como de alto o mediano riesgo. 5 En relación a la dieta, factores importantes a considerar son: su poder cariogénico; su composición, consistencia, frecuencia y momentos de ingesta, trascendentales en la regulación de la placa bacteriana. Aquellos alimentos con un alto contenido de carbohidratos de bajo peso molecular (sacarosa, glucosa y lactosa) son metabolizados con mayor rapidez por las bacterias cariogénicas mediante la glucólisis, cuyo producto de degradación son ácidos, los que descienden el pH en la En cuanto a la consistencia de alimentos cariogénicos, se considera más perjudicial cuanto más pegadizo y adherente sea a la superficie dentaria, debido a que por su bajo clearence permanece por mayor tiempo en boca; en cambio, los de alto clearence, como líquidos, lo hacen en un tiempo menor. 1,3 Si se ingieren azúcares con frecuencia, el pH se mantiene ácido, por debajo de los valores críticos (5.2 a 5.5). Cabe señalar que el flujo salival aumenta considerablemente durante las comidas. Si bien, la saliva presenta una notable actividad buffer, el pH se normaliza más rápidamente cuanto mayor es la cantidad de saliva. 3,4,7 El riesgo de caries es mayor si el azúcar es consumido entre comidas, que si lo es durante las mismas. 7 La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda el índice CPOD ANEXO4 (cariados, perdidos, obturados) para efectuar estudios epidemiológicos sobre experiencia de caries dental. 5 El estudio realizado en Madrid concluyó que durante el embarazo, las mujeres presentaron una incidencia de caries tres veces superior a las mujeres no embarazadas. Este aumento en la incidencia de caries se asoció a los vómitos del embarazo.4 88 JUSTIFICACIÓN de riesgo cariogénico (ANEXO 2). Se les pidió pasar al consultorio de estomatología para llevar a cabo la exploración de la cavidad bucal, la cual se realizó en el sillón dental empleando un explorador, espejo plano del no. 5, pinza de curación, guantes de látex y cubreboca. (ANEXO 5) Los datos de la exploración bucal se registraron en un odontograma (ANEXO 6) y los resultados recabados se vaciaron en una base de datos para llevar a cabo su análisis estadístico. Aunque se sabe que las mujeres presentan mayores índices CPOD, son múltiples los factores que condicionan el problema, observándose que en las embarazadas es aún mayor la afectación a la salud bucal, esto debido a los cambios hormonales, ocasionando una mayor frecuencia de dientes cariados y perdidos, lo que deriva en repercusión a la salud en general y en mayores costos económicos. En la UMF 19 hasta el momento no se han realizado estudios que aborden el problema, por lo que es conveniente la realización de una investigación al respecto, para conocer si efectivamente existe un mayor índice CPOD en embarazadas comparándolas con las no embarazadas. RESULTADOS En nuestro estudio se incluyeron 158 pacientes, 79 embarazadas y 79 no embarazadas, con las mismas edades. (Gráfica 1.) OBJETIVO GRAL Grafica 1. Embarazadas y no embarazadas por grupos de edad Comparar el Índice CPOD (ANEXO 4) en embarazadas y no embarazadas adscritas a la UMF No. 19 en el periodo Enero- Mayo 2007 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ¿Cuál es el Índice CPOD en embarazadas en comparación con las no embarazadas adscritas a la UMF No. 19? HIPOTESIS FUENTE: Encuesta UMF No. 19 enero – junio 2007. El Índice CPOD en embarazadas es mayor que en las no embarazadas adscritas a la UMF No. 19 Con respecto a las características sociodemográficas, prevalecieron la escolaridad secundaria, como ocupación las labores del hogar, las casadas, y no se encontró evidencia de pobreza familiar (Cuadro I) MATERIAL Y MÉTODOS DISEÑO: Encuesta prospectiva comparativa TIEMPO: Octubre de 2006 a Julio 2007 LUGAR: UMF Nº. 19 POBLACIÓN: Mujeres adscritas a la UMF Nº. 19 MUESTRA: Mujeres adscritas a la UMF Nº. 19 que asistan a consulta en el periodo Enero –Junio de 2007 n= 158 Cuadro I. Caracterìsticas sociodemograficas de embarazadas y no embarazadas PROGRAMA DE TRABAJO En el periodo comprendido enero a junio de 2007, a las pacientes, embarazadas y no embarazadas, presentes en sala de espera, y las remitidas por los médicos familiares, se les invitó a formar parte del trabajo de investigación, con su consentimiento se realizó una entrevista (ANEXO 1) para determinar las características sociodemográficas, hábitos higiénico bucales, e índice Característica Embarazadas No embarazadas Escolaridad: Secundaria 33 % 37 % Ocupación: Labores del hogar 57 % 70 % Estado. Civil: Casada 56 % 51 % Índice de pobreza familiar: Sin evidencia 81 % 73 % FUENTE: Encuesta UMF No. 19 enero – junio 2007. 89 n= 158 En cuanto a las características clínicas detectadas se observó en las embarazadas una mayor frecuencia de cepillado y de molestias al mismo, una baja frecuencia de uso de hilo dental tanto en embarazadas como en no embarazadas, baja asistencia a consulta dental, en promedio acudieron solo una vez al año a consulta, con un índice de riesgo cariogénico moderado en su alimentación en los dos grupos . (Cuadro II). se encontraron diferencias solo en dos rubros entre las embarazadas y las no embarazadas. (Cuadro III) Cuadro III. embarazadas Índice cpod embarazadas y no Cuadro II. Características clinicas de embarazadas y no embarazadas FUENTE: Encuesta UMF No. 19 enero – junio 2007. n= 158 CONCLUSIONES En nuestro estudio el índice CPOD mostró diferencias en el número de dientes cariados y en el número de dientes sanos, dado que las embarazadas presentaron un mayor promedio de dientes cariados y un menor número de dientes sanos a pesar de que hubo una mayor frecuencia de cepillado dental. No se encontraron diferencias en factores de interés que repercuten en el índice CPOD tales como índice cariogénico o asistencia al Servicio de Estomatología. Como en estudios previos prevalece la escasa asistencia a consultas odontológicas por lo que será de interés para estudios subsiguientes promover esfuerzos con el fin de mejorar en estos rubros. FUENTE: Encuesta UMF No. 19 enero – junio 2007. n= 158 BIBLIOGRAFIA Al evaluar el índice CPOD las embarazadas tuvieron un índice mayor de dientes cariados y un índice menor de dientes sanos, con respecto a las no embarazadas. 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Índice CPOD embarazadas y no embarazadas FUENTE: Encuesta UMF No. 19 enero – junio 2007. n= 158 Al analizar las diferencias entre los grupos mediante prueba de T de Student para muestras independientes 90 ANEXOS 5. Ruíz L. G, Gómez G. R, Rodríguez G. R. Relación entre la prevalencia de caries dental y embarazo. Asociación Dental Mexicana. 2002; LIX (1): 5-9 http://www.medigraphic.com/pdfs/adm/od-2002/od021b. pdf 6. Vinicio O. S, Siciliano M. M, Valdivia R. S. Indicadores de Salud Bucal en alumnos de secundaria de un área metropolitana de la ciudad de México. Revista Mexicana de Pediatría. 2003; VII (5): 237-42. http://www.medigraphic.com/espanol/e-htms/e-pediat/esp2003/e-sp03-5/em-sp035c.htm 7. Rodríguez V. M. Nivel de Conocimiento sobre prevención en Salud Bucal en Gestantes del Hospital Nacional Daniel A. Carrión. Tesis. 2002. http://sisbib.unmsm.edu.pe/BibVirtual/tesis/Salud/ Rodriguez_V_M/indice.htm 8. Sánchez P. L. 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Manual de prácticas extramuros de la asignatura de Odontología Familiar. ANEXO 1 Embarazada No embarazada FICHA CLÍNICA ODONTOLÓGICA FOLIO: ___________ Fecha Examen: Edad:____________ Nombre: ___________________ _ AFILIACIÓN:________________ FUR: __________________ Escolaridad: 1. Nula ( ) 2. Primaria ( ) 3. Secundaria ( ) 4. Preparatoria ( ) 5. Técnica ( ) 6. Profesional ( ) Otro:______ Ocupación: 1. Ama de Casa ( ) 2. Estudiante ( ) 3. Empleada ( ) 4. Profesión ( ) Estado Civil 1. Soltera ( ) 2. Casada ( ) 3. Divorciada ( ) 4. Unión libre ( ) 5. Otro: _______________ Frecuencia cepillado: 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( ) Otro:________ Molestias al cepillado 1. Si ( ) ¿Cuáles?_____________ 2. No ( ) Le han enseñado alguna vez a cepillarse los dientes 1. Si ( ) ¿Dónde? _____________ 2. No ( ) ¿Utilizas hilo dental? 1. Si ( ) Frecuencia ______________ 2. No ( ) ¿Está en tratamiento odontológico? 1. Si ( ) 2. No ( ) ¿Cuántas veces visitaste al dentista en el último año? ______________________ 91 ANEXO 2 RIESGO CARIOGENICO (a) Consumo (b) Frecuencia Valores Asignados Valor Asignado Grado de Cariogenicidad Bebidas azucaradas Jugos de sobre, jugos de fruta, té, leche con 2 o mas cucharadas de azúcar. 1 Masas no azucaradas Pan blanco 2 Caramelos Chiclets, caramelos, helados, mermelada, chocolates 3 Masas azucaradas Pasteles dulces, tortas, galletas, donas. 4 Azúcar Jugo en polvo sin diluir, miel, frutas secas, frutas en almíbar, turrón, caramelos masticables, cereales azucarados. 5 (d) Consumo por frecuencia (c) Ocasión Valores Asignados 0 1 2 3 1 5 Nunca 2 o más veces en la semana 1 vez al día 2o más veces día Con las comidas Entre comidas (d) (f) Valor potencial cariogénico:____ Consumo por ocasión (e) (e) Para obtener puntaje de riesgo: 1. Se multiplica el Valor dado al consumo en la columna vertical izquierda (a) por el Valor dado a la frecuencia (b) en la columna horizontal. 2. Se multiplica el Valor dado al consumo (a) por Ocasión (b). 3. Se suma los valores parciales de la columna Consumo por frecuencia para obtener el Puntaje total (d). 4. Se suma los valores parciales de la columna Consumo por ocasión para obtener el Puntaje total (e). 5. Se suma (d) + (e) para obtener el Valor del potencial cariogénico. Escala: Puntaje Máximo: 144 10-33: 34-79: 80-144: Puntaje Mínimo: 10 Bajo Riesgo Cariogénico Moderado Riesgo Cariogénico Alto Riesgo Cariogénico 92 ANEXO 3 computado separadamente, por edad y sexo, ya que estos dos factores son importantes en la interpretación correcta de los datos. Por lo que respecta al sexo, sabemos que las niñas, promedio, presentan una erupción más precoz que los niños, consecuentemente se espera un CPOD promedio más alto en las niñas, que en los niños, en el mismo grupo de edad. Así para el factor edad, también el niño con mayor edad tendrá un mayor CPOD promedio, ya que tienen un número mayor de dientes permanentes sujetos al ataque de caries y también, posee dientes permanentes expuestos por un tiempo más largo al ataque de la misma. Además del CPOD promedio, es posible calcular otros datos estadísticos a través de las encuestas CPOD. Cuando una encuesta es realizada en una población de niños que presentan dentición mixta, se utiliza el índice “ c e o” para descubrir la prevalencia de caries en los dientes temporales. El símbolo c, significa el número de dientes temporales presentes con lesiones cariosas y no restauradas. El símbolo e significa el número de dientes deciduos con extracción indicada. El símbolo o, representa el número de dientes temporales obturados. El deberá ser computado separadamente, para cada edad y sexo, en grupos de niños menores de 12 años de edad. Índice Simplificado de Pobreza familiar (ISPF) Indicadores Categorías Puntuación Ingreso económico familiar < 1 salarios mínimos 1-2 salarios mínimos 3-4 salarios mínimos 5 o 6 salarios mínimos 7 o más salarios mínimos 4 3 2 1 Número hijos dependientes 3 ó más hijos 2 hijos 1 hijo ningún hijo 2.5 2 1 0 Escolaridad materna Sin instrucción Primaria incompleta Primaria completa Post-primaria 2.5 2 1 0 Hacinamiento (número de personas por dormitorio) 3 o más personas 1 a 2 personas 1 0 0 0- 3 SIN EVIDENCIA DE POBREZA FAMILIAR 4- 6 POBREZA FAMILIAR BAJA 7- 10 POBREZA FAMILIAR ALTA. SISTEMA DE CLASIFICACIÓN DEL CPOD TOTAL DE PUNTOS: ______ El concepto original del índice CPOD fue elaborado hace 25 años, y la primera publicación sobre el índice fue un artículo en el “The Public Health”, de diciembre de 1937, titulado “Dental Caries in American Indian Children”, siendo autor Henry Klein y Caroll E. Palmer. Después de este trabajo, varios investigadores han utilizado esos conceptos, y en determinadas ocasiones modificaron los criterios, métodos o el sistema original de clasificación. La experimentación y las modificaciones sucesivas han hecho difícil la comparabilidad de datos obtenidos por diferentes investigadores. Las variadas modificaciones usadas hoy en día, acarrean una serie de problemas en el adiestramiento de Cirujanos Dentistas en la práctica de encuestas. Los criterios de exámenes, los sistemas de tabulación y código presentados en este manual pueden variar, en uno o en más aspectos de otros usados actualmente. Las consideraciones siguientes deben merecer la atención del lector. ANEXO 4 CPOD Índice de dientes cariados, perdidos, obturados. El CPOD describe numéricamente los resultados del ataque de caries en los dientes permanentes de un grupo de población. El símbolo C se refiere al número de dientes permanentes que presentan lesiones de caries no restauradas. El símbolo P se refiere a los dientes permanentes perdidos por lesiones cariosas, además se clasifican como perdidos a los dientes cuya extracción está indicada por lesiones cariosas. Así los dientes permanentes perdidos P, estará compuesto por los dientes extraídos E y dientes con extracción indicada. El símbolo D, es usado para indicar que la unidad establecida es el Diente o sea, el número de dientes permanentes afectados, en vez de superficies afectadas o número de lesiones de caries existentes en la boca. El CPOD es generalmente expresado como el número promedio de dientes CPO por persona, en la población en estudio. El promedio es generalmente 1. El examen es realizado para determinar la clasificación de 28 dientes. Los terceros molares son excluidos del sistema por dos razones: a) en encuestas en niños menores de 15 años de 93 edad (grupo generalmente estudiado), el registro de cuatro decisiones adicionales, por el examinador, ofrece un número de informaciones. b) En encuestas en adultos jóvenes, de 15 a 35 años, las variaciones en el patrón de erupción y las frecuentes extracciones debido a dientes incluidos y otras razones no relacionadas con ataque de caries, dificultan la clasificación adecuada de la falta de estos dientes. Aún el interrogatorio cuidadoso al paciente no ofrece una base segura para que el dentista alcance una conclusión confiable. 2. Este sistema de clasificación incluye la categoría de “extracción indicada”, como uno de los componentes del símbolo perdidos “P”, en dientes permanentes cuya pulpa dental se haya comprometida. Cierto es que muchos de estos dientes podrían ser salvados y que las opiniones profesionales pueden variar en decidir cuando un diente debe ser extraído, sin embargo, desde el punto de vista de la Salud Pública, debemos recordar que la mayoría de los servicios odontológicos públicos no cuentan con recursos para tratamientos radiculares, siendo así, que los dientes con problemas pulpares son sumariamente extraídos. La inclusión de la categoría “extracción indicada” no altera el valor numérico del CPOD más la categoría “C” puede estar disminuida cuando es comparada con datos obtenidos en encuestas que no incluyeron esa categoría. Ya que la decisión adicional de clasificar un diente que esta atacado de caries como “cariado” C o “extracción indicada “ (EI), no aumenta de forma significativa el tiempo total de examen y permite además utilizar datos de encuestas epidemiológicas para evaluar aproximadamente las necesidades de tratamiento (Planteamiento de Programas de Atención), la inclusión de la categoría “EI” está justificada. 3. El criterio “extracción indicada” es utilizado para dientes temporales por las mismas razones arriba citadas. 4. El código y el sistema de clasificación no incluyen un método para obtener datos estadísticos sobre otras afecciones bucales que pueden ser observadas durante la encuesta CPOD. Si esos datos son necesarios, una clasificación separada y un sistema de registro diferentes deben ser utilizados. 5. El código usado en esta clasificación está basado en valores numéricos seleccionados, porque ellos son fáciles de aprender o se parecen a palabras usadas en criterios, siendo fáciles de tabular manual y mecánicamente. Los números son también diferentes en sonido, cuando son dictados verbalmente y, consiguientemente más fáciles de distinguir para el anotador. Sin embargo pueden utilizarse otros tipos de código. CÓDIGOS Y CRITERIOS PARA EXÁMENES Y REGLAS PARA EL REGISTRO CÓDIGOS CRITERIOS 0 Espacio vacío 1 Diente permanente cariado 2 Diente permanente obturado 3 Diente permanente extraído 4 Diente permanente con extracción Indicada 5 Diente permanente sano 6 Diente temporal cariado 7 Diente temporal obturado 8 Diente temporal con extracción indicada 9 Diente temporal sano. CRITERIO Y REGLAS PARA EL REGISTRO. 0 Espacio vacío: registrar el espacio dental como “0” (cero) cuando la ausencia del diente es debida a: • Ausencia del diente deciduo o temporal por cualquier razón. • Diente permanente no erupcionado. • Diente temporal no erupcionado. • Diente permanente o temporal incluido o ausente congénitamente. • Diente temporal extraído • Diente permanente extraído por otras causas, que no sea la caries dental. 1. Diente permanente cariado: utilizar el código “1” cuando existan las siguientes evidencias de lesiones cariosas: • Evidencia clínica de esmalte socavado, debe existir una cavidad definida con coloración u opacidad a lo largo de los márgenes, en las cuales el explorador pueda ser introducido. • Las fisuras en las cuales el extremo del explorador se prende, serán clasificadas como cariadas solamente si una de las condiciones, citadas abajo fuesen llenadas: a)Presencia evidente de tejido blando en la base de la fisura. b)Opacidad a lo largo de los márgenes o una mancha indicada , presencia de lesión cariosa subyacente. c) En casos de superficie proximales si el explorador no se disloca cuando se hacen movimientos en la dirección cervico-oclusal. 2. Diente permanente obturado atribuir el código 2 cuando el diente esta obturado con material permanente sin llevar en cuenta el tipo de material restaurador. • Un diente que está al mismo tiempo obturado y cariado 94 es clasificado como cariado (código 1). ANEXO 5 PROCEDIMIENTOS EN EL EXAMEN CPOD 3.Diente permanente extraído de acuerdo con la edad del paciente debería estar presente y fue extraído debido a lesión cariosa. En caso de duda preguntar al paciente si la ausencia del diente es debida a extracción y examínese la forma del reborde alveolar y la presencia o ausencia del diente homologo. Este criterio no es utilizado para dientes temporales. 4.Diente permanente con extracción indicada atribuir el código 4 cuando el diente presente solamente raíces o corona parcialmente destruida, deberá existir siempre la evidencia de que la pulpa fue alcanzada. 5.Diente permanente sano dar el código 5 al diente si no presenta lesión cariosa, restauración, coronas de oro o porcelana. Otros defectos como hipoplasia, fluorosis, defectos del esmalte, puede o no estar presentes. Los dientes permanentes que se presentan restaurados, por causas diferentes a la caries dental, por ejemplo: indicaciones protesicas o fracturas, etc., serán considerados sanos recibiendo el código 5 y anotándose en el espacio destinado a observaciones. En el proceso de examen, el examinador inspecciona visualmente y con el auxilio del explorador, las caras oclusal, vestibular, distal, lingual y mesial de todos los dientes presentes (excepto 3° molares). El examen es realizado con el auxilio de un espejo plano y explorador número 5 con extremidad bien afilada. La posición del paciente debe ser tal que el examinador tenga una visibilidad óptima de los cuadrantes a ser examinados. El examen deberá ser conducido de la siguiente manera: 1.Iniciar el examen en el espacio correspondiente, al segundo molar superior derecho y proseguir hasta el incisivo central superior derecho. 2.Continuar el examen por el incisivo central superior, siguiendo hasta el espacio correspondiente al segundo molar superior izquierdo. 3.Reiniciar el examen por el espacio correspondiente al segundo molar inferior izquierdo, siguiendo hasta el incisivo central inferior izquierdo. 4.Finalmente examinar el último cuadrante, comenzando por el incisivo central inferior derecho y seguir hasta el espacio correspondiente al segundo molar inferior derecho. Los códigos siguientes son para dientes deciduos o temporales, los criterios de clasificación son los mismos de los dientes permanentes. Registrarse de la manera siguiente: CÓDIGO CRITERIO 6 Diente temporal cariado 7 Diente temporal deciduo 8 Diente temporal con extracción Indicada. 9 Diente temporal sano. PROCEDIMIENTO PARA EL EXAMINADOR • Use siempre el explorador, evítelo solo en caries avanzadas (posible exposición pulpar), a fin de no causar dolor o incomodidad del paciente. • Indague con el paciente la razón de la extracción de sus dientes, más si la respuesta no es concluyente, siga su propio juicio clínico. • Dicte el código claramente, para evitar errores de anotación, mantenga el anotador en posición tal que le permita hablar directamente con él. • Solicite al anotador que interrumpa el examen en caso de aclaración o duda sobre la anotación. La perfecta anotación de la fecha de examen es responsabilidad del examinador, por lo tanto mantenga al anotador bajo frecuente supervisión para tener certeza de que está desempeñando su papel correctamente. • Aproveche la oportunidad de realizar educación para la salud, cuando el paciente se muestre interesado en hacer preguntas sobre la encuesta. • Mantenga un ritmo constante. Reglas especiales: • Un diente es considerado como erupcionado cuando cualquier porción de su superficie estuviese expuesta en la cavidad bucal y pudiese ser tocada con el explorador. • Un diente es considerado presente, aún cuando la corona esta totalmente destruida, quedando solo las raíces. • Los dientes supernumerarios no son clasificados. • Si un diente temporal está retenido y su sucesor permanente está presente, se clasifica solamente el permanente. En duda entre: • Cariado y sano, clasificar como sano. • Cariado y extracción indicada, clasificar como cariado. • 1° y 2° premolar, clasificar como 1° premolar. 95 ANEXO 6 HOJA EPIDEMIOLOGICA BUCAL (Odontograma) ÍNDICE CPOD 17 16 47 46 Perm. 55 15 54 14 53 13 52 12 51 11 61 21 62 22 63 23 64 24 64 25 85 45 84 44 83 43 82 42 81 41 71 31 72 32 73 33 74 34 75 35 26 27 36 37 P T P T 96 Capítulo III Salud Pública Análisis de Cluster de Leucemia Aguda en niños de la ciudad de México en el 2006 Sánchez-Acosta Plácido1 , Ortega-Álvarez Manuel Carlos2, Mejía-Aranguré Juan Manuel2 1 Medico Interno de Pregrado del Hospital Regional de Veracruz y egresado de la Universidad Veracruzana, Facultad de Medicina Miguel Alemán Valdés, Veracruz, Ver.. 2 Miembros del Sistema Nacional de Investigadores. Unidad de Investigación Médica en Epidemiología Clínica, Hospital de Pediatría, Centro Médico Nacional Siglo XXI , IMSS MARCO TEÓRICO de alguna forma lo anteriormente mencionado para los otros métodos(1). Por otra parte existen técnicas un poco más generales que pueden aplicarse para la detección de aglomeraciones inusitadas de enfermos en espacio, tiempo y en espacio-tiempo: el test de Grimson, (Grimson, 1991) constituye el mejor ejemplo de estos casos y es el que se utilizará más adelante en el presente trabajo. Este método parte de dividir la región de estudio en regiones más pequeñas llamadas celdas(1). Se dice que una celda está “marcada” si contiene una cantidad de enfermos superior a un cierto umbral definido por un especialista, (matemáticamente este umbral pudiera determinarse por el valor esperado de una distribución de Poisson; Grimson calcula entonces la cantidad “A” de celdas marcadas que son adyacentes. La hipótesis fundamental del test enuncia que bajo el supuesto de la no existencia de clusters, “A” debe ser pequeña, pues las celdas marcadas deben distribuirse con cierta uniformidad por toda la región. Existen fórmulas específicas para el cálculo del valor esperado de A (E(A)) y de su varianza (V(A)). La hipótesis alternativa, por su parte, enuncia que “A” tiene un valor demasiado grande sugiriendo la presencia de al menos un cluster(1). En ocasiones existen dudas sobre cuando aplicar una u otra técnica de detección de clusters, muchas veces la respuesta viene dada por el tipo de datos disponible y por los objetivos de la investigación(1). Si se está trabajando con un área geográfica lo más natural es que se aplique alguna de las técnicas de detección de aglomeraciones espaciales. Si lo que se tiene son fechas de ocurrencia de cualquier evento entonces deben aplicarse métodos de detección de clusters temporales. Por último si se tienen ambos datos, debe comenzarse aplicando tests espacio-temporales, pero en estos casos resulta siempre interesante estudiar además la ocurrencia de conglomerados en espacio y en tiempo por separado; en ocasiones ocurre que, a pesar de contar con ambos tipos de datos, los casos se distribuyen uniformemente en el tiempo, (o en el espacio) y si esto ocurre resulta natural trabajar solo con datos geográficos (temporales)(1). Antecedentes En los últimos años ha habido un notable desarrollo en el surgimiento de métodos estadísticos específicos para la detección de aglomeraciones que han encontrado un campo de aplicación exitoso en la Medicina(1). La importancia de la detección de conglomerados surge como estrategia para detectar en poco tiempo, pequeños focos epidémicos y evitar así su propagación, así como para identificar la etiología de las enfermedades para su prevención. Además la detección de conglomerados constituye una herramienta importante para la vigilancia del cáncer, sirve para identificar áreas de alto riesgo y generar hipótesis acerca de la etiología del mismo(2). Un “cluster” se define como la aparición de un número de casos de una enfermedad en cantidad superior a lo que cabría esperar para un determinado grupo de población, un área geográfica y un período de tiempo determinados(3, 4). Se recomienda la denominación “conglomerado” como traducción más utilizada del término, en castellano. Para precisar aun mas la definición es necesario dividirla en tres: se denomina conglomerado espacial o geográfico a un exceso de casos en un área geográfica, que puede ir desde un pequeño poblado hasta todo un continente; un conglomerado temporal es un exceso de enfermos diagnosticados muy cercanos en tiempo y un conglomerado espacio-temporal es un exceso de casos en ambos escenarios: espacio y tiempo(5). Aunque la interacción espacio temporal por su parte no es la simple presencia de conglomerados de enfermos. Para que exista un cluster en espacio-tiempo tiene que ocurrir que los casos cercanos geográficamente coincidan con los casos cercanos en tiempo. Entre los métodos más conocidos para detectar interacciones se pueden mencionar el de Knox, (Knox, 1964 ), el de Mantel, (Mantel, 1967) y el del k vecino más cercano, (Jacquez, 1996) entre otros. Ellos utilizan a la vez coordenadas espaciales y temporales combinando 99 Por otra parte, ninguno de los métodos de detección de aglomeraciones es infalible, y para evitar grandes equivocaciones se recomienda aplicarlos varias veces modificando el valor de sus parámetros y comparar siempre los resultados obtenidos(1). Las técnicas de detección de clusters por sí solas se limitan a detectar el conglomerado en cuestión, no lo caracterizan. Es por ello que un profesional de la Salud Pública necesitaría, además de detectar a tiempo un posible foco epidémico, conocer cuál o cuáles causas propiciaron en mayor medida la afección(1). A pesar de los incalculables avances médicos de nuestro tiempo, existen numerosas enfermedades con causas desconocidas, fundamentalmente las no transmisibles, como se había visto con anterioridad; así por ejemplo, la lista de alimentos cancerígenos aumenta cada día más sin que se conozca con certeza cuáles son las verdaderas causas que provocan el cáncer(1). Es por ello que resulta trascendental conocer en una determinada población, cual es la época del año, en que una enfermedad es mas frecuente o por ejemplo en que localidad o área geográfica se esta viendo afectada en gran medida por determinada enfermedad, ya que seria un buen logro partir de ahí para determinar a que se atribuye la causa de la enfermedad y si se esta viendo aumentada la incidencia, a que se debe este fenómeno. Vamos a partir del concepto de que las enfermedades neoplásicas en la población pediátrica son muy raras, pero paradójicamente, se encuentran entre las primeras causas de muerte en la población pediátrica en el mundo, basta considerar que entre la población estadounidense de 1 a 19 años de edad, es la segunda causa de muerte, sólo superada por los accidentes(6), y esto no dista mucho de lo que ocurre en México en cuanto a estas mismas patologías. En una nación con pocos recursos para la atención médica y que no puede garantizar una sobrevida elevada en enfermedades como el cáncer (como es el caso de nuestro país), se considera una prioridad instrumentar medidas preventivas específicas que puedan disminuir los casos de esta enfermedad(7). Es aquí, donde resulta notable la aplicación de los métodos de detección de clusters, ya que se evita invertir demasiados recursos económicos a la atención de una patología, conociendo las medidas profilácticas, que surgen a partir de la clara visualización de la etiología. Diferentes trabajos en la literatura, que buscan la identificación de conglomerados, se han enfocado en leucemia infantil debido a la alta incidencia entre niños comparado con otras enfermedades cancerigenas y a la gran preocupación pública que ésta genera(8,9). Las leucemias agudas son los cánceres más frecuentes en menores de 15 años(9,10); lo cual llama la atención de las personas y las mantiene ante la expectativa de que alguien perteneciente su familia pueda padecerla, y seria aun mayor el temor si las personas del país supieran que tan solo en la ciudad de México representan alrededor de 40 % de todas las neoplasias, mientras que en otros países constituyen solo entre 30 y 34 %(9,10). Actualmente se reconoce que en diferentes partes del mundo la frecuencia de las leucemias agudas se ha incrementado(11,12). En lo que respecta a nuestro país, el cáncer en niños pasó del decimotercer lugar como causa de muerte en 1971, al segundo lugar entre la población de 1 a 14 años a partir del año 2000(13). Considerando a la capital del país, El Distrito Federal, uno de los estados mas densamente poblados del país, se ha visto aumentada la tasa de incidencia de la leucemia desde 1982(10), En forma particular la Leucemia Linfoblastica Aguda que en 1982 : reportó una tasa de incidencia de 7.75 por millón de niños menores de 15 años y para 1991 se alcanzó 22.19 por millón(14,15). Entre 1993 y 1994, en el Instituto Mexicano del Seguro Social se encontró una frecuencia de 34 por millón(16); y entre 1996 y 1998, de 60.3(17), siendo la tasa reportada para el periodo de 1996 al 2000 de 58.4 por 1, 000,000 de niños, una de las tasas más altas reportadas en el mundo(18). Debemos definir a las leucemias agudas como enfermedades monoclonales que se originan principalmente en la médula ósea, caracterizadas por crecimiento incontrolado de formas celulares inmaduras de los componentes sanguíneos llamados blastos(19). Dependiendo de la estirpe celular afectada, se puede hacer la distinción de leucemias agudas mieloblásticas, linfoblásticas o de estirpe indiferenciada(20). La causa de la mayoría de las leucemias agudas no se conoce, sólo pocas exposiciones se han establecido firmemente como factores de riesgo(21). Las neoplasias que ocurren en la infancia difieren de las formas principales de aparición en el adulto(22). En la infancia hay un mayor predominio de neoplasias no epiteliales (leucemias, linfomas y sarcomas) y en la etapa adulta hay un mayor predominio de las epiteliales (carcinomas)(23). Por ello, se infiere que las causas del cáncer en la infancia son diferentes a las de los adultos; además, es posible que los factores relacionados con el cáncer operen en etapas muy tempranas de la vida, incluso antes de la concepción(10). En los menores de un año los tumores más frecuentes son las leucemias, tumores del sistema nervioso central y los linfomas(24,25); En algunas naciones como 100 Nigeria la incidencia de los linfomas sobrepasan a las leucemias(26). Pero en la mayoría de los países incluidos Argentina, Cuba y México las neoplasias más frecuentes son las leucemias seguidas de los linfomas y los tumores del sistema nervioso central(9,27,28). Actualmente se entiende que las leucemias agudas en los niños son el resultado de la interacción de diferentes factores ambientales con la susceptibilidad genética a la enfermedad(29) Cabe mencionar que la susceptibilidad genética más importante para el desarrollo de leucemia aguda en niños es el síndrome de Down. Un riesgo relativo muy alto para desarrollar leucemias ha sido encontrado en forma repetida, 10 a 20 veces más que en la población general, si bien el riesgo se incrementa 500 veces en un tipo especial de leucemia aguda mieloblástica: LAMM7(30) podríamos considerar que donde hay mayor incidencia de Sx de Down coincide con la incidencia de Leucemia Aguda y esto puede resultar cierto. Sabemos que aproximadamente 60 % de las leucemias en niños con síndrome de Down son agudas linfoblásticas y el resto 40 %, agudas mieloblásticas(21). Existen mecanismos a través de los cuales los alelos HLA se asocian a la leucemia y convergen principalmente en que uno o más genes del MHC pueden controlar la carcinogénesis bajo la acción de algún factor químico, virus o radiación(31,32) En cuanto a la etiología de la leucemia aguda (especialmente la linfoblástica aguda), Kinlen y Greaves(33,34) proponen que una infección puede tener un papel importante en el desarrollo de la leucemia linfoblástica aguda. Greaves señala que la infección actúa como un promotor más que un iniciador de la mutación leucemiogénica. Se piensa que los niños que desarrollan leucemia pudieran tener un sistema inmunológico defectuoso para reconocer una infección viral(33,35). Y volviendo a los factores ambientales, es importante señalar que algunos factores requieren mayor investigación, como las exposiciones en el hogar. Vivir cerca de campos electromagnéticos y vivir cerca de plantas nucleares han sido las exposiciones en el hogar más estudiadas y controversiales(36), No obstante, existen otras que requieren mayor estudio. La exposición por la proximidad a una industria altamente tóxica o la cercanía a basureros(37), y la exposición a zonas de alto tránsito vehicular(38,39) se han asociado con un riesgo hasta de 4.7 (IC 95 % = 1.6 a 13.5) para desarrollar leucemia. En la mayoría de los estudios epidemiológicos realizados para investigar el cáncer en la población pediátrica se ha buscado la exposición ambiental separada de los factores genéticos. Sin embargo, un estudio de casos y controles realizado en Quebec identificó la evidencia de interacciones genéticas y ambientales en el riesgo de cáncer en niños debido a la exposición a insecticidas y alcohol(40). Existe una respuesta individual ante los diferentes agentes patógenos que depende incluso de la misma herencia genética, así los individuos responde de diferente manera ante una misma sustancia, infección, alergeno, etc., por lo tanto la variación del riesgo de exposiciones específicas asociadas con diferentes fenotipos sugiere que la predisposición genética puede jugar un papel sustancial en la respuesta individual a exposiciones tóxicas y el desarrollo de neoplasias infantiles(40). No debemos olvidar que al hablar del hecho de dilucidar, predisposición genética, implica contar con recursos materiales y económicos, conocimientos de ingeniería genética, aparatos especiales, incluso personal con experiencia en este ámbito, siendo algo que muy pocos países poseen. Es por ello que el gran problema de estudiar la susceptibilidad por su expresión genética es el alto costo de instalación de tecnología y de operación. Por este motivo, los estudios de interacciones más factibles son los que utilizan una población con susceptibilidad conocida, como aquella con síndrome de Down(29). Nuestra Hipótesis del presente trabajo es que si existe, un conglomerado temporal en la serie de casos, por fecha de diagnóstico y en sentido espacial en ciertas delegaciones del DF, la cual responde a la pregunta de investigación ¿Están ocurriendo todos los casos consecutivos de leucemia infantil, registrados en México DF, en un intervalo crítico de tiempo y cercanos espacialmente? Por lo anterior, planteamos como objetivo analizar la distribución temporal y espacial de la incidencia de leucemia entre niños de 0-14 años de edad en México Distrito Federal, de enero a diciembre del año 2006, utilizando métodos estadísticos que evalúen la existencia de conglomerados. METODOLOGÍA Tipo de estudio: Observacional, descriptivo, transversal prolectivo. Diseño: Registro de base poblacional. Universo de estudio: Población pediátrica del DF. Numeradores: casos incidentes de leucemia aguda (LA), diagnosticados de enero a diciembre del 2006 por delegación política, cuyo rango de edad 0-14 años. Denominadores: población de 0 a 14 años por delegación reportada por el INEGI en el II Conteo de Población y Vivienda 2005. 101 Participaron todos los hospitales del DF que atienden niños con LA: pertenecientes al IMSS: Hospital de pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI, Hospital General de México, Centro Médico Nacional La Raza y Hospital Regional Gabriel Mancera; pertenecientes a la SSa: Hospital Infantil de México “Federico Gómez”, Instituto Nacional de Pediatría y el Hospital Juárez de México; y del ISSSTE el Centro Médico Nacional “20 de noviembre”. Diagnóstico: Todos los pacientes con LA fueron diagnosticados por aspirado de médula ósea (Internacional Classification of Disease for Oncology, ICD-O2; 1990); Como dice el Dr Ignacio Mariscal el diagnóstico de la Leucemia se sospecha por la clínica. Se orienta con la citología hemática y se confirma con la biopsia de Médula Ósea(41). Las tasas fueron estandarizadas por edad, la cual es la estandarización más utilizada en epidemiología, es decir considerar la diferente distribución de la población por grupos de edad de las áreas cuyas razones se quieran comparar. Consiste en dividir el número total de casos observados en un área determinada, por el total de la población a riesgo en dicha área. Se utilizó el paquete estadístico Epidat, que contiene distintos métodos de detección de clusters, se realizó el análisis temporal grupal con los métodos Scan, Cusum y Poisson; y el método de análisis espacial fue Grimson. A continuación intentaremos explicarlos. SCAN es una prueba estadística para detectar agrupaciones temporales en una serie temporal de casos de un cierto evento o enfermedad. Es un método útil para captar picos de incidencia de una enfermedad. La hipótesis nula establece que los casos ocurren al azar en el tiempo, frente a la alternativa de que los casos se agrupan en ciertos periodos. Representa el número máximo de casos observados en una ventana móvil de longitud fija (duración esperada de una epidemia), que se mueve en forma continua a lo largo del tiempo. Si los casos se agrupan en el tiempo, entonces el número máximo de casos en la ventana temporal será grande(42). El método CUSUM detecta incrementos en la incidencia de una enfermedad. En la suma acumulada de valores desde el periodo inicial, si aun no se ha declarado ninguna alerta; la reporta, o en caso contrario, desde el periodo siguiente al de la última alerta reportada(42). Usando POISSON, basada en la distribución de Poisson nos permite detectar agregaciones de casos en el tiempo. La pregunta es: ¿hay evidencia de agregación de casos en algún mes?. Epidat con la información de casos esperados calcula, para cada mes, la probabilidad de observar esos casos. Si esa probabilidad resulta ser muy pequeña, se concluye que hay evidencia de una agregación temporal que no es producto del azar(42). GRIMSON detecta agregaciones espaciales dentro de una región subdividida en áreas más pequeñas cuando las áreas de mayor riesgo tienden a agruparse. Se necesita identificar cada una de las áreas( con letras del alfabeto), conocer los índices que identifican áreas adyacentes a ella, esto es que comparten fronteras(Figura 1 y Figura 2); saber las tasas de incidencia de cada área y plantear un punto de cohorte en las tasas de incidencia que define áreas de alto riesgo(42). Fig. 1 Delegaciones del DF Fig.2 Ubicación geográfica 102 RESULTADOS Fig. 4 Distribución de casos por mes y por trimestre Se diagnosticaron 113 casos en niños menores de 14 años residentes del DF, la relación hombre: mujer fue 56:57. La tasa estandarizada por edad de 56.4 casos de leucemia aguda por cada millón de niños. Al participar todos los hospitales del DF que atienden niños con LA cada uno atribuyo un número considerable de casos: pertenecientes al IMSS: Hospital de pediatría del Centro Médico Nacional Siglo XXI, sede del proyecto de investigación 22 casos, Hospital General de México, 1 caso, Centro Médico Nacional La Raza, 21 casos; y Hospital Regional Gabriel Mancera, 4 casos; pertenecientes a la SSa: Hospital Infantil de México “Federico Gómez” con 23 casos; el hospital en el cual fueron diagnosticados mayor numero de casos fue el Instituto Nacional de Pediatría con 32 casos y el Hospital Juárez de México 1 solo caso; y del ISSSTE el Centro Médico Nacional “20 de noviembre” con 9 casos (Figura 3). Las tasas de incidencia por delegaciones políticas reportaron tasas que van de 9.8 a 123.1 casos por millón de niños para las delegaciones Tláhuac y Venustiano Carranza respectivamente (Figura 6). Al buscar un conglomerado espacial mediante el método de Grimson analizando las tasas de incidencia de las 16 delegaciones así como su relación geográfica entre ellas, se encontraron 7 delegaciones próximas (Figura 7), con tasas elevadas; de las 5.9 que se esperarían, pero sin significancia estadística global de conglomerados para el DF. Fig. 3 Hospitales del DF que atienden niños con LEUCEMIA. HOSPITALES DEL DISTRITO FEDERAL INP 32 Fig. 5 Análisis Temporal de los casos por fecha de diagnóstico HIM SXXI 23 22 CMLR 21 20 DE NOV GABRIEL MANCERA HGM 9 HJM 4 1 1 El método de Scan con una ventana temporal de 3 meses muestra una mayor incidencia en los meses de enero, febrero y marzo con un total de 40 casos (Figura 4), que corresponde al 35.4% de los registrados, específicamente marzo contiene el mayor numero de casos, hasta 3 por día. Dicho resultado es demostrable también con el método de Cusum que detecta zona de alarma en marzo por superar el número de casos esperados mensuales. Aplicando el método de Poisson que compara los 9.4 casos esperados con los 19 casos reportados en marzo arroja un valor de p de 0.0024 proporcionando significancia estadística para este cluster (Figura 5). 103 Establecer la presencia de conglomerados, no es un fin en si mismo, es más bien un primer paso para generar hipótesis de investigación para identificar posibles factores ambientales, que posteriormente puedan ser evaluados (44). Con respecto a los clusters en el tiempo, el presente estudio identificó un conglomerado en el mes de marzo, si bien este tipo de estudios se realizan principalmente para enfermedades infecciosas, su búsqueda en padecimientos malignos, aporta elementos para dar sustento la hipótesis de la etiología infecciosa de la leucemia (45). El presente trabajo no identificó significancia a la presencia de clusters espaciales, ya que el método de Grimson no considera la superficie territorial de las unidades de análisis y en este caso las delegaciones políticas son muy heterogéneas al respecto, por lo que es recomendable continuar con el análisis de esta información usando métodos como el de Knox, para el estudio de las distribuciones en espacio y tiempo que precisamente fue probado con casos de leucemia y encontró que en los mismos existía una tendencia al agrupamiento demostrándose un exceso de pares de casos a menos de 1 km., de distancia y de 60 días en la presentación uno del otro (46). Fig. 6. Tasa de incidencia por delegación del DF Fig 7. Distribución de Tasa de incidencia por Delegación en DF BIBLIOGRAFIA 1. Casas-Cardoso G, Cardoso-Romero G, GuerraMorales V, Herrera-Jiménez F. Técnicas de detección de clusters aplicadas a la investigación psicológica. Revista Cubana de Psicología 2002:19 (1). 2. Wheeler DC. 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DISCUSIÓN Este es el primer trabajo que busca la identificación de clusters de leucemia aguda en México. Se confirmó que la incidencia de leucemia aguda infantil en la ciudad de México continúa siendo muy elevada (18), y es este tipo de situaciones donde se recomienda la utilización de los métodos para la búsqueda de clusters (43). 104 8. Craig S, Meng L, Randall LT, Smith AH. Probability Estimates for the Unique Childhood Leukemia Cluster in Fallon, Nevada, and Risks Near Other U.S. Military Aviation. Environmental Health Perspectives 2004:112. 9. Fajardo-Gutiérrez A, Mejía-Aranguré M, Gómez-Delgado A, Mendoza-Sánchez H, Garduño-Espinosa J, MartínezGarcía C. Epidemiología de las neoplasias malignas en niños residentes del Distrito Federal (1982-1991). Bol Med Hosp. Infant Mex 1995;52:507-516. 10. Fajardo-Gutiérrez A, Mejía-Aranguré JM, Hernández-Cruz L, Mendoza-Sánchez HF, GarduñoEspinosa J, Martínez-García MC. Epidemiología descriptiva de las neoplasias malignas en niños. 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Análisis de las características clínicas, espaciales y temporales del rabdomiosarcoma, en niños del Distrito Federal. Hospital de Pediatría Centro Médico Nacional IMSS DF, 1981. 106 Prevalencia de obesidad abdominal en adultos participantes al curso “Escuela sana” Malpica C. M. L1, Marquínez T. D.2, Gómez, D. G.3, Dorantes, C. Alicia, Carrillo, T. Graciela, Martínez, S. Cristina 1 Directora de la Facultad de Nutrición Campus Veracruz, Universidad Veracruzana. 2 M.N.D., Académica de la Facultad de Nutrición Campus Veracruz, Universidad Veracruzana 3 Académica de la Facultad de Nutrición Campus Veracruz, Universidad Veracruzana. RESUMEN Faculty of Nutrition proposed a cross and descriptive study which was approved by the Mexican Society of Nutrition and Endocrinology Chapter Veracruz during the International Congress of Nutrition and Endocrinology. This study of 118 adults included anthropometric evaluation of weight, height and waist circumference. The information was processed thru the program of statistics and epidemiology Epi-info. RESULTS: The prevailing abdominal obesity among women was 64.7% and among men was 73.3%. Obesity grade II was found in 44.9% of the participants against the 11% of them found within the normal parameters CONCLUSSIONS: The obesity is associated with the abdominal obesity determines an increased probability to develop diabetes mellitus type 2, high blood pressure. The importance of the study of the prevalence of abdominal obesity within the adult population is vital to value the size of the problem and to take actions to prevent, early detect and correctly treat the metabolic alterations to reduce the risk of complications. INTRODUCCIÓN: La obesidad resulta de un desequilibrio entre ingestión y gasto energético, puede entenderse como un desequilibrio entre el aporte de grasas y la oxidación lipídica. OBJETIVO: Determinar la prevalencia de obesidad abdominal en los asistentes al programa “Escuela Sana” en Veracruz, Veracruz. MÉTODOS: Se realizó un estudio transversal y descriptivo propuesto por la Facultad de Nutrición y aprobado por La Sociedad Mexicana de Nutrición y Endocrinología Capítulo Veracruz, durante el Congreso Internacional de Nutrición y Endocrinología. El estudio incluyó 118 adultos, realizando evaluación antropométrica: peso, talla y circunferencia de cintura. La información se procesó en el programa de estadística y epidemiología Epi-info. RESULTADOS: La prevalencia de obesidad abdominal en mujeres fue de 64.7 % y en hombres fue de 73.3%. El 44.9% de los participantes se encontraron con obesidad grado II en contraste con el 11% dentro los parámetros de normalidad. CONCLUSIONES: La obesidad se asocia directamente con la obesidad abdominal y condiciona un aumento en la probabilidad de desarrollar diabetes mellitus tipo 2, hipertensión arterial. El estudio de la prevalencia de obesidad abdominal en la población adulta es de vital importancia para valorar la magnitud del problema y de esta forma intervenir con acciones de prevención, detección temprana y tratamiento oportuno de las alteraciones metabólicas para reducir el riesgo de complicaciones. KEY WORDS: abdominal obesity, waist circumference, diabetes mellitus 2, high blood pressure. INTRODUCCION En los últimos años se han generado datos que sustentan un incremento en la prevalencia e incidencia de la obesidad en todos los grupos de edad, razas, grupos étnicos, tanto en hombres como en mujeres, y está considerada por la Organización Mundial de la Salud como la enfermedad nutricional más común del mundo, estimando alrededor de 300 millones de adultos obesos. 1 La obesidad implica una gran preocupación para los clínicos, debido, sobre todo a las graves consecuencias que afecta el estado de salud de las personas, lo que ha llevado a muchos a considerarla una epidemia de consecuencias devastadoras. 2 En los países en transición como el nuestro, la obesidad está alcanzando proporciones significativas en la población adulta y se asocia con un aumento en la morbilidad de enfermedades crónicas no transmisibles. 1 Palabras clave: obesidad abdominal, circunferencia de cintura, diabetes mellitus 2, hipertensión arterial. ABSTRACT (SUMMARY or RÉSUMÉ) INTRODUCTION: Obesity results from an unbalance between intake and energetic expense; it is understood as a lack of equilibrium between fat contribution and lipid oxidation. OBJECTIVE: To determine the prevalence of abdominal obesity in the assistants to the program “Healthy School” in Veracruz, Veracruz. METHODS: The 107 Las implicaciones de la obesidad en relación con la salud de los individuos se puede considerar a partir de varias perspectivas: la magnitud general de la obesidad (cuánto sobrepeso u obesidad tiene el individuo), la disminución de la reserva corporal de grasa, el patrón de distribución regional de grasa subcutánea (si es obesidad abdominal o fémoro-glútea) y el grado relativo de acumulación de grasa intraabdominal. 3 La obesidad es el resultado de un desequilibrio entre la ingestión y el gasto energético. Este desequilibrio es frecuentemente consecuencia de la ingestión de dietas con alta densidad energética y bajas en fibra, y de bebidas azucaradas, en combinación con una escasa actividad física, la cual se ha asociado a la urbanización, al crecimiento económico y a los cambios en la tecnología para la producción de bienes y servicios, así como a los estilos de vida y recreación. 4 La obesidad también puede entenderse desde la perspectiva del desequilibrio entre el aporte de grasas y la oxidación lipídica, es decir, como el resultante de un disbalance graso. Tiene en gran medida una base genética; sin embargo, sobre este factor predisponente resaltan factores de tipo ambiental y/o cultural, siendo esto, condición necesaria para la instauración de la obesidad. 5, 6, 7 La predisposición genética para la obesidad está asociada tanto con la ingesta como con el gasto. Los genes pueden determinar señales aferentes y eferentes así como mecanismos centrales implicados en la regulación del peso corporal. El número de genes o marcadores relacionados con la obesidad pueden ser más de 200. Algunos genes están implicados específicamente en el control de la ingesta (neuropéptido, leptina, POMC, CCK, MCH, etc.) o la regulación de la termogénesis (receptores adrenérgicos β2 y β3, proteínas desacoplantes, leptina, etc.) mientras que la expresión de algunos otros genes influencían diferentes vías de señalización como por ejemplo en adipogénesis que podrían afectar a la ecuación energética. 8 En México, la prevalencia de obesidad en los adultos se ha incrementado en la última década, según los resultados de las diferentes encuestas de salud realizadas: Encuesta Nacional de Enfermedades Crónicas 1993 (ENEC) la cual mostró que la prevalencia de obesidad en adultos fue de 21.5%; Encuesta de Salud 2000 (ENSA) reveló que el 24% de los adultos padecía obesidad y para el 2006 la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición (ENSANUT) registró obesidad cerca de 30% de la población mayor de 20 años (mujeres 34.5 %, hombres, 24.2%). 4 El sobrepeso y la obesidad son problemas que afectan aproximadamente a 70% de la población (mujeres, 71.9 %, hombres, 66.7%) entre los 30 y 60 años, en ambos sexos. No obstante, entre las mujeres existe un mayor porcentaje de obesidad –índice de masa corporal igual o mayor a 30– que entre los hombres. 8 Existen mediciones antropométricas que estiman de manera indirecta el contenido de grasa abdominal, tales como la circunferencia de cintura y la relación cintura – cadera (ICC). Estudios probados han demostrado una alta correlación entre estas técnicas, sin embargo, la medición de circunferencia de cintura es el procedimiento más recomendado por su fácil aplicación, mayor sensibilidad y especificidad. De esta manera se han establecido los puntos de corte para determinar el riesgo a desarrollar Diabetes Mellitus (DM) e Hipertensión Arterial (HTA). 1 La obesidad centroabdominal se determina midiendo la circunferencia de la cintura y su diagnóstico depende del sexo y del grupo étnico a los que pertenece la persona (no al país de residencia). Los valores de referencia actualmente aceptados para México, son los criterios propuestos por la SSA (menor de 80 en mujeres y menor de 90 en hombres). 9 La ENSANUT 2006 registró la prevalencia de circunferencia de cintura excesiva según los criterios propuestos por la SSA del 83.6% en mujeres, representando riesgo para DM e HTA, mientras que los hombres el porcentaje con cintura de riesgo fue de 63.8 %. 2 La presencia de obesidad exacerba las anormalidades metabólicas de la Diabetes Mellitus tipo 2, incluyendo la hiperglicemia, la hiperinsulinemia y la dislipidemia. Aumenta la resistencia a la insulina y la intolerancia a la glucosa. La obesidad puede contribuir a una elevada morbilidad y mortalidad en los diabéticos. 10, 11, 12 La grasa acumulada en la región abdominal es metabólicamente activa, ya que es la responsable de la liberación de múltiples hormonas relacionadas con las complicaciones de la obesidad abdominal, entre las cuales encontramos: Leptina (encarga de enviar señales al cerebro respecto a la formación adiposa del cuerpo, regulación del apetito y la síntesis energética), TNF Factor de Necrosis Tumoral (Interfiere con las señales de los receptores de la insulina y es una posible causa de la resistencia a la insulina en los obesos), IL6 Interleucina – 6 (Implicado en el metabolismo de la glucosa y los lípidos), Angiotensinógeno (Precursor de la angiotensina II. Regulador de la presión sanguínea y la homeostasis electrolítica), AdipoQ/apM1/ Adiponectina/ Acrp (es probable que juegue un papel en la patogénesis de la familia de las hiperlipidemias combinadas y están asociadas a la resistencia a la insulina), entre otras; en este sentido, se considera que la secreción hormonal del tejido adiposo abdominal es el responsable de la mayoría de las complicaciones de la obesidad. 13 108 En este contexto epidemiológico nacional, la nutrición juega un papel fundamental para incidir en las políticas gubernamentales de prevención y control de la obesidad y sus factores de riesgo, a través de la participación de organismos, instituciones y asociaciones enfocadas al abordaje de este problema de salud pública. La Sociedad Mexicana de Nutrición y Endocrinología Capítulo Veracruz, durante el Congreso Internacional de Nutrición y Endocrinología realizado en Octubre de 2006, incluyó en su programa científico-académico el Curso Escuela Sana con el tema “La Obesidad y la Diabetes Mellitus” en el que Universidad Veracruzana a través de la Facultad de Nutrición Campus Veracruz, participó con el apoyo de docentes y estudiantes en el estudio de obesidad abdominal para determinar la prevalencia en maestros de escuelas primarias convocados por el H. Ayuntamiento de Veracruz. establecidos en un informe de la OMS (Anexo 1) que se basan en el riesgo de mortalidad y morbilidad y estos puntos de corte actualmente se aceptan para usarse en adultos tanto en el campo clínico como en el poblacional. Además de la clasificación por IMC se presenta la información sobre el riesgo que representa para la población estudiada tener valores de perímetro de cintura mayores a los actualmente aceptados. 3 Estudio antropométrico El peso se midió sobre una báscula de campo, portátil, digital con graduación de 0.1 kg. El peso se registró a los 100g más cercanos, solicitando al participante despojarse de prendas innecesarias. La estatura se evaluó con estadímetros de barra vertical graduada y una barra horizontal (cabecera), deslizable en la parte superior, que haría contacto con el máximo punto superior sobre la cabeza, solicitando al participante estar descalzo, supervisando la posición correcta en el plano de Frankfurt. Con ambas medidas se determinó el Índice de Masa Corporal (IMC) Peso (kg) / Talla (m)2, (peso entre la talla al cuadrado) y se comparó con el patrón de referencia recomendado por la OMS. 14 Para determinar la circunferencia de cintura, se solicitó a los participantes separar la ropa ajustada, de tal forma que la cinta pudiera colocarse en un nivel y posición correcta, el sujeto se colocó con los pies juntos en posición erguida y con el abdomen relajado. Se tomó la medición con una cinta métrica de fibra de vidrio flexible colocándola en el punto medio entre la última costilla y el borde superior de la cresta iliaca. Se utilizó como referencia los criterios propuestos por la SSA . 1 MATERIAL Y MÉTODOS Se realizó un estudio descriptivo transversal con un muestreo de no probabilística a un grupo de 118 adultos y se utilizó el método de sujetos participantes del curso “Escuela Sana” que fue el criterio único de inclusión, realizando un muestreo por conveniencia. El estudio fue propuesto por la Facultad de Nutrición y aprobado por La Sociedad Mexicana de Nutrición y Endocrinología Capítulo Veracruz, durante el Congreso Internacional de Nutrición y Endocrinología. Se les informó del carácter voluntario de su participación y se les explicaron los procedimientos a realizar. Todas las variables se midieron sólo una vez. Consistió en la evaluación antropométrica de peso, talla y circunferencia de cintura. Para estudios de población, el sobrepeso y la obesidad son cuantificados mediante el uso de indicadores antropométricos, basados principalmente en la combinación del peso, la talla (considerando edad y género) y la circunferencia de cintura, datos que fueron utilizados para obtener los índices que aportaron diagnósticos del estado nutricio del grupo evaluado. De acuerdo a los lineamientos clínicos para la identificación, evaluación y tratamiento del sobrepeso y la obesidad de la Organización Mundial de la Salud el sobrepeso se define como un IMC de 25.0 a 29.9 kg/m2 y la obesidad como un IMC igual o mayor de 30.0 Kg/m2. El razonamiento que dio origen a estas cifras se basó en datos epidemiológicos que muestran un aumento en la mortalidad de las personas que tienen un IMC por arriba de 25 kg/m2. 1 Una manera práctica de clasificar el sobrepeso y la obesidad es utilizar el IMC en los puntos de corte Procesamiento y análisis de la información La información obtenida se procesó en el programa de estadística y epidemiología Epi Info. Se realizó un análisis univariado a través de medidas de tendencia central y de dispersión, así como proporciones. 15 RESULTADOS La población en estudio incluyó 118 personas, de las cuales el 74.6% mujeres y 25.4% hombres. Se encontró un 89 % de mujeres con sobrepeso y obesidad, el 21.6% con sobrepeso, 19.3 obesidad grado I, destacando el 42% con obesidad grado II y con obesidad grado III sólo un 5.7%. Tomando en cuenta la circunferencia de cintura en mujeres encontramos 24.1% con cintura recomendada y 75.9% con cintura excesiva. 109 A nivel nacional la prevalencia de sobrepeso según la ENSANUT 2006 fue más alta en hombres (42.5%), que en mujeres (37.4%, 5pp mayor); en cambio, la prevalencia de obesidad fue mayor en mujeres (34.5%) que en hombres (24.2%, 10pp mayor). Al sumar las prevalencias de sobrepeso y obesidad, 71.9% de las mujeres mayores de 20 años de edad y 66.7% de los hombres mantienen diagnósticos combinados de sobrepeso u obesidad. Estas cifras, especialmente la de obesidad, tienden a incrementarse con la edad. 4 Los resultados de la evaluación nutricia en los maestros que asistieron al curso “Escuela Sana” mostraron diferencias con la situación mundial y nacional, ya que se encontró mayor prevalencia de obesidad en hombres y de sobrepeso en mujeres, no obstante, la prevalencia de obesidad se presentó por arriba de los registros nacionales en las mujeres 67% (32.5pp mayor) y en los hombres 76.6%, (52.4pp mayor). Con respecto a la prevalencia de circunferencia de cintura de adultos hombres y mujeres a nivel nacional, los estudios reportan que el 83.6% de las mujeres presentaron una CC de riesgo (>80), mientras que en los hombres el porcentaje con cintura de riesgo (>90) fue de 63.8%, en comparación con los datos obtenidos en el estudio el 75.9% de las mujeres presentaron circunferencia de cintura en riesgo, resultado por debajo del promedio nacional a diferencia de los hombres con el 86.7% con cintura excesiva, superior al promedio nacional. (1) De manera concordante los datos obtenidos mostraron la prevalencia de obesidad grado II en ambos sexos y se asocian con obesidad abdominal obtenida de los índices IMC y CC arriba de los parámetros oficiales. Estos resultados determinan las consecuencias a la salud que condiciona este estado que es un factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades crónicas no transmisibles. Esta intervención académica en el marco de eventos científicos resultan de gran interés para la comunidad medica así como para el gremio de la Nutriología ya que es claro que los problemas de salud pública que se están viviendo actualmente se han convertido en una epidemia de trascendencia mundial y nacional y es necesario abordarlos desde una perspectiva multidisciplinaria y multisectorial Los estudios de prevalencia de obesidad abdominal en población adulta e inclusive joven, son necesarios para vigilar y valorar la magnitud del problema con el propósito de intervenir en acciones de prevención, detección temprana y tratamiento oportuno de las alteraciones metabólicas para reducir el riesgo de complicaciones y disminuir el gasto en atención médica que generan estos padecimientos. Tabla 1. Prevalencia de obesidad abdominal en mujeres En el caso de los hombres se encontró el 90% con sobrepeso y obesidad, 13.3 % sobrepeso, 23.3% obesidad grado I, 53.3% obesidad grado II. Tomando en cuenta la circunferencia de cintura los resultados muestran el 86.7% con cintura excesiva a diferencia del 13.3% de los parámetros recomendados. Tabla 2. Prevalencia de obesidad abdominal en hombres DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES La obesidad abdominal, diagnosticada por medio de IMC y circunferencia de cintura, condiciona un aumento en la probabilidad de desarrollar DM tipo 2 e HTA.7 A la vez que el tejido adiposo es útil para el almacenamiento y liberación de energía, produce sustancias activas conocidas como hormonas. Una gran cantidad de la grasa abdominal de “alto riesgo”, es responsable de niveles anormales de estas sustancias, que interfieren con la función metabólica normal y conducen a un incremento de la glucosa sanguínea y a niveles de colesterol perjudiciales, los cuales pueden aumentar el riesgo de enfermedad cardiaca y diabetes. 16 En el ámbito mundial las mujeres presentan mayores tasas de obesidad (IMC>30) que los hombres, aunque estos últimos tienen mayores tasas de sobrepeso (IMC>25 y <30). 1 110 BIBLIOGRAFÍA 13. GEMA FRU¨ HBECK,1,2 JAVIER GO´ MEZAMBROSI,2, FRANCISCO JOSE´ MURUZA´ BAL,3 AND MARI´A ANGELA BURRELL “The adipocyte: a model for integration of endocrine and metabolic signaling in energy metabolism regulation” Metabolic Research Laboratory and Department of Histology and Pathology, University of Navarra, 31008 Pamplona, Spain 14 National Center for Health Statistical (NCHS) - Center for Disease Control and Prevention (CDC) 2002 y 2000. 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Red de Revistas Científicas de America Latina y el Caribe, España y Portugal. Venezuela. 12. Scarsella, C.; Después, J. (2003). Tratamiento de la obesidad: necesidad de centrar la atención en los pacientes de alto riesgo caracterizados por la obesidad abdominal. Cuadernos de Salud Pública. Vol.19 suppl.1. Rio de Janeiro. ANEXOS ANEXO 1: CLASIFICACIÒN DE LA OBESIDAD Y SOBREPESO MEDIANTE EL ÌNDICE DE MASA CORPORAL Preventing and managing the global epidemia of obesity. Report of the World Health Organization Consultation of Obesity. Ginebra: WHO; 1997. En: National Institute of Health 111 “Incidencias de Hiperlipidemia y/o Hipertensión y su probable correlación con el IMC y Diabetes Mellitus 2 en personas que acuden al puesto de sangrado del hospital general Córdoba, Veracruz” José A. González-Garrido1, Mario R. Guapillo-Vargas2, Emma V. Herrera-Huerta3, Ángel Ramos-Ligonio4, Aracely López-Monteon5, Guillermo M. Ceballos-Reyes6 y Enrique Méndez-Bolaina7 1 Estudiante DCB-UV. Instituto de Ciencias de la Salud, Doctorado en Ciencias Biomédicas-UV (DCB-UV). Avenida Dr. Luis Castelazo Ayala s/n, Colonia Industrial Ánimas, Xalapa, Ver., CP. 91000. 2 Profesor Titular “C”; 3 Profesor Titular “C”; 4 Profesor Titular “C”; Dra. 5 Profesor Titular “C”; **Dr. 6 Profesor-Investigador .Sección de Posgrado e Investigación-Escuela Superior de Medicina-Instituto Politécnico Nacional. Prolongación de Díaz Mirón y Plan de San Luis s/n, Colonia Casco de Santo Tomás, México, D. F., CP. 11340. 7 Profesor Titular “C” ([email protected]). Facultad De Ciencias Químicas-UV. Prolongación de Ote. 6 # 1009, Colonia Rafael Alvarado, Orizaba, Ver., CP. 94340, ZP. 215. ANTECEDENTES Dislipidemias. Se entiende por Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2), al tipo de Diabetes en la que hay capacidad residual de secreción de insulina, pero sus niveles no superan la resistencia a la insulina concomitante, insuficiencia relativa de secreción de insulina o cuando coexisten ambas posibilidades y aparece la hiperglucemia.5 La hiperglucemia o Diabetes es la causa más importante de amputación de miembros inferiores, de origen no traumático, retinopatía e insuficiencia renal, además, es uno de los factores de riesgo más importantes para desarrollar enfermedades cardiovasculares. Los costos económicos asociados al tratamiento y sus complicaciones representan una grave carga para los servicios de salud y para los pacientes.3 La Obesidad es un problema de salud nacional, que ha incrementado su prevalencia alrededor de 167% en los últimos 11 años, siendo el principal factor de riesgo para el desarrollo de Enfermedades Crónico-Degenerativas, ciertos tipos de Cáncer y otros padecimientos.4 Además, alrededor del 8.2% de la población entre 20 y 69 años padece Diabetes y, cerca del 30% de los individuos afectados, desconoce que la tiene. Esto significa que en nuestro país existen más de cuatro millones de personas enfermas, de las cuales poco más de un millón no han sido diagnosticadas. Por otra parte, la mortalidad por esta causa muestra un incremento sostenido durante las últimas décadas, hasta llegar a ocupar el tercer lugar dentro de la mortalidad nacional general.5,6 Por otra parte, durante las últimas décadas, la mortalidad por enfermedades del corazón ha mostrado La Obesidad es uno de los principales determinantes de la salud en los adultos y un fenómeno mundial que incluye tanto a los países industrializados como a los países en desarrollo. La prevalencia de Sobrepeso y Obesidad en población pediátrica ha aumentado en años recientes hasta alcanzar proporciones epidémicas alrededor del mundo. Según la Encuesta Nacional de Nutrición de 1999 (ENN 99), uno de cada cinco niños mexicanos en edad escolar padece Sobrepeso u Obesidad prediciendo los riesgos futuros en nuestra población adulta. Como es bien sabido la Obesidad es una enfermedad que incluye al Sobrepeso como un estado premórbido, es una enfermedad crónica caracterizada por el almacenamiento en exceso de tejido adiposo en el organismo,1 de etiología multifactorial de curso crónico en la cual se involucran aspectos genéticos, ambientales y de estilo de vida que conduce a un trastorno metabólico. Se determina la existencia de Obesidad en adultos cuando existe un Índice de Masa Corporal (IMC) elevado (≥27 Kg/m2).7 Es por ello que la identificación de factores y poblaciones de riesgo debe iniciar en edades tempranas, con el fin de facilitar el diseño y focalización de intervenciones destinadas a la prevención de este problema de salud.17 La Obesidad en sí misma es un factor de riesgo para desarrollar enfermedades crónicas, principalmente, Diabetes, Enfermedades Cardiovasculares y 113 un incremento constante, hasta llegar a constituirse en la primera causa de muerte en México. Entre las principales causas para el desarrollo de estas enfermedades se encuentra la aterosclerosis. Esta última es una alteración estrechamente asociada a las Dislipidemias, cuyas presentaciones clínicas pueden ser: hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hipoalfalipoproteinemia e hiperlipidemia mixta. Las Dislipidemias pueden obedecer a causas genéticas o primarias, o a causas secundarias. En el caso particular de la hipercolesterolemia secundaria, se consideran como causas: la Diabetes, la Obesidad, el Hipotiroidismo y el Síndrome Nefrótico. La hipertrigliceridemia secundaria, puede tener como causa a: la Diabetes, el Alcoholismo, la Obesidad, el Síndrome de Resistencia a la Insulina, la Insuficiencia Renal, la ingesta elevada de azúcares refinadas, así como al uso de β-bloqueadores, diuréticos y corticosteroides anabólicos. También los procedimientos de diálisis y hemodiálisis, pueden actuar como causa desencadenante de esta Dislipidemia.7 En los Hospitales de nuestro país uno de los principales problemas es la donación de sangre por la falta de personas donadoras, así como la educación para la donación altruista, aunado a esto, de las personas que acuden a donar, muchas veces no cuentan con las condiciones de salud para efectuar la donación, entre otras situaciones por detectárseles alguna Enfermedad Crónico-Degenerativa o No Transmisible. Siendo el propósito de este estudio el conocer el impacto de estas enfermedades, prevalencia y probable correlación en personas que acuden a donar sangre, conociendo que las enfermedades transmisibles han disminuido debido a los nuevos procesos de obtención de la sangre observando nuevos padecimientos en nuestros donadores,8 siendo de gran utilidad la recolección de sangre para brindar atención oportuna a las urgencias médicas e intervenciones quirúrgicas que se presentan día con día. trabajaron normalmente, tal y como se hace en la donación, separándolos en donadores a las personas que efectuaron el proceso y no aptos aquellas que no realizaron el proceso de donación. Los sueros fueron separados por centrifugación a 1 200 x g por 10 minutos y conservados de 2 a 8º C hasta su uso. Determinación de DM tipo 2 La determinación de la glicemia se realizó en el Laboratorio de Farmacología Cardiovascular en la Universidad Veracruzana en muestras de predonadores con un ayuno de 12 horas en suero por método colorimétrico (glucosa oxidasa) y fueron leídos en un espectrofotómetro de la marca Jenway a una longitud de onda de 520 nm, el cual previamente fue calibrado y comprobado con tres niveles comerciales alto, bajo y normal, posteriormente fueron procesadas las muestras considerando como personas diabéticas aquellas que presentaron mediciones de glucosa ≥126 mg/dL.5 Determinación de Hiperlipidemia La determinación de la Hiperlipidemia se realizó a través de la observación macroscópica de los sueros determinado la presencia o ausencia y descartando los sueros con Hiperlipidemia automáticamente por interferir con las pruebas serológicas que garanticen la recolección de sangre segura de acuerdo al Manual de Toma de Muestra y Flebotomía. Determinación del IMC La medición del Índice de Masa Corporal (IMC) se realizó pesando, midiendo a la persona y correlacionándolo con la medición de la Circunferencia de la Cintura (CC), de acuerdo con los siguientes criterios: IMC elevado ≥27 Kg/m2, y el valor de la CC de los participantes, la cual no debe ser mayor a 80 cm en mujeres y en hombres no mayor a 94 cm, denotando así la presencia de Sobrepeso y Obesidad a través de estos indicadores.7 MATERIALES Y MÉTODOS Población de estudio Determinación de la Presión Arterial Se realizó un estudio experimental descriptivo a 300 predonadores de sangre del Puesto de Sangrado del Hospital General Córdoba, los cuales fueron invitados a participar por medio de un consentimiento informado. Dentro de los criterios de selección se incluyeron personas entre 18 y 65 años de edad, las cuales eran asintomáticas y con evolución clínica normal.9 Los predonadores que aceptaron participar mediante la firma del consentimiento informado se La medición de la Presión Arterial (PA) se realizó por medio de un baumanómetro tomando en cuenta los valores de referencia clasificando presión alta como PA >140 mm de Hg (sistólica), y/o >90 mm de Hg (diastólica).10 114 RESULTADOS Cuadro II. Principales incidencias de enfermedades en pacientes donadores De 300 personas que aceptaron participar en este estudio, 25 (8.3%) eran mujeres y 275 (91.7%) hombres, con una edad promedio de 35.5 años, de los cuales, donadores aptos fueron 89 (29.7%) y no aptos 211 (70.3%). (Figura 1) Figura 1. Relación de donadores y predonadores no aptos En los 211 (70.3%) predonadores no aptos se presentaron las siguientes incidencias: Hiperlipidemia en 92 de ellos (30.7%), 19 (9%) con DM2. IMC elevado en 109 de ellos (51.6%) y HTA 7 (3.3%). (Cuadro III) Cuadro III. Principales incidencias de enfermedades en pacientes predonadores no aptos Las incidencias presentadas en los 300 participantes fueron: Hiperlipidemia en 110 (36.6%), HTA en 7 (2.3%), IMC elevado en 167 (55.6%) y DM2 en 41 (13.7%). (Cuadro I) Cuadro I. Incidencias de enfermedades presentadas en los 300 participantes Dentro de las correlaciones analizadas se encontró: De los predonadores que presentaron Hiperlipidemia se correlacionaron con: IMC elevado 167 personas (55.6%) y 31 personas (10.3%) DM2. (Figura 2) Dentro de los 89 donadores destacaron las siguientes incidencias: IMC elevado en 58 donadores (65%), 22 (24.7%) con DM2 y solo 9 (10.3%) sin ninguna incidencia. (Cuadro II) 115 Figura 2. Porcentaje de predonadores con Hiperlipidemia y su correlación con un IMC elevado y la DM2 Figura 4. Porcentaje de predonadores no aptos que presentaron Síndrome Metabólico De los predonadores que presentaron HTA se correlacionaron con: IMC elevado 3 personas (42.8%) y 4 personas (57%) con DM2. (Figura 3) DISCUSIÓN Los cambios sociales y en el estilo de vida han favorecido el aumento de la Obesidad y de las enfermedades crónicas relacionadas. En el mundo, se estiman al menos 300 millones de adultos con Obesidad. En México, 24% de los adultos a partir de los 20 años de edad tienen Obesidad.20,21,22 La Obesidad es una de las epidemias de mayor aumento en nuestro país aumentado su prevalencia en 167% en los últimos 11 años, la cual afecta a la mayoría de los mexicanos. Se ha reportado una asociación directa entre la Obesidad y varias enfermedades, incluyendo Diabetes Mellitus, HTA, Dislipidemia, Enfermedad Cardiaca Isquémica, entre otras.18,19 Es considerada un problema de Salud Pública, que conlleva a un estado mórbido que se correlaciona con una mala alimentación conduciendo a problemas de salud, tales como HTA y DM2, las cuales continúan en aumento. Se han descrito los riesgos cardiovasculares que presentan las personas que padecen Resistencia a la Insulina, produciendo DM2, desarrollando el incremento de enfermedades cardiovasculares, además se ha observado la relación de la Obesidad interaccionando con la DM2 y procesos inflamatorios.11-12 En la donación de sangre existen campañas para la captación de donadores voluntarios, debido a la alta demanda de los componentes sanguíneos,13 dado que Córdoba, Veracruz no es un punto crítico de interés económico del país, resalta el avance de Enfermedades Cardiovasculares en forma silenciosa al observar el Figura 3. Porcentaje de predonadores con HTA y su correlación con un IMC elevado y la DM2 Dentro de los predonadores no aptos para la donación se encontró la combinación de tres padecimientos, denotando la presencia del Síndrome Metabólico (SM) en 21 personas (9.9%). (Figura 4) 116 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS desconocimiento por parte de los participantes en este estudio de padecerlas. Los resultados obtenidos en este trabajo indican que la Obesidad está presente y sugiere riegos de padecer enfermedades tales como, Hiperlipidemia, HTA y DM2, además de considerar la presencia del SM por la presencia de tres de estos padecimiento, aumentando al doble la probabilidad de presentar un infarto agudo de miocardio por la presencia de este último,14,15 evitándonos así el llevar a cabo la donación de sangre y observando los riesgos que presentan las donaciones actuales por parte de donadores diabéticos asintomáticos, aumentando con esto el riesgo de presentar una descompensación por la realización del proceso de donación aunado al desconocimiento de la enfermedad al llevar a cabo la donación, además de las complicaciones conocidas por padecer esta enfermedad, siendo primordial redoblar esfuerzos para que más donadores voluntarios acudan a los puestos de donación cerciorándose del estado de su salud y ayudando a personas que requieran sus componentes sanguíneos, siendo importante que la determinación de glucosa se realicé de rutina a todos los predonadores, aunado a esto, falta más énfasis en el diagnóstico temprano de la Diabetes pues en este trabajo fue evidente que el total de personas predonadoras y donadoras voluntarias ignoraban que la padecían, lo cual podría beneficiar la salud de los predonadores, conociendo su situación con respecto a padecer Diabetes y tomando según corresponda el caso medidas preventivas para evitar el deterioro de su salud, más allá del poder o no donar, es necesaria dicha detección para un mejor control, tratamiento y una mejor calidad de vida. Investigaciones recientes predisponen a la DM2 como el principal factor de riesgo para desarrollar SM, aunque, dos de los factores fuertemente ligados a este síndrome son la Obesidad Abdominal y la mencionada Resistencia a la Insulina,16 siendo significativo el resultado de este trabajo, por la presencia de los padecimientos y factores de riesgo evaluados, agregando que en este trabajo no se aplicó una encuesta que hiciera evidente la presencia de sedentarismo en las personas participantes en este estudio, sin embargo, la presencia de donadores diabéticos, permite calificar que una parte de la donación se hace de un enfermo a otro enfermo y otra parte de donadores sanos que no presentan ningún factor de riesgo al momento de la donación, pero que conllevan riesgos que les impedirán realizar la donación en un futuro, además de los problemas de salud que conllevan este tipo de padecimientos y factores de riesgo. 1. Norma Oficial Mexicana NOM-174-SSA1-1998. 2. Sánchez Castillo CP, Pichardo Ontiveros E. The epidemiology of obesity. Gac Med Méx 2004; 140 (2): S3-20. 3. Castillo Arriaga A, Delgado Sánchez V, Carmona Suazo JA. Family risk perception to diabetes mellitus. Rev Med Inst Mex Seg Soc 2006: 505-10. 4. Sanchez Castillo CP, Velasquez Monroy O, Lara Esqueda A, Berber A, Sepulveda J, Tapia Conyer R, James WP. Diabetes and hypertension increases in a society with abdominal obesity: results of the Mexican National Health Survey 2000. Public Health Nutr 2005; 8(1): 53-60. 5. MODIFICACIÓN a la Norma Oficial Mexicana NOM015-SSA2-1994. 6. Rull JA, Aguilar Salinas CA, Rojas R, Rios Torres JM, Gomez Perez FJ, Olaiz G. Epidemiology of type 2 diabetes in Mexico. Arch Med Res 2005; 36(3): 8896. 7. Norma Oficial Mexicana NOM-037-SSA2-2002. 8. Luban NL. Transfusion safety: Where are we today?. Ann N Y Acad Sci 2005; 1054: 325-41. 9. Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2-1993. 10. Norma Oficial Mexicana NOM-030-SSA2-1999. 11. 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[email protected] 2 Jefe del servicio de pediatria HRPR [email protected] “Un Recién Nacido es una promesa, un devenir, Un ser en construcción hacia el porvenir” tablas somatométricas elaboradas bajo las mismas características: geográficas (Espin Mayorga,2000(2), y Jiménez Balderas,1991(6)), socioeconómicas (Ramos Galván,1977(8)) y socioculturales (Dueñas,1992(1)) a las que pertenece el individuo en estudio. A.A.P.R. MARCO TEORICO Justificación: Antecedentes: A pesar de que se han realizado múltiples estudios acerca de la Somatometría en recién nacidos, tenemos conocimiento, de que se han realizado en poblaciones diferentes a la de nuestro universo en estudio (región norte de Estado de Veracruz). Dichos estudios, no comparten las mismas condiciones socioeconómicas, culturales, dietéticas, geográficas y genéticas. Por lo tanto al aplicarlas a poblaciones que no corresponden al grupo de estudio, marcan diferencias significativas En nuestro medio la población que se encuentra bajo el régimen del Hospital Regional de Poza Rica de los Servicios de Salud de Veracruz (HRPR SES VER), es una población que cuenta con una gran diversidad socioeconómica y cultural. Además de ser un sector con una estructura demográfica significativa y un abordaje geográfico amplio de la región norte de Estado de Veracruz. Sin embargo, en la actualidad, no contamos con tablas somatométricas propias para los recién nacidos de término sanos de nuestra población. Es por ello que surge el interés de plantear esta investigación bajo el escenario retador de establecer un patrón somatométrico propio de la población abierta que atiende el Hospital Regional de Poza Rica Ver de los Servicios de Salud de Veracruz HRPR SES VER., obteniendo Tablas Somatométricas Regionales de una población representativa de la zona norte del estado de Veracruz, que nos permitan implementar: 1.Un recurso diagnostico no invasivo, con características regionalizadas, para la clasificación del crecimiento de nuestros recién nacidos veracruzanos. 2.Un sistema evaluador mas fidedigno del estado La Somatometría o antropometría neonatal, es el estudio y técnica de medidas del cuerpo humano, con la finalidad de clasificación y comparación (12). Las medidas corporales más utilizadas para este fin son: peso, talla y circunferencias. La precisión es muy importante por lo que se debe contar con instrumentos adecuados y examinadores capacitados. (3,13) Es un procedimiento rutinario en las unidades de cuidados neonatales que constituye una parte importante de la evaluación clínica no invasiva del crecimiento corporal y del estado de salud, permitiendo la identificación de neonatos con: afección nutricia, riesgo de complicaciones metabólicas en el periodo neonatal y las posibilidades de supervivencia. Por lo tanto la Somatometría, es considerada como uno de los factores de riesgo perinatal más importante, que debe tomarse en cuenta en la valoración integral de los recién nacidos. En el ámbito poblacional, constituye un elemento valioso para la toma de decisiones en cuestiones de salud pública, a pesar de lo cual es aún poco apreciada. (13) Actualmente las tablas somatométricas oficiales para recién nacidos que rigen a cualquier institución de salud en México, son las marcadas por la Norma Oficial Mexicana NOM-007–SSA2-1993 Para la atención de la mujer durante el embarazo, parto y puerperio, y del recién nacido. Dichas tablas fueron obtenidas del estudio mexicano realizado por Jurado García 1970.(12,14) ,quien tuvo como antecedente las graficas de Battaglia/ Lubchenco; sin embargo en estudios posteriores se ha establecido, que son de mayor utilidad aquellas 119 de salud de los recién nacidos, que arroje datos de afección nutricia y posibilidades de supervivencia de cada recién nacido veracruzano. Este será un elemento valioso para la toma de decisiones en cuestiones de salud pública regional y estatal. 3.Una mejora de calidad en los servicios de salud que se le brinde a cada recién nacido veracruzano. y Jornada Acumulada, obtenidos por parto o cesárea en el del HRPR SES VER, durante el periodo 2004 – 2006, de ambos sexos y de estado socioeconómico indistinto. 3. Tamaño de la Muestra: Por censo se incluyeron el 100% de los recién nacidos sanos de término. Pregunta de Investigación: ¿Cuál es el patrón somatométrico promedio, de los recién nacidos sanos de término 38 – 42 semanas de gestación del HRPR SES VER, en el periodo 2004 2006? Tabla 1: Caracteristicas del universo que censa el hrpr sesver Estructura Geografica (Zona Norte Veracruz) Objetivo General: Determinar un patrón somatométrico regionalizado, basado en peso, talla y perímetro cefálico en los recién nacidos sanos de término 38 – 42 semanas de gestación de la población abierta que atiende el HRPR SES VER, en el periodo 2004 - 2006. METODOLOGIA Tipo de Estudio: Observacional, Transversal Descriptivo, Retrospectivo, Extension Territorial 6631.89 Km2 Densidad De Poblacion 118 Habitantes / Km2 Altitud 44 -54 Mts Sobre Nivel Del Mar Latitud 20° 29’55’’ Del Meridiano Greenwich Numero De Municipios 48 Total De Localidades Que Censa El Hrpr Sesver * 86 1ernivel-4 Hosp. Subzona Localidades De Mas De 100 Habitantes 78 Localidades De Menos De 100 Habitantes 12 Estructura Demografica Universo de Estudio: 1. Institución Participante: Hospital Regional de Poza Rica de los Servicios de Salud de Veracruz HRPR SES VER .Servicio de salud público. Características especificadas en la Tabla 1. Poblacion Total 746,037 Población Asegurada 175, 990 Población No Asegurada 570,047 Población Ses Ver 341,163 Poblacion Imss Oportunidades 228,884 Estructura Socioeconomica Poblacion Con Ingreso Inferior Al Salario Minimo 65% Poblacion Con Ingreso Superior Al Salario Minimo 35% Nivel De Marginacion (Conapo 2000) 4to. Lugar Nacional Estructura Sociocultural Dirección: calle de las Flores sin número Colonia Las vegas Poza Rica Regiones La Huasteca Veracruzana La Región Del Totonacapan Etnias/razas Establecidas Totonacas, Nahuas,tepehuas,otomies Veracruz 2. Universo Poblacional: Fuente: Departamento de Archivo y Estadística del HRPR SES VER Todos los recién nacidos sanos de término (38 – 42 semanas de gestación), atendidos durante las 4 jornadas hospitalarias establecidas: Matutino, Vespertino, Nocturno –2006. 120 Variables: parte distal de la planta del pie. Unidades: Centímetros (cm.) VARIABLE CONCEPTO INDICADORES ESCALA DE MEDICION Edad Gestacional Tiempo transcurrido desde la concepción hasta el nacimiento Semanas de gestación (SDG) Independiente Numérica Sexo Diferencia constitutiva y física entre el hombre y la mujer Femenino Masculino Independiente Nominal Peso Masa corporal de un cuerpo Gramos (Gr.) Dependiente Numérica Talla Longitud total de un cuerpo Centímetros (cm.) Dependiente Numérica Perímetro cefálico Medida de la circunferencia craneana Centímetros (cm.) Dependiente Numérica Perímetro cefálico: Concepto: Medida de la circunferencia craneana. Obtención: Utilizando una cinta métrica, se mide la circunferencia cefálica, tomando como referencia la protuberancia frontal y la protuberancia occipital. Unidades: Centímetros (cm.) Operacionalizacion: Se realizó una base de datos obtenida de los archivos clínicos de registros somatométricos de recién nacidos de las salas de Recuperación Posparto y Alojamiento conjunto del HRPR SES VER, periodo 2004 - 2006. Se determinaron Medidas de tendencia central (media X) y Medidas de dispersión (desviación estándar SD) para determinar el patrón somatométrico propio del universo sometido al estudio. Los resultados se sometieron a un análisis estadístico a través del software STATISTICA 7.0, y se presentaron de manera gráfica. RESULTADOS Edad Gestacional Concepto: Tiempo transcurrido desde la concepción hasta el nacimiento. Obtención: Será calculada por la fecha de última de menstruación hasta el nacimiento del recién nacido. En casos de fechas de última menstruación no confiables se obtendrán por USG. Unidades: Semanas de gestación (SDG). En el periodo 2004 – 2006 en el cual se realizo el estudio, se obtuvo un total de Universo de 3560 recién nacidos sanos, de los cuales 1730 (48.6%) fueron femeninos y 1830 (51.4%) fueron masculinos. Los recién nacidos de término (RNT) sanos del sexo femenino se distribuyeron de la siguiente manera: 301 RNT fueron de 38 SDG, 609 RNT de 39 SDG, 562 RNT de 40 SDG, 217 RNT de 41 SDG y 41 RNT de 42 SDG. En el sexo masculino: 237 RNT fueron de 38 SDG, 616 RNT de 39 SDG, 602 RNT de 40 SDG, 289 RNT de 41 SDG y 86 RNT de 42 SDG (Gráfica 1). Obtuvimos una población de recién nacidos mayoritariamente masculinos. Y con una frecuencia mayor de nacimientos en la 39 y 40 semanas de gestación. Sexo: Concepto: Diferencia constitutiva y física entre el hombre y la mujer. Obtención: Por inspección directa. Unidades: Femenino y masculino. Peso: Concepto: Masa corporal de un cuerpo. Obtención: A través de una báscula mecánica Pesabebés (BAME 440 ®) previamente calibrada, se coloca el recién nacido desnudo en decúbito dorsal. Unidades: Gramos (Gr.) Talla: Concepto: Longitud total de un cuerpo. Obtención: Utilizando una cinta métrica, se mide desde la parte más prominente del polo cefálico hasta la 121 Gráfica 1: Distribución de los Recién Nacidos Sanos de Término De acuerdo al Sexo y Edad Gestación del HRPR SES VER Periodo 2004 – 2006 Gráfica 2: Peso / Edad Gestacional Femenino En el sexo masculino la media en relación al peso para los recién nacidos de: 38 SDG fue de 2709.3 gr. +- 476.4 SD 39 SDG fue de 3229.9 gr. +- 234.2 SD 40 SDG fue de 3421.0 gr. +- 307.8 SD 41 SDG fue de 3906.5 gr. +- 156.6 SD 42 SDG fue de 4366.6 gr. +- 518.6 SD Tomando en consideración todas las variables expuestas previamente, se presenta en la Tabla 2 : La media Global que se logro obtener en nuestro estudio, exponiendo los valores de referencia obtenidos como patrón Somatométrico Regionalizado.. Gráfica 3: Peso / Edad Gestacional Masculino Tabla 2: Patrón Somatométrico Regionalizado En el sexo femenino la media en relación a la talla para los recién nacidos de: 38 SDG fue de 46.5 cm. +- 1.6 SD 39 SDG fue de 48.5 cm. +- 1.5 SD 40 SDG fue de 50.0 cm. +- 1.8 SD 41 SDG fue de 51.8 cm. +- 2.0 SD 42 SDG fue de 53.4 cm. +- 2.7 SD Gráfica 4: Talla / Edad Gestacional Femenino A continuación se muestra de manera grafica, los resultados obtenidos, y analizados por el software STATISTICA 7.0. En el sexo femenino la media en relación al peso para los recién nacidos de: 38 SDG fue de 2783.5 gr. +-424.6 SD (Desviación Estándar) 39 SDG fue de 2993.0 gr. +-233.2 SD 40 SDG fue de 3352.5 gr. +- 322.9 SD 41 SDG fue de 3885.5 gr. +- 186.9 SD 42 SDG fue de 4209.0 gr. +- 619.7 SD 122 En el sexo masculino la media en relación a la talla para los recién nacidos de: 38 SDG fue de 45.9 cm. +- 1.3 SD 39 SDG fue de 48.2 cm. +- 1.8 SD 40 SDG fue de 50.0 cm. +- 2.0 SD 41 SDG fue de 52.1 cm. +- 2.0 SD 42 SDG fue de 53.9 cm. +- 2.1 SD Gráfica 7: Perímetro Cefálico / Edad Gestacional Masculino Gráfica 5: Talla / Edad Gestacional Masculino DISCUSION Tres razones fundamentales son las que dieron origen a la presente investigación: en primer lugar, la necesidad de establecer una identidad somotométrica en la zona norte de estado de Veracruz. En segundo lugar los beneficios para salud pública que trae consigo y por último dejar claro que este trabajo tiene una perspectiva amplia a futuro. Se estableció un Patrón Somatométrico propio de los recién nacidos de término sanos del HRPR SES VER. Obteniendo de esta manera una entidad somatometrica de los recién nacidos de término veracruzanos pertenecientes a las 2 regiones del Norte de Veracruz (Huasteca y Totonaca), los cuales comparten y se identifican por sus características Genética, Geográficas, Demográficas y Socioculturales. El presente trabajo representa el análisis estadístico de 3560 nacimientos del trienio 2004 – 2006, por lo cual, los resultados aquí planteados se consideran como una muestra representativa y significativa del universo en estudio, ya que se aproxima con la tasa de nacimiento anual. Para la variable de edad gestacional encontramos que de acuerdo a lo reportado por nuestro estudio, la ponderación mas significativa de nacimientos fue para las semanas 39 y 40 de gestación, que nos indica que el 67.7% de los RNT sanos femeninos y el 66.5% de los RNT sanos masculinos analizados, están naciendo en las semanas idóneas de gestación, según lo refieren tratados bibliográficos referidos. 9, 11,12 La comparación con los rangos mediales que se encuentran en el órgano oficial que rige a los servicios de salud mexicanos (NOM -007-SSA2-1993,) 14 nos permite obtener un confiabilidad del 95% para cada una de las variables con respecto a nuestros resultados Ante la circunstancia de no contar con un parámetro de referencia como antecedente, no es posible definir si En el sexo femenino la media en relación al perímetro cefálico para los recién nacidos de: 38 SDG fue de 35.0 cm. +- 1.9 SD 39 SDG fue de 36.0 cm. +- 1.4 SD 40 SDG fue de 37.0 cm. +- 1.8 SD 41 SDG fue de 38.0 cm. +- 2.5 SD 42 SDG fue de 39.3 cm. +- 2.8 SD Gráfica 6: Perímetro Cefálico / Edad Gestacional Femenino En el sexo masculino la media en relación al perímetro cefálico para los recién nacidos de: 38 SDG fue de 36.0 cm. +- 1.5 SD 39 SDG fue de 36.7 cm. +- 2.0 SD 40 SDG fue de 37.7 cm. +- 2.3 SD 41 SDG fue de 38.8 cm. +- 2.2 SD 42 SDG fue de 39.8 cm. +- 2.3 SD 123 el patrón somatométrico establecido en nuestro estudio pudo haber sido modificado de forma evolutiva a través del tiempo, pero a partir de las bases aquí establecidas, aplicaran como un antecedente de referencia para valoraciones y comparaciones posteriores. 11. Palacios Treviño J.L., Games Eternord J. Introducción a la Pediatría. Sexta Edición. México: Editorial Méndez Editores 2004;1-8,49-53 12. Martínez y Martínez R. Pediatría La salud del niño y del adolescente. Cuarta Edición. México: Editorial Manual moderno 2001;65-75 13. Scheaffer R, Mendenhall W, Ott L. Elementos de en muestreo México. Cuarta Edición. México: Editorial Iberoamericana 1986;20-25 BIBLIOGRAFIA FUENTES PRIMARIAS: A. Revistas A. Manuales 1. Dueñas Toledo, et Al. Determinación de Somatometría en recién nacidos vivos en Mexicali B.C. Rev. Médica IMSS 1992; 31: 3751- 78. 2. Espin Mayorga V. H., El recién nacido en la altura. Bol Med Hosp Infant Mex 2000; 57(11): 663-67. 3. Fajardo Gutiérrez A, Yamoto-Kimura L, Garduño Espinosa J, Hernández-Hernández DM. Consistencia y validez de una medición en la investigación clínica pediátrica. Bol Med Hosp Infant Mex 1991; 48: 36781. 4. González Richmond A. Estudio comparativo de diferentes índices antropométricos del estado nutricional. 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Excerpta Médica Sitios de Internet relacionados con el tema: 1. www.ssa.gob.mx 2. www.imss.gob.mx 3. www.himfg.gob.mx B. Libros y Tratados 9. Gordon, B. Avery et al. Neonatología fisiopatología del recién nacido. Quinta Edición: Editorial Panamericana 2001; 411-45 10. Levin J. Fundamentos de estadística en la investigación social. Segunda Edición. México: Editorial Harla 1979;211-20 124 Colposcopía asistida por computadora: un enfoque temporal Acosta Mesa Héctor Gabriel1, Llaguno Roque José Luis2, Cruz Ramírez Nicandro3, Hernández Jiménez Rodolfo4, Cocotle Ronzón Bertha5 1Coordinador de la Maestría en Inteligencia Artificial, Departmento de Inteligencia Artificial, Universidad Veracruzana, Sebastián Camacho # 5, C.P. 91000, Xalapa, Ver. México. Tel. (228) 8-17-29-57, Fax (228) 8-17-28-55 http://www.uv.mx/dia, [email protected] {http://www.uv.mx/heacosta} 2 Departmento de Inteligencia Artificial, Universidad Veracruzana, Sebastián Camacho # 5, C.P. 91000, Xalapa, Ver. México, [email protected] 3 Investigador, Departmento de Inteligencia Artificial, Universidad Veracruzana, Sebastián Camacho # 5, C.P. 91000, Xalapa, Ver, [email protected] {http://www.uv.mx/ncruz} 4 Gineco-Obstetra, Diego Leño # 22, C.P. 91000, Xalapa, Ver. México 5 Unidad de Patología Anatómica, Betancourt # 62 Bis, C.P. 91000, Xalapa, Ver. México. [email protected] 1 MARCO TEÓRICO absolutos para correlacionar las características observadas en las imágenes con el grado de lesión. La posibilidad de aportar métodos objetivos para el diagnóstico del cáncer cérvico uterino ha motivado a diversos grupos a la investigación para tratar de automatizar la identificación de lesiones cérvico uterinas a partir del procesamiento de imágenes colposcópicas digitales (6-8). En México, el cáncer cérvico uterino representa la segunda causa de muerte en mujeres. En México, se estima que cada dos horas una mujer fallece por este padecimiento (1). Si es detectado a tiempo, el cáncer cérvico uterino tiene una alta probabilidad de cura (2). La detección temprana de las lesiones precursoras del cáncer cérvico uterino contribuye a la reducción de la incidencia de este tipo de cáncer(3). Las técnicas utilizadas para la detección de las lesiones precursoras y del cáncer cérvico uterino son: el Papanicolaou o Citología (con sensibilidad 62% y especificidad 68%) y la Colposcopía (con sensibilidad 96% y especificidad 48%) (4) , siendo esta última la que tiene mayor sensibilidad aunque resulta económicamente mas costosa (2). La prueba colposcópica es uno de los métodos más comunes para la detección de lesiones malignas y premalignas en el epitelio del cérvix, la cual, realizada por un colposcopista experimentado logra una sensibilidad de 96% y una especificidad de 48% (4). La prueba colposcópica consiste en la observación de la superficie del cérvix después de aplicar una solución de ácido acético diluido al 5% como agente de contraste. El patrón más importante a evaluar es el cambio de tonalidad del tejido ante la reacción con el ácido acético, fenómeno que es conocido como cambio aceto-blanco, ya que el epitelio con transformaciones celulares sugestivas de transformaciones anormales se torna de pálido a blanco intenso (figura 1). Este fenómeno ha sido utilizado desde hace más de 50 años como método de detección para dirigir la toma de biopsias, sin embargo, los fundamentos físico- químicos que producen este fenómeno aun no son entendidos en su totalidad (5) El principal problema de la colposcopía es la naturaleza subjetiva del análisis visual que realiza el experto colposcopista, lo que produce una alta variabilidad de diagnóstico entre expertos ya que no existen criterios Figura 1 Epitelio aceto-blanco. Imágenes adquiridas antes a) y después de la aplicación del ácido acético b). a) b) 2 ANTECEDENTES La posibilidad de almacenar digitalmente las imágenes ha permitido la evaluación de cambio de tonalidad en el tiempo que se presenta en cada parte del epitelio. El estudio de estos patrones temporales ha dado pauta a varios proyectos de investigación que 125 2.2 Hipótesis buscan correlacionar estos patrones temporales con el tipo de tejido observado(5, 7, 9). Particularmente estos trabajos han buscado encontrar las características relevantes que permitan hacer una discriminación del epitelio con la finalidad de poder categorizarlo de forma automática. En términos generales se puede apreciar que los esfuerzos por crear modelos computacionales que realicen un diagnóstico automático que facilite una mejor toma de la biopsia han sido estudios piloto que carecen de conclusiones definitivas. En su mayoría, estos trabajos reportan resultados con un reducido número de casos, carentes de una metodología bien definida que permita replicar los experimentos y menos aún que permitan disponer de los datos para poder analizar los resultados que se reportan. La hipótesis de este trabajo es que es posible caracterizar tanto el tejido normal como las lesiones cérvico uterinas a partir de la dinámica aceto-blanca utilizando criterios cuantitativos, tales como la magnitud de la reacción, velocidad de cambio y velocidad de retorno a su estado basal. 2.3 Objetivo general El objetivo del proyecto es caracterizar los patrones temporales que permitan detectar las lesiones precursoras de cáncer cérvico uterino para segmentar las imágenes colposcópicas. 3 METODOLOGÍA 2.1 Pregunta de Investigación Para llevar a cabo este proyecto se ha propuesto una metodología la cual está conformada por módulos. En la figura 2 se muestra el esquema con el flujo de datos y el vínculo entre los módulos: ¿Es posible identificar el epitelio normal y anormal del cérvix a partir de su patrón temporal característico ante la reacción con el ácido acético? Figura 2 Metodología propuesta en el proyecto. Adquisición de datos Adquisición del conocimiento Aprendizaje autómático Clasificador K-Nearest Neighbor (K-vecinos mas cercanos) Secuencias colposcópicas Segmentación de Imágenes t Registro de imágenes Extracción de series de tiempo Escala de grises con % de cambio 126 3.1 Adquisición de datos 3.1.1 Colposcopio Todas las imágenes se obtuvieron con una frecuencia de muestreo de 1 cuadro/segundo con una resolución de 352x240. Antes de la aplicación del ácido acético se adquirieron 10 imágenes, las cuales fueron tomadas como imágenes de base. Después de la aplicación del ácido acético se adquirieron 300 cuadros, dando en total 310 imágenes. Las imágenes abarcan un área aproximada del cérvix de 18mm.x13mm. Las imágenes de control obtenidas al inicio de cada prueba cumplen dos propósitos: el primero es el de tener una base de referencia para calcular el porcentaje de cambio de la señal, y el segundo es para estimar la cantidad de ruido en la señal. Cada cuadro es almacenado como una imagen independiente en un archivo de formato BMP. En este trabajo al conjunto de imágenes adquiridas le llamaremos secuencia colposcópica. El equipo que utilizado para la adquisición de las imágenes coloscópicas está compuesto por: Un colposcopio es un microscopio de campo estereoscópico, binocular, de baja resolución, con una fuente de iluminación potente de intensidad variable que ilumina el área bajo examen, en este caso el cuello uterino de la paciente (3). En nuestro caso se ha utilizado un colposcopio Vasconcelos modelo CP-M7 con una magnificación de 16 veces, la paciente a revisar se encuentra a una distancia aproximada de 20 cm. del objetivo del colposcopio. Al colposcopio se le ha añadido una cámara de video, la salida producida por la cámara de video se ha enviado hacia la tarjeta digitalizadora instalada en una computadora, en la figura 4 se muestra el colposcopio y la cámara de video utilizados. • • • • Figura 4 Colposcopio con cámara de video Colposcopio Cámara Digitalizador Iluminación blanca En la figura 3 se muestra como interactúan los dispositivos utilizados para adquirir las imágenes. Figura 3 Equipo utilizado para la adquisición de imágenes colposcópicas. 3.1.2 Cámara La cámara de video utilizada en el presente trabajo es marca Sony modelo SSC-DC50A a color (Figura 5). Figura 5 Cámara de video Sony SSC-DC50A Para obtener las imágenes de la prueba colposcópica se utilizó un colposcopio con una cámara de video montada en el cabezal del mismo. La salida producida por la cámara de video es enviada hacia la tarjeta digitalizadora la cual fue instalada en el equipo de cómputo. Con la finalidad de iluminar el colposcopio, se utilizó una fibra óptica que fue conectada al sistema de iluminación. 3.1.3 Digitalizador Para digitalizar las imágenes adquiridas durante la prueba colposcópica se ha utilizado la tarjeta digitalizadora Meteor II de la Marca Matrox (figura 6), la cual ha sido instalada en una computadora marca Hewlett Packard 127 3.2 Registro de imágenes modelo Workstation XW6000. La Meteor II es una tarjeta digitalizadora de cuadros análogos monocromáticos o a color, puede adquirir diferentes tipos de formatos de video utilizando su decodificador de video, acepta un disparador de entrada externo, puede transferir las imágenes adquiridas ya sea a la memoria de la computadora para su procesamiento o a un dispositivo de despliegue (Monitor). La tarjeta digitalizadora Meteor II tiene 4 Mbytes de memoria de transferencia de video para almacenar temporalmente los cuadros adquiridos. (10) Durante la prueba colposcópica la paciente se encuentra acostada en la mesa de exploración con las piernas sujetas en unos soportes llamados “pierneras” con los que se evitan los movimientos de rotación o escalamiento. Sin embargo, factores como la respiración, nerviosismo, movimientos musculares, o incluso el ritmo cardíaco de la propia paciente podrían producir movimiento de traslación, siendo necesario la estabilización de las secuencia de imágenes, lo cual se ha resuelto por medio de algoritmos de registro de imágenes(11). Debido a que las imágenes colposcópicas no contienen muchos detalles distintivos, un método basado en el área fue elegido. El representante clásico de los métodos basado en el área es la correlación-cruzada normalizada (CC) (11). Este método busca la coincidencia directa de las intensidades de la imagen, esta medida de similitud es calculada en cada par de ventanas desde las imágenes de entrada y de las imágenes de referencia en donde se busca su máximo (12). En este trabajo, la finalidad del registro de imágenes es el de corregir el movimiento que pudiera existir en la secuencia colposcópica. Esto se logra a partir de la selección de un área de interés (ROI – “Region of interest”). La ROI contiene patrones definidos durante toda la secuencia de imágenes, esta se añade en las imágenes (en forma de recuadro) como referencia para el registro de las imágenes (figura 8). Figura 6 Tarjeta Digitalizadora Matrox Meteor II 3.1.4 Iluminación El colposcopio cuenta con un sistema de iluminación denominado “luz fría” debido a que no permite el paso de radiación de calor. Este sistema de iluminación está compuesto básicamente por el generador (figura 7), el cual tiene un tablero de mandos que está comprendido por una lámpara piloto, un conector para el cable de fibra óptica y un interruptor con potenciómetro que permite regular la intensidad de la luz en el colposcopio, así como una tapa que da acceso a la lámpara de iluminación que por fábrica es de halógeno de 15V/150W Figura 8. Area de interés (ROI – “Region of Interest”) añadida en la imagen (en forma de recuadro) como referencia para el registro de las imágenes. Figura 7 Sistema de Iluminación Después del registro de las imágenes, estas se pasan a escala de grises. Al cambiar las secuencias colposcópicas a escalas de grises estas reducen su tamaño en un 50%. Logrando con esto disminuir el costo computacional en el manejo de las imágenes. 128 Este reescalamiento puede también ser visto como un filtro espacial pasa bajas que hará a las imágenes más homogéneas y con menos ruido. Con las imágenes alineadas, en escalas de grises y con menor resolución es posible obtener a partir del valor de intensidad de cada píxel series temporales las cuales caracterizan la respuesta aceto-blanca (13). El siguiente paso que se realiza al obtener las series de tiempo de las secuencias colposcópicas es elegir la forma de normalizarlas. 3.3.1 Porcentaje de cambio El porcentaje de cambio se ha utilizado para normalizar las series de tiempo (FDRA) extraídas de las secuencias colposcópicas. La normalización se llevó a cabo utilizando la siguiente ecuación: 3.3 Extracción de series de tiempo Partiendo de la hipótesis que el tejido normal o anormal de la superficie del cérvix puede ser caracterizado por la dinámica aceto-blanca (6), se han obtenido a partir de las imagenes colposcópicas series de tiempo, las cuales llamamos funciones dinámicas de respuesta aceto-blanca(FDRA). Para construir una serie de tiempo, contamos con datos que consisten de una secuencia de imágenes 2D que han sido adquiridas del reflejo de la superficie del cérvix. La secuencia fue obtenida durante un periodo de tiempo (antes y después de la aplicación del ácido acético). Las imágenes pueden ser representadas como una secuencia de t imágenes 2D It(x,y) con tiempo de adquisición t con t<t+1. La variación de tonalidad sobre el tiempo de cada píxel en la imagen proporciona una serie de tiempo. La secuencia de imágenes resultantes puede ser vista como un bloque de imágenes 3D I(x,y) definida en un dominio espacio-temporal (14). En la figura 9 se muestra que para obtener una Función Dinámica de Respuesta Aceto-blanca (FDRA) se busca en toda la secuencia de imágenes el cambio de intensidad de un píxel en las coordenadas (x,y), la búsqueda se inicia en la imágen0 y termina en la imágenn en donde Z es la cantidad total de las imágenes(tiempo). FDRA(t ) = FDRA(t ) − 1 , ∀t ∈ T FRDA(0 ) (2.1) Donde FRDA(t) es la serie de tiempo observada, FDRA(0) es la intensidad promedio de la serie de tiempo en su estado de control. En la figura 10 se muestra una Función Dinámica de Respuesta Aceto-blanca (FDRA) obtenida para un píxel en particular, en donde el eje de las ordenadas corresponde al porcentaje de cambio (variación en la intensidad de un píxel en el tiempo) y el eje de las abscisas representa la secuencia de imágenes (tiempo) (13). Figura 10 Función Dinámica de Respuesta Acetoblanca (FDRA). En la barra horizontal el color verde muestra el tiempo que se utilizó para adquirir imágenes que sirven como estado de control (10 segundos). En amarillo se muestra el momento en que se aplicó el ácido acético. En la zona de color rojo se encuentra la reacción del tejido al ácido acético. Figura 9 Gráfica que muestra las series de tiempo (FDRA) de 2 pixeles. Las coordenadas (x,y) representan un píxel en la imagen, Z representa el volumen de imágenes (tiempo), las series de tiempo (azul y rojo) son obtenidas a partir del cambio de intensidad de cada píxel en el tiempo. 129 3.4 Adquisición de conocimiento La adquisición del conocimiento es una etapa en el desarrollo de un sistema experto que se enfoca en extraer, transformar y transferir la experiencia de una fuente de conocimiento a un programa de computadora (15) . Tradicionalmente se utiliza la entrevista como técnica para extraer conocimiento, sin embargo, en este trabajo se ha implementado una herramienta computacional que le ha permitido al experto (ginecólogo con especialidad en colposcopía) recopilar su propio conocimiento (16). El objetivo de la herramienta de adquisición de conocimiento implementada (figura 11) es el de visualizar una serie de tiempo de la secuencia colposcópica (mediante la selección de un píxel en una imágen) y asignarle una clase de tejido mediante una etiqueta. Para cada pixel de una imagen colposcópica tiene asociada una serie de tiempo. Partiendo del hecho que una serie de tiempo caracteriza un tipo de tejido (sano o enfermo) (7), en la herramienta implementada se le permite al experto seleccionar un pixel a la vez para visualizar su serie de tiempo y posteriormente etiquetarla. La utilización de la herramienta de adquisición del conocimiento se lleva a cabo después de realizar el registro de imágenes. El conjunto de series de tiempo etiquetadas que sean obtenidas mediante esta herramienta será utilizado en el proceso de clasificación del aprendizaje automático. La herramienta ha sido desarrollada como una interfaz gráfica implementada en el lenguaje Matlab versión 7. Figura 11. Herramienta de adquisición del conocimiento (Katool- “Knowledge Acquisition Tool). 1) Visualizador de secuencias colposcópicas, 2) Barra seleccionadora de la imagen e indicador del número de imagen desplegada, 3) directorio en donde se encuentran las imágenes de la paciente, 4) Visualizador de respuesta aceto-blanca, 5) Visualizador de series de tiempo de puntos similares, 6) Series de tiempo, 7) Aprendizaje semi-supervisado, 8) Tipos de etiquetas, 9) Biopsias, 10) Utilerías. 130 3.5 Aprendizaje automático un espacio patrón de n-dimensiones. Cuando llega un ejemplo desconocido, el clasificador “K-vecinos más cercanos” busca en el espacio patrón los k ejemplos de entrenamiento que sean más cercanos al ejemplo desconocido. La cercanía está definida en términos de la distancia Euclidiana (19), aunque se puede utilizar otra métrica. En nuestro caso las series de tiempo son los ejemplos que entrarán en el modelo de clasificación. El enfoque que se ha utilizado para evaluar el desempeño del clasificador es “dejar uno afuera” (“leave one out”). El cual es un caso especial del método de “validación cruzada” (“cross validation”), con el que se asegura que las observaciones de un paciente (conjunto de prueba) no se encuentra en las observaciones del conjunto de entrenamiento. Las técnicas de aprendizaje automático permiten a un algoritmo “aprender” una tarea a partir de un conjunto de ejemplos. Un caso particular de este aprendizaje es la clasificación, la meta es inducir un modelo para poder predecir una clase dados los valores de los atributos (17) . Los métodos de aprendizaje basado en instancias (ejemplos) como el “K-vecinos más cercanos” (“KNearest Neighbor”) son algoritmos sencillos en donde el aprendizaje consiste en almacenar los ejemplos de entrenamiento. Cuando se quiere clasificar una nueva instancia, se extraen de memoria un conjunto de instancias similares que serán utilizadas para clasificar la nueva observación. Este tipo de aprendizaje también se conoce como “lazy learning” (“aprendizaje perezoso”) o “memory based learning” (“aprendizaje basado en memoria”) donde los datos de entrenamiento se procesan solo hasta que se requiere, (cuando se quiere clasificar un nuevo ejemplo) y la relevancia de los datos se mide en función de una medida de distancia (18). En el algoritmo “K-vecinos mas cercanos” el conjunto de ejemplos de entrenamiento está descrito por un espacio de atributos de n-dimensiones. De esta manera, todos los ejemplos de entrenamiento son almacenados en 3.6 Segmentación de Imágenes Uno de los resultados que se obtuvieron en este proyecto fue implementación de una herramienta que es capaz de emitir un diagnóstico segmentando imágenes colposcópicas mediante colores que representan los diferentes tipos de lesiones (figura 12). Esto se lleva a cabo a partir del resultado obtenido de aplicar el algoritmo de aprendizaje al conocimiento adquirido de parte del experto. Figura 12. Herramienta de segmentación de imágenes llamada Sistema experto en colposcopía asistido por computadora, por sus siglas en ingles, Caces (Computer Aided Colposcopy Expert System) 131 4 RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA. Se adquirieron 34 casos (secuencias colposcópicas) de pacientes con edades entre 25 a 45 años. De las observaciones se obtuvieron las siguientes muestras: 25 Normales (11 tejido normal, 7 metaplasia inmadura, 5 metaplasia madura, 2 Ectopia ), 21 Anormales (19 lesión bajo grado, 2 lesión alto grado). El número de observaciones supera al de pacientes debido a que en algunos casos se tomó más de una observación de un mismo paciente. De las secuencias adquiridas se extrajeron series de tiempo representadas en escala de grises con estandarizadas con porcentaje de cambio. Los resultados mostraron porcentajes de especificidad superiores a los reportados en la bibliografía para la colposcopía realizada por un experto humano (59.78%), en cuanto a la sensibilidad se logró un índice promedio de 75.01% [7]. 1. Antonio Tapia FG, Octavio Gómez. Salud:México 2001-2005. Información estratégica por entidad federativa. Secretaría de Salud 2006;Primera Edición 2006. 2. Burghardt Erich, Pickel Hellmuth, Frank G. Primary care Colposcopy. New Year; 2004. 3. 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Image and vision computing 2004. 5 DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en el presente trabajo de investigación fueron comparados con aquellos que se han reportado en investigaciones enfocadas en torno a la caracterización de lesiones malignas y pre-malignas a partir del análisis de imágenes colposcópicas (58, 20). En el trabajo realizado por Schmid se reporta como mayor valor alcanzado para la especificidad 88%. Mientras que en nuestro trabajo hemos obtenido como máximo 59.78% en el mismo rubro. Es importante aclarar que el trabajo de Schmid, fue reportado solamente como un borrador de reporte técnico, que no se publicó en alguna revista o congreso, y que a juicio propio del autor, representa un estudio piloto. En sus experimentos se consideraron 50 pacientes. De las observaciones se obtuvo el siguiente número de casos: 26 anormales (CIN II-III), 32 normales (16 CIN I, 11 sanas y 5 metaplasias). Esto hace una gran diferencia con nuestro enfoque ya que en su trabajo la categoría CIN I se considera normal, lo que simplifica la discriminación pero dificulta la interpretación de la especificidad. En el presente trabajo se adquirieron 34 secuencias colposcópicas de pacientes de un total de 50 que se han considerado en el proyecto. Los resultados obtenidos hasta ahora son prometedores, pero se espera que sean concluyentes al incluir un mayor número de casos en proceso. 132 13. Hernández-Galicia E. Propuesta Metodológica para la detección de lesiones precursoras de cáncer cérvico uterino utilizando funciones dinámicas de respuesta acetoblanca (Tesis de Maestría). 2006. 14. Acosta-Mesa H.G., Cruz-Ramírez. N., Llaguno Roque J.L., Hernández- Jiménez R., B.E. C-R. Assessing Cervical Cancer Lesion Predictability Using AcetoWhite Temporal Patterns with Bayesian Network Learning. Avances en la ciencia de la Computación VII Encuentro Internacional de Computación ENC’06 2006. 15. 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