iv. resultados

Producción de enzimas pectinasas por actinomycetos en cultivo
sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo
Orbegoso, Alexis Germán
IV. RESULTADOS
4.1. EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS pH,
TEMPERATURA Y AIREACIÓN-AGITACIÓN EN UN MEDIO SINTÉTICO,
PARA LA PRODUCCIÓN DE PECTINASAS.
4.1.1. DETERMINACIÓN DEL pH ÓPTIMO
FIGURA 1. EFECTO DEL pH SOBRE EL CRECIMIENTO DEL
MICROORGANISMO
Densidad óptica a 600 nm
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
5.0
7.0
8.5
pH
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FIGURA 2. CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO A DIFERENTES pH
Tubo # (1
2
3 )
(4
pH = 7.0
5
6)
(7
8
pH = 8.5
9
10)
pH = 5.0
4.1.2. DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA
La evaluación del crecimiento del microorganismo vs. temperatura en
caldo TSB , determinó que la temperatura óptima fue de 37 ºC, luego de 72
horas de incubación (Figura 3).
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FIGURA 3. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO
Densidad óptica a 600
nm
DEL MICROORGANISMO
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
28
37
45
Temperatura ( ºC )
4.1.3. DETERMINACIÓN DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN
En experimentos previos se determinó que la mayor concentración de
biomasa ( D.O. 0.65) se obtuvo en un medio control con aireación-agitación a
300 rpm. Estos resultados, presentaron la necesidad de fijar valores de
agitación 300 rpm y aireación 0.5 vvm, para el proceso de biotransformación
sobre medio natural. (Figura 4).
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FIGURA 4. EFECTO DE LA AIREACIÓN-AGITACIÓN EN EL CRECIMIENTO
Densidad óptica a 600
nm
DEL MICROORGANISMO
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
SIN
CON
AIREACION-AGITACION
4.2.
CRECIMIENTO DEL
MICROORGANISMO
Y PRODUCCIÓN
DE
PECTINASAS.
En la Figura 5, se observa que la máxima producción de pectinasas es
alcanzada en la etapa estacionaria del crecimiento microbiano, es decir, a las
64 horas.
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FIGURA 5. CURVA DE CRECIMIENTO DEL MICROORGANISMO Y
10.00
0.90
9.50
0.80
9.00
0.70
Log (ufc/mL)
8.50
0.60
8.00
0.50
7.50
0.40
7.00
0.30
6.50
96
10
4
11
2
12
0
80
88
0.00
64
72
5.00
48
56
0.10
32
40
5.50
8
16
24
0.20
0
6.00
ACT. PECTINASA UI/mL
PRODUCCIÓN DE PECTINASAS EN MEDIO TS- PECTINA 1%
Tiempo (horas)
Log N° DE (ufc/ml).
ACTIVIDAD PECTINASA ( U.I/ml )
4.3. PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN
4.3.1. ANÁLISIS Y SELECCIÓN DE NUTRIENTES MÁS INFLUYENTES EN
LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS PECTINASAS.
El análisis del diseño de Plackett Burman demostró que los nutrientes
que más influyeron sobre la producción de
pectinasas fueron: Cáscara de
naranja , (NH4)2SO4 y FeSO4*7H2O, seleccionándose éstos, para un análisis
posterior de optimización ( ANEXO K ).
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sumergido utilizando pectina y cáscara de naranja. Arroyo
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4.3.2.OPTIMIZACIÓN DE LOS 3 NUTRIENTES SELECCIONADOS EN LA
ETAPA ANTERIOR.
Mediante la optimización de los 3 nutrientes más influyentes, utilizando
el diseño de Box Benhken, obtuvimos los siguientes resultados:
Cáscara de naranja ( 16.7 g/ L ), (NH4)2SO4 (5 g/ L ), FeSO4*7H2O (0.013 g/ L )
y una producción máxima predictiva de pectinasas de 0.71 U.I./mL (ANEXOS
L, L.1 y L.2).
4.3.3. BIOTRANSFORMACIÓN FINAL EN BIORREACTOR
La cinética microbiana, llevada a cabo con los resultados obtenidos del
diseño de Box Benhken, maximizó la respuesta entre las 60 y 80 horas, tiempo
en el que se logró una producción de 0.65 U.I./mL de la enzima.
CUADRO 6.
CONCENTRACIONES ÓPTIMAS A TRABAJAR EN BIORREACTOR
VARIABLES
VALORES
X1 = Cáscara de naranja
ÓPTIMOS
x2
X4
X3
X5
X6
X7
X8
VALORES
MEDIOS
= (NH4)2 SO4
= FeSO4.7H2O
= (NH2)2CO
= CaCl2
= NaCl
= MgSO4
= Na2CO3
CONCENTRACIÓN (g / L)
16.700
5.000
0.013
2.850
0.051
3.000
0.600
2.400
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Volumen del medio experimental
: 1000 mL
Concentración celular del inóculo
: 3 x 10 u.f.c / mL
Tiempo de biotransformación
: 120 horas
Volumen de inóculo
: 100 mL
Temperatura
: 37 ºC
Aireación
: 0.5 vvm.
Agitación
: 300 rpm.
pH
: 7.0
9
En el resultado del crecimiento de la población microbiana que se
muestra en la Figura 6, podemos notar que éste obtuvo un máximo valor entre
las 60 y 80 horas de transcurrido el proceso de biotransformación.
En la misma figura, se muestra la producción de pectinasas, durante el
proceso de biotransformación,
registrándose una alta
producción de 0.65
U.I./mL a las 72 horas, valor muy cercano a lo pronosticado en las Curvas de
Superficie Respuesta 0.71 U.I./mL (ANEXO L.2).
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FIGURA 6. CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE
PECTINASAS POR Actinomyces naeslundii EN UN BIORREACTOR DE 1
0.70
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
Act. pectinasa (UI/mL)
10.00
9.50
9.00
8.50
8.00
7.50
7.00
6.50
6.00
5.50
5.00
11
2
96
80
64
48
32
0.00
16
0
Log (ufc/mL)
LITRO
Tiempo (horas)
Log N° DE ufc/mL.
ACTIVIDAD PECTINASA ( U.I/mL )
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