Reproducción Asistida Documento de Aplicación

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TÉCNICAS
Cada una de las causas que alteran el proceso reproductivo tiene un tratamiento concreto. El
aplicado en cada ocasión depende de los resultados de una serie de estudios previos de cada
paciente. En función de estos resultados, se dispone en la actualidad de diversos tratamientos de
mayor o menor complejidad.
La actuación en muchas ocasiones, se limita a la prescripción de ciertos fármacos o
intervenciones quirúrgicas sencillas, pero en otras es necesaria la aplicación de alguna Técnica
de Reproducción Asistida (TRA).
Estas técnicas existen gracias a los avances técnicos que se han producido en este campo en los
últimos 40 años. Han nacido, crecido y evolucionado de la mano de las nuevas tecnologías, con
la visión y misión de intentar solventar el amplio abanico de causas que llevan a la infertilidad a
una pareja. Gracias a ellas, las posibilidades de éxito en su tratamiento, han crecido muy
considerablemente.
Los procedimientos seguidos con este tipo de técnicas se llevan a cabo en laboratorios
especializados, donde los óvulos y/o espermatozoides son tratados para mejorar su capacidad
fecundante y los embriones obtenidos, se cultivan para mejorar su capacidad de implantación.
Involucran en mayor o menor medida llevar a cabo los siguientes procesos:
•
Evaluación, obtención, preparación y conservación
(espermatozoides y óvulos) que requiera la técnica a seguir.
de
los
gametos
•
Facilitación de la fecundación del ovocito por el espermatozoide (in vivo o in
vitro).
•
Transferencia de gametos o embriones al interior de la paciente.
•
En algunos casos, el Diagnóstico Genético Preimplantacional de los embriones
TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA
Todas las técnicas de reproducción asistida comparten alguno de sus pasos. Sólo difieren en el
método de laboratorio a utilizar y en el momento y lugar de la transferencia de gametos y o
embriones.
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INSEMINACIÓN ARTIFICIAL
La inseminación artificial (IA), se define como el depósito instrumental (no natural) de
espermatozoides en el tracto reproductivo de la mujer, dándole así un acceso directo a las
trompas de Falopio, en un momento próximo a la ovulación, con la finalidad de conseguir la
gestación. Cuando la transferencia se realiza directamente en el útero, se denomina
inseminación intrauterina.
Para poder desarrollarla con éxito es indispensable que las trompas de Falopio estén en buen
estado, y que después de preparar el semen para inseminar, haya un mínimo de 3 a 5 millones de
espermatozoides móviles.
La técnica de IA más utilizada es la intrauterina, y para aumentar su eficacia es necesario
asociarla a la inducción de la ovulación y técnicas de capacitación espermática.
Procedimiento
En un proceso de IA, se siguen generalmente las siguientes etapas:
1. La estimulación del ovario.
La inseminación puede realizarse durante el ciclo natural de la mujer, aprovechando el momento
de ovulación natural, o bien se puede realizar una estimulación de los ovarios mediante
hormonas inductoras de la ovulación. Nos permite la maduración de varios óvulos en un solo
ciclo y aumentar de esta manera la eficacia de la técnica.
ESTIMULACIÓN OVÁRICA
El tener un mayor número de óvulos disponibles para la fertilización aumenta las
probabilidades de alcanzar el embarazo. Dado que el cuerpo de una mujer libera
normalmente sólo un óvulo maduro por mes, se utilizan las medicaciones hormonales
para estimular los ovarios y desarrollar más folículos ováricos. Los folículos son sacos
llenos de líquido en los que maduran los óvulos.
La estimulación de la ovulación para conseguir el desarrollo múltiple de folículos se
realiza habitualmente utilizando gonadotropinas: FSH (hormona folículo estimulante) y
LH (hormona luteinizante).
Se producen en la hipófisis, y actúan sobre el crecimiento y desarrollo de los folículos
ováricos, y la síntesis y secreción de hormonas ováricas clave como estrógenos y
progesterona. Ambas son necesarias para el desarrollo de un folículo maduro, que
contenga un óvulo capaz de ser fertilizado.
La FSH es la principal hormona responsable del desarrollo de los folículos, mientras que
la LH es responsable de la maduración final y posterior ovulación del óvulo y la
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principal hormona involucrada en producir e iniciar la fase lútea. El cuerpo lúteo, da
soporte a las primeras etapas del embarazo.
El tratamiento se inicia en los cinco primeros días del ciclo. En primer lugar se confirma
mediante ecografía que los ovarios se encuentran en situación basal, que no haya
folículos mayores de 10 mm.
Se administra FSH (hormona folículo estimulante) hasta conseguir la maduración de
uno o varios óvulos. Existen distintas pautas de dosificación de FSH que se ajustan a
cada paciente. Una vez iniciado el tratamiento, se realizan controles ecográficos
sistemáticos, para monitorizar el desarrollo folicular y su número, y en ocasiones
también se mide el estradiol en sangre. Esta hormona la producen las células de la
granulosa de los folículos ováricos y da una idea de su desarrollo.
El tamaño del folículo es un indicativo del estado de maduración del óvulo. Cuando 2 ó
3 folículos han llegado al tamaño deseado (entre 18 y 22 mm de diámetro), se induce la
ovulación. La hormona LH normalmente es muy difícil de purificar. A falta de su
versión recombinante se utiliza la HCG (hormona gonadotrópica coriónica), que es
responsable de los últimos estadios de maduración del óvulo y hace la función del pico
espontáneo de LH, para desencadenar la ovulación. Ésta se produce entre 36 y 40 horas
después de la administración de la HCG.
El tratamiento de estimulación ovárica, entraña asumir ciertos riesgos: el embarazo
múltiple en la inseminación artificial (15-20% de los casos) y el síndrome de
hiperestimulación ovárica. Ambos pueden evitarse controlando la inducción de la
ovulación.
2. La preparación del semen.
La realización de la IA, exige la manipulación del eyaculado en el laboratorio para maximizar su
capacidad de fertilización: un lavado (para separar los espermatozoides del plasma seminal y la
selección de los espermatozoides con mayor movilidad) y a su vez la concentración del semen
en un pequeño volumen. Estas técnicas se conocen como capacitación espermática o
preparación seminal.
CAPACITACIÓN ESPERMÁTICA
La capacitación fisiológica de los espermatozoides consiste en el desarrollo funcional
que sufre el espermatozoide, una serie de cambios o modificaciones estructurales y
funcionales que empieza tras entrar en contacto con el tracto reproductivo femenino. Este
proceso de activación dura alrededor de 7 horas, y provee al espermatozoide de las
condiciones adecuadas para que se efectúe la fertilización.
Mientras el espermatozoide está en el sistema reproductor masculino, la capacitación
está inhibida por sustancias presentes en el plasma seminal
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Así pues, para los procesos de IA o FIV es necesario “reproducir” previamente esta
capacitación “in vitro” para que se produzca la fertilización del óvulo. Los primeros en
reportar que el espermatozoide maduro puede ser capacitado “in vitro” fueron
Yanagimachi y Chang en 1963.
A lo largo de estos años se han desarrollado diferentes tipos de técnicas de selección
espermática. Son métodos para limpiar el semen de su plasma seminal (y de ese modo
las sustancias inhibidoras de la capacitación) y recuperar nos espermatozoides de mejor
calidad fecundante cuando se transfieren al interior del útero (en el caso de la IA y GIFT)
ó a una placa de Petri junto al óvulo (para la FIV).
Consiste en una serie de lavados que eliminan los restos celulares, bacterias, leucocitos,
espermatozoides muertos y lentos, secreciones seminales del eyaculado, y a su vez
permiten concentrar y mejorar el semen seleccionando la población de espermatozoides
de mejor calidad, más fértiles.
Existen muchas técnicas, se pueden clasificar en varios grupos:
*Métodos de migración / Movilidad del espermatozoide
Swim-up: en este método se efectúa inicialmente uno o dos lavados del eyaculado (con
Ham F-10), se decanta o centrífuga (300-600g), y se descarta el sobrenadante. Al pellet
del fondo del tubo, donde está todo el concentrado de espermatozoides, se le añade de
0.3 a 0.5 ml del medio de cultivo procurando que resbale por la pared del tubo, para
evitar que se formen burbujas. El tubo, inclinado unos 45º, se deja incubar durante unos
45 minutos-1hora a 37°C / 5% CO2. Los espermatozoides capacitados “nadan” hacia
arriba (swim-up) hacia el sobrenadante, que es la fracción que se recupera para la IA o la
FIV. La desventaja de este método es la baja recuperación espermática.
Self-Migration: es una variante del anterior, fue descrito por Wikland. La separación de
los espermatozoides es por una migración espermática. Se coloca el semen en el extremo
ciego de una pipeta Pasteur o en tubos de centrífuga y se añade una capa del medio
cultivo sin que se mezclen. Éste, tras incubación a 37º / 5% CO2, 45min-1hora, va a
contener los espermatozoides de mejor calidad que han migrado desde el semen. La
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técnica tiene mejores porcentajes de recuperación de espermatozoides móviles que el
swim-up convencional, pero no aumenta significativamente las tasas de embarazo.
Swim-down: este procedimiento es similar al Swim-up, pero en este caso se coloca
primero el medio de cultivo y después se deja resbalar el semen por la pared del tubo
para que quede arriba. Se incuba a 37º / 5% CO2 y se descarta el sobrenadante, ya que en
este caso los espermatozoides más aptos van a nadar hacia la parte de abajo, donde está
el medio de cultivo.
Migración sedimentación: Esta técnica principalmente, consiste en un proceso de swimup combinado con un paso de sedimentación, y aprovecha la capacidad de los
espermatozoides para desplazarse.
Se utilizan unos tubos especiales con dos cámaras concéntricas, la central cónica de
mayor profundidad, y una externa, concéntrica a la anterior, a modo de galería.
El eyaculado se deja licuar 30-60 min a temperatura ambiente. El tubo cónico interior del
la cámara de migración y la cámara que lo rodea se llena con medio de cultivo. Se añade
con cuidado el semen al fondo del tubo exterior, y se deja incubar el conjunto a 37ºC /
5% CO2. Los espermatozoides nadan desde la parte superior, de la galería al medio de
cultivo sobrenadante, y sedimentan en la parte cónica inferior tras un tiempo de
incubación de aproximadamente 1 hora. A continuación se recoge el esperma del fondo
del tubo cónico interior que es el que se utilizará para las técnicas de reproducción
asistida.
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No implica ningún paso de centrifugación, con lo que no se daña la cola del
espermatozoide. Lo que se consigue es un alto porcentaje de espermatozoides móviles
con un aumento en el ratio de fertilización.
•
Métodos basados en filtración
Filtrado en fibra de vidrio: Se basa en la capacidad del material para retener los
espermatozoides muertos o con defectos, solo los móviles pueden pasar a través de la
fibra y no quedarse atrapados durante el proceso de filtración.
Se coloca una pequeña cantidad de fibra de vidrio en el interior de una jeringuilla, y se
lava con el medio de cultivo. Por esta columna, se filtra por gravedad el semen fresco o
lavado, y se lava con un pequeño volumen de medio de cultivo para recuperar los que
están en buenas condiciones.
Filtración en columnas de Sephadex: Son unas columnas especiales para la separación
de las fracciones móviles de los espermatozoides. Existen bajo diferentes nombres
comerciales. Se basan en un filtro fisiológicamente inerte, la matriz es a base de un
derivado polisacárido. Tras hidratar estos filtros, las bolitas de la matriz del soporte,
adquieren una estructura con rugosidades en la superficie que ayudan a atrapar los
espermatozoides muertos o de baja motilidad. Hay diferentes protocolos de uso, algunos
requieren realizar previamente una centrifugación del semen en un gradiente de Percoll
40% y tras lavar y diluir la fracción de espermatozoides se filtra en la columna, otros
directamente aplican la muestra de semen en la columna de filtrado una vez lavado y
diluido en el medio de cultivo.
El filtrado se recoge se centrifuga y el pellet obtenido se diluye en medio de cultivo para
su posterior utilización.
•
Centrifugación por gradientes
Este método permite separar espermatozoides por centrifugación a través de un gradiente
de Percoll, partículas de sílice coloidal cubiertas con polivinilpirrolidona. Esta técnica
aprovecha la diferente densidad de los espermatozoides de modo que aquellos que
presentan mejor motilidad y morfología, más densos, irán al fondo del tubo tras la
centrifugación y los aísla además de otros constituyentes, que se acumulan en el
gradiente, en su densidad apropiada.
Se prepara un stock de Percoll isotónico y se hacen diluciones para obtener los diferentes
gradientes, normalmente 45/90%. En un tubo cónico se depositan consecutivamente e
intentando mantener la interfase, la solución al 90%, al 45% y finalmente la muestra de
semen. Tras centrifugar la muestra (300g, 15 o 20 minutos) se recupera el pellet del
fondo del tubo que contiene los espermatozoides, que finalmente se lava por dos veces y
se resuspende en medio de cultivo para su utilización.
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Sperm preparation for ART
La muestra espermática ya preparada se conserva en tuvo cerrado a temperatura
ambiente hasta ser utilizada.
3. La inseminación
Una vez capacitada la muestra se procede a introducir mediante una cánula los espermatozoides
dentro del cuello uterino. Se realiza en modo ambulatorio, en las consultas, no es preciso
administrar anestesia.
La IA se debe programar de manera que el esperma esté presente en el momento en que produce
la ovulación y se pueda producir la fecundación en las trompas de Falopio. La inseminación se
suele realizar durante dos días seguidos tras haber inducido la ovulación.
4. Tratamientos de soporte
Tras las inseminaciones se administra a la paciente un tratamiento para favorecer la
implantación del embrión en el útero.
La HCG (hormona gonadotrópica coriónica), además de desencadenar la ovulación, mantiene al
cuerpo lúteo produciendo progesterona, hormona que a su vez prepara la mucosa del endometrio
para que el embrión se pueda implantar y para que se produzcan los nutrientes que alimentan al
embrión los dos primeros meses del embarazo. Con este objetivo se administra la HCG o bien
progesterona en dosis repetidas durante los 10 días siguientes a la ovulación.
Indicaciones
Está recomendado para tratar varias causas de infertilidad
Puede realizarse con el semen de la pareja (I.A.C.: inseminación artificial conyugal) o bien con
semen de donante anónimo (I.A.D.: inseminación artificial con semen de un donante)
La IAC se realiza en casos de esterilidad por sémenes patológicos, trastornos en el moco
cervical, en esterilidad de origen inmunológico o desconocido...
En casos de esterilidad masculina, especialmente cuando existe un problema con el esperma,
como bajo recuento o motilidad (movimiento lento) o cuando existe incapacidad anatómica o
psicológica de eyacular en la vagina (impotencia, eyaculación precoz, u otras causas médicas).
En casos de esterilidad femenina, por existencia de anticuerpos contra los espermatozoides en el
mucus cervical de la mujer, endometriosis, disfunciones en la ovulación...
Esterilidad de origen inmunológico, por presencia de anticuerpos antiespermáticos.
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La mayor parte de los casos de esterilidad masculina tienen una posible resolución. Aún así hay
ocasiones en que es necesario recurrir a un banco de semen.
BANCO DE SEMEN
Es un espacio donde de conservan las muestras de semen criopreservadas en nitrógeno
líquido.
Estas muestras proceden tanto de pacientes de las clínicas de reproducción asistida como
de donantes anónimos.
Es habitual la congelación de muestras en casos de:
Pacientes que inician un tratamiento de reproducción asistida, por si es necesario recurrir
a ellas en caso de que no pueda estar presente cuando se le requiera, o exista algún
problema con las muestras que precise un tratamiento previo a su utilización.
Previos a vasectomías, quimio o radioterapia.
Tratarse de muestras de obtención dificultosa: biopsias testiculares, aspiraciones de
epidídimo, dificultades en la obtención de eyaculado.
Donaciones anónimas, para usarse en tratamientos de reproducción asistida.
El procesamiento de la muestra se realiza con nitrógeno líquido (-196 ºC) y un medio
crioprotector que garantiza la viabilidad de los espermatozoides una vez descongelados.
Habitualmente, los donantes son sometidos a una serie de pruebas para garantizar la
calidad del semen, además de un estudio de los antecedentes familiares de enfermedades
hereditarias o congénitas. Se hacen en muchos centros estudios citogenéticos, que
incluyen un estudio de cariotipo y análisis cromosómicos.
En estos casos se controlan de forma especial, las enfermedades de transmisión sexual
(presencia de antígenos de Hepatitis B o anticuerpos VIH, Hepatitis C o herpes, sífilis,
gonorrea, CMV...)
Normalmente se mantienen en cuarentena 6 meses antes de su utilización.
La IAD está indicada en casos de fallo testicular severo, con ausencia de espermatozoides tanto
en eyaculado como directamente en testículo o epidídimo, o de un semen con una tasa muy
elevada de DNA fragmentado. También en aquellas ocasiones en que haya la posibilidad de
transmisión de algún trastorno hereditario genético o alguna enfermedad contagiosa del
cónyuge, y las inseminaciones en el caso de mujeres sin pareja.
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Hasta hace poco tiempo, había que recurrir a la IAC en casos en que la pareja fuera portadora de
la Hepatitis C o del VIH. Actualmente ya existen técnicas que permiten limpiar este semen de
partículas virales y que pueda ser utilizado sin peligro de infección para la mujer o a la
descendencia futura.
PROTOCOLOS PARA SEROPOSITIVOS Y PORTADORES DE LA HEPATITIS C
En estos casos el objetivo de la técnica consiste en eliminar las partículas virales (VIH o
Hepatitis C) que existen en el semen. Esto se consigue con una combinación de SwimUp y Gradientes de densidad.
Una vez capacitada, la mitad de la muestra se analiza mediante técnicas de Biología
Molecular, para determinar la presencia de DNA y/o RNA virales, que hayan podido
eludir el lavado y el resto se congela para utilizarse posteriormente.
Una vez comprobada la ausencia de virus por PCR, la alícuota congelada, se utiliza
normalmente en la técnica de reproducción asistida que corresponda, FIV o IA
Según la legislación vigente, las parejas en que el varón es seropositivo, necesitan formar
parte de un ensayo clínico con un protocolo previamente aprobado por las autoridades
sanitarias, para poder someterse a tratamientos de reproducción asistida.
FECUNDACION IN VITRO
La fecundación o fertilización in vitro (FIV) es uno de los métodos más utilizados entre las
técnicas de reproducción asistida y una de las mejores opciones para el tratamiento de la
infertilidad.
Básicamente consiste en reproducir el proceso de fecundación in vivo del óvulo por el
espermatozoide, fuera de su lugar natural, en un medio artificial como es el laboratorio de
reproducción asistida.
De esta manera se pretende favorecer la fecundación cuando existe algún problema que la
dificulta y conseguir lo que en condiciones espontáneas no se hubiera producido o al menos
hubiera sido muy difícil. Normalmente esta técnica es un punto convergente donde se llega
después de no haber obtenido éxito reproductivo con técnicas más sencillas
La unión de los gametos se realiza en el laboratorio, fuera del cuerpo de la mujer, así que en
primer lugar son necesarias técnicas para obtener, preparar adecuadamente y mantener ovocitos
y espermatozoides viables para la fecundación. Posteriormente técnicas para que se lleve a cabo
la fertilización de los óvulos in vitro y así obtener uno o varios embriones. Finalmente aquellos
procedimientos que permitan y faciliten la transferencia de estos embriones a la cavidad uterina
y su posterior implantación, o bien su congelación / descongelación para su uso posterior.
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Procedimiento
La secuencia de acontecimientos en la FIV sigue las siguientes etapas: La supresión hipofisiaria
seguida de la estimulación ovárica, una punción folicular con aspiración de los ovocitos, la
fecundación en el laboratorio con la muestra de semen y el mantenimiento del cultivo
embrionario y finalmente la transferencia embrionaria intrauterina o congelación.
Respecto a la estrategia de fecundación en si hay dos posibilidades a seguir:
•
•
Fecundación in vitro convencional. La fecundación se produce de forma natural, los
espermatozoides por sus propios medios han de reconocer al ovocito y penetrar en su
citoplasma.
Microinyección Intracitoplasmática de Espermatozoides o ICSI. La fecundación se
produce alojando el espermatozoide en el ovocito mediante una microinyección. Esta
técnica requiere alguna actuación especial en la preparación de los ovocitos.
1. Estimulación ovárica
El objetivo es conseguir el mayor número de ovocitos posibles en un solo ciclo de la mujer.
Cuantos más ovocitos tengamos, mayor será la posibilidad de obtener fertilización y por tanto
más de embriones transferidos (no todos los ovocitos obtenidos llegan a embriones aptos para la
transferirse), y una mayor probabilidad de embarazo.
La estimulación ovárica es básicamente la misma que lleva a cabo en los tratamientos de IA y en
este caso suele ir acompañada de una supresión hipofisiaria.
SUPRESIÓN HIPOFISIARIA.
Se lleva a cabo mediante la administración un análogo de la GnRH. Esta hormona, al ser
administrada durante un tiempo prolongado, produce el bloqueo reversible de la
producción de la FSH y LH endógenas, segregadas por la hipófisis, que controlan la
ovulación. De esta manera se permite el control del ciclo con la administración
farmacológica de estas hormonas y se evita la posible interferencia o avance en la
ovulación que pudieran provocar las hormonas endógenas.
2. Recuperación de los ovocitos
Entre 36-48 horas después de la administración de la HCG (hormona responsable de la
maduración final del ovocito, y desencadenante de la ovulación), se procede a recuperar los
ovocitos ya maduros, justo antes de su liberación.
La recuperación de los óvulos se efectúa mediante una punción tras la identificación de los
folículos maduros. Se realiza bajo sedación por vía transvaginal y guiada con ecografía,
utilizando una guía con una aguja especial, que punciona y aspira el fluido que se encuentra en
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el interior del folículo. Esta operación se repite con todos los folículos aunque no
necesariamente se recuperan óvulos de todos.
Después de la punción los fluidos foliculares se observan al microscopio para identificar los
óvulos y clasificarlos según su aspecto, morfología y grado de madurez.
Según su estado madurativo se pueden identificar como:
− Metafase II o maduros, aptos para la fecundación, que se identifican porque ya han
extraído el primer corpúsculo polar.
− Metafase I, inmaduros aún, pero que pueden madurar en pocas horas y expulsar el
corpúsculo polar.
− Finalmente, las vesículas germinales, que son ovocitos inmaduros, que no pueden
fecundar a menos que maduren a Metafase II.
− También se pueden identificar ovocitos atrésicos o postmaduros, que tampoco son aptos
para la fecundación.
En la FIV convencional, tras este paso los ovocitos se lavan, se transfieren a medio de cultivo y
se mantienen en el incubador de CO2 al 5% y a 37ºC hasta el momento de la inseminación.
En el caso de la ICSI, tras la aspiración folicular los ovocitos son denudados: se les quitan las
células de la granulosa que rodean su envoltorio (la zona pelúcida). Se tiene que limpiar de
células para poder realizar la microinyección. Es un proceso químico / mecánico en que puede
perderse algún ovocito.
Ambas técnicas, (FIV clásica e ICSI) sólo se pueden realizar en los ovocitos que presenten una
maduración correcta, que se encuentren en estadío de Metafase II, momento en que están en un
estado óptimo para ser fecundados. Estos ovocitos maduros o preovulatorios son los únicos que
tienen capacidad de fecundar y dar lugar a embriones. Cuando existen dificultades para la
obtención de suficientes ovocitos maduros para la FIV o ICSI, se puede recurrir a un programa
de donación de ovocitos, o bien en algunos casos puede aplicarse una técnica novedosa, la
maduración in vitro de ovocitos (MIV). En Junio de 2006 ha nacido en España el primer bebe a
partir de un ovocito madurado in Vitro.
MADURACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS (MIV)
La maduración in vitro (MIV) de ovocitos consiste en conseguir la maduración final del
ovocito hasta el estadio de Metafase II, in Vitro, fuera del folículo ovárico.
La punción-aspiración de ovocitos inmaduros y su posterior maduración in vitro, abre
una puerta a la FIV a pacientes, que por sensibilidad al tratamiento de estimulación
desarrollen síndrome de hiperestimulación ovárica o por problemas de maduración de
los óvulos en los ovarios, no puedan tener óvulos viables para fecundar o no los tengan
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en numero suficiente para una FIV-TE efectiva. Es el caso del síndrome de ovario
poliquístico (PCOS).
Lo atractivo de esta técnica es que no hay tratamientos hormonales, con lo que el menor
coste, agresividad y duración del simplifican la FIV convencional. En contrapunto las
tasas de embarazo disminuyen, y de momento no se ha conseguido una eficacia
comparable a la FIV con estimulación, aunque existen estudios que demuestran el éxito
de la técnica: Obstetric outcome of patients with polycystic ovary syndrome treated by in
vitro maturation and in vitro fertilization-embryo transfer.
DONACIÓN DE OVOCITOS
Las donaciones de ovocitos proceden normalmente de mujeres menores de 30 años o de
mujeres jóvenes en proceso de alguna técnica de reproducción asistida, que tienen
ovocitos excedentes en su tratamiento. Son sometidas a estudios cuidadosos para
descartar enfermedades, infecciones, y trastornos genéticos...
El proceso busca llevar a cabo una fecundación en la que el gameto femenino es
aportado por una mujer diferente a la que recibirá el embrión resultante.
Para que esto sea posible los ciclos ováricos de la donante y la receptora deben estar
sincronizados.
La receptora precisa recibir un tratamiento que prepare el recubrimiento uterino para
recibir un embrión. Se ha de desarrollar una mucosa endometrial capaz de implantar los
embriones y permitir su desarrollo. Se consigue mediante la administración de
estrógenos y progesterona. En las pacientes que tienen una función ovárica normal es
aconsejable administrar un análogo de la GnRH, que permite el control del ciclo
evitando la posible interferencia de las hormonas endógenas.
La donante recibe inducción del desarrollo folicular y recogida de óvulos según los
protocolos habituales.
Obtenidos los ovocitos de las donantes e realiza una u otra técnica de Reproducción
Asistida dependiendo de la características seminales.
Está indicado en mujeres de mayor redad, que presenten fallo ovárico primario o precoz
u ovarios inaccesibles, con menopausia prematura o quirúrgica, que sean portadoras de
una alteración genética, que les hayan fallado repetidamente ciclos de FIV o hayan
presentado pérdidas de embarazos inexplicadas y repetidas
3. Fertilización
Una vez obtenidos los ovocitos, se requiere una muestra de semen, previamente lavado y en
condiciones de capacitación.
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En el caso de la FIV convencional: se lleva a cabo la inseminación de forma natural: los
espermatozoides por sus propios medios han de reconocer al ovocito y penetrar en su citoplasma
como lo harían de forma natural en el interior de las trompas de Falopio.
En una placa de cultivo se preparan varias microgotas, en las cuales se colocan los
espermatozoides a una concentración adecuada y un óvulo. Esta placa se deja en el incubador,
en condiciones similares a las fisiológicas, es decir, 37º C, con una concentración del 5% de
CO2 y elevada humedad relativa (95%) y de este modo, en unas horas, uno de los
espermatozoides penetrará en el óvulo, produciendo la fertilización.
En la ICSI: la inseminación en si, consiste en la introducción de forma artificial de un solo
espermatozoide dentro del ovocito por medio de una microinyección.
Para la microinyección se seleccionan espermatozoides aparentemente normales y móviles.
Ésta se lleva a cabo en un equipo denominado micromanipulador. El sistema consta de un
microscopio invertido y de unos brazos microinyectores que permiten sostener el ovocito y
capturar el espermatozoide e inyectarlo.
Acabada esta inyección espermática los ovocitos inyectados se dejan en el incubador a 37º C y
6% de CO2.
En ambas técnicas, después de unas 16-18 horas, los óvulos son examinados para determinar la
presencia de fecundación. Mediante un microscopio invertido se observa la presencia de
pronúcleos, que en los ovocitos fecundados correctamente deben ser dos, correspondientes al
masculino y el femenino.
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4. Cultivo embrionario y transferencia embrionaria
Los ovocitos que son fecundados con éxito inician la división celular, exactamente igual que lo
harían en el interior de la trompa y del útero y se transformarán en embriones.
Desde ese momento, los embriones conseguidos se mantienen en el tipo de cultivo y
condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo. Lo habitual mantener los embriones en
cultivo en el laboratorio durante 48-72 horas, observar su evolución y poder seleccionar así los
embriones de mejor calidad para posteriormente transferirlos. Durante los días después de la
recuperación de los óvulos los embriones tienen un tamaño de 2-4 células, a los 2 días o de 6-8
células a los tres, y generalmente ya se consideran preparados para transferirse.
La transferencia embrionaria es un procedimiento sencillo pero sumamente importante. Se
puede realizar mediante técnicas de abordaje diferentes, bien en el útero o en las trompas.
La transferencia uterina es la más común en FIV, tiene lugar en condiciones de asepsia, por vía
transcervical. Se efectúa de forma ambulatoria sin necesidad de anestesia, portando los
embriones en un catéter blando que se introduce por el cuello del útero con el fin de depositarlos
en la cavidad uterina.
También se puede realizar la transferencia de estos embriones de 2-3 días (TET) o de zigotos
(ZIFT), preembriones de sólo 24 horas post punción, a las trompas de Falopio. Se realiza en
ambos casos mediante una laparoscopia intratubárica. Estas técnicas se reservan para
indicaciones muy precisas, como podría ser la conglutinación cervical que hace imposible la
canalización del útero para llegar a la cavidad uterina, pero sólo se pueden usar si las trompas de
Falopio están sanas.
El momento de la transferencia de los embriones al útero materno se decide para cada caso
concreto en función de las características especiales de cada paciente y las de los embriones
obtenidos. Los embriólogos aconsejan el momento más adecuado de transferencia, que oscila
normalmente entre el segundo y sexto día después de la obtención y fecundación de los
ovocitos. Lo habitual es 2 o 3 días después de la recuperación de los óvulos (embriones de 2-4
células o en 6-8 células respectivamente).
El número de embriones a transferir es un tema muy debatido. Se plantea el problema de
mantener una adecuada tasa de embarazos minimizando el porcentaje de gestaciones
multifetales. Esto se controla ajustando la calidad y el número de embriones a transferir. Se
escogen los embriones morfológicamente mejores, y lo habitual es que el número sea de 2 a 4,
dependiendo de diversos factores (las características de los embriones el número de intento,
edad de la mujer, la causa de infertilidad, etc…).
Hay casos en que la implantación de los embriones cultivados únicamente durante 2-3 días, no
es exitosa, aunque los embriones transferidos estén en buen estado. Son ocasiones en que la
transferencia de los embriones se tiene que realizar en un momento más avanzado del cultivo, en
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que el embrión está en estadio de blastocisto. En esos casos es necesaria una nueva técnica, el
co-cultivo embrionario.
COCULTIVO EMBRIONARIO
Se desarrolla para aquellos casos en que se produjeron fallos repetidos en la gestación,
aunque se transfirieron suficiente número de embriones y de buena calidad, o para casos
en que es necesario un diagnóstico genérico preimplantacional del embrión.
Con la técnica de cultivo convencional, la transferencia de los embriones se efectúa a los
2 ó 3 días de la aspiración de los óvulos, pues no se pueden mantener más tiempo en los
medios de cultivo. Sin embargo en la técnica del cocultivo, los embriones se incuban con
otras células (de folículos, de la trompa de Falopio, del epitelio del endometrio, etc…) y
con medios especiales (medios secuenciales), con lo que se proporciona un ambiente
favorable para que los embriones se encuentren en unas condiciones que no les impidan
su desarrollo, lo que permite mantenerlos durante más días in Vitro, hasta que
evolucionan hasta al estado denominado de blastocisto.
Los medios secuenciales se llaman así, porque el embrión, a lo largo de su desarrollo
hasta el estadio de blasto, va variando sus necesidades nutritivas: en los primeros
estadios requiere principalmente piruvato, a partir de 4-8 células aumenta el consumo de
Glucosa. Cambiamos secuencialmente los embriones de medio, a medida que éstos se
desarrollan para satisfacer sus necesidades en cada momento.
Con el desarrollo del embrión a blastocisto, se pretende mejorar la calidad embrionaria
y/o la receptividad uterina, es decir, obtener embriones con mayor capacidad de
implantar y mejorar la sincronía embrión-endometrio.
En lo que respecta a la calidad embrionaria Este cultivo prolongado de los embriones
durante los cinco días siguientes a la fecundación nos permite observar la evolución en
los primeros estadios de división. Algunos embriones en cultivo bloquean su división al
tercer día de desarrollo, con lo que esta técnica nos permite descartar aquellos que
presenten algún problema y seleccionar aquellos que hayan superado el bloqueo y estén
en estado óptimo para la implantación, lo que aumenta las posibilidades de éxito.
Desde el punto de vista fisiológico, la posibilidad de implantación también es mayor, ya
que cuando se realiza la transferencia de blastocistos al útero, se imita mejor el modelo
natural. In vivo, cuando el embrión entra en el útero está en estadio de mórula y allí se
desarrolla hasta el estado de blastocisto, el endometrio está ya preparado para que el
embrión se le pueda adherir e implantar en cuanto salga de la zona prelucida. En cambio,
el lugar “natural” para los embriones de 2 a 8 células, serían las trompas de Falopio.
Están en un estadio que no se corresponde con el fisiológico, en el momento en que se
transfieren al útero. La transferencia de blastocistos permite sincronizar el estadio
embrionario con la receptividad endometrial de forma más fisiológica.
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La desventaja de la técnica es que se precisa de un número alto de embriones, ya que
Sólo del 30% al 40% de los embriones sobreviven hasta llegar a desarrollarse a
blastocistos.
Se transfiere un número menor 1-2 ya que tienen mayor capacidad de implantación. Esto
evita las gestaciones múltiples.
Esta técnica también se aplica cuando es necesario hacer diagnóstico genético
preimplantacional, ya que en esta técnica es necesario realizar una biopsia de
blastómeras.
Otra posible estrategia a seguir cuando no se consigue la implantación del embrión, aunque los
embriones transferidos estén en buen estado, es la eclosión asistida (Assisted Hatching)
ECLOSIÓN ASISTIDA (ASSISTED HATCHING)
En el proceso natural in vivo, el día 2 o 3 tras la fecundación el embrión está formado
por cuatro u ocho células y una zona pelúcida, que es una especie de envoltorio que
protege al embrión en sus primeros días de desarrollo, hasta que alcanza el estadio de
blastocisto. Los embriones deben desprenderse de esta capa para poder en el endometrio
o pared uterina.
Esto sucede una vez que el embrión está en la cavidad uterina adelgazando su zona
pelúcida gradualmente y ayudado por sustancias producidas por él mismo.
Hay evidencias de que en algunos casos algunos embriones, y debido a diferentes causas
pueden carecer de la habilidad para adelgazar y desprenderse de la zona pelúcida y esta
eclosión no se produce de forma natural.
Para solucionar este problema se diseño esta técnica de eclosión asistida. Se le realiza al
embrión un pequeño orificio en la zona pelúcida previamente a su transferencia, a fin de
facilitar así su desprendimiento y la consecuente implantación.
Esta técnica se recomienda en casos en los que se han producido fallos de implantación,
en el caso de que el embrión tenga la zona pelúcida engrosada o en los que la edad de la
paciente es elevada.
5. Mantenimiento de la fase lútea
Se denomina fase lútea a la etapa del ciclo menstrual posterior a la ovulación. En esta etapa se
mantiene el cuerpo lúteo produciendo progesterona, que es la hormona encargada de preparar el
endometrio (capa interna del útero) para recibir al embrión.
En las pacientes que recibieron el análogo de GnRH como tratamiento de supresión hipofisiaria
en la fase de estimulación folicular, los niveles de progesterona suelen ser bajos, y necesario
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incrementarlos. Para ello se puede administrar la HCG (hormona gonadotrópica coriónica, que
mantiene el cuerpo lúteo produciendo progesterona) o directamente la progesterona por vía oral
o vaginal.
Sólo queda esperar entre 14 a 17 días postransferencia para realizar la prueba de embarazo en
sangre o en orina.
6. Criopreservación de embriones
A medida que aumenta la eficacia de las técnicas de FIV, es más frecuente que haya embriones
excedentes. Si son de muy buena calidad y pueden cumplir con los protocolos de
criopreservación, se congelan para ser utilizados más adelante en el caso de que no se produzca
la gestación. La Ley de Reproducción Asistida, determina el tiempo máximo que unos
embriones pueden ser guardados en estas condiciones es de cinco años.
La criopreservación que consiste en mantener los embriones a muy bajas temperaturas, con
nitrógeno líquido a -196º C, por lo que todas las funciones celulares se detienen pudiendo
conservarse en este estado durante muchos años.
En cualquier caso, las ventajas de la criopreservación son varias: permite contar con una
alternativa para los embriones que no se desean transferir a fin de evitar el riesgo del embarazo
múltiple, y además permite incrementar las tasas de embarazo del procedimiento ya que se
pueden transferir a la pareja si es necesario en un futuro sin necesitad de repetir todos los ciclos
previos, bastan unas dosis de progesterona y una serie de controles ecográficos. Además se
disminuyen costos y riesgos.
Tradicionalmente, este proceso de congelación se realiza en un congelador computarizado que
desarrolla una rampa lenta de descenso de temperatura (decrementos de 0.2ºC/min), que permite
mantener una constancia en tiempos y temperaturas en todas las congelaciones, garantizando así
la mejor viabilidad posible tras la descongelación, que se lleva a término del a misma forma
pero en sentido inverso.
Este método ha sido utilizado durante décadas, pero actualmente una técnica innovadora de
conservación de embriones se está implantando cada vez con más fuerza: la vitrificación.
El proceso de vitrificación implica una congelación ultrarrápida con altísimas velocidades de
enfriamiento, en un medio con altas concentraciones de crioprotectores en un volumen muy
pequeño. Se evita la formación de cristales de hielo y elimina potencialmente el daño celular.
Este nuevo procedimiento mejora la tasa supervivencia en comparación con los métodos de
congelación lenta, que pueden dar lugar a la formación de pequeños cristales en el interior de las
células, dañándolas. La tasa de supervivencia post-descongelación para embriones humanos por
el método tradicional es de alrededor del 70% en el mejor de los casos en comparación al 9095% que se obtiene con la vitrificación.
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Pero en realidad, donde está técnica está suponiendo una verdadera revolución es en los
procesos de congelación – descongelación de ovocitos. Las tasas de recuperación de este
método hacen que actualmente sea una alternativa real a la congelación de embriones.
Con la técnicas de congelación-descongelación tradicionales los embriones resisten mejor el
proceso de que los óvulos. Esto determinó el procedimiento estándar: obtener los óvulos,
fecundarlos, transferir a la mujer un número limitado y congelar el resto para futuras
transferencias, si la inicial fallaba.
El inconveniente es que aparecen los excedentes de embriones congelados, con los problemas
éticos que el tema ha conllevado, y tampoco era una solución para aquellas pacientes que
querían preservar su fertilidad, y tenían riesgo de perderla (por la edad o a tratamientos
agresivos de quimio y radioterapia) la única opción efectiva era recurrir a la donación de
ovocitos.
CONGELACIÓN DE OVOCITOS
Desde hace más de 50 años existen muchas técnicas de criopreservación de diferentes
tipos celulares, entre ellos embriones y espermatozoides. La técnica de congelación de
ovocitos, sin embargo, es extremadamente compleja ya que se trata de células muy
grandes y con una estructura muy sensible a la congelación. Sus grandes proporciones de
agua hacen que al congelarse tienda a formar cristales de hielo que rompen su estructura
impidiéndole sobrevivir o dejándolo inviable para la fertilización. La tasa media de
supervivencia de óvulos tras su descongelación es aproximadamente del 60-70% y una
tasa de implantación de un 10-30%
En algunos países está prohibido congelar los óvulos, y es bastante raro que se empleen
óvulos descongelados en las técnicas de reproducción asistida. Desde El primer
nacimiento a nivel mundial de un bebé a partir de óvulo congelado lo logró el Dr. Cheng
en Corea en 1986 hay menos de 150 de niños nacidos por este método.
Con el desarrollo del a técnica de vitrificación para ovocitos (Dr. Masashige Kuwayama
Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The
Cryotop method.) este panorama ha cambiado totalmente.
Este nuevo método, conocido como Cryo-top, lleva a cabo una congelación ultrarrápida
(desciende 23.000ºC/min) en una cantidad minúscula (<0.1ul) de una solución de
vitrificación especial, antes del almacenamiento en N2. Previene la formación de
cristales con lo cual se preserva la estructura del óvulo.
La supervivencia de los oocitos tras el ciclo de congelación y descongelación es del 90%
y, una vez son fertilizados e implantados, una tasa de gestación del 40-45%,
prácticamente las mismas que utilizando ovocitos frescos.
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Este método abre nuevos horizontes en tratamientos de reproducción, puesto que da
esperanza a aquellas mujeres que quieren preservar su fertilidad futura, y que, por
cualquier razón únicamente disponen de óvulos (y no embriones) disponibles para
congelar (como puede ser el caso de las menopausias precoces, tratamientos de quimio o
radio, extirpaciones de ovarios...)
Con estos resultados exitosos pueden llegar a crearse bancos de ovocitos, de igual
manera que ya existen los bancos de semen.
Actualmente el IVI Valencia es el único centro de España acreditado por el Ministerio de
Sanidad para desarrollar la técnica de congelación de óvulos y su posterior fecundación.
Los primeros embarazos en España con óvulos vitrificados se han conseguido a finales
del 2006.
Indicaciones de la FIV clásica
Esta técnica se aconseja como tratamiento para parejas con distintos tipos de esterilidad, ya sea
de origen femenino o masculino aunque fue desarrollada inicialmente para el tratamiento de la
infertilidad causada por obstrucción de las trompas. Sin embargo, a lo largo del tiempo, las
indicaciones fueron ampliándose e incorporando todos aquellos casos en los que existe
dificultad en el encuentro entre los espermatozoides y el óvulo. Actualmente está indicada en los
siguientes casos:
•
•
•
•
•
Esterilidad masculina moderada.
Esterilidad por factor cervical o inmunológico
Esterilidad de origen tubárico
Endometriosis y ovarios poliquísticos
Esterilidad de origen desconocido
Indicaciones del a ICSI
La ICSI, a diferencia de la FIV, requiere sólo un espermatozoide para cada óvulo. Con esta
técnica se pueden beneficiar casi todos los hombres con infertilidad grave, ya que Sólo es
necesario un espermatozoide vivo para cada ovocito. Está indicado en los siguientes casos:
Factor masculino severo.
Azoospermias
Alteración de membrana ovocitaria.
Fallo en ciclos de fecundación en FIV convencional.
Presencia de elevados títulos de anticuerpos antiespermáticos
Al no necesitarse un número mínimo de espermatozoides, puede realizarse con muestras de
semen de bajísima calidad. Con los avances más recientes se puede hacer la microinyección con
espermatozoides obtenidos directamente del epidídimo o del testículo o incluso con
espermatozoides inmaduros. La técnica utilizada es conocida como recuperación espermática.
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RECUPERACIÓN ESPERMÁTICA EXTREMA
Como ya se ha mencionado, esta técnica es útil para varones azoospérmicos. En los
pacientes con azoospermias es posible recuperar espermatozoides del testículo o de la vía
espermática. El tipo de azoospermia puede ser por obstrucción de la vía espermática
(azoospermia obstructiva) o secretora, no obstructiva y el origen es hormonal con déficit
de la producción. En el primer caso se pueden recuperar espermatozoides prácticamente
en el 100% de los casos, mediante una punción en el epidídimo o en el testículo, en
cambio cuando la azoospermia es secretora, las posibilidades se reducen al 50% y es
necesaria una intervención similar a una biopsia.
En el laboratorio se aíslan los espermatozoides de la muestra de tejido testicular, y se
dejan en incubación para conseguir espermatozoides móviles. Una vez conseguidos se
procede a utilizarlos en el procedimiento de microinyección, o bien se congelan para su
utilización posterior. Por su número y baja movilidad, son aptos únicamente en técnicas
de ICSI. Los resultados obtenidos con espermatozoides de testículo congelados, son
comparables a los hallados con espermatozoides sin congelar.
Los últimos avances en este campo se refieren a la microinyección de espermatozoides
inmaduros recuperados del testículo. Las posibilidades de éxito en la fecundación se ven
muy reducidas, además de que la técnica es compleja. Es difícil distinguir las células en
espermatogénesis del resto de células del tejido testicular y además las células inmaduras
no poseen el mismo potencial fertilizador.
Riesgos del a FIV
Suelen ser procedimientos de bajo riesgo. Las complicaciones más comúnmente observadas son:
-
la hiperestimulación ovárica, que pueden ser controlable según la estimulación efectuada
los embarazos múltiples, se controlan por el número de embriones a transferir. Hay
aproximadamente un 30% de embarazos gemelares.
el embarazo ectópico, el aborto espontáneo y aquellos originados por la punción, que
dependen de factores no modificables por la técnica.
TRANSFERENCIA INTRATUBÁRICA DE GAMETOS (GIFT)
La GIFT fue desarrollada unos pocos años después de la FIV, el primer embarazo conseguido
con esta técnica fue publicado en 1984.
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Procedimiento
En la GIFT comienza con los dos mismos pasos que la FIV: inducción de la ovulación y
recuperación de óvulos. Una vez obtenidos los óvulos y los espermatozoides del hombre (ya
obtenidos y preparados previamente) se colocan en un pequeño catéter, sin que entren en
contacto, separados por una pequeña burbuja de aire. Se colocan inmediatamente en las trompas
de Falopio de la mujer mediante una laparoscopia que debe ser realizada bajo anestesia general.
La fertilización se produce de forma natura len el cuerpo del a mujer.
No hay manera de verificar que la fertilización ha tenido lugar, ya que ocurre in vivo. Si la
fertilización tiene éxito, el óvulo viaja al útero, exactamente igual que en un ciclo natural.
Indicaciones:
Aquellas mujeres jóvenes que experimentan infertilidad sin causa aparente, problemas
cervicales o endometriosis leve, o que tengan creencias religiosas que prohíben la fertilización
fuera del cuerpo.
TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTACIONAL
La incorporación de la Biología Molecular al conjunto de técnicas de FIV ha aportado la
posibilidad de realizar un diagnostico genético a nivel embrionario que permite reconocer
futuras malformaciones, síndromes o enfermedades de carácter genético. Estas técnicas, se
realizan a través del análisis del DNA de una célula extraída del embrión y previamente a su
implantación y posterior embarazo. De esta forma se pueden seleccionar de entre los embriones
formados aquellos que no presenten este tipo de anomalías asegurando el nacimiento de un hijo
sano. Tales anomalías a nivel molecular se manifiestan como alteraciones cromosómicas o
enfermedades monogenéticas de tipo recesivo, dominante o ligadas al cromosoma X.
Enfermedades como la Fibrosis Quística, Distrofia Miotónica de Duchenne, Hungtington o la
Anemia Falciforme o síndromes como Down, Patau o Edwards pueden ser identificados y
evitados de esta manera.
Entre las técnicas más utilizadas destacan Hibridación in situ Fluorescente (FISH), PCR y
posterior análisis de los fragmentos amplificados.
La necesidad de trabajar con el escaso material genético que aporta una única (a lo sumo dos)
célula además del hecho de tener que analizar en una misma muestra cuantas más de estas
alteraciones mejor, lo que implica el uso de múltiples sondas con diferentes fluoroforos, hacen
que el trabajo del biólogo molecular deba ser muy eficaz, tanto en la extracción de DNA,
manipulación, diseño de sondas,etc.
Procedimiento
Obtención del material genético
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La biopsia de una o dos células del embrión se hace antes del cuarto día de desarrollo cuando
éstas se encuentran en un estadio totipotencial por lo que no afectará al desarrollo posterior del
embrión.
La biopsia embrionaria puede disminuir ligeramente la implantación del embrión mientras que
la selección de embriones cromosómicamente normales puede incrementarla. La biopsia de uno
o dos blastómeros se puede comparar a la pérdida celular que sufren algunos embriones después
de la congelación y que, tras ser transferidos, dan lugar a embarazos evolutivos.
El balance entre el posible daño en la biopsia y los efectos beneficiosos del DGP parece
decantarse a favor de la realización de este.
El Diagnostico genético preimplantatorio se ve complementado o confirmado con una
amniocentesis durante el posterior embarazo de forma recomendada en la mayoría de las
unidades de FIV.
FISH
Esta técnica se usa mayoritariamente para el diagnostico de alteraciones cromosómicas,
típicamente en los cromosomas 13, 18 y 21. El procedimiento general consiste en la
hibridación de sondas específicas para determinados cromosomas, o regiones
cromosómicas. Cada sonda está marcada con un fluorocromo diferente (que se visualiza
en un color determinado). Estas sondas fluorescentes se aplican a la célula biopsiada y se
unen a los cromosomas. Dependiendo del tipo de sonda, esta se une a un área específica
del cromosoma, o a todo el cromosoma. Mediante un microscopio de fluorescencia se
determinan el número de copias encontradas en la muestra. La determinación del sexo
también se puede hacer a través de esta técnica para discriminar enfermedades ligadas al
cromosoma X.
Análisis mediante PCR
La detección de las enfermedades monogenéticas requieren el empleo de técnicas mas
especificas que discriminen la presencia de alteraciones en la secuencia codificante de
los genes afectados. Para conseguir esto se necesita amplificar mediante PCR el DNA
específico con oligonucleotidos o sondas diseñadas a tal efecto y la posterior evaluación
de los productos generados.
La PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa consiste en la replicación cíclica de
determinadas secuencias de DNA de forma específica. La aplicación de un determinado
número de ciclos de amplificación permite obtener DNA hasta un nivel de observación
detectable. Una vez la amplificación ha tenido lugar, se utilizan diferentes técnicas de
Biología Molecular para analizar el gen. La técnica más usada es el análisis de
fragmentos mediante Secuenciador o en menor medida mediante un Termociclador de
Tiempo Real.
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Para el primer caso los cebadores u oligos de la PCR se marcan con fluoroforos de
distinta longitud de onda. Tantos como distintos genes queramos identificar. En el
secuenciador se puede discriminar el tamaño de los amplicones incluso en diferencias de
un solo nucleótido y determinar su susceptibilidad de ser un gen anormal.
Para el caso de Real Time también existen sondas específicas que también son capaces
de discriminar estas diferencias en este tipo de genes.
Llegados a este punto tenemos que considerar que aunque estamos hablando de
enfermedades monogenéticas, la mayoría no son en realidad tales, sino que son debidas a
muchos de ellos, pero se estudian loci concretos que responden a altos porcentajes de incidencia
en la población. Como ejemplos, en el caso de la Fibrosis Quística se suele estudiar el gen
CFTR*602421 o para la Enfermedad Charcot-Marie-Tooth el gen MPZ *159440.
También se suele hacer un estudio genético familiar que permita localizar la presencia de estos
genes anormales mediante el estudio de marcadores asociados (Microsatélites) a partir del
historial de cada uno de los miembros, padres y hermanos en lugar de analizar directamente el
gen implicado
Por último, cabe la posibilidad de seleccionar embriones que sean compatibles genéticamente
con un hermano ya nacido que tiene una enfermedad o necesidad de transplante de un donante
compatible. Es lo que se conoce como Hermanos Salvadores o “Savior Siblings”. Este supuesto,
de implicaciones éticas, ya se contempla en la legislación española para ciertos supuestos.
Destacar por último que estas técnicas se están aplicando también al Diagnostico PRENATAL,
a partir del material genético obtenido mediante amniocentesis .
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