Trabajo Práctico Nº4: Análisis Bacteriológico del Agua

Trabajo Práctico Nº4: Análisis
Bacteriológico del Agua
Lic Soria José
Las fuentes del Agua
Se considera agua potable de suministro público y agua potable de
uso domiciliario la que es apta para la alimentación y uso doméstico
Para su consumo:
• no deberá contener sustancias
• cuerpos extraños de origen biológico, orgánico, inorgánico o
• radiactivo.
Las fuentes del Agua
Cumplir con sus características fundamentales del agua :
•Insipida (Sin sabor)
•Incolora
• inodora (Sin olor)
• límpida (Pureza)
Según el Código Alimentario Argentino, se
deben estudiar las siguientes características microbiológicas :
• Bacterias aerobias mesófilas, cuyo recuento refiere a la calidad general del agua
potable,
• Bacterias coliformes totales (Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella y Escherichia coli)
que son consideradas indicadores de contaminación fecal. Las tres primeras pueden
tener origen ambiental., •Bacterias coliformes fecales, proviene del hábitat intestinal humano o animal, y su
presencia en agua es inadmisible.
•Pseudomonas aeruginosa es un patógeno sensible a la cloración, que debería estar
ausente si el agua de bebida es adecuadamente clorada.
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
• La muestra debe tomarse directamente de la fuente de agua,
utilizando recipientes estériles.
• Si el agua a analizar es de un sistema de distribución,
se abre el grifo, se deja correr 2 ó 3 y se toma la
muestra.
• Cuando la muestra proceda de ríos, arroyos, lagos,
estanques, etc., se toma lejos de las costas y a mediana
profundidad
•En todos los casos se llena completamente el envase y se tapa.
Es importante que no quede cámara de aire en el envase. Mantener la tapa
en mano. Rotular y enviar al laboratorio.
Después a las muestras se le adiciona tiosulfato
de sodio para neutralizar el cloro residual libre
RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS
•
•
A partir de la muestra se preparan varias diluciones de la muestra (1/10,
1/100, etc).
Se toma un 1ml de la muestra y se coloca en otro tubo, luego se completa
con agua hasta los 10ml, y asi sucesivamente con las otras diluciones
sucesivas
RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS
•
•
Se coloca 1ml, de cada dilución en una placa y se vuelca el agar fundido
sobre la placa y se deja solificar. (duplicado por cada dilucion)
El microorganismo se deja crecer durante 24hs a 37 º
•
Esta técnica se llama Recuento en Placa vertida
RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESÓFILAS
Se cuentan el número promedio
de colonias en 2 cajas pertenecientes
a la misma dilución, multiplicado por
la inversa de la dilución usada,
expresado en ufc/ml.
Se consideran para el recuento
aquellas cajas que contengan entre
30 y 300 colonias
Valor máximo admitido por el Código
Alimentario Argentino: 500 ufc/ ml.
Estudio de COLIFORMES
Bacterias coliformes totales: (GÉNEROS: ENTEROBACTER,
CITROBACTER, KLEBSIELLA Y ESCHERICHIA)
•Las bacterias coliformes pueden econcentrarse en cualquier parte en
el medio ambiente: tierra, plantas y animales.
• Su presencia en el agua potable indica que la reserva no está
adecuadamente tratada contra los contaminantes.
•La bacteria coliforme es inocua por si misma, pero su presencia es un
alerta de que la reserva de agua debe ser controlada para detectar
otro tipo de contaminación.
COLIFORMES TOTALES
Negativo
ANÁLISIS PRESUNTIVO
caldo McConkey
Positivo
ANALISIS CONFIRMATIVO
Caldo Brilla
Positivo
Negativo
COLIFORMES FECALES
ANÁLISIS PRESUNTIVO
caldo EC
Positivo
ANALISIS CONFIRMATIVO
Agar EMB- IMViC-Gram
Negativo
Positivo
Negativo
COLIFORMES TOTALES
ANÁLISIS PRESUNTIVO: Técnica del número más probable (NMP)
por fermentación de tubos múltiples
•Agitar la muestra vigorosamente
•Inocular series de 5 tubos de caldo
Mac Conkey con distintos volúmenes
de la muestra: 10 ml – 1 ml – 0.1ml
•Incubar a 37º 24- con campana
De Durhan
10ml
1ml
0.1ml
COLIFORMES TOTALES
ANÁLISIS PRESUNTIVO: Técnica del número más probable (NMP)
por fermentación de tubos múltiples
Interpretación: Producción de gas y viraje de color violeta a amarillo en 48
h + 3 h constituye un test presuntivo positivo. Continuar con fase
confirmativa.
COLIFORMES TOTALES
ANÁLISIS CONFIRMATIVO
Procedimiento: De los tubos de Mac Conkey que presentan gas y viraje
de color a las 48 h, sembrar con ansa en anillo en caldo BRILA. Incubar 24
h a 35-37°C.
Interpretación :La producción de gas confirma la presencia de
coliformes totales. Calcular NMP (número más probable en 100 ml)
desde la Tabla de NMP.
Calculo de NMP (número más probable en 100 ml)
Se emplea tabla de NMP
El Código Alimentario Argentino admite hasta 3
coliformes totales en 100 ml de muestra.
COLIFORMES FECALES: E.Coli
ANÁLISIS PRESUNTIVO:
Procedimiento :De cada uno de los tubos positivos de caldo Mac Conkey en la
fase presuntiva, transferir cultivo con ansa estéril de 3-3.5 mm de diámetro a
caldo EC y se incuba por 24hs
•La ausencia de gas dentro de las 24 h de
incubación indica AUSENCIA de
coliformes fecales..
• La producción de gas dentro de las 24 h
o menos indica PRESENCIA de coliformes
fecales
COLIFORMES FECALES: E.Coli
ANÁLISIS CONFIRMATIVO :Confirmación de Escherichia coli
•Escherichia coli, en su hábitat natural, vive en los intestinos de la mayor parte de
los mamíferos sanos.
•Su presencia es indicadora de contaminación
Medio EMB: observación de
colonias características
Pruebas
IMViC: Patrón característico
de E.Coli
Tincion de Gram: confirmación de
Morfología Bacilar Gram ( -)
Medio EMB: observación de colonias características
Procedimiento Desde cada uno de los tubos de caldo EC positivos, sembrar en
agar eosina-azul de metileno (EMB) y observar el desarrollo de colonias
características de Escherichia coli.
Interpretación: Se confirma la presencia por
la observacion de colonias oscuras
con brillo verde-metálico en EMB
IMViC: Patrón característico de E.Coli
Procedimiento Desde cada uno de los tubos de caldo EC positivos, sembrar
las cuatro pruebas bioquimicas del IMViC.
Interpretación: Se confirma la presencia por el patrón
.
característico de E Coli.
Tinción de Gram: confirmación de Morfología Bacilar Gram ( -)
Interpretación: Se confirma la presencia por observacion
de Morfología Bacilar Gram ( -)
El Código Alimentario Argentino recomienda ausencia de
E. coli en 100 ml de muestra.
Investigación de Pseudomonas aeruginosa
•
Pseudomonas aeruginosa,
Es una bacteria flagelada con forma de bacilo,.
•
Es una bacteria muy extendida, y puede encontrarse en el agua, la
tierra, animales o plantas, ya que sus necesidades alimenticias son
mínimas.
•
Es un patógeno oportunista
•
Produce pigmentos fluorescentes
•
Puede degradar ciertos
hidrocarburos
ANÁLISIS PRESUNTIVO:
Procedimiento: Medir 100 ml de muestra en recipiente estéril y sembrar en
100 ml de caldo asparagina doble concentración. Incubar hasta 5 días a 25°C.
Observar bajo luz U.V.
Interpretación: El desarrollo de fluorescencia verdosa por
producción de pigmento se considera test presuntivo positivo.
ANÁLISIS CONFIRMATIVO
Digestión de caseína y
producción de pigmento
verde característico
Caldo
asparagina
positivo
Producción de pigmento
verde característico
Prueba de la oxidasa
ANÁLISIS CONFIRMATIVO
Digestión de caseína y producción de pigmento verde característico
Desde caldo asparagina positivo una placa con Agar Leche.
Realizando una sola estría (de 2 a 4 cm de longitud) e incubar
a 37°C por 24-48 h.
P. aeruginosa hidroliza la caseína y produce un pigmento difusible
verde o amarillento.
ANÁLISIS CONFIRMATIVO
Producción de pigmento verde característico
Sembrar con ansa desde caldo asparagina en agar King Ward Raney A, e
incubar a 37°C por 24-48 h.
P. aeruginosa produce un pigmento fluorescente
que se hace evidente bajo luz UV..
ANÁLISIS CONFIRMATIVO
Prueba de la oxidasa: Se basa en que ciertos microorganismos
contienen citocromo-oxidasas, estas enzimas oxidan la
Dimetilparafenilendiamina en presencia de O2 y citocromo y
llevan alfa-naftol a indofenol de color azul.
P. aeruginosa es un bacilo gram negativo, que da positiva
la prueba de la oxidasa
El Código Alimentario Argentino recomienda ausencia de
P. aeruginosa en 100 ml de muestra.
Fin de la presentación