5CFE01-626 2/15 Tratamientos combinados de la biomasa forestal para la obtención de bioetanol HERNÁNDEZ, G.1, MARTIN, J.A.2, MATA, Y.1, MARTÍN, R.2. TERRÓN, M.C.1, CARBAJO, J.M.2, SANTOS, S.2, EUGENIO. M. E. 2, VILLAR, J.C.2, GONZÁLEZ, A.E.1 1. CIB-CSIC, Ramiro de Maeztu 9, 28040 Madrid; 2. CIFOR-INIA, Crta. de la Coruña Km. 8, 28040 Madrid Resumen La producción de combustibles de primera generación se ha basado en la utilización de cereales, caña de azúcar y remolacha como materias primas. Los azucares presentes en estos productos son fácilmente accesibles y procesables mediante la adaptación de los procedimientos tradicionales de fermentación alcohólica. No obstante, el empleo de materias primas alimentarias ha sido duramente criticado desde puntos de vista éticos y económicos impulsando a investigar intensamente sobre materias primas alternativas. La producción de combustibles de segunda generación usando material lignocelulósico procedente de la biomasa forestal se ha considerado una buena alternativa, sin embargo, estos procesos presentan una serie de inconvenientes relacionados con la composición y estructura de dicho material. Dentro de ellos cabe destacar que la glucosa esta presente en forma de celulosa cristalina que debe ser despolimerizada para ser accesible a la fermentación. Por otro lado la lignocelulosa contiene importantes cantidades de hemicelulosa que incorpora azucares refractarios a la fermentación y la presencia de lignina dificulta el tratamiento ya que es responsable de la compactación del material. Por tanto la producción de biocombustibles de segunda generación a partir de biomasa debe minimizar dichos problemas. La biomasa debe ser pretratada termoquimicamente para despolimerizar parcialmente la lignina y desarticular la estructura de la celulosa. El material pretratado debe ser sometido a una digestión enzimática para liberar la glucosa, la cual será fermentada mediante levaduras o bacterias produciendo bioetanol y materias primas. No obstante el pretratamiento termoquímico es energéticamente caro, ambientalmente agresivo y produce compuestos que inhiben el tratamiento enzimático y el proceso de fermentación. En el presente trabajo se investiga el uso enzimas producidas por hongos basidiomicetos utilizando las capacidades de cepas mono y dicariontes y explorando la elasticidad de su expresión genica en función del medio en que se desarrollan para su implimentación en el proceso. Palabras Clave Lignocelulosa, biocombustibles, hongos, enzimas ligninolíticas. 1. Introducción Producción de Biocombustibles. La producción de Biocombustibles ha estado basada de manera habitual en el uso de cereales, de maíz, de azúcar de caña y remolacha como materia prima para la obtención de los llamados combustibles de primera generación (GALBE y ZACCHI. 2007; GRAY, et al. 2006). El azúcar presente en estos productos es fácilmente accesible y adaptable a los procesos tradicionales de fermentación alcohólica. Sin embargo el uso de alimentos para el consumo humano y animal que afectan directamente a las cadenas tróficas para la obtención 3/15 de proteína animal como materia prima ha sido fuertemente cuestionado desde puntos de vista económicos y éticos. Además dichos proceso repercute directamente en zonas con escaso desarrollo científico y tecnológico. Adicionalmente la variedad en la alimentación de la población de estas zonas es sustancialmente dependiente de estos alimentos que conforman su fuente de nutrientes principal. Los combustibles de segunda generación se producen empleando materiales lignocelulósicos tales como paja de cereales o residuos de la industria forestal como materia prima (ZALDIVAR et al. 2001). El empleo de éstas, implican solventar una serie de retos que dificultan el proceso de obtención del biocombustible: (I) Una fracción importante de la glucosa se encuentra en forma cristalina que debe ser primero despolimerizada para dar lugar a sus monómeros fermentables, (II) la lignocelulosa contiene importantes cantidades de hemicelulosa que incorporan algunos azucares refractarios a los procesos de fermentación tradicional como las pentosas y (III) la presencia de lignina dificulta los tratamientos porque actúa como material compactante de la estructura del complejo lignocelulósico. La producción industrial de biocombustibles de segunda generación incluye varios pasos que pueden sintetizarse en los siguientes: (I) la materia prima es pretratada termomecánicamente para alcanzar un nivel de desestructuración parcial de la lignina y el debilitamiento de la estructura cristalina de la estructura de la celulosa (BALLESTEROS et al. 2006; GALBE y ZACCHI, 2007), (II) el material pretratado es sometido a una digestión enzimática con celulasas para liberar la glucosa fermentable principal objetivo de esta etapa y (III) la glucosa es fermentada por procedimientos clásicos utilizando levaduras o bacterias para la obtención de etanol o metano. Por ultimo, es necesario destilar el alcohol para obtener el biocombustible final. La naturaleza de la materia prima y los correspondientes pretratamientos que se le apliquen son de capital importancia para reducir el coste de esta etapa final, problemas que hasta el momento tienen algunos tipos de bioalcohol generados, por ejemplo, a partir de caña de maíz. Sin embargo, quedan numerosas cuestiones que resolver dentro de esta tecnología entre las que hay que considerar principalmente: - El pretratamiento termo-químico es energéticamente costoso, ambientalmente agresivo porque genera contaminantes que tienen efectos en sus efluentes y productos, generando adicionalmente compuestos que presentan efectos inhibitorios sobre las enzimas a emplear en la etapa siguiente y sobre los procesos de fermentación (KLINKE et al. 2003; KLINKE et al. 2004). - La fermentación de las pentosas contenidas en la hemicelulosa requieren del uso de microorganismos que aun no están suficientemente bien adaptados a los procesos industriales, los que reducen drásticamente la producción de los procesos afectando los factores de convertibilidad de los mismos. (HAHN-HÄGERDAL et al 2007; JEFFRIES, 2006). Degradación de la lignocelulosa por hongos basidiomicetos de pudrición blanca. Los hongos basidiomicetes degradadores de lignina, han sido clasificados como hongos de pudrición blanca y comúnmente su hábitat se encuentra en ecosistemas forestales, fundamentalmente en la hojarasca y en los troncos de árboles en pie como parásitos o caídos como saprofitos. Son eficientes depolimerizando, degradando o mineralizando todos los componentes de la pared celular vegetal, incluyendo la celulosa y hemicelulosa y fundamentalmente la lignina, biopolímero mas recalcitrante a la degradación. (LEONOWICZ 4/15 et al. 1999). En este sentido, los hongos de pudrición blanca juegan un papel crucial en la dinámica del ciclo del carbono. Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarinus, son los hongos ligninolíticos mas extensivamente estudiados hasta el momento. Nuestro grupo de investigación ha incorporado recientemente Pycnoporus sanguineus (EUGENIO et al. 2007) una especie termófila que ha sido aislada en las regiones más cálidas de Colombia. Su capacidad para desestructurar el material lignocelulósico depende de la naturaleza y cantidad de las enzimas extracelulares que producen. Este hecho ha dado lugar a su clasificación en dos grandes grupos según produzcan degradación selectiva de la lignina o extensiva de los tres polímeros principales del complejo (CULLEN y KERSTEN, 2004). La lignina es degradada principalmente por las lignin peroxidasas (LiP, E.C. 1.11.1.14), manganeso peroxidases versátiles (MnPV, EC 1.11.1.16), manganeso peroxidasas (MnP, E.C. 1.11.1.13), y fenol oxidasas (Pox) también conocidas como lacasas (E.C. 1.10.3.2) (HATAKKA, 1994; KERSTEN y CULLEN, 2007). Este grupo de de exoenzimas oxidantes se complementa con otro grupo tales como la aril alcohol oxidasas (AAO, E.C. 1.1.3.7) (ANDER y MARZULLO, 1997), superóxido dismutasa (SOD, E.C. 1.15.1.1), glioxal oxidasa (GLO E.C. 1.2.3.5), celobiosa dehidrogenasa (CDH, E.C. 1.1.99.18) (IGARASHI et al. 1998; ZALDIVAR et al. 2001), y otras que proveen algunos de los substratos usados en las correspondientes reacciones (LEONOWICZ et al. 1999). Por otro lado la Celulosa, es degradada por endoglucanasas que atacan las zonas amorfas y las celobiohidrolasas que son exocelulasas que producen disacáridos como la celobiosa desde el final reducido (tipo I) o no reducido (tipo II) de la celulosa. La degradación final de la celobiosa es levada a cabo por las β- glicosidasas. Los procesos de biodegradación de la lignocelulosa han sido revisados extensamente (LEONOWICZ et al. 1999; MARTINEZ et al. 2004; CULLEN y KERSTEN, 2004; KERSTEN y CULLEN, 2007). Las lignin peroxidasas (LiP) son glicoproteínas que rompen los enlaces Cα-Cβ en los compuestos modelo tipo ligninoles dependiendo del H2O2, haciendo posible la depolimerización de la lignina metilada in vitro (TIEN y KIRK, 1983). Se han aislado varias isoenzimas catalíticamente diferentes (CULLEN y KERSTEN, 2004) y se han encontrado hasta diez genes lip siendo descrita su compleja regulación en P. chrysosporium (MARTINEZ et al. 2004). Genes lip no han sido encontrados en otras especies como P. ostreatus. La Manganeso peroxidasa (MnP) oxida Mn+2 to Mn+3 usando H2O2 como oxidante (GLENN y GOLD, 1985). Su actividad es incrementada por la presencia de ácidos orgánicos dicarboxílicos estabilizando el Mn+3 (GLENN y GOLD, 1985). Seis genes mnp han sido identificados en el genoma de P. chrysosporium (MARTINEZ et al. 2004) uno de ellos es similar a la MnPV descrita en P. eryngii. En P. ostreatus, se han caracterizado tres genes mnp; dos de ellos corresponden a MnPV (KAMITSUJI et al. 2005). Finalmente, las fenoloxidasas (lacasas) catalizan la transferencia de un electrón de los fenoles, aminas aromáticas y otro de un sustrato rico en electrones con la reducción de O2 a H2O (BALDRIAN, 2006). No se han encontrado genes que codifiquen para lacasa en el genoma de P. chrysosporium mientras que hasta ocho genes pox han sido encontrados en un BAC clonado de una cepa de P. ostreatus secuenciada en nuestro laboratorio. La reciente liberación del genoma de P. ostreatus (febrero 2009) por el Joint Genome (USA) nos demuestra la presencia de 12 genes de lacasa y 8 entre mnp y mnpv(34), lo que abre el potencial de las capacidades genéticas de esta especie y demuestra la coherencia que nuestros resultados preliminares (SANTOYO et al. 2008). 5/15 Pretratamientos de lignocelulosa como materia prima para la producción de bioetanol con hongos. Los problemas causados por los pretratamientos termo-químicos de la lignocelulosa como materia prima han impulsado la investigacion por alternativas basadas en tratamientos biológicos o tratamientos combinados. Los hongos de pudrición blanca son una respuesta clara a este problema, por su actividad lignocelulolítica específica (KERSTEN y CULLEN, 2007). Hay muy pocos artículos que describan el uso de hongos de pudrición blanca en el pretratamiento de maderas blandas (LEE et al. 2007) y alguno que describe el empleo de P. ostreatus para el pretratamiento de paja de trigo (TANIGUCHI et al. 2005). 2. Objetivos El principal objetivo de este trabajo es el estudio del uso de hongos en el tratamiento de materiales lignocelulósicos para la producción de biocombustibles. La actividad de los hongos de podredumbre blanca consiste principalmente en la degradación de la lignina y en la estructura cristalina de la celulosa con el fin de poder acceder a los nutrientes que necesitan para su desarrollo. En esta línea se llevará a cabo un estudio preliminar diferenciado en dos aspectos, por un lado se estudiará la producción de las enzimas ligninolíticas por determinadas cepas de hongos de pudrición blanca, y por otro el crecimiento de un hongo celulolítico sobre distintos sustratos para determinar sus posibilidades de uso sobre distintos tipos de materias primas. Los resultados obtenidos de este estudio nos van a ofrecer información valiosa para construir nuevas variedades generadas para que hagan eficiente y selectivamente viable el bio-pretratamiento de la materia prima sometida a estudio. Como modelo de producción de enzimas ligninolíticas se estudiarán los sistemas basados en Pleurotus ostreatus. Para el estudio del desarrollo de un hongo celulolítico sobre distintos materiales se seleccionaron cepas de hongos Thichoderma. 3. Metodología Materias primas lignocelulósicas Se prepararon distintos tipos de materia prima lignocelulósica con el fin de analizar la posibilidad de crecimiento de los hongos sometidos a estudio sobre las mismas. Los materiales preparados fueron: - Astillas de Pinus radiata de tamaño fósforo. - Astillas de Eucaliptos globulus de tamaño fósforo. - Serrín de Pinus radiata. - Serrín de Eucaliptus globulus. - Gasa de uso farmacéutico. - Algodón. - Celulosa de Pinus radiata (Papel obtenido por el proceso Kraft). Tanto la madera procedente de Pinus radiata como de Eucaliptus globulus se descortezó manualmente, tras lo cual fué astillada en una astilladora semi-industrial de volante con dos cuchillas. Las astillas se tamizaron a continuación eliminando las retenidas por un tamiz de agujeros de 30 mm de diámetro y las que atravesaban uno de 8 mm. Para reducir el tamaño de las mismas se empleó un refinador de laboratorio “Sprout-Waldron” con una guarnición de discos de púas C2975, ajustados a la separación mínima. Parte del material 6/15 tanto de pino como de eucalipto se molió empleando un molino de martillos y posteriormente se tamizó. Para los experimentos con celulosa se utilizo gasa para uso farmacéutico, algodón, celulosa de pino obtenida por proceso Kraft, Cepas de hongos Se han utilizado 20 cepas de monocariontes de Pleurotus ostreatus todas ligninolíticas. Para determinar las capacidades de crecimiento en distintas materias primas se utilizaron 7 cepas del hongo Trichoderma. Cultivo de los monocariontes La replicación de las cepas de los monocariontes se hizo con la finalidad de seguir preservándolas y para tener material de trabajo en los posteriores experimentos. Para la preparación del medio de cultivo se pesó Agar extracto de Malta al 2% y agar bacteriológico en la misma proporción. El medio se esterilizaró en autoclave a 110º C durante 15 minutos. Se prepararon las placas en una campana de flujo laminar previamente esterilizada con luz U.V y etanol. Transcurrido el tiempo suficiente como para que se gelificaran se procedió a etiquetarlas y sembrarlas. Las placas se dejaron a la temperatura ambiente del lugar, aproximadamente 24 °C. Como medio líquido para trabajar los monocariontes y la producción de las enzimas se eligió el medio 7, el cual se esteriliza a 110 ºC durante 15 minutos en autoclave. Para los preinóculos se prepararon 264 ml de medio, mismos que fueron divididos en 6 matraces de 250 ml y sobre los cuales fue vertida la placa de agar con el hongo crecido. Con el fin de depositar el agar y el hongo a la placa se tuvo que cortar el agar en trozos de aproximadamente 1 cm2 con la ayuda de un escalpelo. Producción de las enzimas. Se obtuvieron los crudos enzimáticos de los días con mayor actividad de lacasa, manganeso peroxidasa y alcohol aril oxidasa, desarrollados en medio 7 (alto en nitrógeno). Se determinaron las actividades de acuerdo con el procedimiento seguido por Santoyo y col. (SANTOYO et al. 2008) Análisis de la actividad enzimática Las actividades enzimáticas se midieron a temperatura ambiente. La unidad de actividad (UA) se definió como la cantidad de enzima necesaria para producir un 1 µmol de producto en un minuto. La actividad lacasa fue medida mediante el método de 2-6 dimetoxifenol: el método utilizado se basa en la oxidación del 2-6 dimetoxifenol (ε0=49600 M-1 cm-1) en ausencia de peroxido. Este sustrato se diluye en tampón acetato 0,1 M (pH 5.0) hasta concentración final de 1mM en la mezcla de reacción. El incremento de absorbancia se mide en una longitud de onda de 468 nm durante 1 minuto en el espectrofotómetro. La manganeso peroxidasa se midió en la misma cubeta que se hizo la determinación de la actividad de la lacasa, siguiendo el experimento, es decir solo se añadía MnSO4 y después H2O2 esto en intervalos de 1 minuto midiendo a la misma longitud de onda. La Aril-alcohol oxidasa (AAO) se midió a temperatura ambiente en tampón fosfato 100 mM, pH 6.0 y con alcohol veratrílico 10 mM como sustrato en condiciones estándar. Esta enzima chata liza la reacción oxidando el alcohol veratrílico en presencia de oxigeno a veratraldehído y produce agua oxigenada. Este ensayo enzimático es continuo y por lo tanto se realiza directamente en la cubeta del espectrofotómetro midiendo el incremento del valor de absorbancia a 310 nm durante un tiempo determinado. El valor de ε0 7/15 para calcular la concentración de veratraldehído fue de 9300 M-1cm-1. Para cuantificar la actividad se usa la unidad internacional (μmol/min). Crecimiento de Trichoderma sobre diferentes sustratos en medio sólido y líquido Se pretende determinar los sustratos y condiciones en los cuales Trichoderma es capaz de mostrar un mejor crecimiento además de la cantidad de azúcares reductores que pueda liberar el medio, teniendo en cuenta que parte de esos azúcares se consumen por el hongo para su metabolismo. A continuación se muestra la Tabla 1 con las condiciones de siembra para el Trichoderma con el cual se ha realizado el trabajo. Análisis de azúcares reductores Los azúcares reductores en las disoluciones obtenidas a partir de las distintas materias primas tratadas con Trichoderma se determinaron por el método del ácido bicincónico (COPA PATIÑO et al. 1993). Tabla 1. Condiciones de siembra de Trichoderma Medio sustrato Agar bacteriológico al 2% Algodón Agar bacteriológico al 2% Gasa Agar bacteriológico al 2% Papel de Pinus radiata Agar bacteriológico al 2% Papel de Eucalyptus globulus Agar bacteriológico al 2% Carboximetilcelulosa Agar Agar Agar extracto de malta Agar extracto de malta Agua Astillas de Pinus radiata Agua Astillas de Eucalyptus globulus Agua Fosforitos de Pinus radiata Agua Fosforitos de Eucalyptus globulus Agua Serrín de Pinus radiata Agua Serrin de Eucaliptus globulus Agua Papel de Pinus radiata Agua Papel de Eucalyptus globulus Agua Gasa Agua Algodón Medio Kirk modificado Astillas de Pinus radiata Medio Kirk modificado Astillas de Eucalyptus globulus Medio Kirk modificado Fosforitos de Pinus Radiata Medio Kirk modificado Fosforitos de Eucalyptus globulus Medio Kirk modificado Serrín de Pinus radiata Medio Kirk modificado Serrin de Eucaliptus globulus 8/15 Medio Kirk modificado Papel de Pinus radiata Medio Kirk modificado Papel de Eucalyptus globulus Medio Kirk modificado Gasa Medio Kirk modificado Algodón Identificación de la especie del Trichoderma Haciendo uso de un microscopio óptico y con una cámara especial que lograba una mejor definición de la morfología del hongo Tri-7 se identificó morfológicamente la especie de este hongo. 4. Resultados Producción de enzimas. Se obtuvieron distintos crudos enzimáticos producidos por las 20 cepas de Pleurotus ostreatus,. Se analizó la actividad lacasa, manganeso peroxidasa y aril alcohol oxidasa a diferentes tiempos. La Aril-alcohol oxidasa es una enzima que aporta producción de H2O2 para la actividad de las peroxidasas. Los caldos una vez concentrados alcanzaron los niveles de actividad ligninolítica que se presentan a continuación. Tabla 2. Producción máxima de enzimas ligninolíticas en 20 cepas de Pleurotas ostreatus. Cepa Máxima actividad Lacasa (U.A.) Dia Máxima actividad Manganeso Peroxidasa (U.A.) Dia Máxima actividad Aril Alcohol Oxidasa (U.A.) Dia 1 0,0342 10 0,001 4 0,10245 14 2 0,0069 8 0,00165 10 0,02005 8 3 0,01 12 0,00085 14 0,39795 28 4 0,00735 4 0,0047 30 0,0186 30 5 0,01855 4 0,01095 10 0,0267 14 6 0,02485 4 0 0 0,00605 16 7 0,0662 12 0,0024 6 0,0554 24 8 0,0003 12, 14, 16 0,00015 4, 20 0,00085 12 9 0,00035 6 0,00185 6 0,00405 6 10 0,0022 6 0,00045 12 0,0009 16 11 0,0219 4 0,0001 2 0,0041 12, 16 12 0,0073 30 0,01365 22 0,00565 22 13 0,00025 10 0,0002 6 0,00015 10 14 0,01985 22 0,00005 2 0,01985 22 15 0,0058 14 0,00035 6 0,5442 14 16 0,01705 8 0,0002 4 0,09355 14 9/15 17 0,0416 22 0,0027 6 0,0416 22 18 0,029 24 0,0003 4 0,029 24 19 0,003 10 0,0002 4 0,00135 14 20 0,0172 4 0,00405 28 0,01105 30 Como se ha puede observar en la Tabla 2 se producen cantidades variables de las enzimas ligninolíticas, tanto lacasa como manganeso peroxidasa en todas las cepas sometidas a estudio en las condiciones de cultivo empleada. Esto permite confirmar la potencialidad de estos microorganismos para participar de forma evidente en la desestructuración de la matriz lignocelulósica para los procesos posteriores que puedan dar lugar a la producción de bioetanol. Ya que la cantidad de manganeso peroxidasa obtenida en la mayoria de los experimentos es inferior a la actividad producida por la lacasa en cada una de las cepas, se llevó a cabo un experimento empleando un colorante como Poly R46 el cual es decolorado especificamente en medio sólido por esta enzima (GOLD et al. 1988). En la Figura 1 se muestra el comportamiento de 80 monocariontes de Pleurotas ostreatus frente a este colorante, siendo los resultados coincidentes con los obtenidos en el análisis de la actividad enzimática de las cepas mostrado en la Tabla 1. Figura 1. Crecimiento de 80 monocariontes de P. ostreatus frente al colorante Poly R 476 Crecimiento de los Trichoderma en placa en medio sólido y en medio líquido Con el fin de determinar la capacidad del crecimiento de hongos productores de enzimas celulólíticas tales como Trichoderma se sembraron varias cepas en placas de agar y como fuente de carbono se emplearon los siguientes sustratos tal y como se han detallado en la Tabla 1: algodón, gasa, Pinus radiata, Eucalyptus globulus, carboximetilcelulosa, agar (control negativo) y Agar Extracto de malta (control positivo). Tres días después de la siembra se identificaron los sustratos en los cuales hongos se desarrollaba de forma más significativa, siendo algodón, gasa, serrín de Eucalyptus globulus así como agar extracto de malta, los que ofrecieron mejores resultados. En la Figura 2 se muestran diferentes ejemplos del crecimiento sobre alguno de los sustratos estudiados. Es importante mencionar que los hongos también crecieron en sólo agar, es decir, sin ninguna fuente de carbono extra, indicando que con una aportación mínima de nutrientes es capaz de desarrollarse. Respecto al medio líquido Kirk modificado y agua, se desarrollaron de mejor forma en medio Kirk modificado en condiciones estáticas, ya que la agitación podría de interferir el crecimiento de los hongos. En el agua como medio de cultivo con las diferentes fuentes de carbono también crecieron los Trichoderma, pero el desarrolló fue menor que en el medio Kirk modificado. 10/15 Trichoderma harzianum es una cepa que presenta una alta actividad celulolítica y crece vigorosamente sobre gasa y pasta de Eucalipto. Presentando alta actividad celulasa, también se ha confirmado que es capaz de desarrollarse sobre determinados sustratos pretratados donde hay mayor presencia de lignina y hemicelulosa y los resultados son concluyentes el hongo es capaz de crecer aun teniendo este tipo de barreras para acceder a la celulosa. a b Figura 2. Crecimiento de Trichoderma sobre dos sustratos: (a) gasa y (b) serrín de Pinus radiata Los experimentos llevados a cabo para determinar el contenido en azúcares reductores en determinados sustratos tratados previamente con el hongo, indican la existencia de azúcares reductores y que en los casos de celulosa, algodón y la gasa, la liberación de azúcares reductores se produce exclusivamente por la acción de las enzimas secretadas por el Trichoderma. A continuación se muestran la Tabla 3 y la Figura 3 en las que se detallan las muestras estudiadas y el contenido en azúcares reductores liberados al medio de las mismas. Tabla 3. Azúcares reductores en algunos medios donde se desarrollo el hongo Trichoderma.. Número de muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Muestra Absorbancia Fosforito de Pinus radiata en agua Astillas de Eucalyptus globulus en agua Papel de Eucalyptus globulus en agua serrín de pino en agua Fosforitos Eucalyptus globulus en agua serrín de Eucalyptus globulus en agua Papel de pino en M. Kirk estático Gasa en M.Kirk en agitación Gasa en M.Kirk en estático Papel Eucalyptus globulus M. Kirk estático Papel de pino en agua y estático serrín de pino en M.Kirk estático Gasa en agua y en agitación serrín Eucalyptus globulus M. Kirk agitado Algodón en M. Kirk estático Algodón en M. Kirk agitado 0.81 1.585 0.08 0.553 1.979 1.796 0.119 0.037 0.203 0.045 0.196 0.31 0.002 0.984 0.208 0.3 Azúcares en µmol/ml 31.71900826 63.74380165 1.553719008 21.09917355 80.02479339 72.46280992 3.165289256 0.0 6.636363636 0.107438017 6.347107438 11.05785124 0.0 38.90909091 6.842975207 10.6446281 11/15 Azúcares reductores, μmol/mL 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Muestra Figura 3. Comportamiento de algunos sustratos en la liberación de azúcares reductores. Identificación de la especie de Trichoderma Se llevó a cabo una identificación de las cepas utilizadas mediante un microscopio de alta resolución. Para ello se analizaron las esporas y se observó la forma de sus conidios. En función de su morfología y de acuerdo a la bibliografía se dedujo que se trataba de Trichoderma harzianum (Figura 4). Cabe mencionar que este tipo de hongos se desarrollan rápidamente, en comparación de los Basidiomicetos que necesitan semanas para obtener un crecimiento aceptable y por ello los Trichoderma son los competidores naturales de algunos hongos Basidiomicetos en cultivo como P.ostreatus.. a b Figura 4. Conidióforos de Trichoderma harzianum (a) y esporas del mismo (b) 5. Discusión Los resultados preliminares mostrados demuestran que es posible desarrollar concentrados de enzimas ligninolíticas producidos por cepas de hongos basidiomicetos, utilizando sus capacidades de crecimiento en diferentes medios de cultivo. Una purificación y aislamiento posterior de dichas enzimas atendiendo a los criterios de una máxima actividad ligninolítica sobre distintos sustratos, permitiría desarticular la estructura de la materia prima para las etapas posteriores en el proceso de obtención de bioetanol, primero en condiciones controladas de laboratorio y posteriormente en el escalado de las mismas para lo que se 12/15 requiere el apoyo de la ingeniería de procesos. Este hecho resolveria el primer gran reto del proceso global. Por otro lado también se ha puesto de manifiesto la potencialidad de hongos Deutorimicetos productores de enzimas celulolíticas tales como Trichoderma que poseen un potente sistema exo e intracelular para desarticular la celulosa. Según hemos demostrado, estos hongos poseen capacidad para desarrollarse en un amplio espectro de sustratos. Se han obtenido los primeros resultados de presencia de glucosa libre en los caldos de cultivo, teniendo presente que cuando aplicamos el hongo al sustrato la degradación que se realiza es para satisfacer el metabolismo del hongo, dando lugar a azúcares reductores en la mayoria de los casos. Por tanto, estos resultados avalan la posibilidad real del empleo de estos hongos como poderosas herramientas para acometer la segunda gran dificultad del proceso, la obtención de azúcares capaces de ser fermentados hasta etanol. El desafío ahora se encuentra en producir enzimas celulolíticas en calidad y cantidad que permitan desarticular la celulosa hasta glucosa y separar las pentosas o reducirlas para que no interfieran o al menos levemente en los posteriores procesos de fermentación. Los resultados obtenidos en nuestros laboratorios hasta el momento abren una línea de investigación que al igual que otros grupos europeos y latinoamericanos que trabajan en el tema nos permite prever que los procesos combinados de tratamiento de la biomasa vegetal son una vía de solución para los combustibles de segunda generación. Hay una bibliografía emergente en esta dirección que comienza señalar la importancia de desarrollar tecnologías en este ámbito (HENDRIKS, A.T.W.M. Y ZEEMAN, G. 2009). 6. Conclusiones Los resultados preliminares que aquí se presentan demuestran que se pueden implementar procesos enzimáticos, junto a los termoquímico-mecánicos como alternativa real para transformar la lignocelulosa. Las enzimas ligninolíticas producidas por Pleurotus ostreatus así como los complejos celulolíticos producidos por hongos en este caso Trichoderma harzianum permiten abordar el proceso de desarticulación del material lignocelulósico y una posterior degradación de la celulosa a unidades de glucosa. Dentro de este ámbito el papel desempeñado por diferentes variedades de hongos con propiedades ligninolíticas y celulolíticas es esencial. En este sentido se abren nuevas vías de investigación para adaptar la biología molecular de estos organismos a los procesos de producción de bioetanol a partir de distintos materiales lignocelulósicos. 7. Agradecimientos Agradecemos a las autoridades del Gobierno de Morelia, México por la beca concedida a Giovanni Hernández para realizar la estancia en nuestros laboratorios. Y al proyecto AGL 2005-08005-CO2-02 del MICINN, España. 8. Bibliografía ANDER, P., y L. MARZULLO. 1997. 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