secuenciación del dna

Filogenia y Taxonomía
bacteriana.
Evolución: implica
- descendencia con modificación
- desaparición de formas de vida
- diversidad de organismos actuales
- elevado nivel de complejidad
- organismos bien adaptados,
bajo la presión de la selección
natural.
De qué manera se produce la evolución de los organismos?
Mediante variación en la secuencia de DNA
Cómo se producen estas variaciones en la secuencia de DNA?
Mutaciones (errores en la replicación, UV etc.)
- Adaptativas: mejoran la capacidad de supervivencia
- Deletéreas: disminuyen la capacidad de supervivencia
- Neutrales: ni mejoran ni disminuyen.
Otros:
Duplicación génica
Transferencia génica horizontal
Recombinación homóloga
Mejorar la supervivencia de los organismos bajo las nuevas
condiciones ambientales
A QUÉ SE DENOMINA FILOGENIA?
-Estudia las relaciones evolutivas entre los organismos.
-Las relaciones filogenéticas entre las células se pueden
deducir mediante la comparación de la información genética
que existe en sus ácidos nucleicos o en sus proteínas.
-Las moléculas que forman el ribosoma, en particular las del
RNA de los ribosomas (rRNA), resultan ser indicadores
excelentes para determinar las relaciones evolutivas.
GENES UTILIZADOS EN EL ANÁLISIS FILOGENÉTICO
Genes de la subunidad pequeña del RNA ribosómico
(small subunit ribosomal RNA o SSU rRNA)
- Procariotas: genes que codifican el rRNA 16S
- Eucariotas: los genes del rRNA 18S.
Procariota:
70S
30S: rRNA
16S y 21
proteínas
50S: rRNA
5S y 23S y
31 proteínas
-Imágenes tomadas de: www. Google/ imágenes
Eucariota:
80S
POR QUÉ SON APROPIADOS LOS GENES DE LA SUBUNIDAD
PEQUEÑA DEL RNA RIBOSÓMICO PARA EL ANÁLISIS
FILOGENÉTICO?
- están universalmente distribuidos
- son estables y constantes en su función, forman parte integral de la
maquinaria de síntesis proteica básica de toda célula viva
- están lo suficientemente conservados (cambian lentamente)
- tiene la longitud adecuada, de tal modo que proporcionan una visión de
la evolución que abarca todos los organismos vivos.
Base de datos de secuencias génicas de rRNA: Ribosomal database
Projet II (RPD-II: http://rdp.cme.msu.edu)
MOLÉCULAS USADAS PARA MEDIR DIVERGENCIAS
EVOLUTIVAS
RELOJ O CRONOMETRO MOLECULAR: un gen (rRNA), cuya secuencia de DNA
puede emplearse como medida temporal comparativa de divergencia evolutiva.
RNAs ribosómicos (rRNA) : 5S, 16S y 23S (Carl
(Carl Woese)
Woese)
Proteínas conservadas: factor de elongación Tu (síntesis de proteínas),
proteína de choche térmico Hsp60, sintetasas de tRNA.
Varios citocromos
Ferrodoxinas (proteínas de hierro y azufre)
Subunidad beta de ATPasa
Gen recA (proteína:
(proteína: recombinasa, requerida para la recombinación
genética, solo en bacterias
bacterias))
rRNA Procariota: 70S
30S: rRNA 16S y 21 proteínas
50S: rRNA 5S y 23S y 31 proteínas
NOMBRE
TAMAÑO
(nucleótidos)
UBICACIÓN
5S
120
Subunidad mayor
16S
1500
Subunidad menor
23S
2900
Subunidad mayor
Fuente: Brock. Biología de los Microorganismos.10ª ed.
El correlativo eucariótico es el rRNA 18S de los ribosomas 80S
El gen de la subunidad grande del 23S rRNA ( LSU rRNA) también
resulta útil para proveer información filogenética, en tanto que su
secuencia es más larga proporciona información adicional, si bien
es más cara y lenta de secuenciar.
Dado que el RNA 16S es más manejable experimentalmente
que el RNA 23S, se ha utilizado preferentemente para
desarrollar la filogenia en procariotas (en eucariotas se
secuencia el rRNA 18S de los ribosomas 80S).
SECUENCIAS DEL RNA RIBOSÓMICO y árboles
filogenéticos:
Los métodos para obtener secuencias del rRNA y generar árboles
filogenéticos implican una combinación de Biología Molecular y análisis
computarizado.
Las nuevas secuencias generadas se comparan con secuencias obtenidas
de bases de datos:
● RDP II: Base de Datos del Proyecto de Secuenciación Ribosómica
(contiene una colección de secuencias, actualmente supera las 440.000 y
proporciona una variedad de programas de análisis)
Dirección online: http://rdp.cme.msu.edu/html/
● GenBank (USA)
● DDSS (Japón)
● EMLB (Alemania)
Utilizando un programa de análisis, se generan árboles filogenéticos
y se selecciona el que mejor se adapte a la información evolutiva
presente en las secuencias.
Árboles filogenéticos: representación de las líneas de descendencia y la
relación entre dos organismos deben interpretarse y se construyen a
partir de un parentesco (similitudes y diferencias) con un ancestro común
A partir de diferencias en la secuencia de
nucleótidos: construcción de un árbol
filogenético , que ilustra gráficamente las
relaciones entre secuencias de los organismos.
Está compuesto de ramas y nodos.
Los nodos internos: los ancestros
Los extremos de las ramas: las distintas
cepas de las especies bacterianas
de las cuales se obtuvieron las secuencias.
Ramas: definen el orden de la descendencia, los
ancentros de los nodos y la longitud: N° de
cambios.
Cuanto mas reciente sea el ancestro común
compartido entre dos especies, más cercanas se
consideran esas especies. Ej: la B esta mas cercana
a la C que a la A, porque B y C comparten un
ancestro común mas reciente (nodo 2) que B y A
(nodo1)
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12ª ed.
PASOS A SEGUIR PARA GENERAR UN ÁRBOL FILOGENÉTICO
DNA
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12ª ed.
Amplificación por PCR del gen del 16 rRNA a partir del DNA genómico:
obtención suficiente cantidad de DNA del gen del 16 rRNA para poder
secuenciar, con el uso de cebadores específicos:
Amplificación por PCR del gen del 16S rRNA
Termociclador
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12ª ed. y
de www.google/imagenes.
1465 nucleótidos
SECUENCIACIÓN DEL DNA
Secuenciación: determinación del orden preciso de los nucleótidos en
una molécula de DNA (o RNA).
-
Se utilizan cebadores cortos (10 a 20 nucleótidos)
de DNA: iniciadores de la síntesis de nuevas cadenas
MÉTODOS:
•
Método didesoxi de Sanger
-
Secuenciación automatizada
-
Pirosecuenciación 454
1-MÉTODO DIDESOXI DE SANGER
Se basa en el uso de:
-Dideoxinucleótidos (ddNTP) :carecen del grupo OH en el carbono 3´ y la
elongación de la cadena no puede continuar
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 10 ed.
2
1
4
5
7
3
6
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 10 ed.
Secuenciación automatizada: se
utilizan cebadores marcados con
pigmentos fluorescentes. Los
productos se separan por
electroforesis automatizada y las
bandas se detectan por
espectroscopia de fluorescencia.
Los resultados son analizados por
un ordenador y se genera una
secuencia, en la que cada una de
los 4 bases se distingue por un
color.
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12 ed.
Pirosecuenciación 454: genera datos de
secuencias cien veces más rápido que los
métodos anteriores. Se libera un grupo pirofosfato
que aporta la energía necesaria para la liberación
de luz-
ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS:
consiste en alinear dicha secuencia con la secuencia de genes homólogos de
otras cepas o especies, identificándose las diferencias (desapareamientos,
inserciones delecciones o huecos).
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12 ed.
Programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool: thhp://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST
-Imágenes tomadas de: www. Google/ imágenes
ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS:
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12 ed.
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12 ed.
Aspectos que asocian bacterias o arqueas con eucariotas
Características
Bacterias
Arqueas
Eucariotas
Lípidos de membrana
enlace éster
enlace éter
enlace éster
Fotosíntesis c/clorofila
Sí
No
Sí
Presencia de histonas
No
Sí
Sí
Pared celular
contiene Ác murámico No contiene
tRNA iniciador
formilmetionina
Polimerasa de RNA
una (4 subunidades) una (8- 12 sub) tres (8-14 sub)
Sensibilidad a
Cloranfenicol,
estreptomicina y
kanamicina
Sí
metionina
No contiene
No
metionina
No
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos 12 ed.
SECUENCIAS FIRMA O SIGNATURA
Oligonucleótidos cortos de secuencia definida que forman
parte de la secuencia del SSU rRNA y que caracterizan
organismos específicos o grupos de organismos
filogenéticamente relacionados. Secuencias específicas de
ciertos grupos de organismos, por ej. para cada uno de los
dominios, de un género o especie en particular.
Usos:
- Clasificar microorganismos recientemente aislados
- Previamente mal clasificados
Ejemplos:
AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria
CACACACCG (posición 1400) en Archaea
El uso más habitual de las secuencias firma es el diseño de sondas de ácidos
nucleicos específicas.
Secuencias signatura de RNA 16S o 18S que definen los tres dominios de la vida
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 10ª ed.
Sonda molecular: cadena de acido nucleico que una vez marcada puede
utilizarse para que hibride con su cadena complementaria en una mezcla de
ácidos nucleicos
SONDAS FILOGENÉTICAS
Sondas universales de SSU de rRNA están diseñadas para unirse a
secuencias conservadas en el rRNA de cualquier microorganismo, con
independencia del dominio al que pertenezca.
Sondas específicas que reconozcan exclusivamente especies del dominio
Bacteria, gracias a secuencias firma que sólo se encuentran en su RNA.
Sondas específicas de Archaea o Eukarya que reaccionarán con las
respectivas especies de uno u otro dominio.
Pueden diseñarse sondas filigenéticas que reconozcan grupos específicos
dentro de un dominio, como determinadas familias, géneros o especies.
HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU (FISH,
Fluorescence In Situ Hybridization))
-Imágenes tomadas de: www. Google/ imágenes
HIBRIDIZACIÓN FLUORESCENTE IN SITU (FISH)
Bacillus
Levaduras
Aplicaciones:
Ecología y diagnostico clínico
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ª ed.
RIBOTIPADO
método para la identificación de organismos basado en el análisis de los
fragmentos de DNA generados por digestión de sus correspondientes
genes del rRNA mediante una enzima de restricción.
Características
- No requiere secuenciación
-Digestión del DNA de la bacteria con enzimas de restricción
- Separación de los fragmentos resultantes mediante electroforesis en gel
- Los fragmentos separados de DNA se transfieren a una membrana de
nylon y se hibridan con una sonda marcada del gen 16S rRNA
- El patrón generado por los fragmentos de DNA en el gel se digitaliza
- Se compara con los patrones de referencia de otros microorganismos
disponibles en la base de datos.
Ribotipado de cuatro bacterias lácticas diferentes: rápido y específico
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ª ed.
Aplicaciones:
Diagnostico clínico y análisis microbiológico de alimentos
Sistemática microbiana: es el estudio de la diversidad
de los organismos y sus relaciones mutuas o de parentesco;
incluye la taxonomía y la filogenia.
Taxonomía: es la ciencia de la
identificación, la clasificación y la
nomenclatura.
La taxonomía utiliza tres tipos de métodos: fenotípicos,
genotípicos y filogenéticos para la identificación y descripción
de las bacterias.
ALGUNAS CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE VALOR TAXONÓMICO
√ Morfología: morfología de la colonia, reacción a tinción de Gram,
tamaño y forma de la colonia, presencia de esporas, cuerpos de
inclusión, etc.
√ Movilidad: no móvil, movilidad por flagelos, movilidad por
deslizamiento, movilidad por vesículas gaseosas, etc.
√ Metabolismo: mecanismos de conservación de energía (fotótrofo,
quimioorganotrofo, quimiolitótrofo), utilización de compuestos de
carbono, etc.
√ Fisiología: rangos de temperatura, pH, y sales para su crecimiento,
respuesta al oxígeno, producción de enzimas extracelulares, etc.
√ Química celular: ácidos grasos, lípidos polares, quinonas
respiratorias, etc.
√ Otros aspectos: pigmentos, luminiscencia, sensibilidad a
antibióticos.
Desventajas de la utilización de FAME:
REQUIERE UNA ESTRICTA ESTANDARIZACIÓN,
ESTANDARIZACIÓN, ya que el perfil
de ácidos grasos de cualquier bacteria varia en función de la
temperatura, fase de crecimiento y medio de cultivo.
Es necesario estandarizar todas las condiciones para poder
comparar el perfil de ácidos grasos del microorganismo problema con
el de la base de datos.
Su aplicación se limita a aquellos microorganismos que puedan
crecer en condiciones estandarizadas.
No esta claro el perfil de cepas individuales dentro de una misma
especie
MÉTODOS GENOTÍPICOS UTILIZADOS EN TAXONOMÍA BACTERIANA
MÉTODO
Hibridación DNA/DNA
DESCRIPCIÓN/APLICACIÓN
Comparación de similitud de genomas. Útil p/
diferenciar especies dentro de un género.
Pérfil de DNA
Ribotipado, AFLP, Rep- PCR. Métodos rápidos para
diferenciar entre especies y entre cepas dentro de una
misma especie.
MLST
Tipado de cepas utilizando las secuencias de DNA de
múltiples genes. Útil p/ diferenciar cepas muy cercanas
dentro de una misma especie.
Contenido de G+C
Porcentaje de pares de bases de G+C en el genoma.
Es poco común en taxonomía, porque tiene una
resolución pobre.
AFLP: polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados
MLST: análisis de secuencias multilocus
Rep- PCR: secuencias palindrómicas extragénicas repetitivas
HIBRIDACIÓN DNA-DNA
1- DNA genómico
2- Cortar y marcar
3- Desnaturalizar
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
Rep-PCR (repetitive extragenic palindromic PCR): basado en la
Repexistencia de elementos muy conservados de DNA repetitivos
distribuidos aleatoriamente en el cromosoma bacteriano.
El número y posición
difiere entre cepas de
la misma especie.
Utilizando cebadores
específicos que
amplifican dichos
elementos por PCR de
distintos fragmentos
genómicos, se genera
un patrón de bandas,
produciendo una
huella de DNA (DNA
fingerprinting)
especifica para cada
cepa.
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados):
se basa en la digestión del DNA genómico con una o dos
enzimas de restricción y la amplificación selectiva de estos
fragmentos.
Se genera un patrón de
bandas, produciendo
una huella de DNA (DNA
fingerprinting) especifica
para cada cepa.
El elevado número de
bandas proporciona un
grado elevado de
discernimiento entre cepas
de la misma especie
-Imágenes tomadas de: www. Google/ imágenes
Análisis de secuencia multilocus (MLST): implica la
secuenciación de varios genes de mantenimiento básico
celular de un determinado organismo (cromosoma), y su
comparación con los genes equivalentes de otra cepa del
mismo organismo.
1- Amplificación y secuenciación de
los genes diana (450pb)
2- Se comparan las secuencias
nucleotídicas y se toman las
diferencias.
3- Cada diferencia o variante de
secuencia: alelo del gen (número).
4- A cada cepa se le asigna un
conjunto de números: perfil alélico o
tipificación de secuencias
multilocus..
multilocus
5- El grado de relación entre los
distintos perfiles alélico:
alélico:
dendrograma (0: cepas idénticas y 1:
cepas poco relacionadas).
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
Muy útil para detectar cepas patógenas de una misma especie y en epidemiología
Proporción GG-C: porcentaje de G+C. 20% al 80% en bacterias
-Si la proporción de G
G--C de dos organismos difiere en mas de un 5%: poco
emparentados.
-Si la proporción de G
G--C es idéntica puede ser engañosa: secuencias
nucleotídicas muy diferentes
-No tiene futuro en taxonomía bacteriana.
Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE): estudios
epidemiologicos
RANGOS TAXONÓMICOS EN CLASIFICACIÓN BACTERIANA
TAXONES::
TAXONES
TAXÓN DE MAYOR NIVEL
Dominio
Phylum
Clase
Orden
Familia
Género
Especie: unidad fundamental de la diversidad biológica.
Sub--especie
Sub
Importancia en estudios clínicos y ecológicos
Especie procariota: colección de cepas que presenta un alto grado de
similaridad en una serie de rasgos independientes: hibridaicón DNA-DNA
de al menos 70% y parecido de secuencia del 16 S rRNA de al menos el
97%.
Fuente: Brock Biología de los Microorganismos. 12ed.
SISTEMA BINOMIAL DE NOMENCLATURA
(Linneo)
Los procariotas reciben: Género y especie
Los nombres derivan del latín o griego latinizado
que describen alguna propiedad típica de la especie
cursivas.
y se escriben con letras itálicas o cursivas.
Ej:
Escherichia coli o E. coli
Bacillus subtilis o B. subtilis
El código Internacional de Nomenclatura Bacteriana
MANUAL DE BERGEY
Manual Bergey de Bacteriología Sistemática
(Bergey s Manual of Systematic Bacteriology):
Bacteriology):
Es la principal recopilacion en el campo de la taxonomía microbiana
Compendio de información estándar y molecular de todas las especies
reconocidas de procariotas en el momento de su publicación, y contiene
tablas, figuras y otra información útil a los efectos de identificación de
microorganismos.
La segunda edición del Manual Bergey (Vol I: 2001; Vol II: 2005; 3 vol
adicionales: 2007), publicado en 5 volúmenes a partir del 2001 ha incluido
muchos conceptos surgidos de los estudios de secuenciación del rRNA con
abundante información de la taxonomía clásica.
The Prokaryotes (http://www.prokaryotes.com)
COLECCIONES DE CULTIVO:
CULTIVO:
depósitos de la diversidad
bacteriana
American Type Culture Collection (ATCC, Colección Americana de Cultivos
Tipo; Manasas, Virginia, EE.UU)
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen (DSMZ,
Colección Alemana de Microorganismos; BraunsBrauns-Chweig, Alemania)
Las colecciones catalogan y conservan microorganismos y los distribuyen
bajo pedido, a investigadores de instituciones académicas, médicas o
industriales.
La cepa depositada sirve como cepa tipo de la nueva especie y como estándar
para comparar otras cepas que se cree que pueden ser la misma.
Conservación de los cultivos vivos:
- Liofilizados
- Congelados a bajas temperaturas: -80º C a -196º C