Tesis Electrónicas UACh - Universidad Austral de Chile

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Química y Farmacia
PROFESOR PATROCINANTE: Dr. Alejandro Yáñez C.
INSTITUTO: Bioquímica y Microbiología
FACULTAD: Ciencias
“INDUCCIÓN DE GENES DE RESISTENCIA DE LA FAMILIA RND EN LA CEPA DE
Piscirickettsia salmonis AUSTRAL 005 POR EXPOSICIÓN AL ANTIBIÓTICO
FLORFENICOL”
Tesis de Grado presentada como
parte de los requisitos para optar
al Título de Químico Farmacéutico
PAULINA VALENZUELA YÁÑEZ
VALDIVIA-CHILE
2014
AGRADECIMIENTOS
Quisiera comenzar por agradecer al Dr. Alejandro Yáñez por su constante apoyo, su ánimo,
paciencia y cariño demostrado a lo largo de este proceso, sin el nada de esto hubiese podido ser
posible, a mi familia por estar al lado impulsándome en cada paso de este proceso por hacerme
sentir que era capaz, a mis amigos compañeros y pareja que me alegraron y alivianaron la carga.
También deseo agradecer al equipo del laboratorio, por su paciencia y tremendo apoyo en el
trabajo realizado.
1
INDICE
1.-RESUMEN..................................................................................................................................8
1.1.-Abstract .................................................................................................................................9
2.- INTRODUCCION ......................................................................................................................9
2.1.- Antecedentes de Piscirickettsia salmonis. ..........................................................................10
2.1.1-Características de Piscirickettsiosis .................................................................................10
2.1.2-Manifestaciones Clínicas...................................................................................................11
2.1.3Agente etiológico de Septicemia Rickettsial. .....................................................................12
2.1.3.1.- Distribución estacional.................................................................................................12
2.1.4.-Mecanismo de Transmisión del patógeno.......................................................................12
2.1.5.-Métodos de diagnóstico de P. salmonis. ..........................................................................13
2.1.6.-Aislamiento de P. salmonis. .............................................................................................14
2.1.7.-Prevención ........................................................................................................................14
2.2.-Antimicrobianos. .................................................................................................................15
2.2.2.-Terapia antimicrobiana. ..................................................................................................16
2.2.3.-Florfenicol .........................................................................................................................17
2.3.-Mecanismos de resistencia ..................................................................................................18
2.3.1.-Bombas de expulsión ........................................................................................................19
2.3.2.-La familia RDN (“RND”, Resistance-Nodulation-cell Division) ...................................22
3.-MATERIAL Y METODO.........................................................................................................32
3.1.-Materiales: ...........................................................................................................................32
3.2.-Metodo .................................................................................................................................35
4.-RESULTADOS ..........................................................................................................................49
5.-DISCUSION.....................................................................................................................87
6.-BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................................94
2
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Esquema del complejo tripartito.
20
Figura 2. Modelo estructural representativo de la fam. “RND”.
21
Figura 3. Estructura del transportador trimérico AcrB.
23
Figura 4. Estructura cristalina de TolC, AcrA y AcrB
25
Figura 5. Diagrama de transportadores de resistencia.
28
Figura 6. Ensayos cinética de inducción
42
Figura 7. Identificación in silico de los genes de resistencia a drogas en
el genoma de Piscirckettsia salmonis AUSTRAL 005
49
Figura 8. Identificación por Inmunofluorescencia Indirecta (IFAT) para
cepa P. salmonis Austral005
51
Figura 9. Confirmación de P. salmonis vía tinción de Gram
52
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa de Piscrickettsia salmonis
53
Figura 11. Susceptibilidad de P. salmonis a Florfenicol
55
Figura 12. Curvas de disociación para estandarización de partidores (qPCR)
57
Figura 13. Curvas de disociación para estandarización de partidores (qPCR))
58
Figura 14. Curvas de disociación para estandarización de partidores (qPCR)
59
Figura 15. Expresión relativa de los transportadores de eflujo en P. salmonis
61
Figura 16. Gráfico de cinética de inducción del gen DDE2
67
Figura 17. Gráfico de cinética de inducción del gen RNDM
69
Figura 18. Gráfico de cinética de inducción del gen ACRv
71
Figura 19. Gráfico de cinética de inducción del gen ACRBcon
73
3
Figura 20. Gráfico de cinética de inducción del gen IS1
75
Figura 21. Gráfico de cinética de inducción del gen RVE1
77
Figura 22. Gráfico de cinética de inducción del gen RNDD
79
Figura 23. Gráfico de cinética de inducción del gen ACRB240
81
Figura 24. Gráfico de cinética de inducción del gen RND240
83
Figura 25. Gráfico de cinética de inducción del gen AcrB1
85
Figura 26. Grafico global de inducción de la familia RND frente a
Florfenicol a una concentración de 0,5 µg/ml en la cepa de P. salmonis
AUSTRAL005
86
4
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Diseño partidores.
Página
34
Tabla II. Concentraciones de antibiótico, medio y bacteria para la
determinación de CIM de Florfenicol en P. salmonis.
39
Tabla III . Distribución de las concentraciones de Florfenicol
40
Tabla IV. Protocolo de RT-PCR
44
Tabla V. Reactivos y cantidad de estos utilizados qPCR
45
Tabla VI. Protocolo tiempo y ciclos de qPCR
46
Tabla VII. Análisis de identidad de secuencia mediante Blast
49
Tabla VIII Expresión relativa de genes en estudio para concentración 0,125
µg/ml
62
Tabla IX Expresión relativa de genes en estudio para concentración 0,25 µg/ml
63
Tabla X Expresión relativa de genes en estudio para concentración 0,5 µg/ml
64
Tabla XI Expresión relativa de genes en estudio para concentración 0,1 µg/ml
.
65
5
LISTA DE ABREVIATURAS
ADN: Ácido desoxirribonucleico
ARN: Ácido ribonucleico
CAT: Catalasa
COX: Ciclooxigenasa
dsARN: ARN de doble cadena
EROs: Especies reactivas de oxígeno
E.coli: Escherichia coli
mARN: Ácido desoxirribonucleico
mL: Mililitro
P: Péptido
Pb: Pares de bases
PCR: Reacción en cadena de polimerasa
qPCR: Reacción en cadena de polimerasa cuantitativa
RND: Resistance-Nodulation-Cell Division
6
RT-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
SAG: Servicio Agrícola y Ganadero
SFB: Suero fetal bovino
SYBR: Syber green
µg: Microgramo
μL: Microlitro
7
1.-RESUMEN
Piscirickettsia salmonis es la única integrante del género Piscirickettsia, pertenece a la familia
Piscirickettsiaceae dentro de las Gammaproteobacterias. El primer brote de piscirickettsiosis se
describió en salmón plateado Oncorhynchus kisutch para luego producir altas mortalidades en
salmones coho cultivados en su fase de agua de mar. Esta bacteria es responsable de cuantiosas
pérdidas en el ámbito de la salmonicultura, afectado principalmente a las especies de engorda, las
que representan un ingreso importante para la economía chilena. Recientemente el SRS ha sido
parcialmente controlado a través del uso de antibióticos que no son totalmente eficaces y tienen
problemas derivados de su toxicidad y la generación de resistencia. Por esto en este trabajo se
identifico mediante análisis de bioinformática los genes involucrados en el sistema de resistencia
a antibióticos con respecto a una familia de bombas de expulsión denominada RND (resistancenodulation-cell division), para luego evaluar la expresión de genes de resistencia en la cepa P.
salmonis AUS005 mediante la técnica de PCR realtime el cual mostró cambios en la expresión de
los genes seleccionados al ser expuesto a distintas concentraciones del antibiótico Florfenicol
ampliamente utilizado para tratar este síndrome en los salmones. Este estudio nos da una base
para empezar a comprender el gran problema que se genera por el uso de antibióticos, lo cual nos
da luces de como en el futuro proceder para mejorar el manejo de estos diseñado otras pautas de
tratamiento o fármacos que inhiban estas bombas.
8
1.1.-Abstract
Piscirickettsia salmonis is the only member of the genus Piscirickettsia, belongs to the family
within Piscirickettsiaceae Gamma-Proteobacteria. The first outbreak of piscirickettsiosis
described in coho salmon Oncorhynchus kisutch and then produce high mortalities in farmed
coho salmon in the seawater phase. This bacterium is responsible for losses in the field of
salmon, mainly affected species fat, which represent an important income for the Chilean
economy. Recently, SRS was partially controlled through the use of antibiotics which are not
totally effective and have problems associated with its toxicity and the emergence of resistance.
By this shall identify by bioinformatics analysis of genes involved in antibiotic resistance system
with respect to a family named RND efflux pumps (resistance - nodulation -cell division), and
then evaluate the expression of resistance genes in the strain P.salmonis AUS005 the expression
of selected genes associated with resistance to antibiotics through the realtime PCR technique
which showed expression changes when exposed to antibiotic Florfenicol widely used in the
salmon was quantified field, which is a base to start investigating this area that it is a big problem
today.
9
2.- INTRODUCCION
2.1.- Antecedentes de Piscirickettsia salmonis.
La septicemia rickettsial salmonídea (SRS) o Piscirickettsiosis es una síndrome causada por
Piscirickettsia salmonis perteneciente a la clase gamma proteobacteria, orden Thiotrichales, de la
familia Piscirickettsiaceae del género Piscirickettsia (Fryer y Lannan et al. 2005). En Chile, fue
descrita en 1981 donde los primeros brotes se presentaron en la zona del canal de Huito,
extendiéndose posteriormente al canal Caicaén, ambos ubicados en la comuna de Calbuco,
provincia de Llanquihue, décima región. Este síndrome, que en un comienzo sólo se vio
circunscrita a estas dos zonas geográficas, se extendió a casi la totalidad de los centros de cultivo
de especies de salmones en fase marina y en trucha arcoíris criadas en estuarios, llegando a
producir hasta un 90% de mortalidad en algunos centros de cultivo. Durante el primer año de la
enfermedad cerca de 1,5 millones de Salmones Coho (Oncorhynchus kisutch), ubicados en las
zonas cercanas a Puerto Montt y la Isla de Chiloé de nuestro país, murieron con etiología
desconocida, asignada posteriormente a SRS. Estas muertes resultaron en pérdidas en ese
entonces por más de 10 millones de dólares en la industria acuícola de Chile (Cvitanich et al.,
1990).
2.1.1-Características de Piscirickettsiosis
El patógeno P. salmonis es un microorganismo Gram negativo, inmóvil, acapsulado,
pleomórfico, cocobacilo intracelular de 0,2-0,5 µm de diámetro. En un principio fue descrito
como un patógeno intracelular obligado pero posteriormente se describió que posee la capacidad
de crecer en medio enriquecido con sangre y cisteína clasificándolo nuevamente como un
patógeno facultativo (Mauel, et al., 2008; Mikalsen, et al., 2008; Yañez et al., 2012). Mediante el
uso de microscopía electrónica de transmisión se ha observado que posee en su superficie dos
membranas, una externa ondulada y una interna citoplasmática (Fryer et al., 1990; Cvitanich et
al., 1991). Se multiplica por fisión binaria dentro de vacuolas citoplasmáticas rodeadas por una
membrana, en forma esparcida o en agrupaciones que le dan el aspecto de mórula.
10
La cepa de referencia se denomina LF-89 y se encuentra almacenada en la American Type
Culture Collection (ATCC), registrada como VR-1361 y corresponde al primer aislado de P.
salmonis descrito por el grupo de Fryer y al mejor caracterizado hasta el momento, quien logró
recuperar la bacteria a partir de un cultivo de tejido renal de Salmón Coho moribundo. Para ello,
utilizó un cultivo celular de la línea de embrión de Salmón Chinook (Oncorhynchus
tshawytscha), CHSE-214 (ATCC CRL 1681). Posteriormente, se determinó que P. salmonis
también es capaz de infectar otras líneas celulares de salmónidos, produciendo inicialmente la
formación de agrupaciones de células vacuolizadas, redondeadas que dan paso a focos de lisis
con posterior desprendimiento de la monocapa. La temperatura óptima de crecimiento de P.
salmonis in vitro es de 18ºC, disminuyendo su replicación bajo 10ºC y sobre 21ºC (Fyer et al.,
1990).
2.1.2-Manifestaciones Clínicas.
Los signos clínicos
de la septicemia rickettsial del salmón (SRS) o piscirickettsiosis, son
múltiples e inespecíficas, es una enfermedad de curso septicémico, generalmente los peces se
ubican en las esquinas de las jaulas y la superficie del agua, (Bravo et al,. 1989) por lo que
pueden ser fácilmente capturados, tienen un nado lento, errático y descoordinado (Larenas et al.,
1995); presentan coloración corporal oscura y acentuada, palidez branquial, lo que refleja una
anemia severa, corroborada por los niveles de hematocrito que en peces moribundos corresponde
a un 27% o menos (Bravo y Campos, 1989). Además, muestran lesiones en la piel como
erosiones y extensas áreas descamadas (Larenas et al., 1995). El análisis de necropsia revela
esplenomegalia, el hígado aumentado de tamaño y con presencia de nódulos subcapsulares de
color cremoso amarillento, el tubo digestivo se encuentra sin contenido y presenta petequias,
además el riñón en conjunto al corazón se presenta aumentado en su tamaño, en algunos casos,
está cubierto con una pseudomembrana blanquecina, lo que sugiere pericarditis. También existe
un aumento en el volumen del líquido cefalorraquídeo, acompañado en muchos casos de una
congestión las membranas meníngeas, lo que es congruente con los signos nerviosos (Bravo y
Campos, 1989; Cvitanich et al., 1991; Larenas et al., 1995). Finalmente, al examen
histopatológico, se observa inflamación leve, células necróticas y cambios degenerativos en todos
11
los órganos anteriormente nombrados y un gran número de microorganismos difusamente
teñidos. En los vasos se observa coagulación intravascular diseminada y trombos de fibrina
(Bravo y Campos, 1989; Cvitanich et al., 1991; Larenas et al., 1995).
2.1.3Agente etiológico de Septicemia Rickettsial.
2.1.3.1.- Distribución estacional
La enfermedad ocurre principalmente en otoño y comienzos del invierno (marzo-agosto),
típicamente entre los 12-16°C. Un segundo pico, más leve que el anterior, puede presentarse a
fines de la primavera.
2.1.4.-Mecanismo de Transmisión del patógeno.
No se ha establecido aun las condiciones que gatillan la aparición de Piscirickettsiosis o el
mecanismo de transmisión de la bacteria. Los primeros brotes fueron asociados con un aumento
del estrés causado por las fluctuaciones en la temperatura del agua, tormentas severas o
floraciones de algas no tóxicas, sin embargo, importantes pérdidas de peces se siguen observando
después de la desaparición de éstas condiciones, por lo que no se ha determinado una fuerte
asociación entre los brotes de SRS y las condiciones medio ambientales. Por otro lado, se ha
considerado la posibilidad de la participación de un huésped intermediario o vector como
mecanismo de transmisión. Agentes tales como los piojos de mar Calligus spp., o isópodos y
moluscos, quienes se mueven libremente a través de las jaulas en las regiones donde ha brotado la
enfermedad, siendo propuestos como vectores de transmisión (Sema et al., 2006). Sin embargo,
éstos pueden no ser necesarios para el traspaso de la bacteria a su huésped; ya que la
supervivencia extracelular de P. salmonis es de 14 días a 15 °C en agua de mar (Lannan y Fryer,
1994). Estudios por Cvitanich et al. (1991) reportaron la transmisión horizontal entre salmones,
en estanques de agua dulce y de mar a 15 °C, mientras que Garcés et al. (1991) no observó
transmisión de la enfermedad entre salmones infectados y no infectados en un estanque con flujo
continuo de agua dulce a 8 °C. Adicionalmente, estudios por Larenas et al. (2003) evaluaron la
12
transmisión vertical de la P. salmonis mediante la inoculación en machos y hembras de Trucha
Arcoiris con la bacteria, que posteriormente fue detectada por IFAT en bazo en la mayoría de los
peces muestreados y en las crías cuando uno o ambos padres fueron inoculados, sin embargo, los
alevines infectados no mostraron signos de la enfermedad. No obstante, la demostración es poco
concluyente y solo se ha visto in vitro, por lo que hasta ahora, la transmisión de la enfermedad se
considera horizontal en base a la evidencia in vivo. Concretamente San Martin et al., (2010),
señala que la transmisión es horizontal por contacto directo o indirecto entre peces, requiriendo
de vectores para que ocurra la infección.
2.1.5.-Métodos de diagnóstico de P. salmonis.
Los métodos actuales que nos permiten detectar y confirmar la presencia de P. salmonis en peces,
se basan en signos y síntomas generales y hallazgos histológicos usando técnicas histoquímicas
como Hematoxilina y Eosina, Gram, Giemsa, naranja de Acridina, azul de metileno y PAS para
la detección del patógeno en frotis o secciones de tejido. Estas técnicas son rápidas y
ampliamente utilizadas, pero no son específicas (Fryer et al, 1990. Almendras y Fuentealba,
1997), los métodos basados en anticuerpos son más específicos para confirmar la presencia de P.
salmonis (Fryer y Lannan, 1996). Como por ejemplo, la inmunofluorescencia indirecta (IFAT)
que proporciona una buena sensibilidad y especificidad permitiendo la detección del patógeno en
variados tipos de muestra; y la inmunohistoquímica (IHC), que es rápida, puede ser utilizado
tanto en tejidos fijados en formalina o muestras fijadas en cera teniendo la ventaja de la
inmunodetección en que se puede realizar el examen en tejido infectado y con lesiones
histopatológicas (Alday-Sanz et al., 1994). Otra técnica ampliamente usada es el PCR,
herramienta rápida, altamente sensible y específica, que permite la detección de ADN genómico
de P. salmonis. El PCR es útil para la detección del organismo en las primeras etapas de la
infección. Su uso también permite el análisis sobre sus características taxonómicas y ecológicas,
examinar los modos de transmisión, hospederos naturales y su distribución geográfica (Mauel et
al., 1996).
13
2.1.6.-Aislamiento de P. salmonis.
El aislamiento de P. salmonis es a partir de líneas celulares de peces proveniente de lesiones con
este patógeno. Esta técnica posee limitaciones que se fundamentan en su lentitud y dificultad;
dado que el cultivo debe ser realizado sin antibióticos y esta ausencia expone a los cultivos
celulares a la contaminación por otros agentes microbiológicos (Fryer y Lannan, 1996). P.
salmonis es sensible a muchos antimicrobianos agregando además, que no hay crecimiento
bacteriano aunque haya sido inoculada en células CHSE-214 u otras líneas si tales compuestos
están incluidos en el medio de cultivo (Fryer et al., 2003), luego son incubados a 21 °C para que
el efecto citopático se alcance, este proceso tiene una duración de 15 a 22 días. Para su
conservación la bacteria posteriormente es llevada a placas de Austral TSFe y Austral TSHem, el
cual contiene triptona, peptona, yestolate, NaCl, glucosa, y cisteína y finalmente es incubado a 18
°C por 5-9 días (Yañez et al. A y B, 2012). Alternativamente las bacterias pueden ser cultivadas
en el medio Austral SRS broth por 5 días a 18 °C posteriormente alicuotadas y almacenadas a -80
ºC (Yáñez et al. 2012).
2.1.7.-Prevención
De acuerdo a los diversos organismos estatales como Sernapesca donde presentan programas
especiales para el monitoreo y prevención de esta enfermedad, se recomienda como medida
preventiva disminuir el estrés en los cultivos de salmónidos; por ejemplo trabajar con bajas
densidades, reducir al mínimo las manipulaciones, apartar lotes de peces por edad y extraer
constantemente los peces muertos, moribundos o anómalos. Son de fundamental importancia la
buena higiene, la desinfección de las instalaciones y la adquisición de peces en centros de cría
certificados.
Es necesario contar con métodos diagnósticos fiables que detecten antígenos de P. salmonis para
poder certificar alevines, ovas y reproductores, para que de esa forma se prevenga una eventual
transmisión horizontal o vertical de esta enfermedad.
14
2.2.-Antimicrobianos.
La Piscirickettsiosis es una enfermedad de difícil tratamiento y control ya que el agente causal es
intracelular facultativo y una vez que se genera un brote es muy difícil erradicarlo por lo que la
prevención y medidas generales de control de infecciones bacterianas, fundamentadas en una
mejora de las prácticas de gestión, basadas en la prevención de la enfermedad y la reducción del
estrés sobre los peces, permiten una disminución de la enfermedad, fundamentado además en la
eliminación de los peces muertos y clínicamente enfermos, (Branson et al., 1991; Almendras et
al., 1997).
Otras medidas adicionales, como el uso de antibióticos y vacunas, han sido empleadas
principalmente para la prevención y en algunos casos para el tratamiento de la enfermedad. En
primer lugar, los fármacos antimicrobianos han sido el principal método de tratamiento para los
casos de la enfermedad ya estando en curso. Ensayos in vitro han mostrado que la replicación de
P. salmonis es inhibida por estreptomicina, gentamicina, tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina,
ácido oxolínico, claritromicina, y sarafloxacina, y que es resistente a penicilina (Almendras y
Fuentealba, 1997). Actualmente los antibióticos más usados son flumequina, ácido oxolínico,
florfenicol y oxitetraciclina, administrados oralmente mezclándolos con el alimento de los peces.
Sin embargo, en muchos casos la enfermedad no se ha controlado, asociándose la inconsistencia
de estos tratamientos al desarrollo de resistencia (Fryer y Hedrick, 2003). Otras complicaciones
asociadas a los antibióticos tienen relación con su uso excesivo y poco controlado. Por ejemplo,
se ha calculado que en la industria chilena se usan entre 200-250 veces más antibióticos que en
Noruega. La presencia de grandes cantidades de antibióticos en las instalaciones de cultivo ha
producido alteraciones de la flora bacteriana en el entorno acuático induciendo la aparición de
bacterias resistentes, lo cual aumenta las posibilidades de transferencia de resistencia a bacterias
de animales terrestres y patógenos humanos, lo que podría tener efectos perjudiciales para la
salud animal, humana y el medioambiente (Cabello, 2006). En segundo lugar, el uso de las
vacunas, donde nacieron en respuesta a la ausencia de tratamientos efectivos contra la
Piscirickettsiosis por lo que se ha acentuado la necesidad de desarrollar estrategias que prevengan
la enfermedad y este método ha permitido a la industria del salmón controlar numerosas
enfermedades con éxito (Sommerset et al., 2005). Desde 1999 hasta el 2003 la vacunación contra
Piscirickettsiosis aparentemente disminuyó. El motivo principal de este descenso tendría relación
15
con las dudas sobre la eficacia de las vacunas comercialmente disponibles ya que, a diferencia de
lo observado en otras enfermedades bacterianas, su aplicación no ha reducido el uso de
antibióticos (Bravo y Midtlyng, 2007). Sin embargo, hoy en día se están evaluando estrategias
nuevas que permitan el desarrollo de vacunas orales, que eventualmente en combinación con la
vacunas convencionales permitan generar un nuevo plan de vacunación efectivo en la reducción
de la mortalidades asociadas a este patógeno (Tobar y Jerez, 2011).
2.2.2.-Terapia antimicrobiana.
El uso de los antimicrobianos, en la acuicultura, al igual que en la ganadería y en la avicultura,
son utilizados como profilácticos y para el tratamiento de infecciones bacterianas (Cabello et al,
2004), sin embargo, las evidencias experimentales y epidemiológicas indican claramente que el
uso de estas substancias farmacológicas de forma irresponsable es el detonante del proceso
evolutivo hacia la resistencia bacteriana; la cual conlleva a una serie de problemas biológicos,
médicos y económicos, dado que las infecciones producidas por estas bacterias resistentes a los
antibióticos generan mayor mortalidad y morbilidad, lo que va de la mano con el aumento de los
costos para el tratamiento e investigaciones con el fin de buscar nuevas opciones antimicrobianas.
El uso indiscriminado de los antibióticos, tanto en medicina humana como en veterinaria como
forma de promotores de crecimiento o incluso para el tratamiento de enfermedades de vegetales
en grandes plantaciones, ha conducido a la aparición de resistencias en muchos patógenos, como
estafilococos, neumococos, gonococos, Haemophilus, Salmonella, M. tuberculosis, el virus del
VIH o los plasmodios del paludismo. Hoy es bien conocido que los genes que codifican factores
de resistencia pueden pasar de unas bacterias a otras, de modo que bacterias inocuas para el
hombre, pero cuya resistencia es fruto del uso de antibióticos en veterinaria o agricultura, pueden
traspasar su resistencia a las bacterias patógenas para el hombre. Por tanto, el flujo vertical y
horizontal de los genes de resistencia crea una telaraña de reservorios imprevisibles (Prats et al.,
2003).
Para enfrentar esta problemática se hace necesario el uso de una herramienta clave, el
Antibiograma, que no es más que un estudio de la sensibilidad "in vitro" de un microorganismo
patógeno frente a las sustancias antibióticas o antimicrobianas (Bauer et al., 1996). Esta prueba
presenta al menos dos objetivos claramente definidos, el primero de ellos se fundamenta en medir
16
la sensibilidad de una cepa bacteriana, que haya sido evaluada previamente como la responsable
de una infección en presencia de antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los
requisitos previos que aseguran el adecuado funcionamiento del tratamiento farmacológico in
vivo, lo que facilita entonces la decisión terapéutica individual. El segundo objetivo es el de
seguir la evolución de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a
escala de un servicio, un centro de atención médica, una región o país, es como puede adaptarse
la antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos de los fármacos y
adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevención en
centros de cultivo u otros quehaceres veterinarios.
Esta prueba permite finalmente usar los antibióticos de una manera mesurada, responsable y a
dosis correctas evitando entonces la serie de problemas enumerados anteriormente. La cantidad
de estos fármacos, empleados en la industria acuícola de nuestro país según datos aportados por
el Ministerio de Economía el 2008 fueron de 325.616 Kg. (Intesal Chile, 2009). Antecedente
importante si se piensa en la resistencia que dichas cantidades de antimicrobianos usados podría
generar. En nuestro país el 79 % del consumo total de antimicrobianos en fase agua de mar se
destina para el tratamiento de la SRS, de los cuales el 50% corresponde a Florfenicol, por esto se
tratara el tema de la resistencia frente este antimicrobiano.
2.2.3.-Florfenicol
Fuente química: derivado fluorado de tianfenicol fue usado inicialmente en Asia en la acuicultura
desde los años 80, cerca de 1996 fue aprobada una formulación inyectable del fármaco, destinada
a combatir enfermedades respiratorias bovinas en los Estados Unidos (Keyes et al., 2000).
Mecanismo de acción: Florfenicol es un antibiótico bacteriostático que inhibe la síntesis de
proteínas mediante la unión a la subunidad 50s de los ribosomas, que conducen a la inhibición de
la peptidil transferasa, evitando de este modo la transferencia de aminoácidos a cadenas
crecientes de péptidos para la formación de proteínas . El sitio de unión bacteriano para
florfenicol es el mismo cloranfenicol y tianfenicol.
17
Florfenicol tiene un átomo de flúor en lugar del grupo hidroxilo situado en C-3 de la estructura de
cloranfenicol y tianfenicol, haciendo al florfenicol insensible a las cloranfenicol- acetiltransferasas, enzima productora del proceso de resistencia bacteriana al cloranfenicol. Su vía de
administración es preferentemente oral, sin embargo, también puede ser intraperitoneal. En Chile,
el uso del Florfenicol para la industria salmonera tiene una presentación, dosis y posología que
están establecidas de la siguiente manera: - Presentación y Vía de Administración: Suspensión
oral al 40% y polvo oral al 50%. - Dosis: 10 mg/kg biomasa/ día durante 7-10 días. La
biodisponibilidad vía oral en salmones del atlántico es de 96.5% y la vida media 12,2 h con una
dosis de 10 mg/kg cuando la temperatura del agua es 10.8 ± 1.5 °C.
2.3.-Mecanismos de resistencia
Las bacterias, por su tremenda capacidad de adaptación, pueden desarrollar diversos mecanismos
de resistencia frente a los antibióticos, una de ellas es la resistencia natural o intrínseca por parte
de las bacterias si carecen de diana para un antibiótico. La resistencia adquirida es la realmente
importante desde un punto de vista clínico: es debida a la modificación de la carga genética de la
bacteria y puede aparecer por mutación cromosómica por mecanismos de transferencia genética.
La primera puede ir seguida de la selección de las mutantes resistentes (rifampicina, macrólidos),
pero la resistencia transmisible es la más importante, estando mediada por plásmidos,
transposones o integrones, que pueden pasar de una bacteria a otra. Las bacterias se hacen
resistentes a los antibióticos desarrollando mecanismos de resistencia que impiden al antibiótico
ejercer su mecanismo de acción.
Los mecanismos de resistencia de las bacterias son fundamentalmente tres:
1) Inactivación del antibiótico por enzimas: La bacteria produce enzimas que inactivan al
antibiótico, en los Gram positivos suelen ser plásmidos inducibles y extracelulares y en las Gram
negativas también por plásmidos o por transposones, constitutivas y periplásmicas.
2) Modificaciones bacterianas que impiden la llegada del antibiótico al punto diana: Las
bacterias producen mutaciones en las porinas de la pared que impiden la entrada de ciertos
18
antibióticos o alteran los sistemas de transporte. En otras ocasiones pueden provocar la salida del
antibiótico por un mecanismo de expulsión activa, impidiendo que se acumule en cantidad
suficiente para que actúe eficazmente.
3) Alteración por parte de la bacteria de su punto diana, impidiendo o dificultando la acción
del antibiótico. Aquí podemos contemplar las alteraciones a nivel del ADN girasa, del ARNr
23S, de las enzimas PBPs, entre otras.
Una misma bacteria puede desarrollar varios mecanismos de resistencia frente a uno o muchos
antibióticos y del mismo modo un antibiótico puede ser inactivado por distintos mecanismos de
diversas especies bacterianas, todo lo cual complica sobremanera el estudio de las resistencias de
las bacterias a los distintos antimicrobianos.
2.3.1.-Bombas de expulsión
Los organismos vivos se comunican en gran medida con el medio que les rodea a través de
sistemas de transporte sustrato-específicos. Estos sistemas consisten en proteínas integrales de
membrana que se expanden múltiples veces por la membrana citoplasmática.
Estas proteínas que forman canales específicos para cada sustrato y que están acopladas a una
fuente de energía y/o a proteínas situadas en la membrana externa, pueden conferirle a la célula la
capacidad para bombear un soluto y reconocerlo con una alta afinidad (Saier et al., 1998). Las
proteínas que son parte de estos transportadores han sido ampliamente estudiadas desde el punto
de vista estructural, funcional, filogenético. En la actualidad hay descritas en bacterias cinco
familias de transportadores; MFS (Major Facilitator Superfamily), ABC (ATP-Binding-Cassette)
y MATE (multidrug and toxic compound extrusion) son mayoritarias y ancestrales, mientras que
las otras dos familias SMR (Small Multidrug Resistance) y RND (Resistance-Nodulation-cell
Division) son minoritarias y con un origen evolutivo más reciente (Saier et al., 1998). Por lo
general, el número de sistemas de transporte está en proporción al tamaño del genoma del
microorganismo en cuestión, excepto en bacterias adaptadas a sobrevivir en medio ambientes
pobres en materia orgánica y ricos en minerales donde llegan a tener hasta dos veces menos
transportadores en relación al tamaño del genoma (Saier et al., 1998).
19
Muchos de estos transportadores tienen un papel importante en lo que se denomina resistencia a
multidrogras (MDR, multidrug resistance). Estos sistemas catalizan la expulsión activa de
compuestos biogénicos y xenobióticos no relacionados estructural o funcionalmente, desde el
citoplasma o la membrana interna hacia el medio externo (Krulwich et al., 2005; Piddock, 2006;
Borges-Walmsley y Walmsley, 2001). Las evidencias experimentales indican que las
características físico-químicas de los compuestos (carga, hidrofobicidad o anfipatía), las
interacciones de van der Waals que establecen éstos con los residuos de los sitios activos, y la
flexibilidad de estos sitios para acomodar distintas moléculas, son los factores determinantes de
la amplia especificidad de sustrato de estos sistemas de extrusión (Neyfakh, 2001; Murakami et
al., 2002; Yu et al., 2003). Aunque se puede pensar que estos transportadores de antimicrobianos
surgieron recientemente en respuesta a la quimioterapia antimicrobiana y a compuestos de
síntesis humana, el hecho de que haya un número similar de bombas de extrusión que confieren
multirresistencia en microorganismos patógenos y no patógenos y el hecho de que muchos estén
codificados en el cromosoma, sugiere que juegan un rol fisiológico importante en la expulsión de
sustancias tóxicas que normalmente tienen lugar en la naturaleza (tales como toxinas naturales,
productos finales del metabolismo endógeno, y antibióticos) y que también expulsan nuevas
drogas de fabricación reciente por ser éstas de estructura similar a los respectivos sustratos
naturales (Saier et al., 1998). Junto con las proteínas transportadoras, se han identificado dos
familias de proteínas accesorias que funcionan conjuntamente con algunos de los transportadores.
Estas dos familias han sido designadas de acuerdo a su localización celular en la envoltura de las
bacterias Gram-negativas y su presunta función, y se conocen con el nombre de familia OMP
(Outer Membrane Protein) y familia MFP (Membrane Fusion Protein). Se cree que el conjunto de
estas tres proteínas (transportador, OMP y MFP) permiten el transporte a través de ambas
membranas de la envoltura de las bacterias Gram-negativas en un simple paso acoplado a una
fuente energética. La construcción de este complejo tripartito sugiere que los compuestos tóxicos
son expulsados directamente al medio externo y no al periplasma (Nikaido y Takatsuka, 2008).
Esta es una gran ventaja para las células bacterianas, ya que los compuestos una vez expulsados
al medio externo deben atravesar la membrana externa para volver a entrar a la célula (Figura 1).
20
Figura 1. Esquema del complejo tripartito. Los compuestos anfifílicos (rectángulos achurados
que representan las partes hidrofóbicas e hidrofílicas respectivamente, de la molécula) son
hipotéticamente capturados tanto desde el periplasma (o de la interfaz periplasma- membrana
plasmática) como desde el citosol (o de la interfaz citosol-membrana plasmática). Para el último
proceso hay dos posibles caminos: en ambos el sustrato primero atraviesa la membrana hasta la
superficie externa de la membrana citoplásmica y luego sigue el patrón de captura normal o es
capturado directamente desde el citosol. (Nikaido, 1996)
21
2.3.2.-La familia RDN (“RND”, Resistance-Nodulation-cell Division)
Esta familia de transportadores es ubicua encontrándose en bacterias, arqueas y eucariotas. El
transporte está en este caso, acoplado a la fuerza protón-motriz. Los transportadores son
complejos (1000 aminoácidos) y poseen una topología inusual y muy característica de esta
familia. La proteína contiene 12 segmentos transmembrana (STM) y 2 dominios
extracitoplásmicos entre las hélices 1 y 2, y las hélices 7 y 8 (Figura 2). Los análisis de la
secuencia primaria de estos transportadores, sugieren que probablemente hayan surgido como
resultado de una duplicación intragénica en tandem. Los análisis filogenéticos de los miembros
de esta familia realizados en los últimos años revelan la existencia de tres subfamilias cuyos
miembros se agrupan según su función (Saier et al., 1998). Una de las subfamilias posee
miembros que son específicos para iones divalentes de metales pesados, otra subfamilia
probablemente sea específica para el transporte de lipo-oligosacáridos, y otra subfamilia está
conformada por proteínas que expulsan múltiples drogas. Miembros de estas tres subfamilias se
han descrito solamente en bacterias gram-negativas. (Marger y Saier, 1993; Saier et al., 1998;
Borges-Walmsley y Walmsley, 2001).
22
Figura 2. Modelo estructural representativo de los miembros de la familia “RND”. La figura
muestra los segmentos transmembrana y los dos lazos periplásmicos (Saier et al., 1998)
23
En general, estos transportadores juegan un rol importante en la resistencia a una gran variedad
de compuestos tóxicos en bacterias gram-negativas siendo también capaces de transportar una
gran variedad de sustratos que no siempre guardan una gran similitud a nivel de su estructura, por
ejemplo, antibióticos, compuestos flavonoides y mutágenos como el bromuro de etidio (Piddock,
2006; Ramos et al., 1998; Mosqueda y Ramos, 2000; Rojas et al., 2001, Saier et al., 1998).
Una de los transportadores más estudiado de esta familia es AcrB de E. coli, que actuando
conjuntamente con AcrA (MFP) y TolC (OMP) es capaz de transportar antiobióticos como
penicilinas,
cefalosporinas,
fluoroquinolonas,
macrólidos,
cloramfenicol,
tetraciclinas,
novobiocina, ácido fusídico, oxazolidinonas, y rifampicina; detergentes como Tritón X-100, SDS
(dodecilsulfato de sodio) y sales biliares, y también disolventes orgánicos (Nikaido, 1996). La
estructura cristalina de este transportador y de sus proteínas asociadas, TolC y AcrA, han
permitido conocer algunos detalles de su funcionamiento.
AcrB se organiza como un trímero en una estructura en forma de medusa, con una pieza de
“cabeza” de unos 100 Å que se localiza en el periplasma y una región anclada en la membrana
interna de unos 50 Å (Figura 3). Tres de los dominios transmembrana de cada protómero se
organizan en una estructura a modo de anillo con un hueco central que cruza la membrana y se
extiende hasta la parte de debajo de la pieza de cabeza. El transportador posee unas pequeñas
aperturas (vestíbulos) entre las subunidades al final del dominio periplásmico cerca de la
superficie externa de la membrana citoplasmática.
Estas aperturas conducen a la gran cavidad central dentro del dominio transmembrana (Figura 3).
Se cree que los compuestos tóxicos difunden a través del vestíbulo hasta llegar a la cavidad
central donde son capturados (Nikaido y Takatsuka, 2008). TolC también se organiza de forma
trimérica adoptando una conformación cilíndrica que se abre hacia el extremo anclado en la
membrana externa pero que se constriñe hacia el extremo periplasmático.
24
Figura 3. Estructura del transportador trimérico AcrB. En la figura se muestra el dominio
transmembrana, el dominio periplásmico, la cavidad central, el vestíbulo, el poro y el embudo.
Las drogas se unen aproximadamente a nivel de la superficie externa de la bicapa lipídica. (Yu et
al., 2003; Yu et al., 2005).
25
Muestra dos dominios principales: una parte que se difunde por la membrana externa con una
estructura de barril β y una región α-helicoidal como un pasaje que se expande por el periplasma.
La proteína TolC tiene una longitud de 100 Å, lo cual se acerca a la longitud mínima que puede
tener el espacio periplásmico (130 Å). El extremo periplásmico de AcrB tiene las extensiones
precisas para encajar con el final del túnel TolC (Borges-Walmsley et al., 2003; Nikaido y
Takatsuka, 2008; Borges-Walmsley y Walmsley, 2001) (Figura 5). El componente AcrA tiene
una organización muy elongada en la que parece que el extremo N-terminal (que lleva unido un
lípido) está insertado en la membrana.
Medidas hidrodinámicas indicaron que AcrA (MFP) tiene una longitud cercana de 210 Å, por lo
que es viable que las MFP’s sean necesarias para aproximar las membranas entre sí (BorgesWamsley y Walmsley, 2001, Borges-Walmsley et al., 2003). La capacidad de las MFP’s de
formar trímeros estables, sugieren que éstas tienen un papel importante en la formación de un
canal conector entre la translocasa (AcrB) y TolC permitiendo el paso de los sustratos hacia
exterior. La unión sería estable solo durante el transporte del sustrato según está descrito
(Fernandez-Recio et al., 2004, Borges-Walmsley et al., 2003; Borges-Walmsley y Walmsley,
2001).
Aunque la ruta de extrusión no está dilucidada en la estructura cristalina, se cree que los
compuestos son atrapados a través de los vestíbulos localizados justo en la superficie externa de
la membrana citoplasmática, llegan al techo de la cavidad central, entran en el poro central y lo
cruzan hasta llegar al final del dominio periplásmico (Nikaido y Takatsuka, 2008). El extremo
periplásmico interactúa transitoriamente con la proteína de fusión de membrana, abriéndose el
canal para permitir el paso del sustrato. (Zgurskaya y Nikaido, 2000; Fernandez-Recio et al.,
2004). Por tanto parece que los sustratos se reclutan en el periplasma más que en el citoplasma.
Esto se ha demostrado para aquellos compuestos que no son capaces de atravesar la membrana
citoplasmática,
como
los
compuestos
dianiónicos
(carbenicilina,
ceftriaxona)
y los
aminoglicósidos, pero que sin embargo son sustrato de estas bombas (Nikaido, 1996). Si bien
parece quedar claro que la captura de sustratos desde el citoplasma también tiene lugar, no queda
tan claro si éste es el modo de captura que predomina.
26
Figura 4. Estructura cristalina de TolC, AcrA y AcrB. Organización hipotética de la
estructura tripartita TolC (rojo)- AcrA (azul)- AcrB (verde) basado en la estructura cristalina
obtenida por difracción de rayos X (Nikaido y Takatsuka, 2008).
27
Asimismo se ha visto que las bombas RND actúan en sinergismo con otros transportadores.
Como por ejemplo sucede con P. aeruginosa; TetA una bomba de la familia MFS que expulsa
tetraciclina, confiere un nivel de resistencia relativamente bajo (CIM = 32 µg/mL) en ausencia
del principal transportador RND, MexA-MexB-OprM; en ausencia de TetA la CIM conferida por
el transportador RND es de 4 µg/mL. Sin embargo, la CIM aumenta fuertemente (CIM 512
µg/mL) cuando ambos transportadores se expresan a niveles normales y constitutivos. La
explicación más plausible de esto es que la tetraciclina es bombeada hacia el periplasma por TetA
desde donde es capturada por el complejo tripartito (MexAB-OprM) y expulsada hacia el exterior
de la célula (Lee et al, 2000). Esto a su vez enfatiza la importancia del mecanismo de captura
desde el periplasma de las bombas RND (Nikaido y Takatsuka, 2008).
En algún momento se ha sugerido que estos transportadores trabajan sinergísticamente con la
membrana externa. Sin embargo, la inactivación del transportador más importante de una bacteria
(por ejemplo, AcrB en E. coli ó TtgGHI para disolventes en P. putida DOT-T1E) hace que esta
se vuelva susceptible al compuesto toxico en cuestión, a pesar de tener la membrana externa
intacta (Nikaido y Takatsuka, 2008; Ramos et al., 1998).
Cada uno de los componentes es imprescindible para la extrusión del compuesto tóxico, ya que
la falta de alguno de ellos hace que el transportador no desempeñe su papel (Nikaido y
Takatsuka, 2008). Algunos de estos transportadores están codificados junto con sus
correspondientes OMP y MFP (MexAB-OprM, MexEF-OprN, TtgABC, TtgDEF, TtgGHI entre
otros (Poole et al., 1993; Koehler et al., 1997; Ramos et al., 1998; Rojas et al., 2001) mientras
que en otros casos tan sólo se co-transcriben la translocasa con su correspondiente MFS,
utilizando una OMP que puede ser compartida entre varios transportadores (por ejemplo AcrAB
que utiliza TolC, MexXY que se une a OprM; (Srikumar et al., 1997; Aires et al, 1999; Fralick,
1996; Mine et al., 1999). No está claro cómo se acoplan estos complejos y porqué en unos casos
las tres proteínas se co-transcriben y en otros casos no. A diferencia de las proteínas de fusión de
membrana (MFP), las proteínas de membrana externa (OMP) de los sistemas de extrusión
descritos en bacterias Gram-negativas pueden cambiarse entre distintos sistemas de transporte y
entre bombas de la misma familia (Yoneyama et al., 1998, Srikumar et al., 1997, Zgurskaya y
Nikaido, 2000). TolC de E. coli (esencial para el funcionamiento del transportador AcrAB en esta
28
cepa) también colabora en la función transportadora de las bombas MexD y MexY de P.
aeruginosa cuando éstas son expresadas en células de E. coli en ausencia de su correspondiente
proteína de membrana externa nativa (Srikumar et al., 1998). Otro ejemplo lo constituye la
proteína OprM de P. aeruginosa la cual se acopla al menos a dos transportadores de la familia
RND, MexB y MexY (Zgurskaya y Nikaido, 2000). Además, TolC tiene la capacidad de
interactuar con diferentes clases de antiportes de membrana interna pertenecientes a la misma
familia o de familia diferente (RND, ABC y MFS) (Figura 6) (Piddock, 2006; Fernandez-Recio
et al., 2004).
29
Figura 5. Diagrama de transportadores de resistencia. Pertenecientes a las familias ABC,
RND y MFS, todos ellos formando un complejo tripartito con TolC en bacterias Gram-negativas
(Piddock, 2006).
30
Por los antecedentes expuestos se plantean la siguiente hipótesis y objetivos:
Hipótesis
“Piscirickettsia salmonis posee una amplia gama de sistemas de resistencia a antibióticos
que son positivamente activados por el antibiótico Florfenicol”
Objetivo general
Evaluar e identificar la presencia y expresión de genes de resistencia de la familia RND en la
cepa de Piscirickettsia salmonis (Austral 005) a distintos tiempos de exposición a antibióticos y
concentración de estos.
Objetivos específicos
1. Identificación mediante análisis in silico de los genes de la familia RND presentes en el
genoma de Piscirickettsia salmonis.
2. Determinación de la expresión de genes de resistencia de la Super familia RND en
RNAm de P. salmonis mediante la técnica de PCR real time.
3. Determinación del efecto de Florfenicol en la modulación de la expresión de genes de
resistencia RND.
31
3.-MATERIAL Y METODO
3.1.-Materiales:
3.1.1.-Reactivos e insumos:

Applichem: Agar.

BectonDickinson, Tinción de Gram

Bioschile: SRS Fluoro Test indirecto.

Bioworld: D-Glucose, anhydrous.

Difco: Gram stain kit.

Dako: medio de montaje “Fluorescent mounting medium”

Difco: Mueller Hinton Broth.

Epicentre, RNase-Free DNase I

Gibco: Fetal Bovine Serum, Minimum Essential Medium.

Heathrow Scientific: Solution Basin, 55-mL Polystyrene, Sterile.

Merck: Etanol Absoluto

Merck: M-MLV Transcriptasa reversa

Mo- Bio: LB Broth.

US Biological: Florfenicol, L-Cysteine Hydrochloride Anhydrous.

VWR: Sterile Syringe Filter 0.2 µm Cellulose Acetate Membrane.37

BectonDickinson, Tinción de Gram
3.1.2.-Material Biológico

Microorganismo patógeno intracelular facultativo Piscirickettsia salmonis cepa
AUSTRAL 005.

Línea celular de leucocitos de riñón anterior de Salmo salar (SHK-1)

Cepa tipo de E. coli ATCC 25922
32
3.1.3.-Instrumentos

Autoclave: Market Forge Sterilmaticm

Balanza analítica, AS310/C/2 Radwag.

Balanza granataria, WTB 200 Radwag.

Baño termorregulable, Memmert.

Cámara de PCR: BIOAIR Aura PCR, Escoclass II BSC Airstream.

Cámara de flujo laminar: LABCARD Class II Biological Safety Cabinet.

Centrifuga eppendorf, centrifuge 5810 R

Espectrofotómetro de placas de Elisa, Biotek, modelo Synergy 2.

Filtros: Orange Scientific Membrane CA, porosity 0,2um, inlet luer lock, outlet luer slip.

Fuente de poder: Bio-Rad Power Pac Basic.

Frascos con tapa rosca: Duran Schott 100 mL,250 mL, 500 mL y 1000 mL.

Gabinete de Bioseguridad clase 2. Esco.

Jeringas: NIPRO jeringa de plástico desechable

Incubadora con agitador orbital, LM-510-2/5 mrc.

Incubadora ARQUIMED Autotwing FTC 90E

Micropipetas, Labnet.

Microondas, somela Fancy WTI700

NanoDrop 2000 SPECTROPHOTOMETER: Thermo SCIENTIFIC

Parafilm Laboratory Film 4 IN. X 125 FT. ROLL.

Placas 96 pocillos para qPCR: Multigene plate 96 white

Termoblock: BIOSAN T-100 Thermo Shaker.

Termociclador PCR tiempo real: STRATAGENE Mx 3000P.

Termociclador AxygeneMaxygene.

Tubos falcon: AXYGEN Scientific screw cap tubes

Tubos Eppendorf: Scilogex

Vortex mixer VM-2000 mrc.
33
3.1.4.-Sistemas Informáticos

Software Gen® 5 (versión 1.10): Sistema utilizado para la interpretación de los resultados
por el espectrofotómetro de placas de Elisa.

Sofware Mx Pro de Stratagene: Permite la interpretación de resultados que arroja un
qPCR

Software Genious 7.0

Software sigmaplot 11.7
3.1.5.-Kits

Axygen: AxyprepMultisources Total RNA Miniprep kit (para extracción de RNA).

Agilent: 2 X Brilliant II SYBR Green QPCR master mixes.
34
3.2.-METODO
3.2.1.-Diseño de partidores
Para el diseño de partidores se utilizó la base de datos de NationalCenter for Biotechnology
Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). En esta base de datos se buscaron las secuencias
nucleotídicas correspondientes a los genes IS1-1, RVE-1, AcrB-1, DDE-2, ACRv-3, RNDD-4,
RNDM-1, AcrBcon-1, ACRB240-1, RND240-3 de Piscirickettsia salmonis. Los partidores se
diseñaron
con
el
programa
online
de
INVITROGEN
Oligo
Perfect
Design
(http://tools.invitrogen.com/content.cfm?pageid=9716), se seleccionaron los juegos de partidores
que amplificaban productos de PCR entre 100 y 200 pares de bases (Tabla1 ).
35
PARTIDOR
Secuencia nucleotídica 5´-3´
IS1-F1
GGAGCTTTGTTGGCCATAAG
IS1-R1
GCGCAATTAAAGCCTCATCT
RVE-F1
G A A G C G A TT G A A G A G C A A G G
RVE-R1
CGAATGGCTTTAGCTTCTGC
AcrB-F1
GCCAATTTAACCGGAGTTGA
AcrB-R1
TTCGGGACCAACAATACCAT
DDE-F2
GGGCTGGTTCTATGGCTTTA
DDE-R2
GTGAGGCTTTGAGCCATTTC
ACRv-F3
CGATTGTGACGATTCCTGTG
ACRv-R3
CAAATGGCGACAAACCTTTT
RNDD-F4
GGTCAGTGGCTTGGTTCAAT
RNDD-R4
TCAACACCCGATGCTGATTA
RNDM-F1
CAGTGACAAGGGTTGCCTTT
RNDM-R1
ATAGGCTGACTGTGCCTGCT
AcrBcon-F1
GCTCAGTGACCATTCAAGCA
AcrBcon-R1
CCGGAGGTTGCATAAGACAT
ACRB240-F1
CTACTGGCCCTCGTACTTGC
ACRB240-R1
GCTTAAAAATGCGGTTGGAA
RND240-F3
CCTGGCATGACGGTTTTACT
RND240-R3
CCCAAGAGCCTGGATGAATA
Tabla I. Diseño partidores. Segun la base de datos de NationalCenter for Biotechnology
Information
36
3.2.2.-Técnicas de identificación para Piscirickettsia salmonis
3.2.2.1.-Método de Tinción de Gram.
Se tomó una alícuota de aproximadamente de 10 a 20 μL (Sobrenadante de células SHK-1
infectadas o AUSTRAL SRS broth) y se situó sobre un portaobjetos. Se procedió a aplicar al
frotis fijado la tinción primaria (cristal violeta) y se dejó actuar por 1 minuto, se lavó suavemente
la tinción primaria con agua corriente fría. La segunda etapa consistió en cubrir la muestra con
Lugol y se mantuvo sobre ésta por 1 minuto, luego se retiró el mordiente lavando suavemente con
agua fría corriente. En la tercera etapa se agregó acetona/alcohol como agente decolorante, y se
lavó la muestra con abundante agua corriente. Finalmente se cubrió la muestra con un contra
colorante (safranina). Se examinó el frotis bajo microscopía en una lente de 100X con aceite de
inmersión.
Interpretación: bacterias de color azul se clasifican como Gram positivo y bacterias teñidas de
color rojo son Gram negativo. (Kruczak-Filipov et al., 1994).
3.2.2.2.-Ensayo de Inmunofluorescencia Indirecta
A partir de un frotis de bacterias fijadas en un portaobjetos se incubó con 100 μL de una solución
de anticuerpos Oligoclonales reactivas contra P. salmonis (kit Bios Chile) durante 30 minutos a
temperatura ambiente al interior de una cámara húmeda. Se utilizó solución de lavado diluida en
1:25 por cinco minutos para remover el exceso de anticuerpo primario. Se repitió este
procedimiento dos veces.
Una vez removida la solución de lavado se agregó sobre cada muestra 100 μL de anti-IgG de
Ratón conjugado con FITC, previamente diluido 1:100. Se Incubó los portaobjetos a temperatura
ambiente por 30 minutos en una cámara húmeda cerrada y en obscuridad. Posteriormente, se
repitió el procedimiento de lavado descrito para el primer paso y se aplicó 10 a 20 μL de solución
de montaje, se debió cubrir la muestra con un cubreobjeto evitando la formación de burbujas.
Finalmente se tomó la precaución de sellar los bordes del cubreobjeto con algún adhesivo
37
disponible comercialmente (esmalte de uñas transparente). Las muestras se examinaron en un
microscopio de Epifluorescencia con un aumento de 100X y aceite de inmersión.
Interpretación: Una muestra es positiva para P. salmonis cuando se observan estructuras cocoides
de intensa fluorescencia verde. En cambio, es negativa por la ausencia de dichas estructuras
(Anacker et al., 1986).
3.3.-Cultivo celular
La línea celular de riñón cefálico de salmón SHK-1 fue cultivada en medio esencial mínimo
(MEM) suplementada con 10% de SBF (Suero Bovino Fetal), 100 μg/ml de estreptomicina, y
100 U/ml de penicilina en T-flasks (Orange) de 75 cm2. Una vez las células alcanzaran un 95%
de confluencia, éstas fueron lavadas dos veces con PBS 1X y tratadas con tripsina 1X para un
nuevo pasaje.
3.3.1.-Cultivo de Piscirickettsia salmonis
Para la propagación de P. salmonis, se infectó la línea celular de Salmo Salar SHK-1 y se incubó
a 20°C (Lannan et al., 1984) en botellas de cultivo de 175 cm² (aproximadamente 7x10⁶ células)
con medio de cultivo L-15 suplementado con 2% de suero bovino fetal (SBF, Gibco BRL). Para
la recuperación de bacterias desde la línea celular infectada, se incubó hasta obtener un efecto
citopático de entre 90% - 100% de lisis celular, se retiró el sobrenadante de la botella de cultivo y
se centrifugó a 400 x g por 5 min para eliminar el debris celular. Posteriormente, el sobrenadante
se centrifugó a 2500 xg por 10 min y el sedimento fue re-suspendido en medio líquido
AUSTRAL-SRS Broth (Yáñez et al., 2012) y en una placa de agar TSFe (Yáñez et al., 2012)
para P. salmonis. Los cultivos se incubaron a 18°C con y sin agitación respectivamente hasta
observar crecimiento.
38
3.3.2.-Cultivo de Piscirickettsia salmonis en medio de cultivo AUSTRAL SRS Broth
A partir de una placa petri con colonias definidas y puras de P. salmonis, se extrajo una alícuota
con un asa estéril, se depositaron las bacterias en 10 mL de caldo dentro de un matraz estéril con
tapa rosca de 100 mL, y luego se incubó a 18 ºC en agitador orbital (60 rpm). La fase de
crecimiento exponencial se obtiene después de 2 a 3 días alcanzando la fase estacionaria a los 5
días (Yáñez et al., 2011). La absorbancia fue medida a 620 nm (Miller et al, 2005) siendo lo ideal
un valor mayor o igual a 0.8. Para mantener la pureza de los cultivos se trabajó bajo estrictas
condiciones de esterilidad, en Gabinete de Bioseguridad, esto debido a la naturaleza enriquecida
del medio y a la imposibilidad de usar antibióticos en los cultivos ya que la bacteria es sensible a
éstos, además, P. salmonis es de crecimiento lento y se requiere una temperatura de trabajo que
no supere los 20ºC.
3.4.-Susceptibilidad de la cepa P. salmonis AUSTRSL 005 a Florfenicol
Para la realización de este procedimiento se utilizaron microdiluciones de la cepa
AUSTRAL005, con absorbancia a 600nm entre un rango de 0,08 y 0,1, en el medio MuellerHinton.
Se usaron placas de ELISA de 96 pocillos estériles con tapa para la implementación de la técnica,
se utilizó una solución stock de 8 mg/mL de Florfenicol solubilizado en etanol de 95%. De esta
solución stock se obtuvieron las concentraciones de antibióticos necesarias para este ensayo que
fueron 0,125 μg/mL, 0,25 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL y 8μg/mL. A cada
pocillo se le agrego bacteria y se procedió a agregar cada concentración de antibiótico en
triplicado. Una vez terminado se incubó por 5 días a 18°C de temperatura, cada día se midió su
absorbancia en el lector de microplacas y el resultado se graficó por sigmaplot 11.0
39
3.4.1.-Concentración inhibitoria mínima (CIM) de Florfenicol en la cepa P. salmonis
AUSTRAL 005
Para este procedimiento se utilizaron microdiluciones de la cepa 005, con absorbancia a 620 nm
entre un rango de 0,08 y 0,1, en el medio AUSTRAL SRS Broth, basado en el método de MIC de
bacterias acuáticas de Miller et al, (2005).
Se preparó una solución stock de 8 mg/mL de Florfenicol soluble en etanol de 95%, de esta se
prepararon las distintas soluciones patrones a utilizar en la determinación de la MIC, las cuales e
fueron: 80 μg/mL, 8 μg/mL, 2 μg/mL, 0,8 μg/mL y 0,008 μg/mL.
Nombre químico: acetamida, 2,2-dicloro-N-[1 - (flouromethyl) -2 -hidroxi-2-[4 - (metilsulfonil)
fenil] etil] - [R-(R *, S *)]
Fórmula molecular: C12H14Cl2FNO4S
Peso molecular: 358.21
Punto de fusión: 153-154 ° C
Solubilidad: Soluble en agua y soluble en lípidos
Según esto se calculó cantidad de antibiótico, medio y bacteria a utilizar, como se detalla en la
tabla II, se usaron placas de 96 pocillos estériles con tapa y se procedió a la preparación de éstos
con los volúmenes determinados en la tabla II, y fueron distribuidos de acuerdo a la tabla III. El
tiempo de incubación para P. salmonis es de alrededor de 120 horas a 18 °C a una agitación de 50
RPM (Yáñez et al., 2011). Fue incluido un control de MIC de E. coli dentro de la placa de 96
pocillos en las columnas 11 y 12 (tabla III) para la validación de condiciones del antimicrobiano
para hacer posible su reproducibilidad hacia esta cepa tipo y otros aislados nacionales.
40
Stock
de Austral SRS AB(µL)
AB(µg/mL)
Bacteria(µL)
Broth (µL)
Concentración
final
de
AB(µg/mL)
Control
sin 180
-
20
-
AB
0,008
155
25
20
0,001
0,08
175
5
20
0,002
0,08
170
10
20
0,004
0,08
160
20
20
0,008
0,8
176
4
20
0,016
0,8
172
8
20
0,032
0,8
164
16
20
0,064
2
167,5
12,5
20
0,125
2
155
25
20
0,25
8
167,5
12,5
20
0,5
8
155
25
20
1
80
175
5
20
2
80
170
10
20
4
80
160
20
20
8
-
-
-
Control
sin 200
bacteria
Tabla II. Concentraciones necesarias de antibiótico, medio y bacteria montadas en las
placas para el método de determinación de CIM de Florfenicol en P. salmonis.
41
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
C+
0.06
C+
0.06
C+
0.06
C+
0.06
C+
0.06
C+
0.06
4
B
C
0.00
0.12
0.00
0.12
0.00
0.12
0.00
0.12
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
1
5
0.00
0.25
0.00
0.25
0.00
0.25
0.00
0.25
0.00
0.25
0.00
0.25
0.00
2
0.5
0.00
0.01
0.03
C (-)
0.00
2
0.5
4
1
0.00
2
0.01
1
0.03
2
C (-)
0.00
0.01
4
0.03
1
C (-)
0.5
0.00
2
0.01
1
0.03
2
C (-)
0.00
0.01
4
0.03
1
C (-)
0.5
0.00
1
8
2
0.01
2
6
4
2
8
0.00
4
6
2
8
0.5
8
6
4
0.00
2
4
8
2
8
0.00
2
4
6
2
8
0.5
8
6
4
0.00
2
4
8
2
H
4
0.12
6
G
4
0.00
8
F
4
0.12
4
E
4
0.00
2
D
4
0.03
4
2
8
C (-)
8
Tabla III . Distribución de las concentraciones de Florfenicol utilizadas en la placa de 96
posillos, con un n=6.
42
3.5.-Cinética de inducción con Florfenicol
Para determinar y evaluar los cambios en la expresión de los genes escogidos de P. salmonis
AUS005, se realizó un diseño experimental para una cinética de crecimiento a distintas
concentraciones de Florfenicol, 0,125μg/ml, 0,25 μg/ml, 0,5 μg/ml y 1 μg/ml, evaluadas a
diferentes tiempos de exposición.
Las bacterias utilizadas en el ensayo fueron cultivas en medio AUSTRAL SRS Broth a 18°C
hasta que alcanzaran su fase exponencial al cuarto día de cultivo. Para el inicio del ensayo, una
suspensión de P. salmonis a un OD620 de 0,1 se distribuyó en tubos de centrifuga de punta cónica
de 15ml para luego proceder a la administración de las distintas concentraciones de antibiótico
como indica la figura 6.
Una vez cumplida cada hora de la cinética se midió la absorbancia y se centrifugo el tubo a
8000g por 20 minutos, se descartó el sobrenadante y se congelo a -80°C para su posterior
extracción de RNA.
43
Figura 6. Ensayos cinética de inducción. Representación de la cinética de inducción en P.
salmonis con Florfenicol.
44
3.5.1.-Extracción de RNA
El sedimento bacteriano obtenido en la cinética de inducción se almacenó a -80°C al menos 12
horas para favorecer la lisis bacteriana. El pellet bacteriano fue re suspendido en 500 μL de
TRIZOL (Invitrogen) e incubado 5 minutos a temperatura ambiente. Se agregó 100 μL de
cloroformo y se agitó vigorosamente alrededor de 15 segundos. La mezcla se centrifugó a 12000g
por 10 minutos a 10ºC. Se extrajo la fase acuosa y se combinó con partes iguales de etanol 80°
frio (– 20ºC), se agitó vigorosamente 5 segundos y luego 5 segundos en Vortex. La suspensión
final se adicionó en una columna Miniprep del kit AxyPrep TM Multisource Total RNA. La
extracción continuó de acuerdo a las instrucciones del proveedor, el RNA total extraído fue
eluído en 70 μL de agua libre de nucleasas.
Para evitar posible contaminación por gDNA y así tener la certeza de que los productos
amplificados en RT-qPCR son exclusivamente correspondientes a templados de cDNA, se
trataron las muestras con RNase-Free DNase I (Epicentre), 50 μL de la solución de DNase I
fueron agregados a la muestra de RNA, luego se incubaron estas por 10 minutos a 37°C.
Finalmente
el
RNA
total
fue
cuantificado
con
un
equipo
NanoDrop
2000
SPECTROPHOTOMETER, posteriormente las muestras fueron almacenadas a -80°C hasta su
uso.
3.5.2.-Reacción de polimerasa con transcriptasa reversa RT-PCR
Se realizó transcripción reversa para obtener cDNA de cada una de las muestras correspondientes
a la cinética de inducción con Florfenicol; para esto se utilizó el siguiente protocolo con
volúmenes por muestra y divididos en pasos (tabla IV) (según First-Strand cDNA Synthesis
Using M-MLV RT, Invitrogen).
Para la transcripción reversa, se utilizó 1µg de RNA total, 1 µL de OligodT, 1 μL de dNTP mix
10 mM y agua libre de nucleasas hasta un volumen de 12 μL. La mezcla se calentó a 65°C por 5
minutos y se enfrió inmediatamente en hielo por 2 minutos. Luego se agregó 4 μL de 5X FirstStrand Buffer (250 mM Tris-HCl, 375 mMKCl; 15 mM MgCl2, pH 8.3), 2 μL DTT 0,1 M, 1 μL
45
de RNaseOut 40 U/ μL, y se incubó a 37°C por 2 minutos. Finalmente se adicionó 1 μL (200 U)
de la enzima M-MLV RT, se mezcló bien, y se incubó a 25°C por 10 minutos y luego 37° C por
50 minutos. La reacción se inactivó a 70°C por 15 minutos.
REACTIVO
VOLUMEN POR MUESTRAS
Oligo dT (10 μM)
1 μL
dNTPs (10 μM)
1 μL
RNA
1 μg
H₂O
molecular
CICLOS
65° por 5 minutos
biología Volumen necesario para completar 12
μL
2 minutos en hielo
5x buffer
4μL
0,1M DTT
2μL
RNAsa out
1μL
37°C por 2 minutos.
Pausa para agregar enzima
25°C por 10 minutos; 37°C por
M-MLVRT
1μL
50 minutos ; 70°C por 15
minutos
Volumen total: 20μL
Tabla IV. Protocolo de retrotranscripción utilizado (de acuerdo a First-Strand cDNA
Synthesis Using M-MLV RT, Invitrogen).
46
3.5.3.-Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)
Se amplificaron y cuantificaron fragmentos de las secuencias de los genes utilizados (IS1-1,
RVE-1, AcrB-1, DDE-2, ACRv-3, RNDD-4, RNDM-1, AcrBcon-1, ACRB240-1, RND240-3).
El ensayo se llevó a cabo en placas de 96 pocillos para qPCR (Axygen PCR microplate), como
control negativo se utilizó agua libre de nucleasas, para el ensayo se utilizó el termociclador MX
Pro 3000P, para la evaluación de los datos arrojados se utilizó el programa Bioinformatico
MxPRO stratagene, como gen normalizadores se utilizó NADPH y 23s, todas las reacciones
fueron realizadas en triplicado. La tabla V detalla la preparación del mix de qPCR y la tabla VI el
perfil térmico de la reacción de qPCR.
Reactivos
Volumenes (1X)
2X Brilliant II SYBR Green
10 uL
QPCR master mix
Primer F
1 uL
Primer R
1 uL
Agua Biología molecular
6 uL
cDNA
2 uL
Volumen final
20 uL
Tabla V. Reactivos y cantidad de estos utilizados por muestra para una reacción en cadena
de polimerasa cuantitativo (qPCR).
47
Proceso
Temperatura/tiempo
Ciclos
Denaturación inicial
95°C por 3 minutos
1
Denaturación
95°C por 30 segundos
40
Apareamiento
58°C por 30 segundos
Elongación
72°C por 30 segundos
Curva de Melting
10 segundos a 95ºC, 10 segundos a 1
25ºC, 1 segundo a 70ºC y 1 segundo
a 95ºC
Tabla VI . Protocolo de temperatura, tiempo y ciclos utilizados para reacción en cadena de
polimerasa cuantitativo (qPCR).
Las cuantificaciones se llevaron a cabo en base al valor del ciclo umbral (Ct) registrado en el
software MxPRO en base a la Cuantificación relativa normalizada: este método se basa en el
modelo delta- delta Ct desarrollado por PE applied biosystems, Los valores obtenidos para cada
gen son normalizados con los niveles de Ct obtenidos para un gen calibrador. Para ello se utilizó
la fórmula
(Pfeffl,2001). Se realizo la prueba estadística de T de student, usando el
programa Sigmaplot 11.0, seleccionando los p<0,001 como altamente significativos (***) y
p<0,01 (**) y p<0,05 (*).
48
4.-RESULTADOS
4.1.-Resultados de identificación de los genes de Resistencia drogas (RND).
La bacteria Piscirickettsia salmonis AUSTRAL 005 resistente al tratamiento de Florfenicol fue
aislada a partir de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en el medio AUSTRAL-SRS . La
secuencia del genómica de esta bacteriano fue obtenida mediante la tecnología de secuenciación
454 GS Junior e Ion Torrent. Se obtuvo un tamaño de genoma de 2.85 Mb, con un porcentaje de
GC de 37,37%. Los marcos de lectura (ORFs) fueron predecidos mediante Glimmer, y luego
estos fueron anotados usando BLASTx (10), seguido por Blast2Go . El proceso de anotación
entrego un total de
2,571 genes predecidos para codificar proteínas, con 1,873 de ellos
correctamente anotados y 698 codificantes para proteínas hipotéticas o genes desconocidos. Un
numero de 52 tRNAs y 3 rRNAs fueron identificados usando tRNA-scan-SE and RNAmmer,
respectivamente.
La identificación in silico de los putativos genes involucrados en el sistema de resistencia
multidrogas se realizó mediante la interfaz de búsqueda del software Genious 7.0 en la anotación
del genoma de P. salmonis. Una vez realizada la búsqueda corroboro mediante BLAST (tabla
VII) la identidad de secuencia y porcentaje de cobertura.
Se identificaron un total de
la identificación de 59 genes de resistencia de los cuales 44
corresponden a genes correctamente identificados y 15 a genes hipotéticos. En esta tesis nos
centramos en las principales agrupación génicas o cluster génicos indicados en figura 7 en donde
se detallan la ubicación de estos. En ellos se encuentran genes codificantes para la proteína de
resistencia acriflavina, transportadores multidrogas, y proteínas del sistema de eflujo.
49
Proteína
Blast
Microorganismo Query
hipotética
cover
99%
ACRB240 acrB/AcrD/AcrF family Piscirickettsia
protein
salmonis
acriflavin
plasma
protein
Identidad
97%
resistance Coxiella burnetii
membrane
99%
33%
Coxiella burnetii
99%
33%
RND efflux transporter
Tabla VII. Análisis de identidad de secuencia mediante Blast.
50
Figura 7. Identificación in silico de los genes de resistencia a drogas en el genoma de Piscirckettsia
salmonis AUSTRAL 005. Se identificaron los principales clusters génicos de resistencia a drogas
(RND) a partir del genoma anotado mediante análisis informáticos utilizando el software Geneious. Estos
cluster génicos fueron confirmados posteriormente por blast.
51
4.2.-Identificación de P. salmonis
Para la implementación de cualquiera de los ensayos detallados en la tesis se procedió
primeramente a la identificación de la bacteria en cuestión, para esto se utilizaron los siguientes
métodos: Método de tinción Gram donde dio como resultado que se trataba de cocos Gram
negativo, morfología característica de la bacteria (tinción rojiza), Ensayo de Inmunofluorescencia
Indirecta donde se observaron estructuras cocoides de intensa fluorescencia verde y finalmente la
extracción de DNA genómico de la bacteria P. salmonis AUS005 para posteriormente realizar el
PCR confirmatorio. Las pruebas de identificación tinción Gram, IFAT y PCR se muestran en las
figuras 8, 9 y 10.
4.3.-Susceptibilidad de cepa de P. salmonis AUSTRAL005 a florfenicol
Para determinar la susceptibilidad de la cepa de P. salmonis AUSTRAL 005 se sometió a
concentraciones crecientes de Florfenicol, en una placa de 96 pocillos se agregó la bacteria luego
de la previa confirmación de esta vía tinción Gram y se aplicaron distintas concentraciones de
AB como se detalla en la sección de material y métodos. Dando como resultado una disminución
de las curvas de crecimiento en de la bacteria P. salmonis cepa AUSTRAL 005, al aumentar la
concentración de Florfenicol.
52
Figura 8. Identificacion por Inmunofluorescencia Indirecta (IFAT) para cepa P. salmonis
Austral005. Bacterias crecidas en medio Austral SRS por 120 horas a 18 ºC con agitación,
fueron esparcidas en un portaobjeto y teñidas con tinción de IFAT. A: Control. B: 0.001 μg/mL.
C: 0.125 μg/mL y D: 0.25 μg/mL.. Cocoides de intensa fluorescencia verde confirman el
resultado. Se observó por microscopía en una lente de 100X.
53
Figura 9. Confirmación de P. salmonis vía tinción de Gram. Se observa la presencia de cocos
Gram negativos en todas las imágenes, para la cepa AUSTRAL-005, esto confirmaría la
identidad de P. salmonis. Se observó por microscopía en una lente de 100X.
54
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa de Piscrickettsia salmonis. Gel de agarosa al
1,5% donde se observa la amplificación de genes específicos para la detección de P. salmonis.
ST1: estándar 100bp, carril del 1 al 5 P. salmonis cepa AUS005, carril del 6 al 10 cepa LF89,
ST2: estándar 50bp.
55
4.3.1.-Determinación de MIC para Florfenicol en P. salmonis AUSTRAL005
Antes de realizar la técnica estandarizada de la de terminación de la MIC se creció la bacteria en
medio líquido y se confirmó la identidad de esta mediante la técnica de tinción Gram e IFAT para
la cepa Austral- 005 (Figura 11), se procedió entonces a montar la técnica en placas de ELISA
con las cantidades de medio Austral SRS, bacteria y antibióticos, como fue descrito en las Tabla
III y Tabla IV. Luego de incubar las placas a 18 °C con agitación, entre 92 a 96 horas para la E.
coli y luego se realiza una nueva lectura a las 120 horas para P. salmonis a 620 nm
respectivamente. Se replicó dos veces por quintuplicado, dando un tamaño muestral de 10. El
resultado de la MIC para florfenicol en Austral- 005 va de un rango de 0,125 a 0,5 μg/mL
(Figura 11).
4.4.-Cinética de inducción
Para poder identificar la variación en la expresión de los genes anteriormente seleccionados en la
cepa de P. salmonis AUSTRAL005 se hizo una cinética para evaluar su expresión a seis tiempos
distintos, los cuales corresponden a 0, 6, 12, 24, 48 y 72 horas. Este ensayo fue realizado tratando
los cultivos de P. salmonis a distintas concentraciones de antibiótico, Florfenicol, tal como es
descrito en material y método. De esta manera se pudo evaluar los cambios de expresión de los
distintos genes posiblemente involucrados en la resistencia a antibióticos en el tiempo con
respecto a su concentración basal (bacteria sin antibiótico), con el fin de evaluar cambios en su
expresión a las distintas concentraciones del antibiótico.
56
Figura 11. Susceptibilidad de P. salmonis a Florfenicol A. Curvas de crecimiento de la cepa de
P. salmonis AUS005 obtenidos a diferentes concentraciones de florfenicol. B. Concentración
mínima inhibitoria (CMI) de Piscirickettsia salmonis. Curva de la concentración mínima
inhibitoria utilizándola cepa AUS 005 de P. salmonis expuestas a concentraciones crecientes de
Florfenicol
57
La cinética fue evaluada con un n=3, a cada tiempo y concentración se le extrajo el RNA, se trató
con DNAsa I, se realizó RT-PCR para posteriormente obtener el cDNA, el que fue utilizado en el
ensayo de qPCR para evaluar las expresiones de cada gen. A cada concentración en el tiempo
precisado se realizó el proceso anteriormente nombrado.
Para cada gen seleccionado se diseñaron partidores específicos los cuales fueron detallados en la
tabla I de material y método, con el fin de estandarizar y evaluar se evaluó su eficacia por un
qPCR los cuales resultaron con pick de mealting para cada uno, los que dimerizaron fueron
inmediatamente descartados.
4.4.1.-Estandarización de partidores mediante qPCR
Para determinar la formación de producto único se hicieron ensayos de qPCR a distintas
temperaturas de annealing 55, 57, 58 y 60°C se estableció que la temperatura óptima para este
proceso, es de
58°C para cada set de partidores. Los gráficos representa las curvas de
disociación, en donde la ordenada corresponde a derivada de la fluorescencia que es emitida por
el producto y la abscisa a la temperatura en °C, se observa solo un pick de amplificación, lo que
corresponde a un solo producto de PCR para cada par de partidores, ensayo realizado n=3
(Figuras 12, 13 y 14).
58
Figura 12. Curvas de disociación para la selección y estandarización de partidores para
genes de resistencia en la cepa de P. salmonis AUS005. Representación gráfica de las curvas de
melting entregadas para los productos de RT-qPCR de los genes A: IS1-1, B: RVE-1, C: AcrB-1
y DDE-2. Análisis vía software Mxpro.
59
Figura 13. Curvas de disociación para la selección y estandarización de partidores para
genes de resistencia en la cepa de P. salmonis AUS005. Representación gráfica de las curvas de
melting entregadas para los productos de RT-qPCR de los genes A: ACRv-3, B: RNDD-4, C:
RNDM-1 y D: Acrbcon-1. Análisis vía software Mxpro.
60
Figura 14. Curvas de disociación para la selección y estandarización de partidores para
genes de resistencia en la cepa de P. salmonis AUS005. Representación gráfica de las curvas de
melting entregadas para los productos de RT-qPCR de los genes A: ACRB240-1, B: RND240-3,
C: 23S y D: corresponde a un ejemplo de par de partidores descartados por que no se observa un
pick de amplificación limpio.
61
4.4.2.-Evaluación de la expresión relativa de genes de la familia RND en una cinética de
inducción con Florfenicol
La expresión relativa de genes asociado a resistencia pertenecientes a la familia RND fue
determinada mediante la cuantificación de ésta utilizando la fórmula del ∆∆Ct. A partir de los
datos obtenidos se realizó un análisis comparativo el cual fue expresado en número de veces de
cambio en la expresión relativa de cada gen calibrado con respecto a la expresión basal de la
muestra control (sin tratamiento). La normalización del ensayo se realizó utilizando dos genes de
referencia para P. salmonis: GAPDH y 23s.
62
A
23s/GAPDH
RND240
B
23s/GAPDH
23s/GAPDH
RND240
RND240
Figura 15. Expresión relativa de los transportadores de eflujo en P. salmonis. Ejemplo de
resultados obtenidos para los genes RND en la cinética de inducción con florfenicol. A. curvas de
amplificación para el gen RND240 y genes de referencia 23s de P. salmonis. B. Peaks melting
para la familia del gen RND240
63
0,125
µg/ml
Expresión relativa (n° veces de cambio)
Ct
Gen
Control
t6
23s
NORM
NORM
DDE2
1,00
1,0
RNDM
1 (cal)
1,0
ACRv
1 (cal)
1,0
ACRBcon
1 (cal)
0,8
IS1
1 (cal)
0,4
RVE1
1 (cal)
0,7
AcrB1
1 (cal)
0,6
RND240
1 (cal)
1,0
RNDD
1 (cal)
0,3
ACRB240
1 (cal)
0,6
RND1
1 (cal)
0,2
GAPDH
NORM
NORM
t12
t24
t48
t72
NORM
0,7
1,2
0,2
0,6
0,3
0,7
0,6
0,7
0,3
0,6
0,1
NORM
NORM
0,6
1,8
0,3
0,7
0,7
1,0
1,0
0,7
0,3
1,8
0,2
NORM
NORM
0,9
1,1
0,3
0,6
0,7
1,4
1,6
1,0
0,4
1,2
0,3
NORM
NORM
0,7
1,3
0,3
0,3
1,2
1,4
1,5
1,3
0,2
1,5
0,5
NORM
Tabla VIII Expresión relativa de genes en estudio para concentración 0,125 µg/ml. Detalle
del número de veces de cambio de los genes seleccionados con respecto a los genes
normalizadores.
64
0,25
µg/ml
Expresión relativa (n° veces de cambio)
Ct
Gen
Control
t6
23s
NORM
NORM
DDE2
1 (cal)
2
RNDM
1 (cal)
1
ACRv
1 (cal)
3
ACRBcon
1 (cal)
2
IS1
1 (cal)
1
RVE1
1 (cal)
2
AcrB1
1 (cal)
1
RND240
1 (cal)
2
RNDD
1 (cal)
1
ACRB240
1 (cal)
1
RND1
1 (cal)
0
GAPDH
NORM
NORM
t12
t24
t48
t72
NORM
2
17
3
2
1
2
1
2
1
1
0
NORM
NORM
2
36
3
2
1
2
2
2
1
2
0
NORM
NORM
3
6
3
2
1
2
2
2
1
2
0
NORM
NORM
4
3
3
2
1
2
2
2
1
2
0
NORM
Tabla IX Expresión relativa de genes en estudio para concentración 0,25 µg/ml. Detalle del
número de veces de cambio de los genes seleccionados con respecto a los genes normalizadores.
65
0,5
µg/ml
Expresión relativa (n° veces de cambio)
Ct
Gen
Control
t6
23s
NORM
NORM
DDE2
1 (cal)
92
RNDM
1 (cal)
0
ACRv
1 (cal)
62
ACRBcon
1 (cal)
42
IS1
1 (cal)
53
RVE1
1 (cal)
47
AcrB1
1 (cal)
20
RND240
1 (cal)
16
RNDD
1 (cal)
65
ACRB240
1 (cal)
6
RND1
1 (cal)
0
GAPDH
NORM
NORM
t12
t24
t48
t72
NORM
66
0
61
48
45
42
39
72
135
24
118
NORM
NORM
5
0
26
65
13
18
77
149
295
4
0
NORM
NORM
1
0
0
1
1
3
64
200
16
1
1
NORM
NORM
1
0
0
0
1
3
48
194
4
9
32
NORM
Tabla X. Expresión relativa de genes en estudio para concentración 0,5 µg/ml. Detalle del
número de veces de cambio de los genes seleccionados con respecto a los genes normalizadores.
66
1
µg/ml
Expresión relativa (n° veces de cambio)
Ct
Gen
Control
t6
23s
NORM
NORM
DDE2
1 (cal)
0,27
RNDM
1 (cal)
0,07
ACRv
1 (cal)
0,03
ACRBcon
1 (cal)
0,03
IS1
1 (cal)
0,16
RVE1
1 (cal)
0,03
AcrB1
1 (cal)
0,03
RND240
1 (cal)
0,03
RNDD
1 (cal)
0,07
ACRB240
1 (cal)
0,07
RND1
1 (cal)
0,07
GAPDH
NORM
NORM
t12
t24
t48
t72
NORM
0,49
0,42
0,25
0,50
0,50
0,13
0,25
0,25
0,35
0,44
0,30
NORM
NORM
0,10
0,17
0,02
0,03
0,03
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
0,02
NORM
NORM
0,22
0,08
0,05
0,05
0,04
0,01
0,01
0,01
0,01
0,02
0,02
NORM
NORM
0,05
0,10
0,02
0,04
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,01
NORM
Tabla XI. Expresión relativa de genes en estudio para concentración 1 µg/ml. Detalle del
número de veces de cambio de los genes seleccionados con respecto a los genes normalizadores.
67
Evaluación de la expresión de transportadores de eflujo RND
Expresión relativa del gen DDE-2:
Después del tratamiento con 0,25
de Florfenicol se observó un aumento creciente pero no
significativo a partir de las seis horas post inducción con antibiótico. Interesantemente al exponer
la bacteria a una concentración de 0,5
se observó un aumento altamente significativo
(p<0,001) de 92 veces con respecto a la muestra sin tratamiento con antibiótico.
Esto evidencia un claro aumento en la expresión relativa de este, bajo nuestras condiciones
experimentales. Cabe señalar además que las expresión relativa de este gen fue evaluado además
en otras dos concentraciones de Florfenicol, 0,125
(concentración bajo la MIC) y 1
(concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron cambio con respecto a la
muestra control.
68
DDE2
Expresión relativa (Log 2)
4,0
3,0
0,25 µg/ml
2,0
1,0
0,0
Control
t6
t12
t24
t48
t72
Horas Post-inducción
0,5 µg/ml
Figura 16. Gráfico de cinética de inducción del gen DDE2 expuesto a 0,25 µg/ml y 0,5 µg/ml
de Florfenicol. Mediante un RT-qPCR se determinó la expresión relativa del gen DDE2 en la
cepa AUS005 post tratamiento con Florfenicol en las concentraciones indicadas. Como genes
normalizadores se utilizaron GAPDH y 23s. Se considera como significativo a p<0,001 (***),
p<0,01 (**) y a p<0,05 (*) según la prueba estadística de comparación de T de Stundent. El
ensayo se realizó en triplicado, las barras representan el error estándar.
69
Expresión relativa del gen RNDM:
Posteriormente del tratamiento con 0,25
de Florfenicol se observó un aumento creciente
a partir de las 6 horas post inducción con antibiótico, a las 24 horas de exposición, mostro la
mayor expresión relativa de 36 veces con respecto a la muestra sin tratamiento con antibiótico,
mostrado un aumento significativo (p<0,01), para luego de esto disminuir su expresión . Al
exponer la bacteria a una concentración de 0,5
se observó una disminución de la
expresión hasta niveles basales.
Cabe señalar además que las expresión relativa de este gen fue evaluada en otras dos
concentraciones de Florfenicol 0,125
(concentración bajo la MIC) y 1
(concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron cambio con respecto a la muestra
control.
70
0,25 µg/ml
RNDM
Expresión relativa (Log 2)
1,2
1,0
0,8
0,5 µg/ml
0,6
0,4
0,2
0,0
Control
t6
t12
t24
t48
t72
Horas Post-inducción
Figura 17. Gráfico de cinética de inducción del gen RNDM expuesto a 0,25 µg/ml y 0,5
µg/ml de Florfenicol. Mediante un RT-qPCR se determinó la expresión relativa del gen DDE2
en la cepa AUS005 post tratamiento con Florfenicol en las concentraciones indicadas. Como
genes normalizadores se utilizaron GAPDH y 23s. Se considera como significativo a p<0,001
(***), p<0,01 (**) y a p<0,05 (*) según la prueba estadística de comparación de T de Stundent.
El ensayo se realizó en triplicado, las barras representan el error estándar.
71
Expresión relativa del gen ACRv:
Tras un tratamiento con 0,25
de Florfenicol se observó un aumento creciente pero no
significativo contra el control a partir de las seis horas post inducción con antibiótico. Luego de
exponer a la bacteria a una concentración de 0,5
se observó un aumento significativo
(p<0,01) de 62 veces para las 6 horas y manteniendo esto hasta las 12 horas con respecto a la
muestra sin tratamiento con antibiótico, para luego disminuir a las 24 horas su expresión,
llegando a las 48 y 72 horas, hasta condiciones basales. Esto demuestra un aumento en la
expresión relativa en las primeras horas de este, bajo las condiciones experimentales
seleccionadas. Cabe señalar además que las expresión relativa de este gen fue evaluada en otras
dos concentraciones de Florfenicol 0,125
(concentración bajo la MIC) y 1
(concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron cambio con respecto a la muestra
control.
72
ACRv
Expresión relativa (Log 2)
4,0
0,25 µg/ml
2,0
0,0
Control
t6
t12
t24
t48
t72
Horas Post-inducción
0,5 µg/ml
Figura 18. Gráfico de cinética de inducción del gen ACRv expuesto a 0,25 µg/ml y 0,5 µg/ml
de Florfenicol. Mediante un RT-qPCR se determinó la expresión relativa del gen DDE2 en la
cepa AUS005 post tratamiento con Florfenicol en las concentraciones indicadas. Como genes
normalizadores se utilizaron GAPDH y 23s. Se considera como significativo a p<0,001 (***),
p<0,01 (**) y a p<0,05 (*) según la prueba estadística de comparación de T de Stundent. El
ensayo se realizó en triplicado, las barras representan el error estándar.
73
Expresión relativa del gen ACRBcon:
Después del tratamiento con 0,25
de Florfenicol se observó un aumento creciente pero no
significativo a partir de las seis horas post inducción con antibiótico. Interesantemente al exponer
la bacteria a una concentración de 0,5
se observó un aumento significativo (p<0,01) de
42 veces para las 6 horas y manteniendo esto hasta las 12 horas y aumentando la expresión hasta
65 (p<0,001) a las 24 horas, con respecto a la muestra sin tratamiento con antibiótico, para luego
disminuir su expresión a condiciones basales.
Esto muestra un claro aumento en la expresión relativa de este, bajo nuestras condiciones
experimentales. Cabe señalar además que las expresión relativa de este gen fue evaluada en otras
dos concentraciones de Florfenicol 0,125
(concentración bajo la MIC) y 1
(concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron cambio con respecto a la muestra
control.
74
ACRBcon
Expresión relativa (Log 2)
4,0
3,5
3,0
2,5
0,25 µg/ml
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
Control
t6
t12
t24
t48
t72
Horas Post-inducción
0,5 µg/ml
Figura 19. Gráfico de cinética de inducción del gen ACRBcon expuesto a 0,25 µg/ml y 0,5
µg/ml de Florfenicol. Mediante un RT-qPCR se determinó la expresión relativa del gen DDE2
en la cepa AUS005 post tratamiento con Florfenicol en las concentraciones indicadas. Como
genes normalizadores se utilizaron GAPDH y 23s. Se considera como significativo a p<0,001
(***), p<0,01 (**) y a p<0,05 (*) según la prueba estadística de comparación de T de Stundent.
El ensayo se realizó en triplicado, las barras representan el error estándar.
75
Expresión relativa del gen IS1:
Tras el tratamiento con 0,25
de Florfenicol no se observó un aumento o disminución
significativa a partir de las seis horas post inducción con antibiótico. Interesantemente al exponer
la bacteria a una concentración de 0,5
se observó un aumento altamente significativo
(p<0,01) de 53 veces para las 6 horas y manteniendo esto hasta las 12 horas para luego diminuir
la expresión relativa hasta 13 a las 24 horas con respecto a la muestra sin tratamiento con
antibiótico hasta llegar a expresarse basalmente.
Esto evidencia un claro aumento en la expresión relativa de este, bajo nuestras condiciones
experimentales. Cabe señalar además que las expresión relativa de este gen fue evaluada en otras
dos concentraciones de Florfenicol 0,125
(concentración bajo la MIC) y 1
(concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron cambio con respecto a la muestra
control.
76
Expresión relativa (Log 2)
IS1
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,25 µg/ml
Control
t6
t12
t24
t48
t72
Horas Post-inducción
0,5 µg/ml
Figura 20. Gráfico de cinética de inducción del gen IS1 expuesto a 0,25 µg/ml y 0,5 µg/ml
de Florfenicol. Mediante un RT-qPCR se determinó la expresión relativa del gen DDE2 en la
cepa AUS005 post tratamiento con Florfenicol en las concentraciones indicadas. Como genes
normalizadores se utilizaron GAPDH y 23s. Se considera como significativo a p<0,001 (***),
p<0,01 (**) y a p<0,05 (*) según la prueba estadística de comparación de T de Stundent. El
ensayo se realizó en triplicado, las barras representan el error estándar.
77
Expresión relativa del gen RVE1:
Después del tratamiento con 0,25
de Florfenicol se observó un aumento creciente pero no
significativo a partir de las seis horas post inducción con antibiótico. Interesantemente al exponer
la bacteria a una concentración de 0,5
se observó un aumento significativo (p<0,01) de 47
veces con respecto a la muestra sin tratamiento con antibiótico, empezando a disminuir su
expresión hasta las 72 horas.
Esto evidencia un claro aumento en la expresión relativa de este, bajo nuestras condiciones
experimentales. Cabe señalar además que las expresión relativa de este gen fue evaluada en otras
dos concentraciones de Florfenicol 0,125
(concentración bajo la MIC) y 1
(concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron cambio con respecto a la muestra
control.
78
RVE1
Expresión relativa (Log 2)
2,0
1,0
0,25 µg/ml
0,0
Control
t6
t12
t24
t48
t72
Horas Post-inducción
0,5 µg/ml
Figura 21. Gráfico de cinética de inducción del gen RVE1 expuesto a 0,25 µg/ml y 0,5 µg/ml
de Florfenicol. Mediante un RT-qPCR se determinó la expresión relativa del gen DDE2 en la
cepa AUS005 post tratamiento con Florfenicol en las concentraciones indicadas. Como genes
normalizadores se utilizaron GAPDH y 23s. Se considera como significativo a p<0,001 (***),
p<0,01 (**) y a p<0,05 (*) según la prueba estadística de comparación de T de Stundent. El
ensayo se realizó en triplicado, las barras representan el error estándar.
79
Expresión relativa del gen RND-D:
Después del tratamiento con 0,25
de Florfenicol no se observó un aumento o disminución
significativa a partir de las seis horas post inducción con antibiótico. Interesantemente al exponer
la bacteria a una concentración de 0,5
se observó un aumento altamente significativo
(p<0,01) desde las seis horas de 65 veces, a las 12 horas aumenta hasta 135 número de veces de
cambio (p<0,001) y a las 24 horas aumento de 295 veces su expresión relativa con respecto a la
muestra sin tratamiento con antibiótico.
Esto evidencia un claro aumento en el número de veces de cambio de este, bajo nuestras
condiciones experimentales. Cabe señalar además que las expresión relativa de este gen fue
evaluada en otras dos concentraciones de Florfenicol 0,125
1
(concentración bajo la MIC) y
(concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron cambio con respecto a la
muestra control.
80
RND-D
Expresión relativa (Log 2)
2,0
0,25 µg/ml
1,0
0,0
Control
t6
t12
t24
t48
t72
Horas Post-inducción
0,5 µg/ml
Figura 22. Gráfico de cinética de inducción del gen RNDD expuesto a 0,25 µg/ml y 0,5 µg/ml
de Florfenicol. Mediante un RT-qPCR se determinó la expresión relativa del gen DDE2 en la
cepa AUS005 post tratamiento con Florfenicol en las concentraciones indicadas. Como genes
normalizadores se utilizaron GAPDH y 23s. Se considera como significativo a p<0,001 (***),
p<0,01 (**) y a p<0,05 (*) según la prueba estadística de comparación de T de Stundent. El
ensayo se realizó en triplicado, las barras representan el error estándar.
81
Expresión relativa del gen ACRB240:
Después del tratamiento con 0,25
de Florfenicol se observó un aumento creciente pero no
significativo a partir de las seis horas post inducción con antibiótico. Al exponer la bacteria a una
concentración de 0,5
se observó un aumento significativo (p<0,005) solo a las 12 horas
con un número de veces de cambio de 24 con respecto a la muestra sin tratamiento con
antibiótico.
Esto evidencia un claro aumento en la expresión relativa de este, bajo nuestras condiciones
experimentales. Cabe señalar además que las expresión relativa de este gen fue evaluada en otras
dos concentraciones de Florfenicol 0,125
(concentración bajo la MIC) y 1
(concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron cambio con respecto a la muestra
control.
82
ACRB240
Expresión relativa (Log 2)
3,0
2,0
0,25 µg/ml
1,0
0,0
Control
t6
t12
t24
t48
t72
Horas Post-inducción
0,5 µg/ml
Figura 23. Gráfico de cinética de inducción del gen ACRB240 expuesto a 0,25 µg/ml y 0,5
µg/ml de Florfenicol. Mediante un RT-qPCR se determinó la expresión relativa del gen DDE2
en la cepa AUS005 post tratamiento con Florfenicol en las concentraciones indicadas. Como
genes normalizadores se utilizaron GAPDH y 23s. Se considera como significativo a p<0,001
(***), p<0,01 (**) y a p<0,05 (*) según la prueba estadística de comparación de T de Stundent.
El ensayo se realizó en triplicado, las barras representan el error estándar.
83
Expresión relativa del gen RND240:
Después del tratamiento con 0,25
de Florfenicol se observó un aumento creciente pero no
significativo a partir de las seis horas post inducción con antibiótico. Interesantemente al exponer
la bacteria a una concentración de 0,5
se observó un el mayor aumento de la expresión de
genes desde las 6 horas de 16 veces hasta llegar a 72 a las doce horas, 149 a las veinticuatro, una
máxima de 200 y terminar en 194 veces (todos altamente significativo (p<0,001) ) con respecto a
la muestra sin tratamiento con antibiótico.
Esto evidencia un gran aumento en la expresión relativa de este, bajo nuestras condiciones
experimentales. Cabe señalar además que las expresión relativa de este gen fue evaluada en otras
dos concentraciones de Florfenicol 0,125
(concentración bajo la MIC) y 1
(concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron cambio con respecto a la muestra
control.
84
RND240
Expresión relativa (Log 2)
3,0
2,0
0,25 µg/ml
1,0
0,0
Control
t6
t12
t24
t48
t72
Horas Post-inducción
0,5 µg/ml
Figura 24. Gráfico de cinética de inducción del gen RND240 expuesto a 0,25 µg/ml y 0,5
µg/ml de Florfenicol. Mediante un RT-qPCR se determinó la expresión relativa del gen DDE2
en la cepa AUS005 post tratamiento con Florfenicol en las concentraciones indicadas. Como
genes normalizadores se utilizaron GAPDH y 23s. Se considera como significativo a p<0,001
(***), p<0,01 (**) y a p<0,05 (*) según la prueba estadística de comparación de T de Stundent.
El ensayo se realizó en triplicado, las barras representan el error estándar.
85
Expresión relativa del gen AcrB1:
Después del tratamiento con 0,25
de Florfenicol se observó un aumento creciente pero no
significativo a partir de las seis horas post inducción con antibiótico. Interesantemente al exponer
la bacteria a una concentración de 0,5
se observó un aumento altamente significativo
(p<0,001) de hasta 77 veces a las 24 horas de exposición con respecto a la muestra sin
tratamiento con antibiótico.
Esto evidencia un claro aumento en la expresión relativa de este, bajo nuestras condiciones
experimentales. Cabe señalar además que las expresión relativa de este gen fue evaluada en otras
dos concentraciones de Florfenicol 0,125
(concentración bajo la MIC) y 1
(concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron cambio con respecto a la muestra
control.
86
AcrB1
Expresión relativa (Log 2)
3,0
2,0
1,0
0,25 µg/ml
0,0
Control
t6
t12
t24
t48
t72
Horas Post-inducción
0,5 µg/ml
Figura 25. Gráfico de cinética de inducción del gen AcrB1 expuesto a 0,25 µg/ml y 0,5 µg/ml
de Florfenicol. Mediante un RT-qPCR se determinó la expresión relativa del gen DDE2 en la
cepa AUS005 post tratamiento con Florfenicol en las concentraciones indicadas. Como genes
normalizadores se utilizaron GAPDH y 23s. Se considera como significativo a p<0,001 (***),
p<0,01 (**) y a p<0,05 (*) según la prueba estadística de comparación de T de Stundent. El
ensayo se realizó en triplicado, las barras representan el error estándar.
87
Activacion de genes de resistencia en cinetica de induccion con 0,5 µg/ml de florfenicol en P.
salmonis.
La concentracion de 0,5 µg/ml de florfenicol fue en la que más se evidencio un aumento en la
expresion relativa de los genes de resistencia de la famila RND seleccionados, resultando para
algunos casos hasta 295 veces de cambio con respecto al gen normalizador.
Figura 26. Grafico global de inducción de la familia RND frente a florfenicol a una
concentración de 0,5 µg/ml en la cepa de P. salmonis AUSTRAL005. En el grafico se muestra
la expresion de los distintos genes seleccionados a distintos tiempos de tratamiento para la
concentracion 0,5 µg/ml de Florfenicol.
88
5.-DISCUSIÓN
La multi-resistencia a antibióticos es un grave problema asociado al tratamiento de infecciones
bacterianas. Particularmente en la industria salmonera Chilena, esto adquiere una gran relevancia
tomando en cuenta el indiscriminado uso de antibióticos que son utilizados. actualmente y dentro
de las enfermedades que afectan a los salmones con P. salmonis. No existen gran cantidad de
reportes de cepas asociadas a resistencia frente a los antibióticos con que se combate. Sin
embargo, el eventual surgimiento de cepas resistentes de este patógeno acuático podría causar
efectos aún más devastadores en la industria salmonera. Las bacterias pueden adaptarse a la
presencia de niveles tóxicos de antibióticos utilizando varios tipos de respuesta, incluido
mecanismos de regulación que alteran la fisiología celular o cambios genéticos (tales como la
mutación o horizontal de genes transferencia de determinantes de resistencia), degradación o el
secuestro de los antibióticos, prevenir su captación, bombear hacia fuera de la célula o prevenir la
unión molecular al blanco (Harbottle, et al., 2006) (Normark, et al., 2002). La amplificación
génica se ha demostrado que confiere resistencia al causar la sobreproducción de enzimas de
modificación de antibióticos, las moléculas diana y las bombas de eflujo..
Evaluación e identificación de genes putativos relacionados con resistencia a Florfenicol.
Los resultado de los análisis in-silico de la cepa de P. salmonis AUSTRAL 005 efectuados con el
software Geneious mediante homología de secuencias, identificaron 10 genes putativos de
posibles resistencia a florfenicol, pertenecientes a la familia RND bombas de eflujo. Está
ampliamente descrita la capacidad de adaptación de bacterias frente al efecto nocivo de
antibióticos, así como los métodos más efectivos de generación de resistencia que conllevan a la
evolución de estos microorganismos (Adam et al., 2008; Rosenthal y Elowitz, 2012; Tyerman et
al., 2013), Sin embargo, el o los mecanismos de resistencia a antibióticos en Piscirickettsia
salmonis no han sido reportados. En esta investigación se logró caracterizar la familia de bombas
de eflujo RND en P. salmonis. Esta familia ha sido descrita en bacterias Gram negativa y son
muy relevantes en la resistencia multidroga (MDR) (Dinesh y Kumar,2013). Las bombas de
eflujo multidroga componen un mecanismo clave , expulsando sustancias tóxicas como agentes
antimicrobianos o metabolitos para regular la homeostasis bacteriana. Estas bombas pueden estar
caracterizadas por una unidad, o bien por múltiples componentes los cuales son característicos de
las bacterias Gram negativas (Lee A, et al., 2000). Las Bombas de eflujo que expulsan drogas
89
juegan un papel clave, no sólo porque pueden producir resistencia a múltiples fármacos, sino
también porque pueden elevar el nivel de los otros mecanismos de resistencia (li et al.,
2004,2009). Para predecir la posible función de los genes en estudio se analizó la homología de
las secuencias aminoacídicas mediante BLASTx comparando con la base de datos NCBI. Como
ejemplo se observó que el gen putativo ACRB240, no presenta una alta identidad, las mayores
identidades son cercanas al 33% correspondientes a una proteína de membrana y una bomba de
eflujo de la especie Coxiella burnettii cercana filogenéticamente a P. salmonis (Mauel, et al.,
1999). Dado este bajo porcentaje de identidad nos permite excluir de qué se trata de un gen o una
proteína existente en otra especie bacteriana. (Levy et al.., 1999).
Estimación de resistencia y sensibilidad a Florfenicol en cepa de P. salmonis
AUSTRAL005. Últimamente se ha observado que los cultivos de distintas clases de salmones
presentan resistencia a antibióticos usados comúnmente en la industria acuícola, siendo esto un
problema de amplio espectro geográfico (Tuševljak et al., 2013) esto lo corroboran antecedentes
de nuestro laboratorio que describen la generación de resistencia de cepas de P. salmonis frente a
la pre-exposición de dosis sub-CIM de Florfenicol y Oxitetraciclina (Yañez et al., 2013). Uno de
los antibióticos más utilizados en Chile es el nombrado anteriormente Florfenicol (Buschmann et
al., 2012); es un compuesto neutro, liposoluble, que atraviesa fácilmente las barreras celulares;
alcanza concentraciones efectivas a nivel intracelular y difunde rápidamente por todo el
organismo. Su volumen de distribución aparente es mayor a 1 L/kg (San Martin et al., 2010). Por
lo tanto es de relevancia el estudio de como la bacterias responden frente al fármaco. Es por esto
que en esta tesis se desarrolló un método de análisis para la evaluación de la resistencia en una
cepa de P. salmonis. Para cumplir este objetivo se utilizaron distintas concentraciones de
florfenicol valoradas a diferentes tiempos de incubación evaluando así la susceptibilidad de la
cepa frente al antibiótico utilizado. Primero para identificar las bacteria correspondiente a la cepa
P. salmonis AUSTRAL 005, las muestras fueron analizadas por tinción de Gram, IFAT y RTPCR, tal como lo descrito por Fryer et al., (2003). Los resultados de estos ensayos demostraron
que no existía contaminación y que las bacterias presentes en el cultivo eran reactivas a IFAT con
un anticuerpo específico de P. salmonis, además se complementó esta resultado con un qPCR.
90
Posteriormente los resultados mostraron que a mayores dosis de antibiótico fue disminuyendo
proporcionalmente la carga bacteriana hasta hacerse mínima.
Determinación concentración mínima inhibitoria (CIM) para Florfenicol en cepa P.
salmonis AUSTRAL 005. Un parámetro determinado fue la concentración mínima inhibitoria
(CIM) para la cepa P. salmonis AUSTRAL005 administrando diferentes concentraciones de
Florfenicol. Para esto previamente se estandarizo la metodología empleando una cepa de control
(E. coli ATCC 25922), tal como fue documentado por Miller et al., 2005., para establecer los
rangos de sensibilidad de E. coli.
El rango para la CMI en la cepa P. salmonis 005 fue de 0,25µg/ml a 0,5µg/ml este resultado
concuerda con el trabajo de Yañez et al., 2012. Revalidando los datos obtenidos en esta tesis.
Cabe destacar que las mutaciones adaptativas como la resistencia surgen cuando la célula
bacteriana es expuesta lentamente a una concentración no letal, lo que le favorece para poder
expresar métodos de adaptación. Un gran número de mutantes resistentes a los antibióticos puede
provenir de este proceso de mutación en condiciones naturales de las bacterias (Dzidic et al.,
2008), por eso la importancia de la determinación de la MIC. Para dilucidar que genes podrían
mediar la resistencia a Florfenicol en la cepa P. salmonis AUS005 se analizaron 10 genes
putativos encontrados en tres clusters génicos relacionados a la familia RND se realizó una
cinética de inducción. Se analizó la expresión de estos genes frente a distintos tiempos y
concentraciones de Florfenicol, mediante un PCR en tiempo real. Los resultados obtenidos para
la expresión relativa de cada gen fueron expresados en graficas que demostraron el aumento de
números de veces de cambio con respecto a los genes normalizadores utilizados.
Para los genes que fueron expuestos 0,25µg/ml hubo algunos que no aumentaron su expresión
relativa significativamente, con un leve aumento de no más de 3 veces de número de cambio con
respecto al gen de referencia, estos serían: ACRB240, AcrB1, RND240, ACRBcon y ACRv. Esto
se podría deber a que la bacteria no resolvió como necesario el gasto de energía para la
concentración de antibiótico relativamente baja. En otro grupo de genes no se vio ningún tipo de
expresión manteniendo sus concentraciones basales de expresión para esta concentración de
antibiótico dentro de ellos podemos encontrar a RND1 y IS1. A Esta concentración se
encontraron dos genes que aumentaron su expresión relativa considerablemente con respecto al
91
normalizador, que sería RNMD y DD2 sobre 30 veces. Estos resultados indican que la expresión
de estos genes es regulada por bajas concentraciones de antibióticos, sugiriendo que este podría
tratarse de un sistema de respuesta más sensible para dar respuesta al ataque de antibiótico.
Postulamos que RNMD yDD2 tendrían un papel muy importante en la adquisición rápida de
resistencia a florfenicol. Asimismo como la expresión de estos genes es de las más sensibles
podrían servir como sensores de la adquisición temprana de resistencia. Un punto importante a
analizar a futuro es el entorno génico de estos genes y la presencia de regiones promotoras
reguladoras. De la misma forma sería interesante evaluar la presencia de secuencias de inserción
génica utilizadas por tranposasas que permiten modular rápidamente la resistencia a antibióticos
mediante la duplicación génica. En este trabajo experimental no se secuenciaron las cepas
bacterianas después de la agresión con agentes antimicrobianos.
Para la concentración de 0,5µg/ml hubo expresiones génicas que a las seis horas han aumentado
significativamente sobre las 50 veces de cambio y luego decae hasta hacerse basal desde las 48
horas de tratamiento, esto involucraría a los genes ACRv, IS1 y RVE1. Esto se podría deber al
gasto energético por parte de estas bombas de eflujo, lo cual podría explicar la caída drástica de
la expresión de algunos genes como los nombrados anteriormente, luego de las 24 horas como
medida de ahorro de energía, aunque se es las bacterias con frecuencia se adaptan a la presencia
del mecanismo de resistencia costoso mediante la adquisición de mutaciones adicional
compensatorias que reducen el coste energético, a menudo sin pérdida de la resistencia. (Wilson
et al., 2006). . Se observó que otro grupo de genes a las seis horas aumentaron su expresión
génica significativamente para luego alcanzar su pick máximo a las 24 horas, los genes
involucrados son RNDD con un pick máximo de número de veces de cambio de 294,9, AcrB1
con 76,7 veces de cambio 7 ACRB con 65 veces de cambio. De estos tres el único que no se
apagó su expresión génica después de las 24 horas fue AcrB1 manteniendo una expresión relativa
significativa hasta las 72 horas. El gen en estudio RND240 fue el que más expresión génica
demostró, manteniendo su expresión altamente significativa hasta las 72 horas. A diferencia de lo
que sucedió en la concentración 0,25µg/ml el gen RNDM no se expresó a esta concentración lo
que podría ser otro dato para indicar que este gen podría actuar como sensor de la adquisición
temprana de resistencia. El gen ACRB240 solo presentó un pick de expresión a las 12 horas. De
acuerdo a los resultados se indujo un incremento considerable en la expresión génica de estas
92
bombas frente a concentraciones iguales o cercanas a la CIM de Florfenicol en la cepa AUS 005.
Se vuelve a recalcar que el costo energético para el funcionamiento de estas bombas de eflujo es
relativamente alto, lo cual se refleja claramente en el abrupto descenso en los niveles de
expresión génica de componentes de la familia RND entre 48 y 72 horas de inducción con el
antibiótico. Este hecho refleja la importancia de esta familia de bombas eflujo para la
supervivencia de este patógeno acuático, específicamente frente al primer contacto con
Florfenicol (o bien otro antibiótico).
Cabe destacar que se analizaron otras dos concentraciones de Florfenicol 0,125 µg/ml
(concentración bajo la MIC) y 1 µg/ml (concentración sobre la MIC) las cuales no evidenciaron
cambio con respecto a la muestra control, probablemente esto sucedió porque las concentración
de Florfenicol 0,125 µg/ml no alcanzo niveles de injuria altos para la bacteria y esta no tuvo que
activar sus sistemas de resistencia y en el caso de 1 µg/ml la concentración antimicrobiana era
muy alta impidiendo su crecimiento y la expresión de estos genes. Dado que no se presentó una
respuesta homogénea respecto a las expresiones génicas de los genes de la familia RND
analizados, se podría sugerir que probablemente existe una funcionalidad diferencial en relación
al tiempo de expresión de cada gen codificante, esto se refleja en la variación en el número de
veces de cambio a diferentes tiempos.
Si bien existen diversos mecanismos de resistencia a Florfenicol asociados a bombas de eflujo
específicas o modificaciones epigenéticas (Kim y Aoki, 1996; Kehrenberg et al., 2005) éstos no
han sido encontrados en P. salmonis. Por tanto, el o los mecanismos que expliquen una
resistencia estable de Piscirickettsia salmonis frente a concentraciones más elevadas de
Florfenicol aún no han sido develados. A pesar de que el rol de la familia RND en el combate de
Florfenicol no parece prolongarse en el tiempo, podría ser relevante su función durante el primer
contacto con el antibiótico, donde la bacteria aún no cuenta con una maquinaria eficiente para
remediar el efecto de este bacteriostático, o bien no adquiere algún otro mecanismo de adaptación
(plásmidos de multi-resistencia, mutaciones, etc.). Si bien el rol de la familia RND está asociado
a la mayor causa de multi-resistencia a drogas en bacterias gram-negativas (Moore et al., 1999;
Helms et al., 2002; Poole, 2003) pues confieren resistencia a una amplia gama de agentes
antibacterianos (Nikaido, 1998; Schweizer, 2003) resultaría interesante buscar y caracterizar la
función de otras familias de bombas de eflujo en Piscirickettsia salmonis, incluso empleando una
93
cinética de inducción con tiempos más amplios a modo de establecer el grado de relevancia de la
familia RND frente a otras familias de función similar (ABC, MFS, etc.), pues para develar este
mecanismo bacteriano hace falta entender si la resistencia a Florfenicol (u otro antibiótico)
mediada por bombas es un proceso coordinado que abarca una compleja regulación de genes o
bien está mediado por un especializado y reducido grupo de genes.
Mientras que la resistencia a los antibacterianos, especialmente la resistencia a múltiples drogas
sigue aumentando, lo que debemos hacer es investigar los posibles mecanismos de resistencia a
los medicamentos en bacterias y descubrir antibacterianos más eficaces para hacer frente a los
terribles problemas. Por suerte, hay varios fármacos antibacterianos prometedoras con nuevos
mecanismos de acción están en desarrollo y los nuevos tipos de objetivos han surgido. También
tenemos que ser más precisos en la selección de los agentes patógenos y limitar el mal uso de los
antimicrobianos y otras prácticas que aceleran la aparición de nuevos mecanismos de resistencia.
Se debe crear un modelo sostenible para el desarrollo y el uso de antibacterianos. (Lomovskaya et
al., 2008).
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