preza reyes margarita

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOANALISIS
LICENCIATURA EN QUIMICA CLINICA
EXPERIENCIA RECEPCIONAL
Catedratico: M. en C. Victor G. Rivas Espinoza
“UTiLIDAD CLINICA DE LA PROTEOMICA EN
EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES
INFECCIOSAS”
MONOGRAFIA
PRESENTA:
PREZA REYES MARGARITA
DIRECTOR:
M. en C. Elofsa Dominguez Trejo
SINODALES:
Q.C. Patricia Marquez Munoz
M. en C. Laura Cecilia Gonzalez Sanchez
XALAPA DE ENRIQUEZ, VER. DICIEMBRE DE 2010
RESUMEN
En el presente trabajo de Experiencia Recepcional titulado “Utilidad
Cllnica de la Proteomica en el Diagnostico de Enfermedades Infecciosas” se
encontraran cinco capltulos en los que se abordan temas referentes a la
proteomica y su influencia en las enfermedades infecciosas.
En el primer capltulo, titulado “Antecedentes: ADN y Genomica” se
explica desde el descubrimiento de la estructura de la molecula de ADN hasta
los estudios e investigaciones que dieron origen a la genomica.
En
el
segundo
capltulo,
llamado
“Conceptos
Generales
sobre
Proteomica”, se pretende dar un panorama amplio acerca de los principales
conocimientos que debemos saber para comprender los principios de la
proteomica, tales como, protelnas, proteoma, proteomica, etc.
El
tercer
capitulo,
“Clasificacion
y
Definition
de
Enfermedades
Infecciosas”, esta constituido por la clasificacion de las enfermedades
infecciosas en funcion del agente causal; de este modo se encontraran los
subtltulos de Enfermedades Bacterianas, Enfermedades Virales, Enfermedades
Parasitarias y Enfermedades Micoticas; ademas se menciona como la
proteomica ha influido en el diagnostico de cada una de estas.
En el cuarto capltulo, denominado “Metodos de Laboratorio Utilizados en
la Proteomica para el Estudio de las Enfermedades Infecciosas”, se explican las
principales tecnicas que se emplean para el estudio de los proteomas
implicados en las enfermedades infecciosas.
Para finalizar, se encuentra el quinto capltulo, designado como “Future
de la Proteomica”, en el que se pretende realizar una description de los
avances que se esperan de la proteomica, la cual incursionara en distintas
areas y se valdra de distintas herramientas para su desarrollo.
INDICE
Introduction....................................................................................................
4
Antecedentes historicos..........................................
6
Objetivo general........ .........................................
8
Justification....................................
9
Capitulo I “Antecedentes: ADN y Genomica”
1.1 Descubrimiento de la estructura del ADN...................10
1.2 Estructura del ADN....................................................................12
1.3 Bases riitrogenadas: Purinas y Pirimidinas............................ 13
1.4 Inicios de la Genomica............................................................ 14
1.5 Tipos de Genomica................................................................. 15
1.6 El Proyecto Genoma Humano................................................ 16
Capitulo II “Conceptos Generates sobre Proteomica”
2.1 El Gen..................................................................................... 18
2.2 Protelnas..................
18
2.3 Dogma Central de la Biologla Molecular...............................
19
2.4 La Proteomica......................................................................... 20
2.5 Modificaciones postraduccionales.......................................... 22
2.6 Aplicaciones de la Proteomica..................................................23
2.7 El Proteoma.....................................
24
Capitulo III “Clasificacion y Definition de Enfermedades Infecciosas”
3.1 Perlodos de la enfermedad infecciosa................................... 25
3.2 Clasificacion de enfermedades infecciosas........................... 26
3.3 Enfermedades bacterianas..............................................
26
3.4 Enfermedades virales............................................................... 27
3.5 Enfermedades parasitarias..................................................... 28
3.6 Enfermedades micoticas........................................................ 29
3.7 La proteomica en las enfermedades infecciosas................... 30
Capitulo IV “Metodos de Laboratorio Utilizados en la Proteomica
Para el Estudio de Enfermedades Infecciosas”
4.1 Desnaturalizacion de proteinas................................................ 32
4.2 Tecnicas de estudio del proteoma.......................................... 33
4.3 Tecnicas en las que las protelnas estudiadas no se separan
4.3.1 Matrices de protelnas (Arrays)......................................33
4.4 Tecnicas que implican una separation de proteinas
4.4.1 2D -P A G E .................................................................. 33
4.4.2 Cromatografla llquida de alta resolucion.................... 35
4.5 Tecnicas de analisis individualizado de proteinas separadas
4.5.1 Espectrometria de masas.......................................... 36
4.6 Aplicaciones de los metodos de laboratorio utilizados
en la proteomica al estudio de microorganismos
4.6.1 Aplicacion de Arrays al Estudio de Enfermedad
deChagas.........................................................................
37
4.6.2 Aplicacion de Espectrometria de masas,
Electroforesis Bidimensional y Analisis Bioinformatico al
Estudio de Plasmodium, Agente Causal de la Malaria........ 38
l
4.7 Herramientas de la proteomica para el estudio de la
resistencia bacteriana..................................................................... 39
Capitulo V “Futuro de la proteomica”
5.1 Bioinformatica........................................................................... 41
5.2 Analisis proteomicos para la identification de moleculas
alergenicas......................................................................................42
5.3 Proteomica y nanotecnologia............................
43
Conclusiones....................................................................................................45
Referencias
46
INTRODUCCION
En el ano 1953 James Dewey Watson y Francis Harry Compton Crick
descubrieron la estructura de la molecula de ADN, describiendola como una
molecula formada por una doble helice, cuyas cadenas giran alrededor de un
eje central con bases nitrogenadas en el interior de la cadena y grupos fosfato
en el exterior; teniendo como caracteristica principal que las dos cadenas
permanecen juntas por las bases purinas y pirimidinas.
A partir de ese ano se origino una serie de conocimientos nuevos en
genetica y biotecnologia, todo esto gracias al descubrimiento de la estructura y
funcion del ADN. Sin duda, todos los estudios que se han realizado desde ese
tiempo hasta la epoca actual, en cuanto a genetica, han dado paso al desarrollo
de la genomica, y ahora a la proteomica, de la que se esperan grandes
aportaciones.
En el 2003 Cervantes explico que “si la genetica es la ciencia que se
ocupa del estudio de la herencia, sus mecanismos y consecuencias, la
genomica es el campo o area de la genetica que se encarga de los estudios
estructurales y funcionales del genoma”. En este contexto, es necesario
mencionar que la genomica difiere de la genetica en que su estudio no se
inclina particularmente a un gen, sino a todos los genes y las interacciones
entre ellos.
i
El desarrollo del Proyecto Genoma Humano permitio el origen de esta
nueva disciplina, la genomica, originando asi importantes aplicaciones para
atender la salud de las poblaciones. Ponce (2007) describio que “el genoma
humano se termino de secuenciar a finales del afio 2000, solo con el proposito
de conocer de que estamos hechos nosotros mismos”(53). De esta manera se
logro conocer que existen alrededor de 30,000 genes, que codificaran a unas
90,000 proteinas.
Bernal (2007) define al genoma como “el contenido total de ADN de
una celula haploide”. Por otro lado, Lanz (2007) escribio que “el proteoma se
define como la totalidad de proteinas que son expresadas por un genoma en un
momento dado y bajo determinadas condiciones de tiempo y ambiente”. Si bien
el genoma refiere la tipologla del organismo, este no describe las funciones que
rigen el mismo; para explicar de una manera mas completa como funciona el
organismo es necesario estudiar las proteinas, es decir, la proteomica.
Aunque la genomica estudia el funcionamiento de los genomas, no es
una ciencia que permita explicar detalladamente el proceso de un fenomeno
complejo, como el comportamiento del organismo ante las enfermedades, dado
que no existe una absoluta correlation entre el fenotipo y el genotipo. Para
entender el comportamiento fisiopatologico del organismo se requiere de un
mayor entendimiento que va mas alia de conocer el genoma, es decir, se
necesita estudiar el proteoma (conjunto de proteinas). El termino proteomica se
introdujo por primera vez en 1995, aunque el concepto aparecio anteriormente
cuando se planted la creation de un atlas molecular acerca de las proteinas
humanas por Anderson y Anderson. Corrales (2009) define la proteomica como
“el estudio del proteoma, termino analogo a genoma, que se refiere al conjunto
de proteinas de un organulo, una celula, un tejido o un organismo completo”.
Al emplear la proteomica se ha logrado contar con una cantidad
innumerable de conocimientos que tienen aplicacjon en multiples ramas de la
ciencia, dando paso de este modo a mejores estrategias de diagnostico de
multiples enfermedades.
{
5
)
A ntecedentes H istoricos
La proteomica es un avance cientifico con antecedentes importantes,
tales como:
♦ Juan Gregorio Mendel, llamado “padre de la genetica”, realizo
estudios con los que origino una gran aportacion a la ciencia; uso el Pisum
sativum, abriendo esta flor en estado inmaduro y retirando la antera que
proporcionaria el polen y cubriendo el estigma con polen de otra planta con
distintas caracterlsticas logro una fecundacion experimental. Las conclusiones
de este estudio dieron origen en 1866 a las Leyes de la Genetica de Mendel.
♦
En la deqada de los cuarenta, Martin y Synge desarrollaron la
cromatografia sobre papel; y Martin y James, en 1952, la cromatografia de
gases. En esa misma epoca, Moore y Stein desarrollaron la cromatografia de
cambio de ion, procedimiento que permitio la separacion y cuantificacion de
aminoacidos.
♦
En 1944, Avery, MacLeod y McCarty, identificaron el ADN como la
base molecular de la herencia.
♦
Entre los ; anos 1949 y 1959, se introdujeron procedimientos
cromatograficos y electroforeticos de separacion, tales como, electroforesis en
gel de agar (1949), en papel (1950), en almidon (1952) y en gel de
poliacrilamida (1959) que contribuyeron al progreso de la bioquimica.
♦
En 1950, Erwin Chargaff demostro que aunque la composicion del
ADN varia de especie bn especie, el numero de bases adenina (A) era igual al
de timinas (T) y el de citosinas (C) al de guaninas (G).
♦
En 1953 Watson y Crick, basandose en los hallazgos realizados por
Rosalind Franklin, describieron que el ADN estaba formado por una doble helice
regular constituida por azucares (desoxirribosa) y fosfatos con las bases
nucleotidicas formando peldanos de enlaces A - T y C - G.
♦
En octubre de 1990 se inicio un proyecto en el que se hizo un
estudio sistematico de todo el genoma humano, en el que participaron en
conjunto laboratories de China, EE. UU., Francia, Alemania, Japon y Gran
Bretana.
# A mediados de los 90’ el Institute for Genomic Research (TIGR)
logro automatizar todo el proceso de subclonacion “shotgun” y secuencio en un
tiempo realmente corto para la tarea, la secuencia completa del genoma del
Haemophilus influenzae.
*
En junio de 2000, el Consorcio International del PGH, que incluye
cientificos de China, Francia, Alemania, Italia, Japon, Suiza y el Reino Unido,
anunciaron que habian elaborado un borrador de la secuencia del genoma
humano, que significaba que el 97% del genoma humano habia sido mapeado,
y el 87% secuenciado de forma precisa.
❖
En abril de 2003, nace la genomica, ya que en este aho el Proyecto
Genoma Humano puso fin a la era pre-genomica con el anuncio de que habia
llegado a la secuencia completa del genoma humano.
O bjetivo G eneral
❖
Describir la utilidad clinica de la proteomica en el diagnostico de
enfermedades infecciosas.
JUSTIFICACION
Gracias a la description del genoma humano se ha logrado introducir
una nueva forma en la que se pueden estudiar y comprender los fenomenos
fisiopatologicos. Actualmente, se ha podido estudiar el conjunto total de los
componentes de las celulas, logrando as! describir la cantidad total de genes
que conforman la especie humana y, de este modo, aclarar las dudas que en el
pasado se tenlan sobre las funciones celulares, fisiologicas y patologicas.
La aparicion y desarrollo de la proteomica, que nace de la genomica, ha
comenzado a describir la funcion de las miles de protelnas codificadas por los
genes, quienes toman un papel importante en las funciones celulares.
Los avances que nos ha brindado la genomica es el inicio de un gran
adelanto, pero es la proteomica quien cobra una gran aportacion en el
desarrollo de metodos de diagnostico. Por esta razon, es necesario el uso de la
proteomica como parte del diagnostico de enfermedades infecciosas, ya que
nos va a permitir conocer las modificaciones que sufran los proteomas (conjunto
de proteinas) de. patogenos y hospedero en las infecciones, saber la vision de
los cambios fenotlpicos que sufre un microorganismo en funcion del medio que
le rodea, conocer diferentes proteomas de microorganismos, etc., para obtener
una vision mas amplia de las enfermedades infecciosas que nos permita
alcanzar nuevos metodos de diagnostico y tratamiento acertados.
A pesar de que la proteomica incluye estrategias y tecnicas que influyen
positivamente en el diagnostico de diversas enfermedades, incluyendo las
infecciosas, la difusion de la informacion que existe acerca de la misma
continua fluyendo muy lentamente.
La aplicacion clinica de la proteomica ha resultado muy prometedora, es
por eso que resulta de gran importancia dar a conocer informacion de esta
disciplina cientifica para que dentro de pocos anos sea una de las herramientas
mas importantes en el diagnostico oportuno de diversas patologias.
CAPITULO I
“ANTECEDENTES: ADN Y GENOMICA”
1.1 Descubrimiento De La Estructura D el ADN
La molecula de ADN siempre ha sido concebida como una estructura
uniforme con aparienpia de doble helice; tal como fue descrita por Watson y
Crick, sin embargo, el descubrimiento de esta estructura tiene sus bases en
multiples experimentos que se fueron realizando paulatinamente para concretar
lo que ahora conocemos como ADN.
En 1951, James Dewey Watson asistio a una reunion cientifica donde
uno de los ponentes era Maurice Wilkins, quien centraba sus investigaciones en
el trabajo del ADN. En dicha conferencia, Wilkins hablo de datos obtenidos en
su laboratorio sobre la estructura molecular del ADN mediante la aplicacion de
la cristalografia con rayos X, fue asi como Watson se intereso en el estudio
sistematico de la molecula de ADN.
Para este momento, ya se tenia sabido que los cromosomas de todas las
celulas presentaban ADN; al final de la decada de los cuarenta se conocia la
composicion de la molecula de ADN explicandose que esta conformada por
unidades llamadas nucleotidos, conteniendo desoxirribosa, un grupo fostato y
bases nitrogenadas.
Watson logro u'nirse al grupo de Max Perutz en el Laboratorio Cavendish;
ahi mismo conocio a Francis Harry Compton Crick, quien se encontraba
realizando sus estudibs de doctorado en dicho Laboratorio. Ambos mantenian
el mismo interes por conocer detalladamente la molecula de ADN.
En 1951, Rosalind Franklin (la dama gris del ADN) fue invitada a trabajar
en las investigaciones sobre ADN mediante la cristalografia, ya que ella contaba
con muchos conocimientos sobre este sistema. Rosalind apoyada por Raymond
Gosling jugo un papel muy importante en el descubrimiento de la estructura del
ADN. Sin embargo, su relation con Wilkins no era buena, por lo que decidio
trabajar aislada de este.
Mientras tanto, Watson y Crick continuaban con su interes centrado en la
estructura del ADN. Contaban con ciertas bases que les habia proporcionado
Wilkins, tales como: la molecula de ADN era mas ancha de lo que se suponia
en caso de que consistiera solo de una cadena de nucleotidos. Eso daba indicio
i
de que el ADN probablemente era un espiral compuesto por varias cadenas de
nucleotidos que se trenzaban entre si.
Watson y Crick suponian que si el orden en las bases nitrogenadas de la
molecula era irregular se tendria como consecuencia la existencia de una gran
variabilidad para la molecula de ADN. Apoyandose en fotografias de rayos X y
en conocimientos del Rosalind Franklin, empezaron a construir modelos de
ADN, que en un principio estaban equivocados; propusieron una estructura
helicoidal de 3 hebras para el ADN, colocando la cadena azucar fosfato en el
centra, enlazando los grupos fosfato con sales de magnesio en una triple helice.
Sin embargo, esta propuesta fue eliminada cuando Rosalind Franklin explico
que los iones Mg++ debian estar rodeados por densas capas de moleculas de
agua, lo cual hacia improbable que fuesen el soporte de una estructura tan
compacta.
i
Despues de ;este rechazo,
continuaron
investigando hasta que,
basandose en los trabajos de Linus Pauling, encontraron la clave de la forma de
la molecula: “dos cadenas que se enrollaban una en torno a la otra, con series
de bases identicas, unidas por puentes de hidrogeno”(52). Fue asi como, Watson
y Crick, propusieron en su escrito una estructura totalmente distinta a la
propuesta por Pauling:
Una doble helice, cuyas cadenas giran alrededor de un eje central.
^
Las
dos
cadenas
pero
no
perpendicularmente al eje central.
{ » )
sus
bases,
estan
relacionadas
^
Cada cadena consta de grupos fosfodiester, unidos por residuos de
(3-D-deoxiribofuranosa con enlaces 3', 5'.
#
Las bases estan en el interior de la cadena y los fosfatos en el
exterior.
^
El azucar es perpendicular a la base mas cercana.
La estructura se repite cada 10 pares de bases y cada 34 A.
#
La principal caracteristica de la molecula es la manera como las dos
cadenas permanecen juntas, por las purinas y pirimidinas.
Las uniones se dan entre una purina de una cadena, con una
pirimidina de la otra, a traves de puentes de hidrogeno: Purina en posicion 1 a
pirimidina en posicion 1. Purina en posicion 6 a pirimidina en posicion 6.
1.2 Estructura D el ADN
El ADN puede ser considerado como “la molecula de la vida”, ya que es
l
la que tiene codificada la informacion genetica caracteristica de todos los seres
vivos. Gracias a su descubrimiento, se ha logrado avanzar en el conocimiento
del funcionamiento de cada tipo celular. Es una molecula capaz de cumplir con
muchas funciones, tales como: controlar la transmision de la informacion
genetica, coordinar las interacciones del funcionamiento tisular y celular, regular
sus propios procedimientos (replication, transcription y traduction), controlar la
reproduction y mantenimiento de las caracteristicas de cada especie.
Pero, <-,Que es el ADN? Definiendo en forma sencilla, podemos decir que
“El acido desoxirribonucleico (ADN) es un polimero que, en su estructura lineal,
consta de una serie de monomeros denominados desoxirribonucleotidos
(nucleotidos)” (50). Cada nucleotido consta de:
1.
Un azucar (desoxirribosa), con 5 atomos de carbono enumerados del
1'al 5', en el carbono 3' presenta un grupo hidroxilo (OH).
2.
Un grupo fosfato (P), unido al azucar por el carbono 5'.
3.
Una base nitrogenada, unida al azucar por el carbono 1
Los atomos de carbono de la desoxirribosa soil enumerados con primas,
porque las bases nitrogenadas tambien poseen atomos de carbono que son
enumerados sin primas.
Gracias a la estructura que posee, la informacion genetica codificada a
traves de las bases nitrogenadas que conforman el ADN queda hacia el interior
de la molecula, de este modo, las paredes exteriores de la helice la protegen de
posibles alteraciones que se pudieran producir por reacciones con moleculas
del exterior.
1.3 Bases N itrogenadas : P urinas y P irimidinas
“Los nucleosidos y nucleotidos son componentes esenciales de todo
sistema biologico”(32). Un nucleosido esta constituido por una base nitrogenada
y una ribosa (en el caso de ARN) o desoxirribosa (en el caso de ADN); y un
nucleotido es el resiiltado de la union de un nucleosido con uno, dos o tres
fosfatos identificados con las letras griegas a, (3, y.
En base al tipo de base nitrogenada que posean, los nucleosidos y sus
nucleotidos pueden ser purinas o pirimidinas. Los nucleosidos adenosina y
guanosina se consideran purinas; mientras que, la uridina, la timidina y la
citosina son pirimidinas.
Cada una de las bases nitrogenadas que conforman la molecula de ADN
se designan con la letra inicial correspondiente: adenina (A), citosina (C),
guanina (G) y timina (T).
Los nucleotidos formados pueden enlazarse entre si mediante dos
formas:
1. Mediante un enlace fosfodiester (covalente). El grupo fosfato 5'de un
nucleotido se une al grupo hidroxilo 3' de otro. Este enlace permite la
construction de cadenas simples de ADN.
2.
Mediante un enlace de hidrogeno que se realiza a traves de las
bases nitrogenadas. Este enlace es mas debil que el fosfodiester y se rige por
el principio de complementariedad, es decir, la adenina solo se puede enlazar
con la timina y la citosina solo con la guanina (y viceversa). El enlace entre A y
T se establece mediante 2 puentes de hidrogeno, y el enlace entre la C y la G
se produce mediante 3 puentes de hidrogeno, por lo que este ultimo enlace es
mas fuerte.
Esta especificidad en el apareamiento de las bases obedece a las reglas
de Chargaff, un investigador austriaco, quien a finales de los cuarenta descubrio
que la composition del ADN de diferentes organismos era bastante similar, en
ciertos aspectos: dos de las cuatro bases nitrogenadas del ADN, las purinas
i
llamadas adenina (A) y guanina (G), estaban hechas de dos anillos de carbono,
hidrogeno, oxigeno y nitrogeno, uno de cinco lados y el otro de seis. Las otras
dos bases eran las pirimidinas citosina (C) y timina (T), ambas estaban
conformadas por anillos de seis lados. Chargaff descubrio que la cantidad de
adenina en una muestra de ADN era siempre igual que la cantidad de timina,
asimismo la cantidad de guanina era igual a la cantidad de citosina. Fue asi
como se llego a la conclusion de que las bases nitrogenadas en la molecula de
ADN se encuentran unidas como ya se menciono anteriormente.
El orden que adquieren las diferentes bases nitrogenadas en la molecula
de ADN se llama secuencia de ADN, esta secuencia determina las
instrucciones de la herencia genetica para cada organismo vivo.
1.4 Inicios D e La G enomica
El termino “Genomica” se comenzo a emplear hace mas de 20 anos, fue
introducido por Thomas Roderick en 1986, refiriendose a esta como el estudio
de los genes de manera sistematica, es decir, estudiando las relaciones entre
estos y con el medio ambiente.
14
Bernal y Suarez (2007) definen a la genomica como “el estudio
sistematico de las secuencias completas de ADN (genoma) de un organismo;
sus procesos de investigacion no se limitan a la <anatomla> del gen, sino que
alcanza, en su espectro de accion, a la fisiologla molecular (protelnas); es decir,
la genomica puede explicar el origen del fenotipo, codificado en los genes”.
[
i
Esta disciplina cientlfica surgio gracias a la consolidation del Proyecto
Genoma Humano a finales de los 80's. Dicho proyecto se define como un
“programa de investigacion colaborativo, cuyo objeto principal fue identificar por
completo la information genetica contenida en cada celula y escrita en el
lenguaje del acido desoxirritjonucleico ADN”(42). “El Proyecto del Genoma
Humano ha logrado determinar el orden preciso de los cerca de 3,200 millones
de los nucleotidos del genoma humano y elaborar un mapa que ubica a sus
30,000-40,000 genes”(31’ 62).
j
i.
Ciertos acontecimientos que marcaron la historia de la genetica, tales
como, las leyes de Mendel, lo6 experimentos que llevaron al descubrimiento de
la estructura de la molecula ;de DNA y el desarrollo del Proyecto Genoma
Humano fueron piezas clave p'ara que se fundamentara lo que hoy conocemos
como genomica.
1.5 T ipos de G enomica
i
(
La genomica como disciplina cientlfica puede clasificarse en 3 tipos
'
I
distintos,en funcion de su objeto de estudio particular; as! tenemos las
t
siguientes:
*
i
I
;
I
-$■ Genomica estructural: El enfoque de estudio de este tipo se refiere a
i
las variantes estructurales de secuencia en los genomas que se estan
investigando. Ejemplos de estajs variantes pueden ser polimorfismos de un solo
nucleotido (SNPs), mutaciones jo repeticiones e inserciones de nucleotidos.
^
Genomica funcional:jsu estudio va enfocado a la determinacion de la
funcion biologica de los genes y sus productos.
Genomica comparativa: Esta se enfoca a estudiar y comparer los
genomas estructural y funcionalmente de distintos organismos, ya sea el
humano, un raton o bacterias como Escherichia coli. Esta rama de la genomica
tiene como objetivo tener un mejor conocimiento acerca de como han
evolucionado las especies y determinar la funcion de los genes y de las
regiones no codificantes de los genomas.
1.6 E l P royecto G enoma H umano
El genoma humano se encuentra en el nucleo de cada una de las celulas
que conforman nuestro organismo, consiste en ADN unido a moleculas
proteicas organizadas en unidades distintas llamadas cromosomas.
Para entender el objeto de estudio de la genomica es preciso definir que
el genoma humano es el material genetico contenido en una larga cadena de
acido desoxirribonucleico (ADN) y constituye la informacion en que se
especifica los procesos homeostaticos de nuestra especie.
i
Ahora bien, ^Como surgio el Proyecto Genoma Humano (HUGO por sus
siglas en ingles)? En la segunda mitad del siglo XX los avances cientificos
pusieron de manifiesto lo importante que resultaba conocer el genoma humano;
asi en 1985 surgio la idea de secuenciar el genoma humano completo, sin
embargo, fue hasta el 1° de octubre de 1990 cuando oficialmente se inicio el
primer proyecto del : genoma humano en Estados Unidos de America,
culminando el 14 de abril de 2003. En un principio, el objetivo del Proyecto
Genoma Humano estaba dirigido al conocimiento de la secuencia de las cuatro
bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina y timina) que conforman el ADN
de los seres humanos. Ademas de este, se tenian otros objetivos(4), como:
Completar un mapa fisico del genoma de modo de tener hitos de
referencia a lo largo de cada cromosoma.
&
Desarrollar
cromosomas.
metodos
para
ubicar
genes
conocidos
en
los
#
Desarrollar metodbs de secuenciacion rapidos y eficientes.
#
Desarrollar herramientas de bases de datos y software adecuados
para manejar e interpretar los datos del genoma.
Aunque el proyecto fue iniciado por Estados Unidos de America, cabe
mencionar que otros paises han participado, principalmente Francia, Inglaterra,
Japon y Alemania.
Los resultados que se obtuvieron al termino del Proyecto Genoma
Humano fueron de gran importancia para el inicio de disciplinas como la
genomica; entre los principales hallazgos(4) se pueden mencionar:
S
El genoma humano contiene 3,164 millones de bases.
S
Un gen promedio contiene 6,000 bases.
■S El numero total de genes esta en alrededor de 30,000.
S
Menos del 2% del genoma corresponde a la secuencia que codifica
para las proteinas (genoma codificante).
S
50% del genoma son secuencias repetitivas.
S
El 99.3% de la secuencia del ADN es exactamente la misma en
todos los individuos.
S
Se desconoce la funcion de un 50% de los genes descubiertos
(aproximadamente 15,000).
Con el conocimiento del genoma humano se evidencio la diferencia
fundamental entre la genetica, que estudia los genes, y la genomica, que se
encarga del estudio sistematico de los genomas.
CAPITULO II
“CONCEPTOS GENERALES SOBRE PROTEOMICA”
2.1 El G en
Barbieri y Moya (2005) definen al gen como “la unidad fisica, funcional y
fundamental de la herencia*4). Desde el enfoque de la biologia molecular,
podemos decir que “un gen es la secuencia completa de acidos nucleicos
necesaria para la sfntesis de un polipeptido funcional”(34).
La secuencia espedfica de cada gen corresponde a una pequena
porcion del ADN total de un genoma y corresponde a la information necesaria
para producir una proteina en particular; asi, un gen determinado codifica para
cierta proteina correspondiente(57).
2.2 ProteInas
Para comprender la aplicacion que la proteomica brinda al diagnostico de
enfermedades infecciosas es importante recordar que las proteinas son
moleculas organicas constituidas por aminoacidos ordenados en cadenas
polipeptidicas que se; unen mediante enlaces quimicos entre el grupo amino
(NH2) de un aminoacido y el grupo carboxilo (COOH) del siguiente.
“Veinte tipos diferentes de aminoacidos pueden conformar a las
proteinas. Dentro del gen, secuencias especificas de tres bases (codones)
codifican a un aminoacido. Por ejemplo, la secuencia de bases ATG codifica al
aminoacido metionina. El codigo genetico incluye, entonces, una serie de
codones que especifican que aminoacidos son necesarios para formar una
proteina especifica”(4
9)ii.
(
i
1
Las proteinas forman parte de todos los organismos y, al igual que otras
macromoleculas, son esenciales para el funcionamiento celular; ya que
participan en la mayoria de los procesos celulares, como la comunicacion
celular, la respuesta inmune, mantenimiento de la homeostasis celular y en el
ciclo celular.
Gracias a todas las funciones que pueden desempenar las proteinas son
consideradas muy importantes para la vida, es por eso que el objetivo de
estudio de la proteomica se centra en estas macromoleculas.
2.3 Dogma C entral D e La B iologia M olecular
Con el conocimiento del Dogma Central de la Biologia Molecular se
ilustran los mecanismos con los que se transmite y se expresa la herencia
genetica; el conocimiento de este dogma se dio tras el descubrimiento de la
codificacion de la doble helice del DNA.
Dogma central de la biologia(4) (la informacion genetica codificada en el ADN se copia en un
ARN mensajero que se traducira finalmente en proteinas en el citoplasma)
“El dogma propone que existe una expresion unidireccional de la
informacion contenida en los genes de una celula, es decir, que el DNA es
transcrito a RNA mensajero y que este es traducido a proteina, elemento que
finalmente realiza cada accion celular”(67).
Replicacion, Transcripcion y Traduccion:
Segun el dogma central de la biologia molecular, en las celulas el ADN
original es copiado en una nueva molecula de ADN (a este proceso se le llama
replicacion). Esta copia sirve de molde para generar moleculas de ARN
(proceso llamado transcripcion) a partir de las cuales se sintetizan las
protefnas (traduccion). Dichos productos proteicos cumplen con funciones
especlficas para la celula(57).
2.4 La P rote6 mica
La proteomica es una disciplina cientffica creada a rafz de los avances en
el estudio del ADN y del genoma humano, se origino posterior a la genomica,
siendo su objetivo de estudio mas especffico que esta.
Patterson (2003) propone la siguiente definition para proteomica: “Es el
estudio sistematico de las diversas propiedades de las protefnas para proveer
detallada description de la estructura, funcion y control de los sistemas
biologicos, esto incluye: secuencia, cantidad, modificaciones, interacciones con
otras protefnas, etc. tanto en salud como en la enfermedad”(48).
“El objetivo final de la proteomica es la deduction de la estructura y las
interacciones de todas las protefnas en una celula dada. La comparacion de
mapas proteicos de cdlulas sanas con los mapas de celulas enfermas podrfa
permitir a los investigadores entender los cambios que ocurren en las senales
que generan las celulas y los procesos metabolicos que se llevan a cabo”(49).
Los primeros estudios en proteomica comenzaron en 1975 con la
introduction de los geles de dos dimensiones por diversos grupos que
comenzaron a obtener mapas de protefnas de Escherichia coli, ratones y
algunos tipos de conejillos. En ese tiempo cerca de 300 protefnas podfan ser
separadas pero debido a limitaciones tecnicas no era posible identificarlas
completamente. Actualmente, con metodologfas y tecnicas instrumentales mas
refinadas tanto la separation como la identification de protefnas ha avanzado a
pasos agigantados en condiciones reproducibles(25,61).
En los estudios de proteomica a gran escala se puede detectar la
composicion/estructurd
de
las
protefnas,
sus
isoformas,
los
cambios
conformacionales, las alteraciones moduladoras durante el desarrollo, las
modificaciones pos-traduccioriales (fosforilacion, glicosilacion de protemas), las
interacciones con otras protemas o con farmacos, etc. A partir de cantidades
minimas de compuesto (p. ej., 10 ppm) se puede identificar protemas
individuales en mezclas complejas de miles de moleculas(24).
Segun el objeto de estudio, la proteomica puede dividirse en:
•s Proteomica de expresion: Su objetivo es obtener la description del
proteoma total de uh tejido, fluido, tipo celular u organelo, asi como las
mediciones cuantitativas de los niveles de expresion proteinica. Las protemas
celulares son analizadas mediante electroforesis bidimensional o cromatografia
de alta resolution combinadas con espectrometria de masas(65).
s
Proteomica funcional: Se encarga principalmente del estudio de la
localization sub celular de las protemas y la regulation de su expresion,
incluyendo
las
interacciones
proteina
-
proteina,
protemas
-
ADN,
protemas - ARN y las modificaciones post-traduccionales.
»
i
S Proteomica de cartoqrafia celular: Centra su estudio en la interaction
entre protemas en distintas fases de la funcion celular(7).
S
Proteomica estructural: Busca comprender la funcion celular
'
i
basandose en el analisis tridimensional y la realization de modelos de
proteinas(44,60).
i
|
!
En cierto modo, se puede afirmar que la proteomica surgio a partir de la
genomica; sin embargo, ambas son totalmente distintas, ya que el genoma se
puede definir como una coleccion de genes cuya naturaleza es estatica, es
decir, no cambia entre una y otra celula; sin embargo, el proteoma consiste en
una coleccion dinamica de protemas que difieren de un individuo a otro o de
una celula a otra.
La proteomica se ha podido desarrollar valiendose de varias ciencias
como la biologia molecular, bioquimica, microbiologia y bioinformatica, entre
otras. Ademas, recordando el objeto de estudio de la proteomica (el proteoma),
es importante reconocer que esta tiene una especial importancia en el
{ * , }
diagnostico de enfermedades, ya que los eventos fisiologicos y patologicos que
constituyen las bases para la salud y la enfermedad son, en el fondo, procesos
manejados por protelnas(4).
En resumen, se puede decir que la proteomica incluye no solo la
identification de protelnas sino tambien la determination de su localizacion,
modificaciones, interacciones, actividades y principalmente su funcion en ultima
instancia(10).
2.5 M odificaciones Postraduccionales
Las protelnas son los elementos efectores de la mayorla de las funciones
fisiologicas en el interior de las celulas y su papel en el medio extracelular es
fundamental.
La modificacion postraduccional de protelnas supone un mecanismo
fundamental de regulation de su actividad biologica. Se llaman modificaciones
postraduccionales, ya que se realizan despues del proceso de traduction o
slntesis proteica. “Una de las modificaciones mas estudiadas es la fosforilacion
de protelnas. La presencia o ausencia de grupos fosfatos regula su actividad,
estabilidad, localizacion y juega un papel importante en rutas metabolicas y en
transduction de senales”(37), Otra modificacion postraduccional compleja es la
glicosilacion de protelnas.
Glicosilacion de protelnas: Consiste en la adicion covalente de azucares
a las protelnas. Recientemente, se han definido dos tipos de glicosilacion, esta
!
clasificacion va en funcion del aminoacido al que se une el azucar: la Nglicosilacion, en la cual los azucares se unen al grupo y-amido de la asparagina
y la O-glicosilacion donde los azucares se unen al grupo hidroxilo de las
cadenas
laterales
de
los
aminoacidos
serina,
treonina,
hidroxiprolina,
hidroxilisina y tirosina(17).
Anteriormente, los procariontes fueron considerados por mucho tiempo
incapaces de glicosilar protelnas, ya que esta actividad, en eucariontes, se Neva
a cabo en el reticulo endoplasmico y aparato de Golgi, organelos que los
procariontes no tienen. Sin embargo, los reportes de proteinas glicosiladas se
han ido incrementando, tanto en bacterias patogenas como de vida libre.
Debido al interes clinico que representa la caracterizacion de proteinas
glicosiladas y el estudio de sus mecanismos de glicosilacion, se han inclinado
mas hacia las bacterias patogenas.
En general, las proteinas glicosiladas en bacterias se encuentran
siempre expuestas en la superficie de las celulas, por lo que su funcion
biologica podria tener un importante papel en la patogenesis.
Algunas de las bacterias de las que se
ha descrito la presencia de
proteinas glicosiladas son Campylobacter spp. (agente causal de diarrea),
Helicobacter pylori (patogeno que infecta la mucosa gastrica causando
ulceraciones), Treponema pallidum, agente causal de la sifilis, Pseudomonas
aeruginosa, bacteria que infecta individuos inmunocomprometidos y a pacientes
con fibrosis quisticas y Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la
tuberculosis(17).
2.6 A plicaciones D e La P roteomica
Existen cuatro aplicaciones principals de la proteomica(2), estas son:
1. Mineria de proteinas: Se identifican todas las proteinas contenidas en
una muestra.
2. Perfiles de expresion proteica: Se refiere a la identification de una
proteina en una muestra o en un estado en particular de un organismo o celula.
Las celulas o tejidos “normales”
pueden ser comparados con un estado
fisiologico o patologico para determinar la expresion diferencial de proteinas en
los distintos estadios.
3. Mapas de redes de proteinas: El objetivo es determinar como las
proteinas interactuan entre ellas en organismos vivos.
4.
Mapeo de modificaciones en proteinas: Es importante conocer las
modificaciones que sufre una proteina, por lo tanto, mediante este mapeo se
identifican como y donde son modificadas.
2.7 E l P roteqma
El proteoma de un organismo es un complejo y dinamico elemento que
ha cobrado gran importancia en los ultimos anos, debido a los alcances
cientificos que ha permitido en materia de salud.
“El termino proteoma fue acuhado en 1994 para definir a todas las
proteinas que son expresadas por un genoma en un tejido o en una celula” (47).
Se dice que el proteoma de un organismo es altamente dinamico porque sus
componentes varian ampliamente en funcion del tejido, celula o compartimiento
celular que se estudie y estos, tambien pueden ser modificados por alteraciones
externas, como estres, accion de farmacos o el estado fisiologico (normal o
patologico). Asl, el proteoma humano esta constituido por muchos proteomas
que son caracteristicos de cada tipo celular de un organismo.
Puesto que las proteinas se encuentran organizadas y expresadas en
sistemas que interactuan, su estudio puede ser muy complicado. Mientras que
el genoma no revela los detalles de la funcion de una celula, el estudio del
proteoma tiene exactamente ese objetivo(24).
CAPITULO III
CLASIFICACION Y DEFINICION DE ENFERMEDADES
INFECCIOSAS
Inarejos (2007) define a las enfermedades infecciosas como “un proceso
patologico cuyas manifestaciones clinicas se deben a la accion de germenes o
sus toxinas”(27).
Generalmente, se manifiestan tras un periodo de incubacion y de
contagio del agente causal. El aspecto microbiologico constituye un paso
esencial en el establecimiento de la etiologia y diagnostico de las enfermedades
infecciosas. La caracteristica fundamental del diagnostico es la identificacion del
agente etiologico,
sin embargo,
en
la actualidad
incluye tambien
la
determinacion de la sensibilidad in vitro a los antimicrobianos y la utilization de
metodos de tipado que permitan la diferenciacion
intraespecifica de los
aislamientos(54).
3.1 P eriodos D e La E nfermedad Infecciosa
Las enfermedades infecciosas se desarrollan en diversas etapas desde el
contagio del agente causal hasta su elimination del organismo. A continuation
se explican las etapas de la enfermedad infecciosa:
1.
Periodo de incubacion: Es el tiempo que transcurre entre la invasion
al organismo por el agente causal y el inicio de los signos y sintomas. Durante
este lapso los microorganismos crecen y se multiplican.
2.
Enfermedad (fase o periodo de estado): Es la etapa de la
enfermedad en la cual los signos especificos son evidentes. Generalmente, las
enfermedades presentan signos locales relacionados con el organo afectado,
asi como sintomas generates que afectan a todo el organismo cuando se cursa
una enfermedad infecciosa, como fiebre, dolor de cabeza, etc.
3.
Convalecencia: Es el lapso entre la desaparicion de los sintomas y el
regreso al estado normal del organismo.
3.2 C lasificacion de Enfermedades Infecciosas
Las enfermedades infecciosas pueden ser clasificadas en funcion de
varios factores; sin embargo, este apartado se enfocara a la clasificacion en
base al agente causal, los cuales pueden ser virales o bacterianos y, con menor
frecuencia, parasitarios o micoticos.
3.3 E nfermedades Bacterianas
Entre los microorganismos patogenos, las bacterias son las responsables
de la mayoria de las enfermedades infecciosas sistemicas, de organos y de
aparatos.
“Las bacterias son organismos unicelulares
procariotas,
cuya estructura cromosomica es
unica y de doble cadena, que carecen de
membrana nuclear y de otras organelos limitadas
por membranas”(3). En el ser humano pueden
estar como constituyentes de la flora normal o
como patogenos causantes de enfermedades
infecciosas.
El espectacular desarrollo de la biologfa molecular con la introduccion de
la genomica y la proteomica ha permitido, mediante la utilizacion de diferentes
tecnicas moleculares (hibridacion de DNA, amplification, secuenciacion de
acidos nucleicos, ribotipado, analisis de plasmidos, etc.), alcanzar importantes
resultados(3) como:
a)
Clasificar taxonomicamente las bacterias patogenas para los seres
humanos dentro del dominio Bacteria, uno de los tres que agrupan las formas
de vida conocidas;
b)
Determinar cambios de generos y especies;
infectan, poseen capacidad oncogenica. Los virus no solo infectan a todas las
especies de eucariotas, sino que tambien son frecuentes en bacterias; estos
ultimos se denominan bacteriofagos o, simplemente, fagos{3).
El diagnostico de
las infecciones viricas se establece
mediante
observacion de las lesiones citopaticas caracteristicas, deteccion de antigenos
especfficos o de fragmentos especi'ficos del genoma en el material ch'nico
remitido para estudio, o bien, por aislamiento del virus en cultivo celular a partir
de ese materia!(3).
3.5 E nfermedades Parasitarias
Las enfermedades parasitarias se encuentran con menor frecuencia que
las enfermedades bacterianas, sin embargo, tambien constituyen un problema
de salud importante. Botero (2006) distingue una infection parasitaria de una
enfermedad parasitaria. De este modo, define a la infection parasitaria como el
proceso que “sucede cuando el hospedero tiene parasitos que no le causan
enfermedad, lo cual constituye el estado
de portador sano”(8); y a la enfermedad
parasitaria comoel proceso
presenta
cuandoel
que “se
huesped
sufre
alteraciones patologicas y sintomatologia
producidas por parasitos”(8>.
La patologia
parasitos
provocada por los
depende tanto
de factores
intrmsecos, propios del parasito, como de
factores extrinsecos, o dependientes del
hospedero. En funcion de lo anterior, un
mismo parasito puede ser inocuo para
determinados hospedadores y, por el contrario, causar alteraciones funcionales
mas o menos graves en otros (21).
En los ultimos anos, gracias al desarrollo de la genomica y la proteomica
se ha logrado desarrollar procedimientos rapidos y precisos para los estudios
biologicos, el diagnostico, la prevention y el tratamiento de las infecciones
parasitarias. La tecnologia se basa en el uso de los acidos nucleicos; mediante
estos metodos los parasitos pueden ser lisados y liberar los acidos nucleicos,
los cuales se pueden desnaturalizar e hibridar para su estudio.
3.6 E nfermepades M icoticas
Las enfermedades micoticas, tambien llamadas micosis, comprenden un
grupo importante de trastornos que incluyen desde infecciones cutaneas
superficiales y mucosas que pueden originar irritation local a procesos muy
invasivos asociados a patogenos sistemicos y oportunistas clasicos(43).
“Los hongos son organismos eucarioticos que viven como saprofitos en
la tierra y la vegetation. Se reproducen mediante la formation de esporas y
pueden
existir
formas
en
dos
principales:
micelios y levaduras. En
la forma de micelios, los
hongos estan compuestos
por
estructuras
filamentosas de aspecto
tubular,
hifas,
denominadas
que
mediante
crecen
ramificaciones
laterales formando grandes colonias. Por el contrario, las levaduras son celulas
redondas u ovales que se reproducen por gemacibn”(9). Solo algunas de las
mas de 100,000 especies de hongos son patogenas para el hombre; estos
pueden
ser
hongos patogenos,
aquellos
con
capacidad
para causar
enfermedad en sujetos sanos; u hongos oportunistas, aquellos que unicamente
causan enfermedad en sujetos inmunosuprimidos(9).
u hongos oportunistas, aquellos que unicamente causan enfermedad en sujetos
inmunosuprimidos(9).
Es importante que el diagnostico micologico se realice a nivel de especie,
ya que esta information puede ser decisivo para j orientar el tratamiento
antifungico (54). Por lo tanto, el diagnostico de una determinada enfermedad
micotica supone la integration de 3 enfoques basicos: microbiologico,
inmunologico y anatomopatologico; estos son complementados con metodos
moleculares y bioquimicos de detection e identificacion de microorganismos.
3.7 La P roteomica en las E nfermedades Infecciosas
La aparicion de la proteomica ha tenido un gran impacto en el
diagnostico de enfermedades, incluyendo las infecciosas. La identificacion de
las proteinas que intervienen en las diversas etapas de la enfermedad ayuda a
comprender las bases moleculares y la naturaleza de dicha anomalia; de igual
manera, estas proteinas identificadas se pueden emplear como biomarcadores
de diagnostico o pronostico de la enfermedad.
Esta disciplina cientifica tiene aplicaciones en diversas areas, tales como,
la industria farmaceutica, la salud publica, la busqueda de biomarcadores, el
diagnostico de enfermedades cronicas y enfermedajdes infecciosas, etc. A
continuation, se explicara brevemente la aplicacion be la proteomica en el
diagnostico de enfermedades infecciosas(46):
Para comprender el modo en que el agente infeccioso afecta al
hospedero es necesario conocer las interacciones entre este y el patogeno, ya
que estas reflejan el equilibrio de los mecanismos de defensa del hospedero y
la virulencia del patogeno. Sin embargo, poco se Jconoce acerca de los
mecanismos por los cuales el patogeno logra superar la reaccion inmunitaria del
hospedero y alterar otros procesos celulares. Con la introduccion de la
proteomica ha sido posible caracterizar la interaccion patogeno - hospedero en
funcion de las alteraciones que sufren las proteinas en estos procesos.
Hasta ahora, se han publicado estudios proteomicos para distintos
patogenos:
Bacillus
Mycobacterium
anthracis,
tuberculosis,
Escherichia
Salmonella
coli,
Candida
typhimurium,
albicans,
Streptococcus
pneumoniae, Yersinia pestis(68,33).
Por otro lado, los virus codifican proteinas multifuncionales que
interactuan y modifican las proteinas de la celula hospedadora. En la
actualidad, los genomas virales ya han sido secuenciados; sin embargo, se ha
planteado el estudio de los proteomas correspondientes, ya que gracias a la
espectrometrla de masas se han encontrado diferentes modificaciones postraduccionales en las proteinas virales(40,64).
En el caso de enfermedades transmitidas por vectores, como la malaria,
el dengue y la enfermedad de Chagas, el patogeno- debe adaptarse a dos
hospederos muy diferentes, por un lado el insecto vector y por otro el
hospedero vertebrado (generalmente es el humano). En la actualidad no se
cuenta con vacunas para estas enfermedades y los mosquitos han desarrollado
resistencia a los insecticidas, por lo que la proteomica podrla proporcionar
informacion valiosa para interrumpir la transmision de los patogenos en los
insectos vectores a traves de la identification de proteinas fundamentals para
su desarrollo(47).
Con lo anterior, se hace evidente la importancia de la intervention de la
proteomica en la prevention y diagnostico de las enfermedades infecciosas, ya
sea enfermedades bacterianas, parasitarias o virales.
CAPITULO IV
METODOS DE LABORAtORIO UTILIZADOS EN LA
PROTEOMICA PARA EL ESTUDIO DE ENFERMEDADES
INFECCIOSAS
El objetivo de estudio de la proteomica es el proteoma, por lo que se
enfoca a identificar y caracterizar todas las protemas expresadas por un
organismo o tejido en un determinado estado fisiologico o patologico; en la
i
busqueda de esta caracterizacion de dichas proteinas, la identificacion y
descripcion de la secuencia de aminoacidos que las coriforman es una actividad
clave(66). De este modo, es posible relacionar las secuencias de aminoacidos
con los genes que las codifican y, por lo tanto, relacionar los genomas con los
i
proteomas.
La proteomica engloba una serie de tecnicas y metodos cuyos objetivos(58)
van destinados principalmente a:
1.
Separar las protelnas;
2. Analizar y cuantificar las protelnas separadas; j
3.
Identificar y caracterizar las protelnas de interes y,
4. Almacenar y compartir los datos.
|
4.1 D esnaturalizacion D e P roteInas
Para llevar a cabo el proceso de identificacion de las protelnas, es
necesario desnaturalizar la proteina previamente. “La desnaturalizacion se
encarga de romper todos aquellos enlaces no - covalentes, asi como enlaces
entre sus aminoacidos y cualquier grupo fosfatico o con el entorno (enlaces
debiles)” (49). Al romper estos enlaces, la estructura de la proteina es modificada
y adquiere una forma de cadena lineal; es necesaria la desnaturalizacion para
poder efectuar la separacion de todas las protemas en una muestra.
{
32
4.2 T ecnicas D e Estudio D el P roteoma
Para realizar el estudio de los proteomas de cualquier organismo, se
emplean diversos metodos y tecnicas*11) que pueden ser englobadas en los
siguientes grupos:
1. Tecnicas en las que las protelnas estudiadas no se separan: por
ejemplo, las matrices o micromatrices (arrays o microarrays) de protelnas.
2. Tecnicas que implican una separacion de protelnas: por ejemplo, la
electroforesis bidimensional (electroforesis- 2D) y cromatografla llquida (LC).
3. Tecnicas de analisis individualizado de protelnas separadas: tales como
espectrometrla de masas (MS).
4.3 T ecnicas E n Las Q ue Las P roteinas Estudiadas No S e
S eparan
4.3.1 MATRICES DE PROTEINAS (ARRAYS)
1
“Las matrices, arrays o biochips de protelnas jpermiten la deteccion,
i
caracterizacion y cuantificacion proteica, as! como el estudio de las cualidades
funcionales de las protelnas y sus interacciones, tanto entre ellas como con
moleculas de DNA o llpidos”(11).
En la actualidad, los arrays de protelnas constituyen una metodologla en
rapido desarrollo para la caracterizacion de actividades y para deteccion de las
interacciones protelna - protelna a gran escala(23).
4.4 T ecnicas Q ue Implican Una S eparacion D e P roteinas
4.4.1 2D -P A G E
|
Actualmente, el metodo de election para llevar a cabo la separacion e
identification de protelnas de una muestra es la Electroforesis Bidimensional
en
Geles
de
Polyacrilamida
(Two-Dimensional Poiyacriiamide
Gel
Electrophoresis o 2D-PAGE). 2D - PAGE posibilita generar, a partir de una
muestra de un fluido o de un tejido, un mapa de proteinas ordenadas
espacialmente en dos dimensiones(49).
El mapa proteico se obtiene en 2 etapas(49), cada etapa corresponde a una
dimension:
i
1. Primera etapa (Focalizacion isoelectrica [IEF]): Se Neva a cabo la
separation de las proteinas en un gradiente de pH hasta que alcanzan una
position estacionaria donde su carga electrica neta es |cero (punto isoelectrico,
pi).
Estas
proteinas
separadas
son
posteriormente
procesadas
por
electroforesis en presencia de sulfato dodecil de sodio (SDS - PAGE).
i
2. Segunda etapa: Las proteinas procesadas en SDS son separadas en
gel de poliacrilamida de acuerdo a su peso molecular, mediante la aplicacion de
un diferencial de potenpial perpendicular al gradiente dp pH. Ademas, se realiza
una coloration del gel(55) para evidenciar la presencia de proteinas (Azul
Coomassie, tincion con plata, compuestos fluorescentes, etc).
|
Como producto final de este procedimiento encontramos un gel en el que
las proteinas se encuentran separadas bidimensionalmente en funcion de su
punto isoelectrico y de su peso molecular. Este metodd solo puede proveer un
estimado aproximado. Sin embargo, la proteomica necesita un metodo de alto
rendimiento que permita identificar y cuantificar un alto numero de proteinas a la
vez; nuevas tecnologias como la espectrometria de masa asociada a
procedimientos que ionizan las moleculas proteicas con laser en un campo
electrico, para luego medir la cantidad de tiempo hasta^que los iones alcancen
el detector son actualmente las mas usadas; sin embargo, aun no es posible un
mismo procedimiento para todo este proceso(1).
j
Preparacion de la muestra: Sin importar el origen de la muestra a
analizar, esta debe ser sometida a un tratamiento previo cuyo objetivo sera
liberarlas de todos los componentes no proteicos presentes; estos son
esencialmente: lipidos, acidos nucleicos, componentes de naturaleza organica e
inorganics de bajo peso molecular como vitaminas y cofactores, iones
inorganicos y sales. La preparation de las muestras(13) incluye los siguientes
pasos:
1.
mezclas
Extraccion o solubilization de proteinas: Generalmente se emplean
de
agentes
caotropicos
y
detergentes,
adicionandose
otros
componentes (inhibidores de proteasas, un agente reductor y anfolinas del
,
i
rango adecuado).
2.
Eliminacion de lipidos mediante extraccion con solvente organico.
3.
Eliminacion de acidos nucleicos mediante digestion con nucleasas, co-
precipitacion con compuestos basicos o ultracentrifugacion.
4.4.2 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)
La HPLC es una tecnica analitica que separa las moleculas en funcion del
i
|
tipo de soporte (columna cromatografica) que se utilice (cambio ionico, fase
reversa, afinidad, etc.)(55).
,
|
Se realiza mediante la conexion de dos columnas; habitualmente, la
primera columna es de cambio ionico (separacion por carga) y la segunda de
fase
reversa
(separacion
por
hidrofobicidad)(51). *Consiste
en
marcar
diferencialmente con isotopos estables los peptidos generados por la proteolisis
de todas las proteinas sintetizadas por una celula o tejido en dos condiciones
que se desean estudiar o comparar. Posteriormente, interviene el analisis por
cromatografla liquids de fase reversa acoplada a la espectrometrla de masas,
con la que podemos realizar la identificacion de las proteinas en las bases de
datos de secuencias. La cuantificacion se logra mediante un analisis detallado
de las distribuciones isotopicas de los peptidos analizddos y as! se infiere la
expresion diferencial de las proteinas que los contienen(13).
|
Este metodo se emplea con frecuencia debido a que brinda excelentes
resultados en la separacion de peptidos, por lo que permite analizar muy poca
cantidad de muestra rapidamente.
'
4.5 T ecnicas D e A nalisis Individualizado
D e Proteinas
S eparadas
4.5.1 ESPECTROMETRIA DE MASAS
I
El principio de esta tecnica es el siguiente: “la radiacion electromagnetica
es descompuesta o separada de acuerdo a las difererites longitudes de onda”
( 13)
El espectrometro de masas esta compuesto por dos elementos
esenciales: la fuente de ionizacion (donde se producen los iones al suministrarle
energla a la muestra estudiada), y el analizador (un campo electrico, un campo
magnetico, de tiempo de vuelo o una combination de estos) donde los iones se
separan de acuerdo a la relation masa/carga (m/z).
^
La energia que es suministrada en la muestra es suficiente tanto para
ionizar la molecula, obteniendo un ion molecular (la molecula intacta pero con
una carga positiva o negativa), como para provocar \a fragmentation de la
molecula dando lugar a iones fragmentados. Cada ion producido es
caracteristico de un determinado compuesto quimico, de este modo es posible
su identification a partir de un espectro de masas.
j
Este metodo permite identificar una proteina y secuenciarla; sin embargo,
ademas de cumplir con esta funcion tiene la capacidad !de identificar y localizar
las modificaciones post-traduccionales en las proteinas contenidas en una
muestra. “La espectrometria de masas es practicamente el unico metodo capaz
de detectarlas y determinar su ubicacion en la cadena de aminoacidos”(13).
Valiendose de tablas que reportan los corrimientos de masa provocados por las
diferentes modificaciones es posible identificar el aminoacido y la modificacion
correspond iente.
i
{
36 }
4.6 A plicaciones D e Los M etodos De Laboratorio Utilizados
E n La P roteomica A l Estudio de M icroorganismos
i
4.6.1 Aplicacion de A rrays al Estudio de Enfermedad de Chagas
La enfermedad de Chagas, enfermedad infecciosa causada por el parasito
Trypanosoma cruzi y transmitida, sobretodo al hombre, por insectos hemipteros
pertenecientes a la subfamilia Triatominae representa uno de los problemas de
salud publica mas alarmante en el continente americand(36).
I
Para el ano 2003, en Mexico existian 2 millones de personas infectadas,
650,000 casos cronicos atendidos por los servicios dje salud, 69,000 nuevos
casos anuales y una mortalidad no menor de 25,000 por ano(56).
Una de las aplicaciones de la proteomica al estudio de T. cruzi fue
resultado de la necesidad de mejorar el diagnostico de la infeccion en los
vectores y los hospederos mamiferos. Tradicionalmente se han empleado dos
herramientas diagnosticas para la detection de la infeccion por T. cruzi: los
metodos serologicos y los metodos parasitologicos.
“Al considerar la evolution de la infeccion en los hospederos humanos, la
permanencia de los parasitos en la circulation sanguinea por muy corto tiempo
despues de su entrada, su localization en tejidos de dificil acceso y la escasa
cantidad de ellos en relation con el volumen de sangre con el tiempo y segun la
etapa de la enfermedad, es claro que el diagnostico tradicional parasitologico (y
todavia de primera linea en algunos paises) por microscopia carece de
sensibilidad”(45).
Recientemente, el uso de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)
se ha incrementado para detectar la presencia del parasito, ya que presenta la
ventaja de que aun cuando se encuentre en diminutas cantidades, el ADN del
parasito se puede amplificar; sin embargo, las dificultades que se han
encontrado
para
establecer
procedimientos
estandares
y
asegurar
la
sensibilidad del diagnostico parasitologico con PCR han propiciado la
introduction de metodos de diagnostico moleculares con el objetivo de mejorar
la sensibilidad y la especificidad del diagnostico de enfermedad de Chagas.
Dentro de los metodos moleculares que se han introducido al diagnostico
de la enfermedad de Chagas se encuentra la tecnica de microarravs: esta tiene
el potencial de realizar diagnostico de enfermedades jnfecciosas diferenciales
altamente especificos(19, 26). Esta metodologia requiere! ser perfeccionada y en
un futuro podria posibilitar lo siguiente(36):
j
1. Detectar infecciones agudas en una sola pruebai.
i
2. Realizar el seguimiento de los pacientes tratados para evaluar la
elimination del parasito y la evolution de su respuestaj inmunitaria posterior al
tratamiento.
|
4.6.2 Aplicacion de E spectrom etria de m asas , Electroforesis
B idim ensional y A nalisis B ioinform atico
al Estiidio de P lasm odium ,
|
Agente Causal de la Malaria
Los plasmodios son los parasitos causantes de^ la malaria, pueden ser
transmitidos por la picadura de mosquitos Anopheles', de estos, el Plasmodium
falciparum es la principal especie causante de malaria. En Mexico, hasta la
mitad del siglo pasado, con un promedio anual de 24000 y 2.4 millones de
casos, la malaria se hallaba entre las cinco primeras causas de muerte(15).
Uno de los avances cientificos de la proteomica map importantes surgio en
la presente decada con la combinacion de la espectrometria de masas con la
electroforesis bidimensional y el analisis bioinformatico, lo que permitio la
identificacion de proteinas a gran escala.
Para el
estudio de
proteomas de
|
i
parasitos! intracelulares
como
Plasmodium se requiere de suficientes cantidades de material parasitario, con
la minima contaminacion de material del hospedero, por lo que el analisis
proteomico encuentra limitaciones en el estudio de ciertas fases especificas de
desarrollo, como las hepaticas, sexuales o fracciones subcelulares(15).
Sin embargo, el uso de perlas magneticas cubiertas con anticuerpos
monoclonales permitio purificar esporozoitos(20) y ‘ el empleo de lineas
transgenicas de Plasmodium que expresan la proteina verde fluorescente
(GFP) bajo el control de promotores especificos de sexo permitio la purification
de gametocitos machos y hembras por medio de citometria de flujo(30).
I
El estudio proteomico ha permitido conocer las sepuencias proteinicas de
algunas fases de desarrollo del Plasmodium; sin embargo, la investigation
futura de estas proteinas proveera nueva informacion sobre la biologia y
diferenciacion sexual de los gametocitos, junto con las estrategias que utiliza el
parasito para sobrevivir en el intestino del mosquito vector, lo cual seguramente
resultara en la identificacion de posibles blancos para la interruption de la
transmision, ya sea por medio de farmacos o vacunas(15).
i
4.7
Herramientas D e La Proteomica Para E l Estudio D e La
R esistencia Bacteriana
|
La detection oportuna de la resistencia a antibioticos en las bacterias
causantes de infecciones aporta informacion muy valiosa para la prescripcion
de un tratamiento adecuado y exitoso.
|
En los ultimos afios se han introducido al laboratorio de microbiologia
diferentes pruebas, como tiras E - test, discos impregnados con antibioticos
(sensidiscos), medios cromogenicos, etc.(22) para identificar el patron de
resistencia a los antibioticos.
j
t
Con la introduccion de la genomica se hizo posible ,la identificacion de los
mecanismos de resistencia a antibioticos mediante j el uso de tecnicas
realizadas en el laboratorio de biologia molecular, tales como, hibridacion ADN
- ADN con sonda de ADN marcada con fluorescencia, amplification de un gen
especifico por PCR, secuenciacion nucleotidica de ADN, etc.
Sin embargo, con el initio del desarrollo de la proteomica se ha hecho
necesario emplear nuevas metodologlas que impliquen un conocimiento mas
especifico para comprender los mecanismos de resistencia a antibioticos y, de
este modo, resulte mas sencilla la prevention y el tratamiento de enfermedades
infecciosas. Dentro de estas nuevas metodologias,! la espectrometria de
masas ha constituido una tecnica importante para identificar polimorfismos y
genotipificacion de diferentes proteinas en una sola muestra.
i
Es posible predecir que las herramientas que se emplean en proteomica
se iran perfeccionando e incluso apareceran nuevos procedimientos y equipos
que solucionaran las principals limitaciones actuates. Sin lugar a dudas la
proteomica fortalecera su position actual en las investigaciones medicas,
farmaceuticas, y sus aplicaciones seran multiplicadas en pocos afios.
i
{
40
) ------------------- :
I
CAPITULO V
FUTURO DE LA PROTEOMICA
Las recientes investigaciones que se han realizado a partir de la biologia
molecular han revolucionado las ciencias de la salud; ya que con la introduction
de la genomica y, posteriormente, la proteomica, el diagnostico y tratamiento de
i
distintas enfermedades se ha logrado realizar con mejores metodos.
La proteomica como disciplina cientlfica ha venido avanzando lentamente;
sin embargo, en un futuro se desarrollaran nuevas tecnicas de diagnostico, mas
rapidas y fiables que facilitaran la prevention de las enfermedades.
“A medida que progresen la genomica y la proteomica, se descubriran los
mecanismos que causan enfermedades afectadas por varios genes, por
factores ambientales asociados y la forma en que varian sus expresiones (las
proteinas)”(49).
5.1 Bioinformatica
La bioinformatica es una nueva area que combina las ciencias de la salud,
la biologia molecular, las ciencias de la computation y las tecnologias de
information para dar origen a una herramienta de gran importancia para la
proteomica.
|
Existen tres areas fundamentals en la bioinformatica: el desarrollo de
nuevos algoritmos y tecnicas estadisticas con las que se logre encontrar y
cuantificar relaciones entre elementos de bases de datos muy grandes; el
i
analisis y la interpretation de varios tipos de datos induyendo secuencias de
nucleotidos y aminoacidos, dominios de proteinas y estructuras proteicas; y,
finalmente, el desarrollo e implementation de herramientas que permitan
administrar y acceder de forma eficiente a diferentes tipos de informacion(49).
*
i
La bioinformatica nace por la necesidad que encuentran la genomica y la
proteomica de almacenar los nuevos conocimientos que se van obteniendo
relacionados con los genomas y proteomas de distintos organismos; por tales
motivos
resulta
interesante aplicar enfoques computacionales a estas
disciplinas cientificas.
i
Una de las aplicaciones que presenta la bioinformatica a la proteomica es
la busqueda de similitudes u homologfas entre las nuevas secuencias de ADN y
secuencias
o fragmentos de ADN
de
otros
organismos
previamente
encontrados. Esta aplicacion facilita la prediction del tipo de proteina que
codifica una nueva secuencia(49).
1
A traves de internet y otras redes de comunication se ha logrado tener
(
acceso a grandes bases de datos de informacion biologica, esto ha sido posible
gracias a la bioinformatica; la cual ha sido una herramienta imprescindible para
organizar el flujo de informacion de los genes y proteinas, sus estructuras
moleculares, su funcion bioquimica, su conducta biologica y, finalmente, su
influencia en los estados fisiologicos normales y patologicos de un organismo.
Esta area conocida como bioinformatica surgio recientemente, por lo que
aun no se ha logrado encontrar un desarrollo complete de la misma; sin
embargo, con los pasos agigantados con los que ^vanza la ciencia, es
indudable que la bioinformatica alcanzara ese desarrollo que permitira tener un
mejor almacenamiento de la informacion que vaya surgiendo en relation a la
I
proteomica.
5.2
A nalisis
P roteomicos
M oleculas A lergenicas
Para
La ^Identificacion
I
Con el objetivo de diagnosticar de una forma mas precisa la presencia de
procesos alergicos, se han comenzado a probar nuevasi metodologias basadas
en la proteomica.
I
Las estrategias convencionales e innovadoras pueden ser explotadas para
identificar y caracterizar nuevas proteinas alergenicas. El analisis proteomico
{
42
}
De
incluye el extracto proteico de la muestra, a partir de la fuente alergenica,
posteriormente se Neva a cabo la separation de protelnas contenidas en una
mezcla y, por ultimo, se realfca la detection, identification y caracterizacion de
moleculas de IgE circulante(38).
Las metodologlas y nuevas tecnologlas que se emplean para realizar este
analisis proteomico, incluyen la espectrometria de masas, el procedimiento de
la degradation de Edman, las tecnicas de microarrays y estrategias de
bioinformatica.
pueden
Aun se siguen evaluando las ventajas y desventajas que
presentar
estas
metodologias
destinados
para
este
tipo
de
diagnostico(38).
Con el desarrollo de este tipo de analisis, se da iun paso adelante en el
establecimiento de la proteomica como herramienta de diagnostico de diversas
enfermedades.
5.3 P roteomica y Nanotecnologia
Para entender la relation que guarda la proteomica y la nanotecnologia es
necesario aclarar que es la nanotecnologia; de ahl que; inicialmente, debemos
partir del entendimiento del tamano para poder definirla. Un nanometro
representa una unidad de longitud del orden de una mil millonesima parte de un
,
i
metro.
!
La Oficina Nacional de Coordination de la Nanotecnologia (ONCN) de
Estados Unidos, define la nanociencia como aquella que “involucra la
investigation y el descubrimiento de nuevas caracterlsticas y propiedades de
materiales en la nanoescala, cuyo rango va de 1 a 100 nanometros (nm)”; y la
nanotecnologia como “la manera en que los descubrimidntos en la nanoescala
son puestos a trabajar”(5).
{
43
}
Dicho lo anterior, es posible entender que el conocimiento de las
alteraciones proteomicas requiere de la aplicacion de nano - biotecnologlas(12),
estas pueden ser de la siguiente manera:
• Nanotecnologla en un chip
• Tecnica
de
microfluidos
que
permiten
la
manipulation
de
nanovolumenes en un chip “Nanochips”
• Lectura optica de nanopartlculas marcadas
• Nanoarreglos para el estudio de proteinas.
En la actualidad, se consideran pocas las aplicaciones que ofrece la
nanotecnologla a la proteomica; sin embargo, otras podran llegar a constituir
una gran herramienta para el desarrollo de la proteomica en un futuro. En el
ambito de la escala nano -
biotecnologica cada dla se abren nuevas
perspectivas y amplios horizontes, inimaginables en la actualidad.
I
CONCLUSIONES
El nacimiento de la proteomica, a partir de la genomica, ha venido a
revolucionar el estudio de las enfermedades, incluyendo las infecciosas, cuyo
diagnostico basado en los metodos tradicionales podia resultar en ocasiones
complejo de efectuar.
La proteomica, como disciplina cientlfica, ha jrepresentado desde su
surgimiento la llnea de conocimiento de uno de los componentes moleculares
mas importantes del organismo, las protelnas. Su infljuencia en el diagnostico
de enfermedades infecciosas constituye una brillante dportacion a la medicina
actual, ya que mediante metodos de analisis proteomicos pretende establecer
las identidades, las cantidades, las estructuras, las funciones bioquimicas y
celulares de todas las protelnas de un organismo, organo u organelo, y las
formas como las anteriores propiedades varlan en el espacio y el tiempo y con
el estado fisiologico normal y patologico.
Con el desarrollo de metodos de laboratorio en biologla molecular, los
metodos tradicionales de diagnostico podran ser desplazados en poco tiempo,
ya que su sensibilidad y especificidad resulta baja en comparacion con los
metodos de identification de proteomas.
En la actualidad, la proteomica cuenta con multiples aplicaciones en
diversas areas, sin embargo, no se considera como la principal herramienta
para el diagnostico de enfermedades infecciosas; no obstante, observando los
pasos agigantados con los que avanza resulta indiscutible el creer que dentro
de pocos anos sera considerada como uno de los metodos principales para el
diagnostico oportuno y tratamiento de estas y otras enfermedades.
{
45
}
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