1982 FUNDACION Dr. J.R. Villavicencio Avances en el Diagnóstico Molecular: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real Dres. Sergio Lejona1 Maria Silvina Benetti2 Fabián Fay3 Oscar Fay4 Laboratorio CIBIC. Centro de Diagnóstico Médico de Alta Complejidad S.A. Rosario. Argentina 1 Responsable Área Investigación y Desarrollo 2 Responsable Área Biología Molecular 3 Director Ejecutivo 4 Director General Rosario, Argentina [email protected] Resumen En los últimos años, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) ha surgido como una metodología robusta y extensamente utilizada para la investigación biológica porque puede diferenciar y cuantificar cantidades muy pequeñas de Acidos Nucleicos (ADN y ARN). En el área de la investigación básica, una de sus mayores aplicaciones es la evaluación rápida y exacta de cambios en la expresión génica como resultado de procesos fisiológicos o patológicos. Para el diagnóstico clínico, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real puede ser utilizada para medir las cargas vírales o bacterianas o evaluar el estado de diferentes tipos de cáncer. Abstract In recent years, real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) has emerged as a robust and widely used methodology for biological investigation because it can detect and quantify very small amounts of specific nucleic acid sequences. As a research tool, a major application of this technology is the rapid and accurate assessment of changes in gene expression as a result of physiology or pathophysiology. For clinical molecular diagnostics, real-time PCR can be used to measure viral or bacterial loads or evaluate cancer status. Key words: real-time polymerase chain reaction fluorophore - viral load Palabras clave: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real - fluoroforo - carga viral Introducción En los últimos años, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real “Real Time PCR” ha surgido como una metodología robusta y extensamente utilizada para la investigación biológica ya que puede identificar y cuantificar cantidades muy pequeñas de Ácidos Nucleicos (ADN y ARN) en forma específica. Como herramienta de investigación, su importancia se debe a que su tecnología permite determinar en forma rápida y exacta cambios en la expresión génica resultantes de fenómenos fisiológicos o patológicos. De esta manera es posible correlacionar la fisiopatología con los eventos moleculares lo que permite un mayor entendimiento de los procesos biológicos. Esta metodología se basa en la reacción de PCR desarrollada por Kary Mullis en la década de los ´80, que permitió a los investigadores amplificar grandes cantidades de ADN en forma específica (1- 3). Las diferentes metodologías que aplican la PCR han propulsado a la biología molecular hacia delante, permitiendo a los investigadores manipular el ADN, facilitando procedimientos comunes, como el clonado, y permitiendo grandes emprendimientos como el Proyecto Genoma Humano (4, 5). La PCR en tiempo real representa otro salto tecnológico que ha generado nuevas expectativas para los investigadores, esto es en parte porque la enorme sensibilidad de PCR ha sido emparejada a la precisión proporcionada con la detección en tiempo real de los productos de la PCR. Esta tecnología nació en los años ´90 cuando Higuchi y colegas (6, 7) en Roche y Chiron realizaron la primera reacción de PCR en tiempo real utilizando el marcador fluorescente BrEt (bromuro de etidio) el cual aumenta su fluorescencia al unirse al ADN y siguieron la reacción de PCR con una videocámara. Subsiguientemente, esta tecnología maduró rápidamente en un mercado competitivo; esto es evidenciado por el número de compañías que ofrecen equipamiento y reactivos para PCR en tiempo real y la cantidad creciente de publicaciones científicas que incluyen esta metodología. El primer equipamiento para realizar PCR en tiempo real fue comercializado en 1996 por Applied Biosystems, posteriormente se fueron incorporando distintas empresas como BioGene, Bioneer, Bio-Rad, Cepheid, Corbett Research, Idaho Technology, MJ Research, Roche Applied Science, y Stratagene. En la PCR en tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea dentro del mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Además, mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación (6,7). Los termocicladores para llevar a cabo la PCR en tiempo real incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificación. ANUARIO FUNDACIÓN Dr. J. R. VILLAVICENCIO | 2006 | Nº XIV | 033 - 037 033 Avances en el Diagnóstico Molecular: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real Sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR en tiempo real Agentes intercalantes: son fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice. El más empleado en PCR en tiempo real es el SYBR Green I el cual aumenta en más de 1000 veces su fluorescencia cuando se une al surco menor del ADN (8). El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional de la fluorescencia emitida (Figura 1). Este sistema de detección tiene la ventaja de que la optimización de las condiciones de la reacción es muy sencilla, pero el principal inconveniente de los agentes intercalantes es su baja especificidad, debido a que se unen de manera indistinta a productos generados inespecíficamente o a dímeros de cebadores, muy frecuentes en la PCR. Molecular beacons son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una molécula donadora (reporter) en el extremo 5', una aceptora (quencher) en el extremo 3' pero, además presentan una estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unión Figura 2: Mecanismo de acción de las sondas Taqman A B C Figura 1: Mecanismo de acción del SYBR Green I SYBR Green I Libre Florescencia (-) SYBR Green I Unido Florescencia (+) Sondas de hibridación específicas: estas sondas están marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas. Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis, denominadas también sondas TaqMan, las “molecular beacons” y las sondas FRET. Sondas de hidrólisis (Taqman) son oligonucleótidos de unión específica al ADN diana marcados con un fluorocromo donador (reporter) en el extremo 5' que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor (quencher) en el extremo 3' que absorbe la fluorescencia liberada por el donador. Para que esto ocurra, las moléculas donadora y aceptora deben estar espacialmente próximas. Además, el espectro de emisión de la primera se ha de solapar con el espectro de absorción de la segunda. Mientras la sonda está intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor (Figura 2A). Sin embargo, durante la amplificación de ADN blanco, la Taq polimerasa al desplazarse a lo largo de la cadena en su acción de síntesis, que tiene actividad 5' exonucleasa, hidroliza el extremo libre 5' de la sonda, produciéndose la liberación del fluorocromo donador (Figura 2B). Como donador y aceptor están ahora espacialmente alejados, la fluorescencia emitida por el primero es captada por el lector (Figura 2C). 034 específica con el ADN blanco. Los extremos permanecen plegados cuando la sonda no está hibridada, lo que conlleva que donador y aceptor estén muy cerca uno de otro. En esta conformación la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo. Sin embargo, al hibridar con el ADN diana la sonda se abre, alejándose donador y aceptor, pudiendo ser detectada la fluorescencia emitida por el primero (Figura 3). Figura 3: Mecanismo de acción de las Molecular beacons Sonda ADN diana Mol beacons Sondas FRET el sistema se compone de dos sondas que se unen a secuencias adyacentes del ADN diana. Una de las sondas lleva un donador (reporter) en el extremo 3' y la otra un aceptor (quencher) en el extremo 5'. Cuando las sondas están hibridadas, los dos fluorocromos están próximos. Al ser excitado el donador transfiere su energía ANUARIO FUNDACIÓN Dr. J. R. VILLAVICENCIO | 2006 | Nº XIV | 033 - 037 1982 FUNDACION Dr. J.R. Villavicencio al aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que detecta el lector del equipo (Figura 4). Biosystems y Roche Diagnostics (Tabla 1). Las diferencias más importantes entre estos equipos hacen referencia a la rapidez y al número de muestras que se pueden procesar al mismo tiempo. El número de canales de lectura que presentan los equipos también es importante. Disponer de varios canales de lectura permite detectar la emisión de distintos fluorocromos a la vez. De esa manera, se pueden usar varias sondas marcadas con distintos fluorocromos, para identificar diferentes tipos de ADN blanco en la misma reacción (PCR múltiple) o incorporar controles internos a la reacción, para detectar la presencia de inhibidores. Figura 4: Mecanismo de acción de las sondas FRET A Formatos de PCR a tiempo real. Amplificación y detección de ADN o ARN blanco en la muestra. PCR múltiple. Cuantificación del ADN o ARN blanco en la muestra. Se puede cuantificar la concentración inicial de ADN (o ARN) blanco en la muestra de manera muy sencilla, añadiendo simplemente controles externos con concentraciones conocidas y crecientes de ADN blanco (curva patrón) en la tanda de amplificación. En la PCR en tiempo real el programa informático va registrando el incremento de fluorescencia (proporcional al aumento de ADN) en cada ciclo y esta información se refleja gráficamente en curvas de cinética de la reacción para cada una de las muestras y controles. Por tanto, se puede controlar la amplificación en las fases iniciales, cuando la concentración de los reactivos todavía no es limitante y el efecto de la variabilidad en la eficiencia de amplificación es menos importante. Para cada muestra el programa informático calcula el número de ciclo en el que el lector empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo, con respecto a la señal de base. El ciclo en el que se empieza a detectar el aumento de fluorescencia se denomina punto de corte (Cp o crossing point) o ciclo umbral (Ct, o B Lector En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con un aumento de hibridación de las sondas, lo que conlleva un aumento en la misma proporción de fluorescencia emitida. El empleo de sondas garantiza la especificidad de la detección y permite identificar polimorfismos o mutaciones puntuales. Equipos para PCR en tiempo real Están compuestos por un termociclador y por un lector de fluorescencia y diseñados para poder efectuar la lectura de la fluorescencia emitida en cada uno de los viales usados y en cualquier momento de la reacción. Los más utilizados son los equipos fabricados por Applied Tabla 1 Instrumento Fabricante Sistema Técnico Tiempo de Reaccion Capacidad Serie GeneAmp Applied Biosystems Convencional 2 hs. 96 Serie AbiPrism Applied Biosystems Convencional 2 hs. 96 ICycler iQ Bio Rad Convencional 3 hs. 96-384 Light Cycler Roche Aire 20-60 min 32 Smart Cycler Cepheid Ceramica 40-60 min 16-96 MX4000 Stratagene Convencional 90 min 96 Rotor Gene Corbett Aire 50 min 32 ANUARIO FUNDACIÓN Dr. J. R. VILLAVICENCIO | 2006 | Nº XIV | 033 - 037 035 Avances en el Diagnóstico Molecular: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real threshold cycle) y es inversamente proporcional a la concentración inicial de ADN blanco presente en la muestra. Con las concentraciones previamente conocidas de los controles externos y sus Cp correspondientes se dibuja una curva patrón. Interpolando en ella los valores de los Cp de cada muestra problema se puede inferir su concentración de ADN inicial (Figura 5). Figura 6: Curvas de disociación Figura 5: Curvas de cinética de reacción Análisis de curvas de disociación: Se basa en la aplicación de un gradiente de temperaturas creciente después de la PCR para monitorizar la cinética de disociación de los fragmentos amplificados. Mediante esta aplicación se puede determinar la Tm de los amplicones para comprobar su especificidad. También permite el análisis de mutaciones puntuales, que se puede abordar de diferentes maneras. Un enfoque sencillo consiste en usar una sonda complementaria con el ADN blanco de tipo salvaje, que abarque la posición del polimorfismo. El híbrido formado entre sonda y ADN de tipo salvaje tendrá una estabilidad mayor que el formado entre la sonda y el ADN mutado, puesto que en este caso la complementariedad no es absoluta. La mayor estabilidad de la unión entre la sonda y el ADN salvaje se reflejará en un Tm superior. Las diferencias en la temperatura de disociación de los híbridos nos permitirá discriminar perfectamente entre el ADN de tipo salvaje y el de tipo mutado, pudiéndose establecer además, de forma relativa la cantidad de ambos (Figura 6). Ventajas de la PCR en tiempo real La primera gran ventaja de la PCR a tiempo real es su rapidez, puesto que no se necesita ningún proceso adicional de detección. Si el equipo empleado es el Light Cycler o equivalente, esta ventaja todavía es más acusada, pudiéndose completar el proceso de amplificación y detección en 30-40 min. Además, gracias a su rapidez, estos equipos se pueden rentabilizar al máximo, permitiendo un flujo mucho mayor de muestras y de ensayos. Otra ventaja muy importante de la PCR a tiempo real es que, al utilizar sistemas cerrados, el riesgo 036 de contaminación disminuye de forma muy importante. Los sistemas a tiempo real permiten cuantificar la concentración inicial de ácido nucleico presente en las muestras de manera mucho más sencilla, más precisa y sobre todo en un rango mucho mayor (5-6) que en los procedimientos convencionales (2-4). Asimismo, la determinación de mutaciones puntuales que pueden estar relacionadas con resistencias a medicamentos antimicrobianos o con factores de virulencia, es mucho más fácil. Los equipos para PCR a tiempo real tienen una capacidad muy elevada ya que en el mismo instrumento se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos, cuantitativos, determinación de mutaciones, PCR múltiple, etc., mientras que para los procedimientos convencionales se requieren múltiples equipos. Aplicaciones de la PCR en tiempo real en el Diagnóstico Biomédico > Microbiología (9,10) a) Diagnóstico e identificación de patógenos b) Medición de Cargas virales y bacterianas c) Identificación de resistencia a los tratamientos (aparición de cepas mutantes) d) Genotipificación > Oncología/Oncohematologia (11- 15) a) Medición de la expresión de genes relacionados con diferentes tipos de tumores con valor diagnóstico, pronóstico y predictivo de respuesta al tratamiento b) Determinación y cuantificación de diferentes translocaciones causantes de desórdenes oncohematológicos. > Genética Humana (16 - 19) a)Determinación de mutaciones y polimorfismos causantes de enfermedades genéticas y de predisposición génica b) Determinación y cuantificación de variantes alelicas (polimorfismos) relacionadas con diferente respuesta a drogas (fármacogenetica) ANUARIO FUNDACIÓN Dr. J. R. VILLAVICENCIO | 2006 | Nº XIV | 033 - 037 1982 FUNDACION Dr. J.R. Villavicencio Bibliografía 1 Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Sci Am 262: 5661, 1990. 2 Mullis KB and Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335350, 1987. 3 Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, and Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 13501354, 1985 4 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, and Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology. Hoboken, NJ: Wiley, 2005 5 Olson M, Hood L, Cantor C, and Botstein D. A common language for physical mapping of the human genome. Science 245: 14341435, 1989 6 Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, and Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10: 413417, 1992. 7 Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, and Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11: 10261030, 1993. 8 Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, and Rasmussen RP. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques 22: 130138, 1997. 9 Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin Microbiol Infect 10: 190212, 2004. 10 Mackay IM, Arden KE, and Nitsche A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res 30: 12921305, 2002. 11 Ferrari AC, Stone NN, Kurek R, Mulligan E, McGregor R, Stock R, Unger P, Tunn U, Kaisary A, Droller M, Hall S, Renneberg H, Livak KJ, Gallagher RE, Mandeli J. Molecular load of pathologically occult metastases in pelvic lymph nodes is an independent prognostic marker of biochemical failure after localized prostate cancer treatment. J Clin Oncol. 2006 Jul 1;24(19):3081-8. 12 Eisenberg DP, Adusumilli PS, Hendershott KJ, Chung S, Yu Z, Chan MK, Hezel M, Wong RJ, Fong Y. Real-time intraoperative detection of breast cancer axillary lymph node metastases using a green fluorescent protein-expressing herpes virus. Ann Surg. 2006 Jun;243(6):824-30. 13 Cerna M, Holubec L Jr, Pesta M, Kormunda S, Topolcan O, Cerny R. Quantitative estimation of CEA and CK20 expression in tumour tissue of colorectal cancer and its liver metastases with reverse transcription and real-time PCR. Anticancer Res. 2006 Jan-Feb;26(1B):803-8. 14 Stock W, Yu D, Karrison T, Sher D, Stone RM, Larson RA, Bloomfield CD. Quantitative real-time RT-PCR monitoring of BCR-ABL in chronic myelogenous leukemia shows lack of agreement in blood and bone marrow samples. Int J Oncol. 2006 May;28(5):1099-103 15 Lamy PJ, Nanni I, Fina F, Bibeau F, Romain S, Dussert C, Penault Llorca F, Grenier J, Ouafik LH, Martin PM. Reliability and discriminant validity of HER2 gene quantification and chromosome 17 aneusomy analysis by real-time PCR in primary breast cancer. Int J Biol Markers. 2006 Jan-Mar;21(1):20-9. 16 Tran A, Jullien V, Alexandre J, Rey E, Rabillon F, Girre V, Dieras V, Pons G, Goldwasser F, Treluyer JM. Pharmacokinetics and toxicity of docetaxel: role of CYP3A, MDR1, and GST polymorphisms. Clin Pharmacol Ther. 2006 Jun;79(6):570-80. 17 Lualdi S, Di Rocco M, Corsolini F, Spada M, Bembi B, Cotugno G, Battini R, Stroppiano M, Gabriela Pittis M, Filocamo M. Identification of nine new IDS alleles in mucopolysaccharidosis II. Quantitative evaluation by real-time RT-PCR of mRNAs sensitive to nonsensemediated and nonstop decay mechanisms. Biochim Biophys Acta. 2006 Apr;1762(4):478-84. 18 Bodlaj G, Stocher M, Hufnagl P, Hubmann R, Biesenbach G, Stekel H, Berg J. Genotyping of the lactase-phlorizin hydrolase -13910 polymorphism by LightCycler PCR and implications for the diagnosis of lactose intolerance. Clin Chem. 2006 Jan;52(1):148-51 19 Tizzano EF, Barcelo MJ, Baena M, Cornet M, Vencesla A, Mateo J, Fontcuberta J, Baiget M. Rapid identification of female haemophilia A carriers with deletions in the factor VIII gene by quantitative real-time PCR analysis. Thromb Haemost. 2005 Sep;94(3):661-4. ANUARIO FUNDACIÓN Dr. J. R. VILLAVICENCIO | 2006 | Nº XIV | 033 - 037 037