enzimas como indicadores bioquímicos de evolución de procesos

VIII CAIQ2015 y 3 JASP
ENZIMAS COMO INDICADORES BIOQUÍMICOS DE
EVOLUCIÓN DE PROCESOS DE DIGESTIÓN ANAERÓBICA
H. Campaña, A. Airasca, M. Uribe Echevarría, V. Monserrat, P. Benedetti
GEIA - Universidad Tecnológica Nacional - Facultad Regional Bahía Blanca
11 de Abril 461 - 8000 Bahía Blanca – Argentina
e-mail: [email protected]
Resumen. En este trabajo se presentan los resultados de la medición de la
actividad enzimática como indicador de la evolución de procesos anaeróbicos,
considerando que en la primera etapa de la digestión anaeróbica, las enzimas
hidrolíticas son las encargadas de reducir moléculas de gran tamaño a
compuestos capaces de ingresar en los ciclos metabólicos y generar biogás a
partir de los mismos.
La actividad de las enzimas que actúan en la etapa hidrolítica, celulasas y β
glucosidasas fueron determinadas en muestras obtenidas de reactores
anaeróbicos utilizando como sustratos, pasta de cebolla procesada y estiércol
vacuno. La determinación de dichas actividades enzimáticas, se complementó
con mediciones de pH, DQO, AGV (ácidos grasos volátiles), alcalinidad,
composición del biogás obtenido, etc. Los resultados presentados en este
trabajo corresponden a la primera etapa de reacción (hidrólisis/acetogénesis) en
la que el biogás obtenido es principalmente hidrógeno. Las variaciones
encontradas en las actividades enzimáticas específicas y su relación con las
condiciones operativas serían indicadores tempranos de cambios en el proceso
y en la generación de biogás.
Palabras clave: DIGESTION ANAERÓBICA, ACTIVIDAD ENZIMÁTICA,
BIOGÁS.
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1. INTRODUCCIÓN
Para el tratamiento natural de residuos orgánicos, una alternativa posible son los
procesos de digestión anaeróbica, a partir de los cuales se pueden obtener biogás y
biofertilizantes. Estos procesos tienen el objetivo de transformar parcialmente la biomasa
en compuestos simples tales como metano e hidrógeno debido a la actividad de
microorganismos (Campaña y col. 2014). La digestión anaeróbica se divide en cuatro fases,
hidrólisis, acidogénesis, acetogénesis/deshidrogenación y metanogénesis. Desde el punto de
vista tecnológico, dichas fases pueden reducirse a dos grupos, que físicamente definen dos
etapas de reacción, la primera más rápida, hidrólisis y acetogénesis, y la segunda de mayor
duración, metanogénica. La degradación de la materia orgánica se relaciona con la
hidrólisis de la materia orgánica soluble de los sustratos, la fermentación de éste material
soluble para producir ácido acético, dióxido de carbono (CO2) e hidrógeno (H2) y
finalmente la conversión del ácido acético, hidrógeno y parte del dióxido de carbono en
metano (CH4), (Manual de biogás, 2011). El control y optimización de los procesos de
digestión anaeróbica tradicionalmente se ha basado en mediciones de parámetros
físicoquímicos. La inclusión de parámetros como la actividad de enzimas hidrolíticas de los
microorganismos productores de la digestión anaeróbica, permitiría mejorar el ajuste de las
condiciones operativas.
Las enzimas son proteínas que al combinarse con el sustrato específico catalizan una
reacción bioquímica, para la transformación de energía y el reciclado de nutrientes,
especialmente en el ciclo del nitrógeno, fósforo y carbono (García Izquierdo, 2004). Estos
parámetros son útiles como indicadores tempranos de cambios microbiológicos y se
utilizan para caracterizar la dinámica y la actividad microbiana.
El objetivo de este trabajo es evaluar las distintas condiciones operativas de la digestión
anaeróbica en reactores productores de biogás, utilizando la actividad enzimática como
indicador, relacionando la actividad de enzimas hidrolíticas como β glucosidasas y
celulasas con los parámetros fisicoquímicos pH, AGV y volumen de biogás.
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2. DESARROLLO
En el presente trabajo se realizó la determinación de enzimas hidrolíticas tales como
celulasas totales y β glucosidasas.
Las celulasas totales involucran un complejo de enzimas conformado por endo y exo
glucanasas, las cuales hidrolizan los enlaces β-1,4 de la celulosa para producir glucooligosacáridos y celobiosa a partir de celulosa respectivamente. La β glucosidasa es una
enzima que participa en el ciclo del C y completa el proceso hidrolítico convirtiendo los
fragmentos de celobiosa a glucosa o removiendo glucosa desde los extremos no reductores
de pequeños oligosacáridos (Lymar, et al, 1995; Zhang et al, 2006).
La hidrólisis es el primer paso necesario para la degradación anaeróbica de sustratos
orgánicos complejos, ya que la materia orgánica polimérica no puede ser utilizada
directamente por los microorganismos a menos que se hidrolicen en compuestos solubles
que puedan atravesar la pared celular. La hidrólisis de estas moléculas complejas es llevada
a cabo por la acción de enzimas extracelulares producidas por microorganismos
hidrolíticos.
Uno de los factores que influyen en la hidrólisis es el tamaño de las partículas debido
fundamentalmente a la disponibilidad de superficie para la adsorción de las enzimas
hidrolíticas que se liberan al medio durante el metabolismo y muerte celular.
En la etapa fermentativa o acidogénica se produce la fermentación de las moléculas
orgánicas solubles transformándolas en compuestos tales como ácido acético, ácido
fórmico e hidrógeno y compuestos orgánicos más reducidos como los ácidos grasos
volátiles (ácido propiónico, butírico, valérico, láctico, etc.) que tienen que ser oxidados por
bacterias acetogénicas en la siguiente etapa del proceso. En esta etapa se elimina el oxígeno
disuelto del sistema.
En la etapa acetogénica algunos productos de la fermentación son transformados en
acetato e hidrógeno por la acción de las bacterias acetogénicas.
Los productos obtenidos a partir de las etapas hidrolítica y acetogénica son utilizados
como sustrato por las bacterias metanogénicas en la siguiente etapa.
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En este trabajo se presentan los resultados de la medición de la actividad enzimática
como indicador, considerando que en la primera etapa de la digestión anaeróbica, las
enzimas hidrolíticas son las encargadas de reducir moléculas de gran tamaño a compuestos
capaces de ingresar en los ciclos metabólicos y generar biogás a partir de los mismos.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
La actividad de las enzimas que actúan en la etapa hidrolítica, celulasas y β glucosidasas
fueron determinadas en muestras obtenidas de reactores anaeróbicos (fig. 1) utilizando
como sustratos, pasta de cebolla procesada y estiércol vacuno. La determinación de dichas
actividades enzimáticas, se complementó con mediciones de pH , DQO, AGV, volumen,
alcalinidad, composición del biogás obtenido, etc. En la tabla 1 se muestran la composición
y la caracterización de las mezclas de los reactores de digestión anaeróbica.
Tabla 1. Composición y caracterización de las mezclas
Composición
Mezcla 1
Mezcla 2
Mezcla 3
290 g pasta de
cebolla
600mL inóculo 1
600 mL inóculo 2
500 mL rumen
300 g pasta de
cebolla
300 g estiércol de
vaca
Agua destilada
Se burbujea con N2
2000
6.34
9.50
55
1.79
74.28
43.09
1.60
300 g pasta de
cebolla
300 g estiércol de
vaca
Agua destilada
Se burbujea con N2
2000
8.00
9.62
55
3.06
66.92
36.50
11.10
Volumen total (mL)
2000
pH
7.35
pH inicial
9.00
Temperatura (ºC)
55
% Materia seca
2.72
% (ms)Materia orgánica 69.39
% (ms)Carbono orgánico 40.39
% (ms)NTK
2.40
En todos los casos la cebolla utilizada fue procesada con cáscara. El inóculo 1 es
resultante del procesamiento anaeróbico de pasta de cebolla y el inóculo 2 es resultante del
procesamiento anaeróbico de estiércol de vaca.
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Las mezclas se llevaron a volumen final de 2 litros con agua destilada y se burbujearon
con N2 para crear una atmósfera libre de oxígeno. Todas las mezclas se realizaron por
duplicado.
En la Mezcla 3 la pasta de cebolla procesada con cáscara, se estabilizó con cal, siendo el
pH final 9.35.
La tabla 2 muestra los resultados obtenidos del fraccionamiento de la materia orgánica
de la cebolla.
Tabla 2. Fraccionamiento de la materia orgánica de la cebolla
% hidrosoluble
% liposolubles
% hemicelulosa
% lignina
Catáfilas
9.72
5.43
78.52
6.33
Cebollas
67.06
12.19
19.47
1.28
Fig. 1. Armado de reactores de digestión anaeróbica.
El sustrato utilizado para la determinación de la actividad de β glucosidasa es el pnitro β-D-glucopiranosido, el cual es hidrolizado por la enzima liberando p-nitrofenol y
se mide la absorbancia de la solución. El método utilizado es el de Tabatabai ,(1982) /
Eivazi y Tabatabai (1988).
El método de las celulasas totales se basa en la determinación de los azúcares
reductores producidos luego de la incubación de la muestra en presencia de celulosa
microcristalina (Avicel) como sustrato, según el método de Hope y Burns (1987).
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Para la medición de la actividad enzimática se preparó un extracto acuoso siguiendo la
metodología propuesta por Cunha Queda (2006), con la finalidad de disminuir el volumen
extraído del reactor. Para la determinación de las actividades enzimáticas se diluyeron 5g
de muestra del reactor en un volumen final de 100 mL. Las determinaciones de las enzimas
se efectuaron por triplicado.
Todas las lecturas de absorbancia fueron realizadas en un espectrofotómetro HACH
2100.
4. RESULTADOS
Los resultados presentados en este trabajo corresponden a la primera etapa de reacción
(hidrólisis/acetogénesis) en la que el biogás obtenido fue principalmente hidrógeno.
Los valores de actividad enzimática de las 3 mezclas se presentan en las tablas 3, 4 y 5 y
en las fig. 2 y 3.
Tabla 3. Actividad enzimática Mezcla 1
Actividad Glucosidasas
Actividad Celulasas
(µmol de PNP g-1 h-1)
(µmol de glucosa g-1 h-1)
3:00 h
0,0329
0,425
6:00 h
0,0474
0,005
21:00 h
0,194
0,065
25:00 h
0,013
0,77
Tiempo
En la mezcla 2 se observa un máximo en la actividad de celulasas (2.56 µmol de glucosa
-1
g h-1) a las 9 h en coincidencia con el valor de pH 6.54. Los valores de pH tienden a
mantenerse constantes al igual que los AGV, mientras que la actividad enzimática tuvo un
marcado descenso.
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Tabla 4. Actividad enzimática Mezcla 2
Tiempo
Actividad Celulasas
(µmol de glucosa g-1 h-1)
3:00 h
0,265
6:00 h
0,71
9:00 h
2,56
22:30 h
0,675
En la mezcla 1 la actividad de las enzimas glucosidasas presenta poca variación cuando
el pH es mayor de 8 (0.03 – 0.04 µmol de PNP g-1 h-1) , mientras que la actividad de
celulasas disminuye hasta 0.005 µmol de glucosa g-1 h-1 para este valor de pH. A las 24 h se
observa un máximo en la actividad de glucosidasas con valores de pH alrededor de 7 (0.194
µmol de PNP por g-1 h-1) y un ascenso de la actividad de las celulasas. El aumento de la
concentración de AGV produce una disminución de pH observándose simultaneamente una
disminución de la actividad de glucosidasas. Como han encontrado otros investigadores
(Del Real Olvera, 2007), el aumento de AGV, puede inhibir la actividad enzimática .
Tabla 5. Actividad enzimática Mezcla 3
tiempo
Actividad Glucosidasas
Actividad Celulasas
(µmol de PNP g-1 h-1)
(µmol de glucosa g-1 h-1)
3:00 h
0,0258
0,11
6:00 h
0,0238
0,085
9:00 h
0,0395
0,08
23:00 h
0,011
0,06
31:00 h
0,0376
0,125
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12
10
pH
8
6
4
Mezcla 1
2
Mezcla 2
Mezcla 3
0
0:00
12:00
24:00
36:00
Tiempo [h]
48:00
60:00
Fig. 4. Variación de pH durante el tiempo de tratamiento
3000
AGV [mg/L]
2500
2000
1500
Mezcla 1
1000
Mezcla 2
500
Mezcla 3
0
0:00
12:00
24:00
36:00
Tiempo [h]
48:00
60:00
Fig. 5. Evolución de los ácidos grasos volátiles durante el tiempo de tratamiento
Para la mezcla 3 no se observa variación en la actividad enzimática debido a que en esta
mezcla los valores de pH se mantuvieron por encima de 8 durante las primeras 24 h.
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4000
3500
Volumen [ml]
3000
2500
2000
1500
Mezcla 1
1000
Mezcla 2
500
Mezcla 3
0
0:00
12:00
24:00
36:00
Tiempo [h]
48:00
60:00
Fig. 6. Evolución del Volumen de biogás generado
5. CONCLUSIONES
Se obtuvo el mayor valor de actividad de celulasas (0,16 µmol de glucosa g-1 h-1) para un
rango de pH variando entre 6.2 y 6.8, durante las primeras 9 horas del proceso de digestión
anaeróbica.
Las glucosidasas, mostraron el mayor valor (0,194 µmol de PNP g-1 h-1), en el mismo rango
de pH pero en un tiempo de digestión mayor (21 h).
En el inicio de los tratamientos no se observan variaciones en la generación de biogás,
pero sí en la actividad enzimática, por tanto, dicha actividad podría utilizarse para ajustar
las condiciones iniciales de operación.
Dado que para la mezcla 3 no se observan variaciones en las actividades tanto de
glucosidasas como de celulasas, debería evaluarse si prevalece la hidrólisis química sobre
la enzimática. Las variaciones encontradas en las actividades enzimáticas específicas y su
relación con las condiciones operativas serían indicadores tempranos de cambios en el
proceso y en la generación de biogás.
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REFERENCIAS
Campaña, H., Uribe Echevarría, M., Monserrat, V., Airasca, A., Benedetti, P., Enzymatic Activity Biohydrogen
production process, 1st Workshop Latinoamericano de Biohidrógeno - San Carlos – 28 al 30 de junio de 2014 Universidad de San Pablo USP Brasil.
Cunha-Queda C. (2006) Métodos para a determinaçao de actividades enzimáticas em solos.
Del Real Olvera, J. (2007). Evaluación y modelado de la cinética de depuración anaerobia de vinazas de la industria
alcoholera. Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo, Instituto de Ciencias Básicas e Ingeniería. Doctorado en
ciencias ambientales.
Eivazi, F., Tabatabai, M. A. (1988). Glucosidases and galactosidases in soils. Soil Biol. Biochem., 20: 601-606.
García Izquierdo, C. y Hernández Fernández, T. (2004). Importancia de la medida de la actividad microbiana en suelos y
materiales orgánicos. I Conferencia Internacional Eco-biología del Suelo y el Compost. León, 15 - 17 de Septiembre
de 2004. España.
Hope, C. F. A., Burns, R. G. (1987). Activity, origins and location of cellulase in a silt loam soil. Biol. Fertil. Soils, 5:164170.
Lymar, E. LI, B. Renganathan, V. (1995). Purification and Characterization of a cellulose binding β-glucosidase from
cellulose degrading cultures of Phanaerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbial. 8 2976-2980.
MINENERGIA / PNUD / FAO / GEF. (2011). Manual de biogás. ISBN 978-95-306892-0.
Tabatabai, M. A. (1982). Soil enzymes. In: methods of soil analysis, Part 2, Chemical and microbiological properties Ed.
Page, A. L. Baker, D. E., Rosco e Ellis, Jr., Keeney, D. R., Miller, R. H., Rhoades, J. D. Agronomy, number 9 (Part
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Zhang, Y. Himmel, M. Mielenz, J. (2006). Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.
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