diagnóstico molecular de hemofilia ay de mutaciones asociadas con
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UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR Decanato de Estudios de Postgrado Maestría en Ciencias Biológicas DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE HEMOFILIA A Y DE MUTACIONES ASOCIADAS CON EL DESARROLLO DE INHIBIDORES DEL FACTOR VIII Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por Silvia Elena Albánez Tinedo Como requisito parcial para optar al grado de Magíster en Ciencias Biológicas Realizado con la tutoría de la Profesora Antonietta Porco Giambra Enero, 2.010 i ii UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR Decanato de Estudios de Postgrado Maestría en Ciencias Biológicas TRABAJO DE GRADO DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE HEMOFILIA A Y DE MUTACIONES ASOCIADAS CON EL DESARROLLO DE INHIBIDORES DEL FACTOR VIII Por Silvia Elena Albánez Tinedo Enero, 2.010 iii DEDICATORIA A Clara, por inspirarme el amor a la biología y por haber sido siempre tan clara como el agua Siempre estarás presente, inspirándome a ser mejor iv AGRADECIMIENTOS A las Doctoras Apsara Boadas, Arlett Ruiz-Sáez y Norma de Bosch, del Centro Nacional de Hemofilia (BMS), por su valiosa colaboración con las muestras y datos de los pacientes, así como por sus oportunas recomendaciones. Gracias a Liliana Casique, por enseñarme a modelar en 3D mi proteína y por siempre responder alegremente a mis constantes preguntas. A mis padres y hermanos, por su amor incondicional y presencia constante. Gracias por motivarme a ser mejor cada día. A Gian Carlo, por estar presente en todo momento, por animarme a seguir adelante y darme el apoyo moral que tanto hace falta. Gracias por trasnocharte conmigo, por ayudarme y por ceder gran parte del tiempo que te correspondía, para que esta tesis pudiera llegar a un grato final. A todos los estudiantes que están y estuvieron en el laboratorio, por haber hecho del lugar de trabajo un sitio siempre agradable para estar, aprender y compartir. El laboratorio en el que crecí como profesional, que me dio todo y al que le entregué mis días, noches y algunos fines de semana, para hacer lo que me gusta y disfrutar cada momento. Sin duda “el lab” dejó una huella que quedará por siempre en mi, tanto a nivel personal como profesional. A Caro y Karle, porque qué sería de mi sin ustedes… sin duda una vida muy aburrida y monótona. No hay palabras para agradecerles por su amistad y apoyo incondicional, por ayudarme cuando lo he necesitado, por escucharme, por pasar los mejores momentos juntas. Son las mejores amigas y compañeras de trabajo que haya podido tener. Gracias a la Profe por todo el apoyo, la paciencia, la disponibilidad y la amistad, sin condiciones. Por poder contar siempre con usted, y que usted haya contado conmigo también. Esté donde esté y haga lo que haga, siempre demostraré con orgullo todo lo que aprendí estos años junto a usted. v FINANCIAMIENTO Todos los experimentos se realizaron con los equipos y reactivos actualmente disponibles en el Laboratorio de Genética Molecular Humana “B” de la Universidad Simón Bolívar, con el apoyo del proyecto LOCTI N° 50-2105 y la ayuda del Decanato de Extensión (Banco de Proyectos) y del Decanato de Estudios de Postgrado. vi RESUMEN La Hemofilia A (HA) es una enfermedad hereditaria recesiva ligada al cromosoma sexual X, que se caracteriza por la aparición de hemorragias recurrentes. Es causada por deficiencias del Factor VIII (FVIII), una proteína plasmática que actúa en el proceso de coagulación sanguínea. Alteraciones en el gen que codifica para este factor que conlleven a deficiencias en cantidad o actividad del FVIII resultan en HA, la cual dependiendo de la severidad, puede clasificarse en leve, moderada o severa. Específicamente, para el caso de la HA Severa (HAS), se han descrito dos inversiones, que en conjunto abarcan cerca del 50% de las alteraciones genéticas que la causan: la inversión del intrón 22 (inv-int22) y la inversión del intrón 1 (inv-int1). El resto de las alteraciones son sumamente diversas y generalmente cada familia afectada posee su propia mutación. Por otro lado, es conocido que el tipo de mutación presente en el gen del FVIII puede predisponer a que el paciente desarrolle inhibidores (anticuerpos) contra el FVIII que se le administra como tratamiento. Recientemente, se ha encontrado que polimorfismos genéticos en los genes que codifican para la Interleuquina 10 (IL10) y para el Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNF) pueden tener también un papel importante en la respuesta inmune del paciente frente al tratamiento. Por lo anteriormente expuesto, el objetivo principal de este trabajo fue la detección de las alteraciones genéticas presentes en el gen del FVIII y el análisis de algunos polimorfismos genéticos asociados con el desarrollo de inhibidores en pacientes con HAS en Venezuela. Para ello, se determinó inicialmente a partir del ADNg extraído de la sangre de dichos pacientes, la presencia de la inv-int22 mediante PCR inversa; a los pacientes negativos para dicha inversión, se les analizó la presencia de la inv-int1 mediante PCR convencional; y a aquellos pacientes negativos para ambas inversiones, se les analizó el gen completo mediante Electroforesis en Geles Sensibles a la Conformación (CSGE) en busca de otras mutaciones. Las mutaciones más frecuentes en los pacientes con HAS fueron la inv-int22 (40%) y las mutaciones sin sentido (16,7%). Se encontraron 7 mutaciones nuevas, no reportadas previamente. En relación a la detección del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G y del polimorfismo -1082AG en la región promotora del gen IL10, así como del polimorfismo 308GA en el gen TNFA, los cuales han sido relacionados con el desarrollo de inhibidores frente a la terapia con FVIII, a diferencia de otros estudios, se encontró asociación significativa entre el alelo -1082A en el gen IL10 y el desarrollo de inhibidores. Adicionalmente, el tipo de mutación presente en el gen del FVIII también pudo ser asociado con el desarrollo de inhibidores. El diagnóstico molecular de HA es una herramienta de suma importancia, ya que permite entender la fisiopatología de esta enfermedad y permite el análisis familiar de los pacientes, en las cuales se pueden detectar mujeres portadoras, que de otra manera no sería posible. Asimismo, es posible conocer si existe una predisposición genética al desarrollo de inhibidores contra el FVIII exógeno, lo cual permitirá aplicar el tratamiento más adecuado a cada paciente. Palabras clave: Hemofilia A, alteraciones genéticas, Factor VIII, TNF, IL10. vii ÍNDICE GENERAL Página RESUMEN ............................................................................................................................................ vi I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................... 1 II. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES .......................................................................................... 5 II.1 Proceso de Coagulación Sanguínea .............................................................................................5 II.2 Hemofilia A................................................................................................................................. 10 II.3 Factor VIII de la Coagulación .................................................................................................... 11 II.4 Gen del factor VIII de la coagulación ......................................................................................... 12 II.4.1 Alteraciones genéticas en el gen del FVIII de la coagulación ............................................. 14 II.5 Tratamiento de la Hemofilia A y complicaciones asociadas....................................................... 22 II.5.1 Desarrollo de inhibidores .................................................................................................... 23 II.5.2 Alteraciones genéticas asociadas al desarrollo de inhibidores ........................................... 25 III. OBJETIVOS ................................................................................................................................... 27 IV. DESCRIPCIÓN METODOLÓGICA............................................................................................... 28 IV.1 Selección de los pacientes ......................................................................................................... 28 IV.2 Toma de muestras y análisis de laboratorio .............................................................................. 28 IV.3 Extracción del ADN genómico a partir de sangre total ............................................................. 28 IV.4 Cuantificación y verificación de la calidad del ADNg extraído ................................................. 29 IV.5 Determinación de la inv-int22 ................................................................................................... 29 IV.6 Determinación de la inv-int1 ..................................................................................................... 31 IV.7 Amplificación del gen del FVIII ................................................................................................. 31 IV.8 Análisis mediante CSGE ............................................................................................................ 34 IV.9 Determinación del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G ....................................................... 35 IV.10 Detección del polimorfismo -1082GA en el gen IL10 ............................................................ 35 IV.11 Detección del polimorfismo -308GA en el gen TNFA............................................................ 36 IV.12 Electroforesis en geles de agarosa .......................................................................................... 37 IV.13 Tinción con Nitrato de Plata de los geles de poliacrilamida ................................................... 37 IV.14 Análisis estadístico de los datos obtenidos .............................................................................. 38 IV.15 Análisis in silico de las mutaciones de pérdida de sentido ...................................................... 38 V. RESULTADOS ................................................................................................................................. 39 viii V.1 Pacientes estudiados ................................................................................................................... 39 V.2 Extracción del ADN genómico a partir de sangre ...................................................................... 40 V.3 Determinación de la inv-int22 .................................................................................................... 40 V.4 Determinación de la inv-int1 ...................................................................................................... 43 V.5 Amplificación del gen del FVIII .................................................................................................. 44 V.6 Análisis mediante CSGE ............................................................................................................. 46 V.7 Determinación del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G ......................................................... 51 V.8 Determinación del polimorfismo -1082G>A en el gen IL10 ....................................................... 52 V.9 Determinación del polimorfismo -308G>A en el gen TNFA ....................................................... 53 VI. DISCUSIÓN ................................................................................................................................... 55 VI.1 Hemofilia ................................................................................................................................... 57 VI.2 Beneficios y aplicaciones del diagnóstico molecular de HA ...................................................... 59 VI.3 Diagnóstico molecular de HA.................................................................................................... 61 VI.3.1 Detección de la Inversión del intrón 22 .............................................................................. 61 VI.3.2 Inversión del intrón 1.......................................................................................................... 68 VI.3.3 Otras mutaciones en el gen del FVIII ................................................................................. 70 VI.4 Tratamiento de la Hemofilia A y desarrollo de inhibidores ..................................................... 102 VI.4.1 Desarrollo de inhibidores contra el FVIII ........................................................................ 104 VI.4.2 Terapia génica .................................................................................................................. 110 VI.5 Consideraciones finales ........................................................................................................... 112 VII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.............................................................................. 114 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 115 IX. ANEXOS ....................................................................................................................................... 125 IX.1 Anexo I: Consentimiento previa información. ......................................................................... 125 IX.2 Anexo II: Esquema de la formación de heterodúplex para la detección de mutaciones mediante la técnica de CSGE. ........................................................................................................................ 128 IX.3 Anexo III: Análisis de secuencias de los productos de I-PCR de pacientes positivos y negativos para la inv-int22.............................................................................................................................. 129 ix ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1. Frecuencia de la inv-int22 en el gen del FVIII en pacientes con HAS en diferentes poblaciones…………………………………………………………………………………………..16/17 Tabla 2. Frecuencia de la inv-int1 en el gen del FVIII en pacientes con HAS en diferentes poblaciones………………………………………………………………………………………………20 Tabla 3. Cebadores empleados para la detección de la inv-int22 por I-PCR……………………………30 Tabla 4. Cebadores empleados para la detección de la inv-int1…………………………….…………….31 Tabla 5. Lista de cebadores utilizados para la amplificación del gen del FVIII……………………..32/33 Tabla 6. Grupos de amplificación por M-PCR para el análisis por CSGE del gen completo del FVIII……………………………………………………………………………………..34 Tabla 7. Lista de cebadores empleados para la detección del polimorfismo -1082G>A y tamaño de los productos de PCR obtenidos.……………………..………………………………….36 Tabla 8. Lista de pacientes estudiados y desarrollo de inhibidores……………………………………….39 Tabla 9. Lista de pacientes positivos para la presencia de la inversión del intrón 22………………….42 Tabla 10. Mutaciones encontradas en los pacientes con HAS mediante la técnica de CSGE y secuenciación…………………………...……………………………………………………………….48 x ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Fase de iniciación del proceso de coagulación sanguínea…...………………………………….6 Figura 2. Fase de amplificación del proceso de coagulación sanguínea…..………………………………7 Figura 3. Fase de propagación del proceso de coagulación sanguínea………...………………………….7 Figura 4. Balance en la formación y degradación del coágulo de fibrina………...……………………….9 Figura 5. Estructura del FVIII y FVIIIa ………………………………………………………………………12 Figura 6. Estructura y localización del gen que codifica para el FVIII de la coagulación…...............13 Figura 7. Esquema de la inversión del intrón 22 ……………………………………………………………16 Figura 8. Esquema de la ubicación del gen del FVIII de la coagulación, las regiones involucradas en la recombinación homóloga y los genes adicionales involucrados en la inversión del intrón 1, en condiciones normales…………………………………………….18 Figura 9. Esquema de la recombinación homóloga entre la región ubicada en el intrón 1 del gen del FVIII y su otra copia ubicada hacia la región telomérica, que da origen a la inversión del gen…………………………………………………………………………………...19 Figura 10. Plan de Trabajo realizado para el análisis de las muestras en el laboratorio……………..28 Figura 11. Corrida electroforética de algunos ADNg de pacientes con HAS……………………………40 Figura 12. Esquema de la I-PCR para la detección de la inv-int22, en base a la metodología descrita por Rossetti y colaboradores (2005)………………………………………41 Figura 13. Corrida electroforética de los productos de I-PCR para la detección de la inv-int22…….42 Figura 14. Esquema de la PCR para la detección de la inv-int1…………………………………………..43 Figura 15. Corrida electroforética de los productos de PCR para la detección de la inv-int1………..44 Figura 16. Corrida electroforética de los productos de M-PCR del grupo GP-8……………………….45 Figura 17. Corrida electroforética de los productos de M-PCR del grupo GP6………………………...46 Figura 18. Análisis por CSGE de los productos de M-PCR del GP-5 de pacientes con HAS………….47 Figura 19. Porcentaje de los diferentes tipos de mutaciones puntuales encontradas en los pacientes con HAS mediante la técnica de CSGE………………………………………………….50 xi Figura 20. Corrida electroforética de los productos de PCR para la detección del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G en pacientes con HAS…………………………………………..51 Figura 21. Corrida electroforética de los productos de AS-PCR obtenidos de los pacientes con HAS…………………………………………………………………………………………………..52 Figura 22. Corrida electroforética de los productos de digestión para la detección del polimorfismo -308G>A en el gen TNFA en pacientes con HAS……………………………….…53 Figura 23. Distribución de las deficiencias raras de los factores de coagulación………………………55 Figura 24. Recombinación homóloga entre secuencias repetidas en la misma orientación o en orientación opuesta……………………………………………………………………………….63 Figura 25. Esquema de los tipos (I y II) de la inv-int22……………………………………………………..65 Figura 26. Explicación representativa de las causas que conllevan a una mayor frecuencia de la inversión del intrón 22 vs. la inversión del intrón 1…………………………………………69 Figura 27. Distribución de las diferentes mutaciones puntuales encontradas en los diversos dominios del FVIII…………………………………….………………………………………………..70 Figura 28. Distribución de las mutaciones sin sentido en pacientes que desarrollaron inhibidores………………………………………………………………………………………………73 Figura 29. Secuencias normales y efecto de las mutaciones nuevas encontradas del tipo deleción e inserción …………………………………………………………………………………….76 Figura 30. Alineamiento de la secuencia proteica del FVIII de diversas especies animales…………..77 Figura 31. Modelo tridimensional de la estructura del FVIII………………..…………………………….78 Figura 32. Alineamiento de la secuencia proteica del FVIII de diversas especies animales…………..81 Figura 33. Modelo tridimensional de la estructura del FVIII………………………………………………82 Figura 34. Polimorfismos no sinónimos presentes en el gen del FVIII de la coagulación y representación de los 6 haplotipos posibles……………………………………………………….83 Figura 35. Alineamiento de la secuencia proteica del FVIII de diversas especies animales…………..84 Figura 36.Modelo tridimensional de la estructura del FVIII……………………………………………….85 Figura 37. Alineamiento de la secuencia proteica del FVIII de diversas especies animales…………..87 Figura 38. Modelo tridimensional de la estructura del FVIII………………………………………………88 xii Figura 39. Alineamiento de la secuencia proteica del FVIII de diversas especies animales…………..89 Figura 40.Modelo tridimensional de la estructura del FVIII……………………………………………….90 Figura 41. Sitios aceptores del empalme del ARNm en los tres pacientes con mutaciones encontradas………………………………………………………………………………………………91 Figura 42. Resumen gráfico de la frecuencia de las mutaciones encontradas en los pacientes con HAS…………………………………………………………………………………………………..98 Figura 43. Proceso de formación de inhibidores contra el FVIII utilizado como tratamiento……….105 Figura 44. Proceso de formación de heterodúplex para la detección de mutaciones mediante CSGE………………………………………………………………………………………...128 xiii LISTA DE ABREVIATURAS AAV: adeno-associated virus ADN: ácido desoxirribonucleico ADNc: ADN complementario ADNg: ADN genómico ADP: adenosín difosfato APC: célula presentadora de antígeno aPCC: concentrados de complejos de protrombina activados ARN: ácido ribonucleico ARNm: ARN mensajero AS-PCR: PCR alelo específica ATIII: antitrombina III ATP: adenosín trifosfato BLASTn: Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide BMS: Banco Metropolitano de Sangre BSA: albumina sérica bovina C/EBPα: CAAT / enhancer-binding protein α C/EBPβ: CAAT / enhancer-binding protein β CeSAAN: Centro de Secuenciación y Análisis de Ácidos Nucleicos CSGE: Electroforesis en Geles Sensibles a la Conformación CTLA-4: antígeno-4 asociado al linfocito T citotóxico d.C.: después de Cristo DBP: D-box binding protein DGGE: denaturing gradient gel electrophoresis DMSO: dimetil sulfóxido dNTP: deoxiribonucleótido trifosfato DTT: ditiotreitol EDTA: ácido etilendiaminotetraacético ELISA: enzym-linked immunosorbent assay EvW: Enfermedad de von Willebrand FII: Factor II FIIa: Factor II activado FIX: Factor IX FIXa: Factor IX activado FT: Factor Tisular xiv FV: Factor V FVa: Factor V activado FVII: Factor VII FVIIa: Factor VII activado FVIII: Factor VIII FVIII:Ag: Niveles antigénicos de FVIII FVIII:C: Niveles funcionales de FVIII FVIIIa: Factor VIII activado FvW: Factor von Willebrand FX: Factor X FXa: Factor X activado HA: Hemofilia A HAL: Hemofilia A leve HAM: Hemofilia A moderada HAMSTeRS: The Hemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site HAS: Hemofilia A severa HB: Hemofilia B HLF: Hepatic leukemia factor HNF-1: Hepatocyte nuclear factor 1 HNF-4: Hepatocyte nuclear factor 4 IL1: Interleuquina 1 IL10: Interleuquina 10 IL12: Interleuquina 12 IL2: Interleuquina 2 IL4: Interleuquina 4 IL5: Interleuquina 5 Inv-int1: inversión del intrón 1 Inv-int22: inversión del intrón 22 I-PCR: PCR inversa IS-PCR: Inverse shifting –PCR IVIC: Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas LINE: Long Interspersed Element LRP: Proteína relacionada al receptor de la lipoproteína de baja densidad LTR/ERVL: Long Terminal Repeat / Endogenous Retroviral Element MHC: Complejo mayor de histocompatibilidad MIBS: Malmö International Brother Study xv M-PCR: PCR múltiple MPP1: Proteína de Membrana Palmitoilada 1 NCBI: National Center for Biotechnology Information NFκB: Nuclear factor kappa B OR: Odds Ratio PAI-1: inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 PC: Proteína C PCa: Proteína C activada PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PDB: Protein Data Bank PDF: Productos de degradación de fibrina PS: Proteína S PTT: Tiempo parcial de tromboplastina activada RFLP: Restriction fragment length polymorphism rFVIIa: Factor VII activado recombinante RT-PCR: Reverse transcribed – Polymerase chain reaction SDS: dodecilsulfato sódico SINE: Short Interspersed Element SSCP: Single strand conformation polymorphism SSPP: Splice Site Prediction Program Ta: temperatura de annealing TAFI: Inhibidor de la fibrinólisis activado por trombina TCR: receptor de las células T TEMED: tetrametiletilendiamina TFPI: Inhibidor de la ruta del Factor Tisular TM: Trombomodulina TNFA: gen que codifica para el TNFα TNFα: Factor de Necrosis Tumoral α TNFβ: Factor de Necrosis Tumoral β t-PA: activador tisular del plasminógeno TTE: buffer Tris-Taurina-EDTA UB: Unidades Bethesda UI: Unidades Internacionales USB: Universidad Simón Bolívar VBP1: von Hippel-Lindau binding protein 1 VIH: Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 I. INTRODUCCIÓN La sangre es un tejido líquido, que bajo condiciones normales se mantiene circulando dentro de un sistema cerrado de vasos sanguíneos. Cuando ocurre un daño o lesión traumática, estos vasos pueden romperse y la sangre exponerse al tejido subendotelial, originando lo que se conoce como hemorragia. En respuesta a este fenómeno, se producen los primeros eventos en la hemostasia sanguínea, que no es más que el proceso que se desencadena para evitar la pérdida excesiva de sangre en el área lesionada, de forma tal que la circulación pueda continuar normalmente en el resto del sistema sanguíneo. La hemostasia es un proceso sumamente complejo, que conduce a la formación de un coágulo sanguíneo para detener la hemorragia, a su posterior eliminación y a la reparación del área lesionada (McKenzie, 2000; Dahlbäck, 2005). Cuando el proceso de hemostasia sanguínea no funciona adecuadamente se pueden desencadenar diversas patologías, que pueden manifestarse ya sea como un exceso en la pérdida de sangre (hemorragias) o como la formación de un coágulo sanguíneo anormal (trombosis). Las alteraciones en la hemostasia pueden ocurrir de forma temporal o permanecer a lo largo de la vida de un individuo, cuando son resultado de un trastorno hereditario. Particularmente, las enfermedades hemorrágicas hereditarias se caracterizan por la presencia de hemorragias prolongadas, ya sea a consecuencia de alguna lesión o de forma espontánea. La mayoría de las enfermedades hemorrágicas se consideran raras, ya que sus incidencias a nivel mundial son bajas, a excepción de la Enfermedad de von Willebrand (EvW) y de la Hemofilia. La EvW representa la causa más común de este tipo de enfermedades, ya que afecta a 1 de cada 1.000 personas en la población general (Mannucci y Tuddenham, 2001). Con relación a la Hemofilia, existen dos tipos denominados Hemofilia A (HA) y Hemofilia B (HB), de las cuales la HA es la más común de las dos, con una incidencia de entre 1:5.000 a 1:10.000 hombres en la población general, mientras que la HB tiene una incidencia seis veces menor (Mannucci y Tuddenham, 2001). En conjunto, estas tres enfermedades representan entre el 95 al 97 % de todas las enfermedades hemorrágicas hereditarias (Mannucci y col., 2004). Las Hemofilias se caracterizan por producir principalmente sangramientos leves a severos en músculos y articulaciones, así como heridas que sangran en forma reincidente. Cuando estas hemorragias ocurren de forma repetida, pueden dejar consecuencias graves que llegan a ser incapacitantes o en algunos casos hasta mortales, tal y como ocurre cuando afectan al sistema nervioso central (Colman y col., 2006). Las Hemofilias pueden ser clasificadas como 2 leves, moderadas o severas, de acuerdo a la actividad y/o concentración plasmática del factor de coagulación afectado. Sin embargo, su severidad clínica puede verse influenciada por la presencia de otros factores genéticos y de factores adquiridos tales como el estrés, embarazo, dieta, actividad física, niveles hormonales, infecciones, entre otras (Mannucci y Tuddenham, 2001). En el caso particular de la HA, ésta es causada por deficiencias del Factor VIII (FVIII) de la coagulación sanguínea, una proteína plasmática que actúa como cofactor en el proceso hemostático. Al no poseer una función normal, ya sea por una disminución en sus niveles o por una actividad alterada, el proceso de coagulación no se lleva a cabo de forma adecuada, por lo que el coágulo que debe detener la hemorragia no se forma y se produce la hemorragia (Colman y col., 2006). De esta manera, cualquier alteración (mutación) en el gen que codifica para dicho factor y que afecte su síntesis, actividad, transporte, regulación o degradación pueden conllevar al desarrollo de HA, siempre y cuando su efecto final sea una disminución en los niveles o actividad del FVIII (Mannucci y Tuddenham, 2001). En los casos de HA leve (HAL) y moderada (HAM) no se han descrito mutaciones comunes que las causen, aunque se sabe que las mutaciones puntuales son las más frecuentes, particularmente las del tipo de pérdida de sentido, donde el cambio de un aminoácido por otro afecta la función de la proteína (Oldenburg y col., 2004). Por el contrario, para los casos de HA severa (HAS) se ha descrito una alteración relativamente común, una inversión en el intrón 22 del gen (inv-int22) que da origen a una proteína incompleta y que está presente entre un 30 al 50 % de los pacientes en todas las poblaciones a nivel mundial. Asimismo, se ha detectado la presencia de otra inversión, la cual involucra al intrón 1 del gen (inv-int1) pero cuya frecuencia es mucho menor (Oldenburg y col., 2004; Bagnall y col., 2002; De Brasi y col., 2000). El gen que codifica para el FVIII de la coagulación tiene una alta tasa de mutación, la cual está asociada a su gran tamaño y a la presencia de secuencias repetidas dentro y fuera del gen, que facilitan procesos de recombinación homóloga intracromosómica. Es por ello, que uno de cada tres casos de HA es un caso nuevo o esporádico, donde el paciente no tiene historia familiar de la enfermedad. Por otro lado, a excepción de la inv-int22 y la inv-int1, no se han reportado otras mutaciones que ocurran con alta frecuencia en las diversas poblaciones que han sido analizadas, ya que los individuos de una familia generalmente portan una mutación propia 3 de esa familia (Colman y col., 2006). El hecho que en los pacientes con HAS sólo se pueda determinar de manera directa cerca de un 50 % de las alteraciones genéticas presentes (inv-int22 e inv-int1), se hace más dificil establecer el posible comportamiento de la enfermedad que tendrá un paciente. Por otro lado, dado que las mujeres generalmente pueden ser portadoras de la enfermedad y no padecerla, el diagnóstico molecular es la única herramienta que puede determinar si en realidad es portadora o no de la Hemofilia. Por ello, con el conocimiento de las alteraciones genéticas presentes en los pacientes con HA, se podrá realizar el diagnóstico de mujeres portadoras pertenecientes al núcleo familiar, y en un futuro se podría realizar el diagnóstico prenatal de la enfermedad. Todo ello resalta la importancia que tiene este tipo de diagnóstico en pacientes con HA. Cabe la pena resaltar que la HA es una enfermedad tratable, ya que se utilizan terapias de reemplazo para controlar y prevenir las hemorragias. En la actualidad, el tratamiento más ampliamente utilizado consiste en concentrados de FVIII que son obtenidos a partir de derivados plasmáticos o producidos en forma recombinante (Stonebraker y col., 2009; Powell, 2009). No obstante, el tratamiento de la HA tiene un problema asociado, ya que se ha observado que un número significativo de pacientes, principalmente con HAS, no responden a la terapia debido a que su sistema inmune produce una respuesta frente a ésta. Esto ocurre cuando los pacientes desarrollan anticuerpos (inhibidores) anti-FVIII, que actúan en contra del FVIII exógeno utilizado como terapia, complicando así el tratamiento de las hemorragias en estos pacientes y aumentando su mortalidad. La etiología del desarrollo de los inhibidores no se conoce totalmente y se han descrito factores de riesgo que pueden depender tanto del paciente, como del tipo de tratamiento utilizado y del tipo de mutación presente en el gen del FVIII (Powell, 2009; Bril y col., 2004). Lo anteriormente expuesto resalta la importancia de conocer, en un paciente con HA, cuál es la mutación en el gen del FVIII que la origina, lo cual determinará la severidad de la enfermedad, así como la respuesta que tendrá ante el tratamiento. En Venezuela no se realizaba el diagnóstico molecular de HA, por lo que no se conocen en el país las frecuencias de las inversiones inv-int22 e inv-int1 o de cualquiera otra mutación o mutaciones relacionadas con HA, así como tampoco se realiza el diagnóstico de mujeres portadoras. De esta manera, éste representa el primer trabajo de investigación dentro de esta área en nuestro país, permitiendo así, dar a conocer las alteraciones genéticas causantes de esta 4 patología en Venezuela, y permitiendo además, aportar información adicional a los médicos tratantes sobre las consecuencias de la alteración genética que presenta el paciente, para así aplicar el mejor tratamiento y mejorar la calidad de vida del paciente. 5 II. MARCO TEÓRICO Y ANTECEDENTES II.1 Proceso de Coagulación Sanguínea La hemostasia sanguínea es un proceso complejo, en el cual se debe garantizar un perfecto equilibrio entre los componentes procoagulantes y anticoagulantes que participan en el sistema. Para ello, se requiere de la interacción coordinada de numerosos componentes que incluyen proteínas plasmáticas, plaquetas y el endotelio vascular, los cuales en conjunto dan inicio a la formación de un coágulo que detendrá la hemorragia y permitirá la reparación del área dañada (Colman y col., 2006; Dahlbäck, 2005). Durante este proceso, se garantiza que los factores procoagulantes que se activan en el momento permanezcan localizados sólo en el sitio de la lesión, para evitar así la formación de coágulos en lugares que no se requieren y que podrían conllevar al desarrollo de otras patologías (Hoffman, 2003a). Durante el proceso de coagulación sanguínea participan numerosos factores, conocidos como factores de coagulación, que en su mayoría son zimógenos de serín-proteasas y que se sintetizan en el hígado. Estos factores circulan en el plasma en una forma inactiva hasta que son requeridos para el proceso de coagulación, en el cual adquieren sus propiedades enzimáticas por ruptura de una o más de sus uniones peptídicas (Colman y col., 2006; Schoenmakers y col., 2005; McKenzie, 2000). El proceso global de la coagulación se inicia cuando al ocurrir un daño vascular, el Factor Tisular (FT) que está presente en las células subendoteliales y matriz extracelular queda expuesto al torrente sanguíneo, de manera que puede captar ahora al Factor VII (FVII) activado que circula en el plasma (en pequeñas cantidades), para formar así el complejo tenasa extrínseco. Este complejo es capaz de activar al FVII, produciendo más FVIIa (a, activado) que se podrá unir a más FT; así como activar al Factor IX (FIX) y al Factor X (FX). El FXa producido puede entonces ahora escindir proteolíticamente a la protrombina (FII) para producir trombina (FIIa), la cual se genera en pequeñas cantidades sobre la superficie subendotelial (Figura 1) (Monroe y Hoffman, 2006). La producción de FXa en esta fase de iniciación es regulada por el Inhibidor de la Ruta del Factor Tisular (TFPI), al actuar como un inhibidor del complejo tenasa extrínseco, así como por la Antitrombina III, que además de inhibir al FXa, puede inhibir al FIXa, FVIIa y a la trombina (Colman y col., 2006). 6 Figura 1. Fase de iniciación del proceso de coagulación sanguínea. Ver explicación en el texto. (Tomado y modificado de Hoffman, 2003a). Por otro lado y simultáneamente, a la superficie dañada se comienzan a adherir las plaquetas por interacción de sus receptores de membrana (integrinas, selectinas y otras moléculas de adhesión) con componentes subendoteliales como el colágeno, fibronectina, vitronectina, fibrinógeno y el Factor von Willebrand (FvW) (Grunkemeier y col., 2000). Las pequeñas cantidades de trombina que se generaron por acción del FXa permiten la activación de las plaquetas, con la cual sufren cambios morfológicos y liberan diversos componentes almacenados en sus gránulos, entre los que se encuentran más agonistas plaquetarios como el tromboxano A2, ADP y serotonina, que permitirán la activación de más plaquetas. Una vez activadas, las plaquetas pueden agregarse a través de interacciones plaqueta-fibrinógenoplaqueta y formar así un tapón plaquetario débil. Finalmente, la superficie de las plaquetas activadas servirá ahora para el ensamblaje de los complejos tenasa intrínseco y protrombinasa, que permitirán la amplificación de la formación de trombina, y por ende, de fibrina (Figura 2) (Monroe y Hoffman, 2006; Hoffman, 2003a). 7 Figura 2. Fase de amplificación del proceso de coagulación sanguínea. Ver explicación en el texto. (Tomado y modificado de Hoffman, 2003a). El proceso de amplificación en la superficie plaquetaria es posible debido a que el FIXa generado por el complejo tenasa extrínseco no es inhibido rápidamente como ocurre con el FXa cuando se encuentra libre, por acción del TFPI y ATIII. De esta manera, el FIXa se podrá unir al Factor VIII (FVIII) activado por acción de la trombina, para formar el complejo tenasa intrínseco, que activará eficientemente al FX sobre la superficie plaquetaria activada, en la fase de propagación. Este FXa se unirá al Factor V (FV) activado, que actúa como su cofactor, para formar el complejo protrombinasa, que producirá grandes cantidades de trombina (Figura 3) (Monroe y Hoffman, 2006). Figura 3. Fase de propagación del proceso de coagulación sanguínea. Ver explicación en el texto. (Tomado y modificado de Hoffman, 2003a). 8 La trombina producida actuará sobre el fibrinógeno, para convertirlo en fibrina, a través de la liberación de los fibrinopéptidos (A y B), permitiendo así la formación de la malla de fibrina, que es estabilizada por acción del Factor XIIIa (activado también por la trombina). Esta malla de fibrina estable representa el coágulo o tapón hemostático secundario que detendrá la hemorragia e iniciará el proceso de cicatrización (Monroe y Hoffman, 2006). Una vez que la lesión ha sido reparada, el coágulo que impedía la pérdida de sangre debe ser eliminado, por lo que otros componentes del sistema sanguíneo actúan de forma controlada, en una etapa que se conoce como fibrinólisis (McKenzie, 2000). La fibrinólisis es el resultado de un equilibrio dinámico de eventos enzimáticos que conducen a la disolución del coágulo, en la que participan grupos de proteínas que actúan como generadores de plasmina (plasminógeno, activadores, fibrina), como inhibidores de la fibrinólisis (2-antiplasmina, PAI-1 o inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1) o como moduladores negativos (TAFI, inhibidor de la fibrinólisis activado por trombina) (Colman y col., 2006). Luego de la formación del coágulo en el espacio intravascular, el plasminógeno y el activador tisular del plasminógeno (t-PA) se fijan a la superficie de la fibrina formando un complejo trimolecular, que conlleva a la formación efectiva de plasmina. Esta última es una serín-proteasa cuya actividad primordial es la degradación de fibrina hasta que el coágulo sea disuelto; luego entonces es liberada a la circulación donde es inhibida rápidamente por la 2antiplasmina, antes que ataque a otras proteínas del plasma, como el fibrinógeno. Por lo tanto, la producción localizada de plasmina en la superficie del coágulo conduce a la degradación progresiva de la fibrina y a una fase de amplificación y aceleración del proceso fibrinolítico (Colman y col., 2006). La gran complejidad del proceso de coagulación sanguínea asegura que en presencia de un daño vascular, se forme el coágulo de fibrina y se evite la pérdida excesiva de sangre, y permite a su vez que ocurra de manera controlada y regulada, evitando así la formación de coágulos anormales (trombos) en ausencia de una lesión. La regulación de este proceso ocurre a cada nivel de las rutas implicadas, ya sea por inhibición enzimática o por modulación de la actividad de los factores de coagulación, asegurando así un control minucioso de la hemostasia (Dahlbäck, 2000). En este sentido, el proceso de coagulación sanguínea y el proceso fibrinolítico deben mantener un perfecto balance, en el que el coágulo de fibrina se forme y a la vez, pueda ser degradado. Como se describió anteriormente, la formación de trombina conlleva 9 a la conversión del fibrinógeno en fibrina, pero adicionalmente, la trombina en complejo con la trombomodulina (TM) activa a la Proteína C (PC), que junto a su cofactor, la Proteína S (PS), se encargará de disminuir su propia producción, al inhibir a los factores FVa y FVIIIa. Por otro lado, la formación del coágulo induce el proceso fibrinolítico al generar la plasmina, ya que ésta degradará la fibrina en productos de degradación de fibrina (PDF). El mismo complejo trombina-trombomodulina no sólo estimula la vía anticoagulante de la PC, sino que puede activar también al TAFI, el cual actúa como un inhibidor del proceso fibrinolítico (Figura 4) (Colman y col., 2006). Figura 4. Balance en la formación y degradación del coágulo de fibrina. El proceso de coagulación conduce a la formación de trombina (FIIa), la cual se encargará de convertir al fibrinógeno en fibrina. De manera simultánea, el plasminógeno (Plg) es convertido en plasmina (PLn), la cual degradará la malla de fibrina en productos de degradación de fibrina (PDF). La trombina producida en complejo con la trombomodulina activa a la PC, activando la ruta anticoagulante que inhibe una mayor producción de trombina. Asimismo, este complejo activa al TAFI, el cual inhibe el proceso fibrinolítico (Tomado y modificado de Colman y col., 2006). En algunas ocasiones el balance normal entre ambos procesos, de coagulación y fibrinolítico, puede verse alterado y conllevar al desarrollo de ciertas patologías, ya sea por exceso en la pérdida de sangre (hemorragia) o por la formación de un coágulo en la superficie interna de la pared vascular sin la presencia de un daño (trombosis) (McKenzie, 2000). Es bien conocido que alteraciones en algunos factores de la coagulación pueden contribuir con el desarrollo de eventos hemorrágicos o trombóticos; por lo cual, han sido ampliamente estudiadas 10 las causas que dan origen a estas patologías, en especial, aquellas alteraciones genéticas que afecten ya sea la síntesis, actividad o regulación de alguno de los factores de coagulación y demás componentes del sistema hemostático (Schenone y col., 2004; McKenzie, 2000). Particularmente, han sido de gran interés aquellas alteraciones en el gen que codifica para el FVIII de la coagulación que conlleven a una falta o disminución de dicho factor en el plasma y en consecuencia, al desarrollo de la enfermedad hemorrágica conocida como HA. II.2 Hemofilia A Como se mencionó en la introducción, entre las enfermedades hemorrágicas hereditarias más comunes se encuentra la Hemofilia. La HB es causada por deficiencias del FIX de la coagulación, mientras que la HA es causada por deficiencias del FVIII. Ambos tipos de Hemofilia tienen un patrón de herencia recesivo ligado al cromosoma sexual X, por lo que son los hombres quienes generalmente padecen la enfermedad. En Venezuela, según el Centro Nacional de Hemofilia, hasta el año 2.008 se habían reportado 1.923 casos de Hemofilia, de los cuales 1.508 casos corresponden a HA (78,4 %) y 415 casos corresponden a HB (21,6 %) (Comunicación personal, Centro Nacional de Hemofilia). En el caso particular de la Hemofilia A, es una enfermedad causada por fallas en la fase de propagación del proceso de coagulación sanguínea, debido a que el FVIII no puede actuar como cofactor del FIXa para producir FXa en la superficie plaquetaria. De esta manera, los pacientes con esta patología no producen cantidades suficientes de trombina que permitan la formación de un coágulo estable de fibrina que detenga la hemorragia, y por ello, sangran prolongadamente. La importancia del complejo tenasa intrínseco (FIXa/FVIIIa) se resalta por las manifestaciones clínicas tanto de la Hemofilia A como de la B (deficiencias del FIX), y demuestra asimismo, que las cantidades de trombina producidas por el complejo tenasa extrínseco (FT/FVIIa) no son suficientes para producir un tapón hemostático secundario estable que evite la pérdida de sangre (Hoffman, 2003b). En relación a la severidad de la HA, ésta dependerá de la cantidad de FVIII disponible y funcional que exista en el plasma. Según la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia se clasifica en tres formas clínicas: Severa, cuando los niveles de FVIII están por debajo de 0,01 UI/mL ( 1 % del normal); Moderada, cuando los niveles varían entre 0,01 y 0,05 UI/mL (entre 1-5 % del normal); y Leve, cuando los niveles de FVIII se encuentran entre 0,05 y 0,4 UI/mL 11 (entre 5-40 % del normal) (Preston y col., 2004). Sin embargo, su severidad clínica puede verse influenciada por la presencia de otros factores, que pueden ser tanto genéticos (deficiencia de otros factores de coagulación, mayor presencia de factores procoagulantes, grupo sanguíneo) como adquiridos (estrés, actividad física, dieta, infecciones, uso de medicamentos, entre otras) (Mannucci y Tuddenham, 2001; Preston y Barr, 1964). Cerca del 50 al 60 % de los pacientes con HA son severos, los cuales padecen de hemorragias espontáneas en articulaciones, músculos y órganos internos; un 25 al 30 % son pacientes con HAM, los cuales sufren hemorragias luego de traumas menores; y un 15 al 20 % de los pacientes son hemofílicos A leves, que padecen de hemorragias luego de traumas mayores o cirugías (Colman y col., 2006). La clasificación de la severidad de la HA en un paciente dependerá principalmente del tipo de mutación presente en el gen del FVIII y del efecto que ésta tenga sobre la proteína. II.3 Factor VIII de la Coagulación El FVIII de la coagulación, es una proteína heterodimérica que circula en el plasma sanguíneo en forma inactiva, formando un complejo no covalente con el FvW. Consta de dos cadenas polipeptídicas, una pesada y otra liviana, que están unidas entre sí por un puente dependiente de ión metálico (Cu+) y que comprenden los dominios A1-A2-B y A3-C1-C2, respectivamente (Figura 5) (Fay y Jenkins, 2005). Cuando el proceso de coagulación sanguínea se inicia, este pro-cofactor es convertido a su forma activa por acción de la trombina mediante proteólisis en la Arg372, ubicada entre los dominios A1 y A2 de la cadena pesada, con lo cual es convertida en un heterotrímero (Figura 5). Existen dos residuos adicionales en la proteína donde puede ocurrir también la proteólisis que aumentan la especificidad de la actividad del FVIIIa: la Arg740 en la cadena pesada (unión de los dominios A2-B) y la Arg1689 en la cadena liviana (dominio A3). Una vez que el FVIII es activado por la trombina, puede unirse a superficies fosfolipídicas cargadas negativamente, como la de las plaquetas activadas, junto con el FIXa e iones calcio, para formar así el complejo tenasa intrínseco. Como se mencionó anteriormente, es este complejo quien convierte de forma eficiente al FX en su forma activa durante el proceso de coagulación. La regulación de este complejo incluye la disociación del FVIIIa del complejo tenasa intrínseco y su inactivación por acción del complejo PC/PS (Fay y Jenkins, 2005). 12 Figura 5. Estructura del FVIII y FVIIIa. Los dominios A, B y C se muestran en azul, rojo y anaranjado, respectivamente. Los segmentos ricos en aminoácidos ácidos en los dominios A1, A2 y A3 se muestran en verde. La cadena liviana se encuentra unida a la cadena pesada mediante un puente dependiente de ión metálico (Cu+), indicado con una línea discontinua azul. Los sitios de activación por la trombina se muestran con flechas rojas, mientras que los sitios de interacción macromolecular y con iones metálicos se muestran con círculos azules. Las asociaciones electrostáticas entre los dominios A1 y A2 se indican con la línea discontinua roja. PL: fosfolípidos; LRP: Proteína relacionada al receptor de la lipoproteína de baja densidad (Tomado y modificado de Fay y Jenkins, 2005). II.4 Gen del factor VIII de la coagulación El gen que codifica para el FVIII se encuentra ubicado en el extremo distal del brazo largo del cromosoma X (Xq28), abarcando cerca de 187 Kpb de ADN genómico (Figura 6). Consiste de 26 exones, con tamaños que varían desde 69 hasta 3.106 pb, de los cuales los exones 14 y 26 son los más grandes, comprendiendo 3.106 pb y 1.958 pb, respectivamente (Oldenburg y col., 2004; Gitschier y col., 1984). La mayor parte del exón 26 corresponde a una secuencia que es transcrita pero no traducida (Levinson y col., 1992). Por su parte, 6 de los 25 intrones del gen abarcan más de 14 Kpb; uno de los cuales, el intrón 22, posee a su vez dos genes “intrónicos” (F8A y F8B) que se transcriben y cuyas funciones fisiológicas aún no están bien establecidas (Levinson y col., 1990). El gen del FVIII da origen a un ARNm de aproximadamente 9 Kpb, que incluye 7 Kpb que codifican para una proteína de 2.332 aminoácidos (Oldenburg y col., 2004). Uno de los genes que se encuentra ubicado dentro del intrón 22, el F8A, no contiene intrones propios y se transcribe en sentido opuesto al gen del FVIII. Aunque los transcritos de este gen se han detectado en diversos tejidos, no se conoce aún la función que podría tener la 13 proteína F8A en el organismo. El otro gen intrónico, el F8B, se transcribe en el mismo sentido que el gen del FVIII y da origen a un ARNm de 2.5 Kpb que incluye un exón propio y los exones 23 al 26 del gen del FVIII (Levinson y col., 1990). Estudios realizados en ratones transgénicos y quiméricos han sugerido que el producto del gen F8B podría estar involucrado en el desarrollo embrionario (Valleix y col., 1999). Figura 6. Estructura y localización del gen que codifica para el FVIII de la coagulación. (Tomado y modificado de http://www.hemobase.com/Molecular_Hemofilia/FVIII.jpg). La expresión del gen del FVIII se da principalmente en el hígado, por lo que en su región promotora se han encontrado sitios de unión para distintos factores de transcripción, entre los que se encuentran el HNF-1 y HNF-4 (Hepatocyte nuclear factor), NFB (Nuclear factor kappa B), C/EBP y C/EBP (CAAT/enhancer-binding protein), DBP (D-box binding protein) y HLF (Hepatic leukemia factor), los cuales estarían involucrados en la adecuada expresión del gen en este órgano (Begbie y col., 1999; Figuereido y Brownlee, 1995). Un estudio detallado de la región promotora del gen permitió identificar 12 sitios de unión a diversos factores transcripcionales, distribuidos a lo largo de aproximadamente 1 Kpb en la región 5´ no traducida del gen. Asimismo, se pudo determinar que la región promotora mínima que permite la activación de la transcripción del gen va desde el nucleótido -44 hasta el +148. Se ha demostrado que a esta región se une el factor transcripcional HNF-1, el cual ha mostrado ser indispensable en la expresión del gen del FVIII. Sin embargo, los demás factores y elementos regulatorios presentes aguas arriba del gen permiten un adecuado balance en la 14 activación transcripcional, así como una adecuada respuesta frente a diversas señales del organismo (McGlynn y col., 1996). Como se mencionó anteriormente, debido al gran tamaño del gen del FVIII, éste tiene una alta tasa de mutación, con una frecuencia que varía entre 2,5 x 10-5 y 4,2 x 10-5 (Becker y col., 1996). Es por ello, que numerosas investigaciones han estado dirigidas hacia la identificación de alteraciones genéticas presentes en el gen del FVIII que provoquen la disminución de sus niveles en sangre o alteren su función y que por ende, conlleven a estados hemorrágicos, con el fin de poder establecer pruebas diagnósticas dirigidas a la detección de dichas mutaciones. II.4.1 Alteraciones genéticas en el gen del FVIII de la coagulación Para el año 1990 se pensaba que la HA era causada por diferentes y numerosas mutaciones en la región codificante del gen del FVIII, que podrían incluir mutaciones que originan un codón de terminación prematuro (sin sentido), cambios de un aminoácido por otro (pérdida de sentido), cambios en el marco de lectura, alteración del empalme, deleciones, duplicaciones o inserciones. En algunos casos, una misma mutación era observada en individuos no relacionados, pero en general cada familia tenía su propia mutación (Lakich y col., 1993). Sin embargo, Higuchi y colaboradores (1991), al analizar la región codificante del gen y las regiones intrónicas cercanas, pudieron determinar las mutaciones presentes en la mayoría de los pacientes con HA leve y moderada, pero sólo pudieron identificar cerca de la mitad de las mutaciones presentes en pacientes con HAS. Esto les permitió a los investigadores sugerir que el resto de las mutaciones que daban origen a HAS, estaban ubicadas en las regiones reguladoras del gen, en secuencias intrónicas no analizadas o en otros genes involucrados con la expresión del gen. Bajo la premisa anterior, Naylor y colaboradores (1993), al estudiar el ADNc del FVIII mediante RT-PCR (Reverse transcribed – Polymerase chain reaction), encontraron que en la mitad de los pacientes con HAS analizados era imposible realizar la amplificación entre los exones 22 y 23 del gen, pero era posible entre los exones 1-22 y 23-26. Dado que no consiguieron otras mutaciones en estos pacientes, sugirieron que la alteración genética debía encontrarse dentro del intrón 22 del gen del FVIII. 15 II.4.1.1 Inversión del intrón 22 El intrón 22 es el más grande de los 25 intrones que posee el gen del FVIII, abarcando cerca de 33 Kpb de ADN. Contiene una isla rica en G+C, la cual está ubicada cerca de 10 Kpb aguas abajo del exón 22 y se ha sugerido que funciona como promotor bidireccional para los dos genes intrónicos que están presentes en este intrón (F8A y F8B), como se mencionó anteriormente. Del gen F8A, existen dos copias adicionales (F8A' y F8A'') que se transcriben y que están ubicadas en la región telomérica del cromosoma X, cerca de 450 y 550 Kpb aguas arriba del gen del FVIII. En base a los resultados obtenidos por Naylor y colaboradores (1993), Lakich y colaboradores (1993), propusieron un modelo para explicar dichos resultados y que podría ser la base genética de aproximadamente el 40 % de las alteraciones que dan origen a HAS. En este modelo, los autores propusieron que el gen intrónico F8A sufría una recombinación homóloga con alguna de sus dos copias presentes en la región telomérica del cromosoma. Si la copia que se recombinaba se encontraba en orientación opuesta a la del F8A, la recombinación daría origen entonces a la inversión de las secuencias de ADN ubicadas entre ambas. Así, el gen del FVIII quedaría dividido en dos partes, una intacta con la región promotora y los exones 1 al 22, y una segunda parte en orientación opuesta con los exones 23 al 26 (Figura 7). La separación y ubicación opuesta de ambas regiones del gen del FVIII daría origen a una proteína incompleta, a la cual le faltarían los últimos 4 exones del gen. Esta proteína truncada carecería del dominio C2, el cual es responsable de la unión a fosfolípidos, esencial para la actividad procoagulante de este factor, y al cual se unen parte de las moléculas de FvW que le confieren estabilidad y protección (Levinson y col., 1990). Posteriormente, Naylor y colaboradores (1995), definieron las regiones homólogas involucradas en la recombinación que ocasionan la inversión, como una sección de 9.5 Kpb de ADN, que fue denominada int22h (región homóloga al intrón 22). Así, la copia ubicada dentro del intrón 22 del gen del FVIII se denominó int22h-1, la copia ubicada en posición proximal al gen del FVIII int22h-2 y finalmente, la copia ubicada en la posición distal al gen int22h-3. Estos mismos autores, al comparar cerca de 8 Kpb de las tres copias del int22h, encontraron que eran un 99,9 % homólogas entre sí, lo cual explicaría la alta frecuencia con la que ocurre la recombinación entre estas regiones. Más aún, al examinar los sitios donde ocurría la inversión, encontraron que los cambios que se generaban en ambas copias del int22h involucradas eran precisos, por lo que se verificaba el modelo de recombinación homóloga propuesto. 16 Figura 7. Esquema de la inversión del intrón 22. Esta es generada por la recombinación homóloga entre una región del intrón 22 (F8A) y alguna de sus dos copias homólogas ubicadas en la región telomérica del brazo largo del cromosoma X (F8A´ y F8A´´) (Tomado y modificado de http://www.hemobase.com/Molecular_ Hemofilia/FVIII.jpg). Actualmente se sabe que la inv-int22 representa la primera causa genética a buscar cuando se quiere realizar el diagnóstico molecular de pacientes con HAS y de mujeres portadoras (De Brasi y col., 2000). Diferentes estudios a nivel mundial han encontrado que esta inversión afecta entre un 30 a 55 % de los pacientes con HAS, tal como se indica en la Tabla 1. Tabla 1. Frecuencia de la inv-int22 en el gen del FVIII en pacientes con HAS en diferentes poblaciones. Estudio Población Abu-Amero y col., 2008 David y col., 2006 Laurie y col., 2007 Awidi y col., 2009 Andrikovics y col., 2003 Jayandharan y col., 2005 Poláková y col., 1998 Boekhorst y col., 2005 Owaidah y col., 2009 Sawecka y col., 2005 Rossetti y col., 2007 Guillet y col., 2006 Arabia Portugal Nueva Zelanda Jordania Hungría India Eslovaquia Holanda Arabia Saudita Polonia Argentina Francia Número de familias HAS analizadas no relacionadas 22 135 26 42 104 89 44 20 22 113 80 241 Inv-int22 (%) 55 54 54 52 52 51 50 50 50 50 45 46 17 Bagnall y col., 2002 Petkova y col., 2004 Mantilla y col., 2007 Oldenburg y Pavlova, 2006 Habart y col., 2003 Lin y col., 2008 Fukuda y col., 2004 Acquila y col., 2007 Chowdhury y col., 2000 Rastegar y col., 2004 Hwang y col., 2009 Soares y col., 2001 Li y col., 2009 Green y col., 2008 Fernández y col., 2005 Sirocova y col., 2009 Yenchitsomanus y col., 2003 Sultanaeva y col., 2000 Inglaterra Bulgaria México Alemania República Checa Taiwán Japón Italia India/Asia Irán Corea del Sur Brasil China Reino Unido España Moldavia Tailandia Rusia 209 23 31 753 162 122 100 93 20 124 38 33 65 No indicado 55 42 47 34 45 45 45 45 44 43 42 42 40 40 39,5 39 38,5 38 36 31 30 30 Se ha establecido que la presencia de las diversas copias del int22h en el cromosoma X, se originaron por conversión génica durante la recombinación homóloga en la meiosis y que dichas duplicaciones ocurrieron hace más de 25 millones de años (Bagnall y col., 2005). El proceso de recombinación homóloga intracromosómico que da origen a la inv-int22 se conoce que ocurre con mayor frecuencia en las células germinales de los hombres que en las de las mujeres (Bröcker y col., 1991), ya que la recombinación homóloga es facilitada en la meiosis masculina e inhibida en la meiosis femenina por el apareamiento de los cromosomas X homólogos (Oldenburg y col., 2004). Por otro lado, se ha observado que algunos individuos pueden poseer copias adicionales de la región int22h y que pueden asimismo, recombinarse con la copia presente en el intrón 22 del gen del FVIII (int22h-1), por lo que la región entre ambas se invertirá al igual que en los otros casos anteriores (Naylor y col., 1996). Esto demuestra que la presencia de copias extras de la región int22h le confieren una mayor inestabilidad al segmento cromosómico Xq28, región donde se encuentra ubicado el gen del FVIII. Sin embargo, esta no es la única región que le confiere inestabilidad al gen del FVIII, ya que existe otra región, denominada inth1, que está presente en el intrón 1 del gen y fuera de éste hacia la región telomérica, que también favorece eventos de recombinación intracromosómica. 18 II.4.1.2 Inversión en el intrón 1 Existe otra mutación en el gen del FVIII que constituye la segunda causa más común de HAS, y es una inversión que involucra al intrón 1. La presencia de esta inversión fue sugerida por Brinke y colaboradores (1996), al encontrar mediante experimentos con RT-PCR, dos ARNm quiméricos del FVIII en pacientes con HAS. Uno de estos ARNm se transcribe bajo el control del promotor del gen del FVIII y contiene el primer exón de este gen, seguido de unos exones de un gen no identificado y los exones 2 al 6 del gen VBP1 (von Hippel-Lindau binding protein 1) (Figuras 8, 9). El otro ARNm que se origina producto de la inversión, se transcribe bajo el control del promotor del gen C6.1A y contiene todos excepto el último exón del gen C6.1A, algunos exones del gen no caracterizados aún y los exones 2 al 26 del gen del FVIII (Brinke y col., 1996). Figura 8. Esquema de la ubicación del gen del FVIII de la coagulación, las regiones involucradas en la recombinación homóloga y los genes adicionales involucrados en la inversión del intrón 1, en condiciones normales (Tomado y modificado de Bagnall y col., 2002). Para determinar la causa de la presencia de los ARNm quiméricos, Bagnall y colaboradores (2002) estudiaron detalladamente el intrón 1 en pacientes hemofílicos con la inversión y personas sanas. Para ello, dividieron el intrón 1 en 12 regiones solapadas que se pudieran amplificar y secuenciar, encontrando que una de las regiones (denominada región 9) del intrón no podía amplificarse en los pacientes. Además, observaron que cuando la región 9 era subdividida en cuatro segmentos, cada uno podía amplificarse por separado, pero no en conjunto. Por ello, sugirieron que la inversión que ocurría en este intrón tenía que ser el producto de la recombinación homóloga con una región repetida de la secuencia, al igual que ocurría con el intrón 22 del gen (Figura 9). Lo anterior fue demostrado por los mismos autores, 19 al utilizar el ADN de un paciente con HAS, que posee una deleción desde la región promotora hasta el intrón 6 del gen del FVIII, pudiendo identificar una secuencia idéntica al segmento 9b del intrón 1 aproximadamente 140 Kpb aguas arriba del gen del FVIII, que abarca 1.041 pb. A esta secuencia se le denominó int1h-2 y a la que está presente en el intrón 1 del gen del FVIII int1h-1 (Bagnall y col., 2002). Figura 9. Esquema de la recombinación homóloga entre la región ubicada en el intrón 1 del gen del FVIII y su otra copia ubicada hacia la región telomérica, que da origen a la inversión del gen (Tomado y modificado de Bagnall y col., 2002). Por otro lado, Bagnall y colaboradores (2002) investigaron las posibles causas de la duplicación de la región int1h y analizaron las secuencias aledañas al int1h-1, encontrando a cada lado de dicha región, la presencia de un elemento repetitivo tipo LTR/ERVL (Long Terminal Repeat / Endogenous Retroviral Element). Asimismo, cercano a la región repetida int1h-2 encontraron un elemento repetitivo tipo LINE L2 (Long Interspersed Element), lo cual podría explicar la duplicación de la secuencia en el genoma, y podría permitir que nuevas copias se generasen, tal como ha ocurrido con la región int22h. La inv-int1 en el gen del FVIII, es la segunda alteración genética a identificar en pacientes con HAS, luego de la inv-int22. Diversos estudios reportan que la frecuencia de esta alteración puede alcanzar hasta un 5 % en pacientes con HAS, tal como se indica en la Tabla 2. 20 Tabla 2. Frecuencia de la inv-int1 en el gen del FVIII en pacientes con HAS en diferentes poblaciones. Estudio Población Tizzano y col., 2003 Bagnall y col., 2002 Li y col., 2009 Habart y col., 2003 Acquila y col., 2007 Green y col., 2008 Hwang y col., 2009 Schröder y col., 2005 Sirocova y col., 2009 Jayandharan y col., 2005 Awidi y col., 2009 Rossetti y col., 2004a David y col., 2006 Rastegar y col., 2004 Guillet y col., 2006 Lin y col., 2008 Mantilla y col., 2007 Castaman y col., 2007 Andrikovics y col., 2003 España Inglaterra China República Checa Italia Reino Unido Corea del Sur Alemania Moldavia India Jordania Argentina Portugal Irán Francia Taiwán México Albania Hungría Número de pacientes HAS analizados 201 209 65 162 93 No indicado 38 No indicado 42 89 42 64 135 124 241 122 65 19 104 Inv-int1 (%) 5,0 4,8 4,6 4,0 3,2 3,2 2,6 2,4 2,4 2,0 2,0 1,6 1,5 1,5 1,0 0,8 0,0 0,0 0,0 Al igual que ocurre con la recombinación en el intrón 22, la inversión producto de la recombinación en el intrón 1 del gen del FVIII ocurre con mayor frecuencia en las células germinales de los hombres, ya que el plegamiento intracromosómico del cromosoma X ocurre más fácilmente en los hombres y por ende, la recombinación homóloga, a diferencia de las mujeres, en donde el apareamiento de los cromosomas X homólogos lo dificulta (Bröker y col., 1991; Oldenburg y col., 2004). La presencia de secuencias repetidas dentro del gen del FVIII de la coagulación y en la región telomérica del cromosoma X, tales como la inth22 e inth1, han demostrado ser un factor desestabilizador frecuente de esta región cromosómica ya que facilitan la recombinación homóloga, conllevando a la inversión de las secuencias entre ellas y conduciendo al desarrollo de HA (Oldenburg y col., 2004). Sin embargo, la frecuencia de ambas inversiones sólo alcanza cerca de un 55 % de los casos con HAS, por lo que resta un gran porcentaje de pacientes con mutaciones que no se presentan con un patrón frecuente y que generalmente son mutaciones puntuales, que pueden estar distribuidas a lo largo de todo el gen del FVIII. 21 II.4.1.3 Otras mutaciones en el gen del FVIII Se han detectado otros tipos de mutaciones en el gen del FVIII, que aunque no se presentan con un patrón frecuente, como en el caso de las inversiones mencionadas anteriormente, en conjunto hacen que la HA sea una condición muy heterogénea tanto en su clínica como a nivel molecular (Oldenburg y col., 2004). En el caso de la HAS, las mutaciones puntuales representan el porcentaje restante del total de mutaciones en el gen del FVIII, tales como deleciones, inserciones y mutaciones sin sentido, que conllevan a la síntesis de proteínas truncadas. En cuanto a las mutaciones causantes de la HA leve y moderada, las de pérdida de sentido, donde el cambio de un aminoácido por otro genera una proteína no funcional, representan el mayor porcentaje en estos pacientes. Asimismo, se ha establecido que las mutaciones puntuales pueden ocurrir con una cierta frecuencia en dos puntos dentro del gen (puntos calientes). En un estudio realizado en 846 familias con HA, se encontró que cerca del 40 % de las mutaciones puntuales se daban en uno de los 70 sitios CpG del gen, aún cuando estas regiones representan sólo el 2 % de la secuencia codificante. Por otro lado, también se determinó que cerca del 25 % de las deleciones pequeñas que se han detectado en el gen, ocurren en alguna de las dos series de adenina de 8 y 9 nucleótidos, que están presentes en el exón 14 del gen (Oldenburg y col., 2004). Como se mencionó anteriormente, las mutaciones en el gen del FVIII generalmente se producen en la línea germinal masculina (3.4 veces más con respecto a la femenina), aunque esto va a depender del tipo de mutación. En el caso de las inversiones, como las del intrón 22 e intrón 1, la frecuencia es más de 10 veces mayor en los hombres que en las mujeres, mientras que las mutaciones puntuales entre 5 a 10 veces más. Por el contrario, se ha encontrado que las deleciones ocurren 5 veces más en la línea germinal femenina que en la masculina. Esto último se ha observado también en otros desórdenes ligados al cromosoma X, sin embargo, los autores no dan una explicación del por qué esta mayor frecuencia en la línea germinal femenina (Becker y col., 1996). La HAS solía ser una enfermedad letal, por lo que los pacientes con esta patología dejaban poca descendencia, conllevando de esta manera, a que cerca de un tercio de las mutaciones en el gen del FVIII se perdieran en cada generación. Sin embargo, la frecuencia de HA se ha mantenido en todas las poblaciones a nivel mundial, por lo que cerca de un tercio de las mutaciones se deben generar de forma espontánea en cada generación. Esto se corrobora con 22 la amplia lista de mutaciones en el gen del FVIII que han sido reportadas y por la numerosa cantidad de pacientes en donde las mutaciones no son encontradas en los alelos de su línea materna (Colman y col., 2006; Oldenburg y col., 2004). Hasta el año 2.007, la base de datos HAMSTeRS (The Hemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site) reportaba un total de 1.209 mutaciones diferentes causantes de HA, aunque este número actualmente debe ser significativamente mayor debido a la continua publicación de nuevas mutaciones. II.5 Tratamiento de la Hemofilia A y complicaciones asociadas Antes del surgimiento de la terapia para controlar la HA, la mayoría de los hombres morían antes de los 20 años de edad por hemorragias prolongadas causadas por algún trauma o generadas de forma espontánea. Aquellos pacientes que lograban sobrevivir, padecían de las complicaciones asociadas a esta enfermedad, como daño cerebral y daño en las articulaciones y músculos, que posteriormente conllevaban a la incapacitación del individuo debido a las frecuentes hemorragias en esas áreas (Powell, 2009). El tratamiento de la HA no comenzó sino hasta los años ´70, cuando estuvieron disponibles los concentrados plasmáticos de los factores de coagulación, que permitieron el control de las hemorragias y sus daños asociados. Sin embargo, estos concentrados eran obtenidos de cientos de donantes de sangre, que en muchos casos estaban infectados con el virus de la Hepatitis B y C, y el de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) (Mannucci y Tuddenham, 2001). A finales de los años ´80, cerca del 75 % de los pacientes con HAS y muchos de los pacientes leves y moderados, estaban infectados con VIH en los Estados Unidos de América; asimismo, casi el 95 % de los pacientes se infectaron con Hepatitis C (Powell, 2009). Afortunadamente, en los últimos 20 años se han producido concentrados plasmáticos de FVIII más puros y seguros, debido a que son sometidos a procesos de inactivación viral, disminuyendo así el riesgo de transmisión por esta vía, de los virus mencionados anteriormente. Posteriormente, estos riesgos fueron eliminados totalmente cuando se logró la producción del FVIII en el laboratorio, mediante el uso de las técnicas del ADN recombinante (Powell, 2009; Mannucci y Tuddenham, 2001). Actualmente, el FVIII recombinante es ampliamente utilizado, aunque también se sigue empleando el FVIII purificado de plasma. El uso de uno u otro depende principalmente del costo, la disponibilidad y eficacia de cada uno de ellos, de acuerdo 23 a las capacidades de cada centro de atención médica. Sin embargo, ambos requieren de su administración periódica, ya sea para tratar las hemorragias o para prevenirlas, por lo que en la actualidad se siguen buscando métodos más efectivos en la terapia de la HA, tales como la terapia génica, en donde se busca reemplazar la función perdida del FVIII gracias a la inserción del gen en el individuo por medio de algún vector (Miller y Stamatoyannopoulos, 2001). La Hemofilia ha sido uno de los blancos terapéuticos por excelencia para la terapia génica desde que se caracterizaron los genes que codifican para el FVIII y el FIX en la década de los ´80. En la actualidad, se están realizando diversas pruebas clínicas de transferencia génica en Hemofilia, que permitirán determinar cuál terapia resultaría más exitosa. Sin embargo, la terapia génica de momento, no escapa de las complicaciones que en los últimos años han sido asociados al tratamiento convencional de la HA, como es el desarrollo de inhibidores contra el FVIII exógeno (Lillicrap y col., 2006). II.5.1 Desarrollo de inhibidores En los últimos años, se ha observado que los pacientes con HAS pueden padecer otras complicaciones adicionales a la hora de recibir el tratamiento, que van más allá de la pureza del factor que se le administra como tratamiento. De hecho, el problema más importante que se presenta en la actualidad con los pacientes hemofílicos es el desarrollo de anticuerpos o inhibidores, como mejor se les conoce, contra el factor exógeno que se les está administrando (DiMichele, 2008). Por lo general, los anticuerpos se desarrollan cuando el organismo detecta la presencia de algún componente exógeno, tales como toxinas, bacterias, virus, etc. En el caso de la HAS, en donde la enfermedad en muchos casos es debida a alteraciones genéticas que conllevan a la falta de síntesis de la proteína, el organismo muchas veces reconocerá como extraña cualquier molécula de FVIII que se le administre al paciente y por ende, generará inhibidores contra el tratamiento, disminuyendo así su eficiencia. En muchos casos, la presencia de los inhibidores puede convertirse en un problema a largo plazo, afectando la salud y calidad de vida de los pacientes, y aumentando el costo de los tratamientos médicos (Astermark y col., 2005). Durante la terapia con FVIII, la intensidad de la respuesta inmune puede variar de acuerdo a la cantidad de inhibidores generados, clasificándose en inhibidores de alta- y bajarespuesta (DiMichele, 2008). Si el sistema inmune responde bruscamente frente a repetidas 24 exposiciones al FVIII, los anticuerpos contra el FVIII aumentan rápidamente a niveles muy elevados (> 5 UB/mL1), por lo cual se denominan inhibidores de alta respuesta. La disminución de los niveles de este tipo de inhibidores puede tomar meses o incluso años. Por su parte, los inhibidores de baja respuesta (≤ 5 UB/mL) se presentan cuando el sistema inmune responde de manera débil y lenta, y por ende, las complicaciones con el tratamiento no son tan severas como con los de alta respuesta (DiMichele, 2008). Cerca de un 20 a 35 % de los pacientes con HAS desarrollan inhibidores contra el FVIII, aunque el riesgo de cada persona dependerá tanto de factores ambientales como genéticos. En los pacientes leves y moderados el riesgo de desarrollar inhibidores es mucho menor, debido a que en la mayoría de los casos el paciente posee FVIII circulante en plasma, ya sea en niveles reducidos o en niveles normales pero no funcionales (DiMichele, 2008; Astermark, 2009). En Venezuela, según el Centro Nacional de Hemofilia se ha reportado que el 13,85 % de los pacientes con HA presentan inhibidores (Comunicación personal, Centro Nacional de Hemofilia). El principal factor de riesgo para el desarrollo de inhibidores es el tipo de alteración presente en el gen del FVIII. Los pacientes que poseen deleciones largas, mutaciones sin sentido y aberraciones intracromosómicas tienen un riesgo mayor para desarrollar inhibidores, ya que se ha observado que entre un 30 a 40 % de los pacientes con este tipo de mutaciones los desarrollan. Por su parte, aquellos pacientes con mutaciones de pérdida de sentido, deleciones o inserciones pequeñas y mutaciones que alteran el empalme tienen un riesgo reducido, donde sólo el 5 %, 10 % y 3 % respectivamente, de los pacientes con estas mutaciones desarrollan inhibidores. También son factores de riesgo para el desarrollo de inhibidores el origen étnico y la historia familiar del paciente, así como el tipo de tratamiento administrado (derivados plasmáticos o recombinantes), la edad de inicio del tratamiento (siendo mayor durante los primeros 20 años de vida), el número de infusiones con FVIII exógeno (mayor durante las primeras 50) y el motivo por el cuál es tratado el paciente (DiMichele, 2008; Astermark, 2009). Sin embargo, muchas veces no se encuentra explicación en por qué un paciente presenta inhibidores y otro no, aún cuando poseen la misma mutación y/o son del mismo grupo familiar (Astermark y col., 2005). 1 Se mide la actividad residual de FVIII en un plasma control mezclado con el plasma del paciente. Si luego de la prueba la actividad residual es del 50 %, se dice que posee 1 unidad Bethesda. 25 II.5.2 Alteraciones genéticas asociadas al desarrollo de inhibidores Recientemente, se ha propuesto que puede existir una predisposición genética adicional al desarrollo de inhibidores, que es explicada por la presencia de mutaciones y polimorfismos en genes que codifican para diversos componentes del sistema inmune, al modular la respuesta inmune de cada individuo (Astermark y col., 2005). Entre las alteraciones genéticas que se han asociado con el desarrollo de inhibidores se encuentran la presencia del alelo 134 pb del microsatélite IL10G y del alelo G del polimorfismo -1082 GA, ubicados en la región promotora del gen que codifica para la Interleuquina 10 (IL10), así como el polimorfismo -308 GA en el gen que codifica para al Factor de Necrosis Tumoral (TNFA) (Pavlova y col., 2009). La IL10 es una citoquina anti-inflamatoria con una amplia variedad de acciones en la respuesta inflamatoria. Sin embargo, se ha demostrado que la IL10 también puede estimular la síntesis de inmunoglobulinas por parte de las células mononucleares en diversas patologías. La presencia del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G ubicado en la región promotora del gen IL10, el cual está compuesto por repeticiones de CA, se ha asociado con numerosas enfermedades autoinmunes tales como el lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, granulomatosis de Wegener y mieloma múltiple. En el estudio internacional MIBS (Malmö International Brother Study) se evaluaron diversos polimorfismos presentes en genes que codifican para citoquinas, tales como la IL4, IL10 e IL1, para evaluar su posible participación en el desarrollo de inhibidores en pacientes hemofílicos, encontrándose una fuerte asociación con el alelo 134 pb del microsatélite IL10G, el cual aumenta el riesgo unas 4.4 veces (Astermark y col., 2006a). Por otro lado, en el mismo estudio MIBS se analizaron varios polimorfismos genéticos en el gen TNFA (-827C>T, -238G>A, 670A>G y -308G>A) para determinar también su asociación con el desarrollo de inhibidores en pacientes con HA. El TNF es una potente citoquina pro-inflamatoria que modula en gran medida la respuesta inmune, ya que polimorfismos en el gen de esta citoquina han sido asociados con diversas enfermedades mediadas por anticuerpos. El polimorfismo más estudiado con efectos fisiopatológicos es el 308 GA en la región promotora del gen, el cual aumenta los niveles de TNF y por ende, la formación de anticuerpos. Se ha encontrado que este polimorfismo genético puede aumentar el riesgo de inhibidores hasta 20 veces en pacientes con HAS (Astermark y col., 2006b). 26 De esta manera, además de identificar la alteración genética en el gen del FVIII causante de la HAS, resulta de gran importancia determinar la presencia de los polimorfismos en la citoquinas antes mencionadas, con la finalidad de determinar si existe una predisposición genética adicional en el paciente al desarrollo de anticuerpos frente al tratamiento. En base a todo lo anterior, se resalta la importancia que tiene el estudio de las bases moleculares de la HA. Es por ello, que en el año 2.007 se inició un proyecto entre el Laboratorio de Genética Molecular Humana B de la Universidad Simón Bolívar (USB) y el Centro Nacional de Hemofilia del Banco Metropolitano de Sangre (BMS), para determinar las alteraciones genéticas presentes en el gen del FVIII, así como las mutaciones asociadas al desarrollo de inhibidores en pacientes con HA. Con la detección de estas alteraciones genéticas se podría fácilmente realizar el diagnóstico a familiares de los pacientes y determinar si existe un riesgo genético para el desarrollo de inhibidores. 27 III. OBJETIVOS III.1 Objetivo General Determinar las alteraciones genéticas presentes en el gen que codifica para el FVIII de la coagulación en pacientes ya diagnosticados con Hemofilia A Severa, así como la presencia de ciertas mutaciones en genes del sistema inmune que pudieran estar asociadas con el desarrollo de inhibidores. III.2 Objetivos Específicos - Determinar la presencia de la inv-int22 mediante PCR inversa en muestras de pacientes con HAS. - Determinar la presencia de la inv-int1 mediante PCR convencional en aquellos pacientes con HAS que hayan dado negativo para la inv-int22. - Detectar la presencia de mutaciones mediante la técnica de Electroforesis en Geles Sensibles a la Conformación (CSGE), en la región promotora, todos los exones y regiones intrónicas aledañas a los exones, así como en la región 3´-no traducida del gen del FVIII, en aquellos pacientes con HAS negativos para la inv-int1. - Determinar la posible asociación entre la presencia del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G y del polimorfismo -1082 GA en la región promotora del gen IL10, así como del polimorfismo -308 GA en el gen TNFA, y el desarrollo de inhibidores en los pacientes con HAS. 28 IV. DESCRIPCIÓN METODOLÓGICA IV.1 Selección de los pacientes Se estudiaron 55 pacientes de sexo masculino, no relacionados entre sí y de cualquier edad, que fueron diagnosticados con HAS en el Centro Nacional de Hemofilia (BMS) y que dieron consentimiento escrito para participar en el estudio (Anexo I). Asimismo, se obtuvieron los datos sobre la presencia de inhibidores (alta y baja respuesta) frente al tratamiento. IV.2 Toma de muestras y análisis de laboratorio Las muestras de sangre total periférica fueron obtenidas mediante venopunción en tubos con anticoagulante (7,5 nM de EDTA) y conservadas a -20 °C en el BMS hasta su traslado al Laboratorio de Genética Molecular Humana B de la USB para su estudio. Cada muestra se procesó según el plan de trabajo mostrado en la Figura 10. Figura 10. Plan de Trabajo realizado para el análisis de las muestras en el laboratorio. IV.3 Extracción del ADN genómico a partir de sangre total Para la obtención del ADN genómico (ADNg) de alto peso molecular se empleó el método descrito por Bowen y Keeney (2003), con algunas modificaciones. De cada muestra de sangre con EDTA (7,5 nM), se tomaron 750 μL y se mezclaron con un volumen igual de una 29 solución de lisis celular (10 mM de Tris-HCl pH 8, sacarosa al 11 % p/v, 5 mM de MgCl2 y Tritón X-100 al 1 % v/v). Se mezcló en el vórtex brevemente y se dejó a temperatura ambiente por 2 minutos. Se centrifugó 5 minutos a 2.000 x g y se descartó el sobrenadante. El precipitado obtenido se lavó con 500 μL de la solución de lisis celular, se centrifugó nuevamente por 2 minutos y se descartó el sobrenadante. Se resuspendió el precipitado en 300 μL de una solución de lisis nuclear (10 mM de Tris-HCl pH 8, 10 mM de EDTA, 10 mM de Citrato de Sodio y SDS al 1 % p/V) y se le agregaron 100 μL de NaCl (5,3 M) y 500 μL de cloroformo. Se mezcló por inversión hasta que se formó una emulsión uniforme y se centrifugó por 5 minutos a 2.000 x g para separar las fases. Se tomaron 300 μL de la fase acuosa (superior) y en un nuevo tubo se mezclaron con 600 μL de etanol absoluto frío. Se invirtió suavemente hasta que apareció la malla de ADNg y se centrifugó a 12.000 x g por 10 minutos. Se descartó el etanol dejando evaporar completamente y se resuspendió en 50 μL de agua estéril. IV.4 Cuantificación y verificación de la calidad del ADNg extraído Se tomaron 5 μL del ADNg extraído de cada muestra, para medirle su absorbancia mediante el uso de un espectrofotómetro Biophotometer (Eppendorf) a una longitud de onda de 260 y 280 nm y así, determinar la concentración del ADNg y proteínas presentes, respectivamente. Para la determinación de la concentración de ADNg se estableció que una unidad de absorbancia a 260 nm equivale a una concentración de 50 μg/mL de ADN doble cadena. Asimismo, se determinó la relación A260/A280 para estimar la pureza del ADNg extraído. Finalmente, se realizaron corridas electroforéticas en geles de agarosa al 0,8 % para verificar la calidad e integridad del ADNg extraído (Sambrook y col., 2001). IV.5 Determinación de la inv-int22 Para la detección de la inv-int22 se empleó la técnica de PCR inversa (I-PCR). El uso de esta técnica para el diagnóstico de la inv-int22 fue descrita por Rossetti y colaboradores (2005) y consiste en tres pasos fundamentales: digestión del ADNg con una enzima de restricción específica, ligación intramolecular del ADN digerido y amplificación por PCR a partir de los anillos formados. La IPCR se realizó empleando 1 μg de ADNg, que fue digerido con 20 U de la enzima BclI (Promega), 1X de buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 y 1 mM 30 DTT) y 0,1 mg/mL de BSA en un volumen final de 50 µL, a 50 C durante toda la noche. A la mezcla anterior se le agregaron 50 µL de agua y los fragmentos de digestión se purificaron usando 100 µL de cloroformo puro y centrifugando a 12.000 x g por 5 minutos. Se tomaron 100 µL de la fase acuosa superior y se precipitaron con 200 µL (2X) de etanol absoluto frío. Se centrifugó a 12.000 x g durante 15 minutos, se descartó el etanol y se dejó secar el precipitado. Se resuspendió en 539 µL de agua y se procedió a realizar la ligación, usando la enzima T4 DNA Ligasa (Promega), para formar los anillos intramoleculares. La ligación se realizó empleando 3 U de enzima y 1X de buffer (30 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT y 1 mM ATP), a 15 C durante toda la noche. Los anillos fueron purificados usando 600 µL de isopropanol al 100 % y centrifugando a 12.000 x g durante 15 minutos. El precipitado obtenido se lavó con 500 µL de etanol al 70 %, se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos, se descartó el etanol y se dejó secar. El precipitado obtenido se resuspendió en 10 µL de agua estéril, y fue utilizado en su totalidad para amplificar mediante PCR la región que contiene el sitio BclI (Modificado de Rossetti y col., 2005). Se realizó una PCR touchdown, en donde las condiciones de amplificación utilizadas fueron las siguientes: 94 ºC por 5 minutos; 10 ciclos de 94 C por 30 segundos, 60 C por 60 segundos y 72 C por 90 segundos, en el que en cada ciclo la temperatura de hibridación baja 1 ºC; 20 ciclos de 94 C por 30 segundos, 56 C por 60 segundos y 72 C por 90 segundos; y una extensión final de 72 C por 10 minutos. La mezcla de reacción estuvo compuesta por 200 μM de cada dNTP, 0,04 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen), 1X de buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 y 50 mM KCl), 1,5 mM de MgCl2, 0,6 μM de cada cebador (Tabla 3) y 10 μL de anillos (Modificado de Rossetti y col., 2005). Tabla 3. Cebadores empleados para la detección de la inv-int22 por I-PCR. (Tomados de Rossetti y col., 2005). Cebador Secuencia 5´ 3´ IU ID ED CCTTTCAACTCCATCTCCAT ACATACGGTTTAGTCACAAGT TCCAGTCACTTAGGCTCAG Para determinar la presencia o ausencia de la inv-int22, se corrieron los productos de PCR en geles de agarosa al 3 %, donde una banda de 559 pb es indicativa de la presencia de la inversión, mientras que una de 487 pb es indicativa de la presencia del alelo normal. 31 IV.6 Determinación de la inv-int1 A todos aquellos pacientes negativos para la inv-int22, se les determinó la presencia de la inv-int1, mediante una PCR convencional, según Bagnall y colaboradores (2002). En cada reacción de amplificación se utilizaron tres juegos de cebadores, que permitieron discernir entre la presencia o ausencia de la inversión en las dos regiones int1h involucradas en la recombinación (Tabla 4). Si un paciente no posee la inversión, los cebadores 9F y 9cR que acotan la región int1h-1 producen un fragmento de 1.908 pb, mientras que los cebadores Int1h2F e Int1h-2R que acotan la región int1h-2 producen un fragmento de 1.191 pb. Cuando está presente la inversión, los tamaños de los productos en cada región se invierten (Bagnall y col., 2002). La amplificación por PCR se llevó a cabo usando 0,5 mM de dNTPs, 0,05 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen), 1X de buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 y 50 mM KCl), 2,5 mM de MgCl2, 5 % de DMSO y 0,5 μM de cada cebador, siguiendo el siguiente esquema: 94 C por 5 min, 30 ciclos de 94 C por 1 min, 55 C por 1 min y 72 C por 1 min, con una extensión final de 72 C por 10 min. Tabla 4. Cebadores empleados para la detección de la inv-int1 (Tomados de Bagnall y col., 2002). Región analizada Int1h-1 Int1h-2 Cebador 9F Int1h-2F 9cR Int1h-2F 9F Int1h-2R Secuencia 5´ 3´ GTTGTTGGGAATGGTTACGG GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA CTAGCTTGAGCTCCCTGTGG GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA GTTGTTGGGAATGGTTACGG TGGGTGATATAAGCTGCTGAGCTA Los productos de PCR obtenidos para cada región amplificada se corrieron en geles de agarosa al 1,5 % para discernir según el tamaño de cada banda entre la presencia o ausencia de la inv-int1. IV.7 Amplificación del gen del FVIII En aquellos pacientes que no se detectaron las inversiones inv-int22 ni inv-int1, se procedió a la amplificación por PCR de la región promotora, de todos los exones y regiones intrónicas aledañas, así como de la región 3´ no traducida del gen del FVIII, empleando los cebadores indicados en la Tabla 5, para el posterior análisis mediante CSGE (Electroforesis en Geles Sensibles a la Conformación). 32 Tabla 5. Lista de cebadores utilizados para la amplificación del gen del FVIII. Nombre P1A P1B P2A P2B 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B 6A 6B 7A 7B 8A 8B 9A 9B 10A 10B 11A 11B 12A 12B 13A 13B 14A 14A2 14B1 14B 14C 14C2 14D1 14D 14E 14E2 14F1 14F 14G 14G2 14H1 14H 14J 14J2 Región a amplificar Región promotora Región promotora Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón 4 Exón 5 Exón 6 Exón 7 Exón 8 Exón 9 Exón 10 Exón 11 Exón 12 Exón 13 Exón 14 Exón 14 Exón 14 Exón 14 Exón 14 Exón 14 Exón 14 Exón 14 Exón 14 Secuencia 5´ 3´ GAGCTCACCATGGCTACATTC TCCTGTCACTCCTCTTCTCAG AGGTCAGGAGAAAGGGCATG CCCACTGGATGTGCTCAGCA ACTGCTCTCAGAAGTGAATG GTAGCATCACAACCATCCTA CCTCCTTGCTAATAGTAGAA AGTTAGGGAAACATTCTCTT CACTGTGACCTTGACTCTAAC ACCTTAAAAGAGTTGTAACGC GTACAGTGGATATAGAAAGGAC GATTCAGTTGTTTGTACTTCTC TTCTTACTGTCAAGTAACTG CTGAACAGTAATGTAATTTA TCCCACTTATTGTCATGGAC TACAGAACTCTGGTGCTGAA AGCTGTTGGTTTGATAGTAG ATTCCTGTACATTGTCCAG CATATAGCCTGCAGAAACA CTGATGCTCAGCTATGTTAG CTAACATAGCTGAGCATCAG GATCATGTCCATTGGAGAC ATGTAGATAGAGGCCACTTT ACTTTAGACTGGAGCTTGAG TGCGACTTTAGCTTCCACTT ACTGACCTATATTGCAAACCA AGATATATCACATGCATGCC CATTCATTATCTGGACATCAC AACAATCTACTTTTTTGGAAGA CCTCAAGGAAGAAAATGCTA ATGACCTGTGATATAATGATAC AAAGTCTCATATTTGGCTTC TTTGCACACAGAACACCTAT TATTATCAGTACCTGCTGCC AACAGAGTTGAAGAAACTTG CTAATATATTTTGCCAGACTG ACTTCCAATAATTCAGCAAC AGAGTTCTTTCCATGAGTCC ACAAAATCCAGATATGTCGT ATCTTGAAGTACTGGAGCAT TACATACAGTGACTGGCACT ATGTTTCATGTTTTTGGAC CACGCAACGTAGTAAGAGAG CCAACCTCTCTTTGATCAC GAAAGAAAGATTCTGGGGTC CAGGTCTGTTTGCTTCATTC TATTCCCTACGGAAACTAG CTTCATTTCAACTGATATGG Tamaño (pb) Tomado de 540 Williams y col., 1998 617 Williams y col., 1998 Modificado de Williams y col., 1998 526 Williams y col., 1998 344 Williams y col., 1998 Este trabajo 307 Este trabajo 319 Williams y col., 1998 274 Williams y col., 1998 422 Williams y col., 1998 466 Este trabajo 548 417 328 446 336 477 Modificado de Williams y col., 1998 Williams y col., 1998 Williams y col., 1998 Modificado de Williams y col., 1998 Este trabajo Williams y col., 1998 Williams y col., 1998 Este trabajo Williams y col., 1998 Williams y col., 1998 Modificado de Williams y col., 1998 518 Este trabajo 385 Este trabajo 497 Este trabajo 345 484 398 459 360 504 Este trabajo Jayandharan y col., 2005 Este trabajo Jayandharan y col., 2005 Jayandharan y col., 2005 Este trabajo Jayandharan y col., 2005 Modificado de Jayandharan y col., 2005 Modificado de Jayandharan y col., 2005 Jayandharan y col., 2005 Modificados de Jayandharan y col., 2005 33 14K1 14K 15A 15B 16A 16B 17A 17B 18A 18B 19A 19B 20A 20B 21A 21B 22A 22B 23A 23B 24A 24B 25A 25B 26A 26A2 26B1 26B 26C 26D 26E 26F Exón 14 Exón 15 Exón 16 Exón 17 Exón 18 Exón 19 Exón 20 Exón 21 Exón 22 Exón 23 Exón 24 Exón 25 Exón 26 Exón 26 Exón 26 Exón 26 y región 3´-UTR AACGGGAAATAACTCGTAC AAGAGTTTCAAGACACCTTG AGATGAAGTGGTTAACTATGC GTGGGAATACATTATAGTCAG AGCATCCATCTTCTGTACCA TCAGTAGATTCCAGAATGACA TGTCATTCTGGAATCTACTGA CCACTCCCACAGATATACTC AGAGTATATCTGTGGGAGTGG CTTAAGAGCATGGAGCTTGT GCAAGCACTTTGCATTTGAG AGCAACCATTCCAGAAAGGA ACGTTGAGTACAGTTCTTGG ACTAATAGAAGCATGGAGATG GAATTTAATCTCTGTTTCTTTAC ATTGAATGTGATACATTTCC TAGTTTCAGGAGGTAGCACAT TGGAAGCTAAGAGTGTTTGTC GTCTTATGTAGATGTTGGATG AGTCTCAGGATAACTAGAACA CAGTGGAAGCTGCTCAGTAT CCCATAACCAAACTTCCTTG AGTGCTGTGGTATGGTTAAG GCTCTGAAAATTTGGTCATA GGTTTAATCCTGGACTACTG CACAAAGGTAGAAGGCAAG AGGACCTCTACTGAGGGTG CTCCATTTTGCAGATTGTC GTTTATTATCCTGATCAAGC AACCCTTCACAATCTTATG AGGAGGTCAGAAGAAAATTG GAGTGTCCATCTTGCTATTC 337 Este trabajo Jayandharan y col., 2005 349 Williams y col., 1998 526 Williams y col., 1998 493 413 Jayandharan y col., 2005 Modificado de Jayandharan y col., 2005 Modificado de Jayandharan y col., 2005 Jayandharan y col., 2005 342 Williams y col., 1998 315 Williams y col., 1998 162 Modificados de Williams y col., 1998 310 Este trabajo Modificado de Williams y col., 1998 350 Williams y col., 1998 363 Williams y col., 1998 370 356 542 793 800 Williams y col., 1998 Modificado de Williams y col., 1998 Jayandharan y col., 2005 Modificado de Jayandharan y col., 2005 Este trabajo Modificado de Williams y col., 1998 Williams y col., 1998 Modificado de Williams y col., 1998 Williams y col., 1998 Las distintas regiones a amplificar del gen fueron agrupadas según la temperatura de hibridación de cada cebador y del tamaño del producto a obtener, para hacer 13 grupos de PCR multiplex (M-PCR) (Tabla 6). Para cada reacción de PCR se emplearon 0,6 mM de dNTPs, 0,075 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen), 1X de buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 y 50 mM KCl) y 1 µM de cada cebador. Las concentraciones de MgCl 2 empleadas para cada grupo se indican en la Tabla 6. La amplificación de cada grupo se realizó siguiendo el siguiente esquema: 94 C por 5 min, 30 ciclos de 94 C por 40 segundos, Ta (Tabla 6) por 40 segundos y 72 C por 1 min, con una extensión final de 72 C por 10 min. 34 Tabla 6. Grupos de amplificación por M-PCR para el análisis por CSGE del gen completo del FVIII. Grupos GP-1 GP-2 GP-3 GP-4 GP-5 GP-6 GP-7 GP-8 GP-9 GP-10 GP-11 GP-12 GP-13 Cebadores 11/15/22 13/18 14E/14B/12 14C/9/2 8/17/25/4 26EF/P1/14D 1/7/24 y 5 16/6/23 P2/14A/14H/3 14J/10/21 26B/14G y 14F/14K 26CD/26ª 19/20 Tamaños (pb) 446/349/310 477/413 484/385/336 497/417/344 548/493/370/319 800/540/345 526/466/363/274 526/422/350 617/518/360/307 504/328/162 542/459 y 398/337 793/356 342/315 MgCl2 (mM) 4,0 3,5 3,75 3,5 4,25 3,5 3,5 y 1,5 3,5 4,75 4,0 2,0 2,5 2,5 Ta (C) 55 57 55 55 57 58 58 y 53 58 58 55 58 57 57 Los productos obtenidos de cada una de las M-PCR fueron corridos en geles de agarosa al 2,5 % y analizados posteriormente mediante CSGE para detectar la presencia de alteraciones en la secuencia de ADNg, como se describe a continuación. IV.8 Análisis mediante CSGE Los productos de PCR obtenidos de la Sección IV.7, fueron mezclados con una cantidad igual de un producto de PCR de un ADNg control y tratados para formar heterodúplex (98 °C x 5 min, 68 °C x 1 h, temperatura ambiente x 30 min). Esta mezcla de pacientes/control fue corrida en geles de alta sensibilidad y ligeramente desnaturalizantes, compuestos por 12,5 % de poliacrilamida (acrilamida-bisacrilamida 99:1), 10 % de etilenglicol y 15 % de formamida en buffer TTE 1X (89 mM Tris, 15 mM Taurina y 0,5 mM EDTA pH 9). El buffer de carga utilizado para cargar las muestras estuvo compuesto de 20 % etilenglicol, 30 % formamida y 0,025 % de xilencianol y azul de bromofenol. El buffer de corrida de la cámara superior utilizado fue TTE 0,25X y el de la cámara inferior TTE 1X (Ganguly y col., 1993). La corrida electroforética se llevó a cabo en una cámara de secuenciación estándar a 600 V durante 18 horas. Una vez finalizadas las corridas electroforéticas, los geles fueron teñidos mediante tinción con nitrato de plata, tal como se describe en el apartado IV.13. La presencia de dos o más bandas en un producto de PCR fue indicativa de la presencia de una mutación en la secuencia de ADN analizada. Para verificar que efectivamente había una mutación en la secuencia de ADN analizada de los pacientes, aquellos productos en los que se 35 observó la presencia de un heterodúplex, fueron enviados para su secuenciación automatizada al Centro de Secuenciación y Análisis de Ácidos Nucleicos (CeSAAN) del IVIC. De esta manera, mediante el uso de los programas DNAMAN y “DNA for Windows” disponibles gratuitamente en la web, se pudo analizar directamente la secuencia de ADN de cada paciente y compararla con la secuencia reportada en la base de datos (NCBI), pudiendo identificar así la alteración genética presente en cada caso. IV.9 Determinación del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G La detección de la presencia del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G presente en la región promotora del gen IL10 se realizó mediante PCR touchdown. Para ello, se diseñaron los siguientes cebadores: IL10G-F 5´-GGAAGGTGAAGGCTCAATC-3´ (sentido) e IL10G-R 5´GATGGGGTGGAAGAAGTTG-3´ (antisentido), que amplifican un fragmento de 315 pb que contiene al microsatélite IL10G de 43 pb. La PCR se realizó utilizando 0,2 mM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 0,05 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen), 1X de buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 y 50 mM KCl), 1 µM de cada cebador y 60 ng de ADNg. Por su parte, las condiciones de amplificación para la PCR touchdown incluyeron: un paso de desnaturalización a 94 ºC por 5 minutos; 9 ciclos de 94 ºC por 40 segundos, 65 ºC por 40 segundos y 72 ºC por 1 minuto, donde en cada ciclo la temperatura de hibridación baja 1 ºC; 26 ciclos de 94 ºC por 40 segundos, 60 ºC por 40 segundos y 72 ºC por 1 minuto; y un paso de extensión final a 72 ºC por 5 minutos. Los productos de PCR obtenidos fueron corridos en geles de agarosa al 3 % para determinar el tamaño estimado del microsatélite. Aquellas muestras que tuvieron un tamaño similar a 406 pb, fueron enviadas a secuenciar al CeSAAN y posteriormente, fueron analizadas in silico para corroborar la presencia específica del alelo 134 pb. IV.10 Detección del polimorfismo -1082GA en el gen IL10 La detección del polimorfismo -1082GA en la región promotora del gen IL10 se realizó mediante PCR alelo específica (AS-PCR). Para ello, se utilizaron los cebadores descritos por Karhukorpi y colaboradores (2001), donde se emplea un cebador específico para cada alelo además de un cebador común (Tabla 7). Las reacciones se llevaron a cabo en tubos separados, ya que cada producto alelo específico posee el mismo tamaño, correspondiente a 161 pb. 36 Adicionalmente, se empleó el cebador IL10G-F (Sección IV.8) que junto al cebador común, amplifica un fragmento de 349 pb que sirve como control interno de la PCR. La reacción de amplificación se realizó utilizando 0,2 mM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 0,05 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen), 1X de buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 y 50 mM KCl), 1 µM de los cebadores alelo específicos y cebador común, 0,75 µM del cebador control IL10G-F y 60 ng de ADNg. Tabla 7. Lista de cebadores empleados para la detección del polimorfismo -1082G>A y tamaño de los productos de PCR obtenidos. Cebador Secuencia 5´→ 3´ Normal 1082G Mutado 1082A IL10G-F Común 1082 AACACTACTAAGGCTTCTTTGGGTG AACACTACTAAGGCTTCTTTGGGTA GGAAGGTGAAGGCTCAATC GTAAGCTTCTGTGGCTGGAGTC Tamaño obtenido con el cebador común (pb) 161 161 349 - Por su parte, las condiciones de amplificación para la AS-PCR incluyeron: un paso de desnaturalización a 94 ºC por 5 minutos; 35 ciclos de 94 ºC por 40 segundos, 63 ºC por 40 segundos y 72 ºC por 45 segundos; y un paso de extensión final a 72 ºC por 5 minutos. Posteriormente, los productos de AS-PCR obtenidos fueron corridos en geles de agarosa al 2,5 % para determinar así los genotipos. IV.11 Detección del polimorfismo -308GA en el gen TNFA La detección del polimorfismo -308GA en la región promotora del gen que codifica para el TNF se llevó a cabo mediante amplificación por PCR y posterior RFLP (Restriction fragment length polymorphism) con la enzima de restricción NcoI. Los cebadores utilizados para la amplificación de la región que contiene el polimorfismo fueron 5´- AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT -3´ (sentido) y 5´-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3´ (antisentido), los cuales generan un producto de 107 pb (Barber y col., 1999). La amplificación por PCR se realizó utilizando 0,2 mM de dNTPs, 1,5 mM de MgCl2, 0,05 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen), 1X de buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,4 y 50 mM KCl), 1 µM de cada cebador y 60 ng de ADNg. Las condiciones de amplificación incluyeron: un paso de desnaturalización a 94 ºC por 5 minutos; 30 ciclos de 94 ºC por 40 segundos, 62 ºC por 40 segundos y 72 ºC por 30 segundos; y un paso de extensión final a 72 ºC por 5 minutos. 37 La digestión enzimática del producto de PCR se realizó 37 ºC durante toda la noche, empleando 0,25 U de enzima NcoI (Promega), 1X de buffer (6 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,15 M NaCl, 6 mM MgCl2 y 1 mM DTT) y 0,1 mg/mL de BSA. Para determinar el genotipo de cada muestra, los productos digeridos fueron corridos electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 8 % (0,04 % de persulfato de amonio, 8 % de acrilamida-bisacrilamida 29:1 y 0,07 % de TEMED) en buffer TAE 1X (40 mM de Tris acetato, 1mM de EDTA), según Sambrook y colaboradores (2001). Los productos de digestión se mezclaron con buffer de carga 1X (5 % de glicerol, 0,04 % de azul de bromofenol y 0,04 % de xilencianol) y se corrieron en una cámara vertical modelo EC120 (Thermo EC) a un voltaje constante máximo de 150 V y 25 mA, durante 30 minutos. La pre-corrida se realizó bajo las mismas condiciones durante 15 minutos. Una vez finalizada la corrida electroforética, los geles fueron teñidos mediante tinción con nitrato de plata, tal como se describe más adelante. IV.12 Electroforesis en geles de agarosa Las corridas electroforéticas en geles de agarosa se realizaron cargando una mezcla del ácido nucleico (ADNg, digestiones y productos de PCR) con buffer de carga 1X (5 % de glicerol, 0,04 % de azul de bromofenol y 0,04 % de xilencianol), en geles de agarosa a la concentración correspondiente, preparados en buffer TAE 0,5X (20 mM de Tris acetato, 0,5 mM de EDTA) (Sambrook y col., 2001). Las corridas se realizaron en tampón buffer TAE 0,5X utilizando una cámara horizontal Gel XL Ultra V-2 (Labnet). Los geles fueron teñidos con una solución de Sybr Safe al 0,5X y visualizados mediante fluorescencia indirecta a 302 nm en el transiluminador del equipo Fotodyne. IV.13 Tinción con Nitrato de Plata de los geles de poliacrilamida Los geles de poliacrilamida empleados para los análisis mediante RFLP y CSGE fueron teñidos con una solución de nitrato de plata para su visualización. Para ello, los geles fueron tratados consecutivamente con tres soluciones: una solución fijadora (ácido acético al 10 %) por 10 minutos, una solución de impregnación (nitrato de plata al 0,15 %) por 15 minutos y una solución reveladora (formaldehido al 0,05 % y NaOH al 1,5 %) hasta la visualización de las bandas (Brandt y col., 1992). Los geles fueron lavados con agua desionizada luego de la aplicación de cada solución. 38 IV.14 Análisis estadístico de los datos obtenidos Para relacionar la presencia del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G y del polimorfismo -1082G>A en el gen IL10, así como del polimorfismo -308GA en el gen TNFA con el desarrollo de inhibidores, se determinaron los valores de Odds Ratio (OR) para cada genotipo mediante el uso del programa Statcalc versión 6 (EpiInfo). El OR es la razón de los productos cruzados de los tres genotipos para cada uno de los polimorfismos estudiados, tanto en los individuos que desarrollaron inhibidores como en los que no. Por lo tanto, el OR corresponde al cociente del Odds de un evento A entre el Odds de un evento B, y se define como: Odds (A) Odds Ratio = -------------Odds (B) Un Odds se define como el cociente entre la probabilidad de que un evento ocurra frente a la probabilidad de que no ocurra. De esta manera, si el OR de un evento es igual a 1, existe igual probabilidad de que el evento ocurra y de que no ocurra (P(A) = P(no A) = 0,5). Si el OR 1 implica que existe mayor probabilidad que el evento ocurra, y esa probabilidad es mayor cuanto más grande es el valor. De manera inversa, si el OR 1, es más probable que el evento no ocurra (Bulla, 1998). IV.15 Análisis in silico de las mutaciones de pérdida de sentido Para determinar la conservación de los aminoácidos involucrados en cada una de las mutaciones de pérdida de sentido encontradas, se realizó el alineamiento de las secuencias reportadas del FVIII en el Gene Bank para humano (Homo sapiens, NP_000123), toro (Bos taurus, NP_001138980), perro (Canis lupus familiaris, AAB87412), cochino (Sus scrofa, NP_999332), conejo (Oryctolagus cuniculus, ACA42556), ratón (Mus musculus, NP_032003), rata (Rattus norvegicus, NP_899160) y pez (Takifugu rubripes, NP_001027922), mediante el uso del programa DNAMAN. El posible efecto de las mutaciones de pérdida de sentido encontradas sobre el FVIII, fue analizado realizando el modelado tridimensional de la proteína mediante el uso del programa UCSF Chimera, versión 1.4, disponible gratuitamente en la web. Para ello, se empleó la estructura cristalizada del FVIII disponible en la base de datos de proteínas (PDB, Protein Data Bank), bajo el número de registro 2R7E. 39 V. RESULTADOS V.1 Pacientes estudiados En el presente estudio se realizó el análisis molecular a partir del ADNg extraído de muestras de sangre de 55 pacientes de sexo masculino, no relacionados entre sí y diagnosticados con HAS en el Centro Nacional de Hemofilia, ubicado en el BMS. Las edades de los pacientes estuvieron comprendidas entre los 8 meses de edad y los 57 años, con un promedio de 16 ± 12 años. En la Tabla 8, se indican los pacientes analizados y si desarrollaron inhibidores o no frente al tratamiento con FVIII. Se puede observar que de los pacientes con HAS, 15 desarrollaron inhibidores de alta respuesta (27,3 %) y 2 inhibidores de baja respuesta (3,6 %). Tabla 8. Lista de pacientes estudiados y desarrollo de inhibidores. Código del paciente H-01 H-02 H-03 H-04 H-05 H-08 H-10 H-11 H-13 H-14 H-15 H-17 H-19 H-21 H-24 H-26 H-27 H-29 H-30 H-37 H-49 H-50 H-52 H-59 H-65 H-68 H-71 H-74 Desarrollo de inhibidores Código del paciente Desarrollo de inhibidores No H-75 AR AR H-76 No AR H-78 No No H-80 No No H-82 No AR H-88 No No H-92 No BR H-97 No No H-98 No AR H-99 AR No H-100 AR No H-101 No No H-103 No BR H-104 No No H-105 No No H-106 No AR H-115 AR No H-119 AR No H-122 AR AR H-125 AR No H-126 No No H-127 No No H-129 No No H-130 No AR H-131 No No H-135 No No H-138 No AR AR: inhibidores de alta respuesta. BR: inhibidores de baja respuesta. 40 V.2 Extracción del ADN genómico a partir de sangre Para el análisis molecular de los pacientes con HAS, se procedió inicialmente a la extracción del ADNg a partir de muestras de sangre total obtenidas en el BMS, de los 55 pacientes analizados, tal como se describió en el Marco Metodológico (IV.3). Una vez obtenido el ADNg, se procedió a su cuantificación espectrofotométrica, con lo cual se pudo determinar la concentración de cada una de las muestras y con ello, calcular la cantidad necesaria a emplear para los distintos análisis moleculares. Asimismo, se procedió a la realización de la corrida electroforética en geles de agarosa al 0,8 % de 6 µL de cada uno de los ADNg extraídos, para verificar la calidad e integridad de las muestras. En la Figura 11 se observan algunas de las muestras analizadas, donde se puede apreciar un alto rendimiento y total integridad, indicado por la presencia de una sola banda de alto peso molecular (Carriles 1-3 y 6-8). Sin embargo, varios pacientes no fueron incluidos en el estudio, debido a que el ADNg se encontraba degradado (Carriles 4 y 5). Figura 11. Corrida electroforética de algunos ADNg obtenidos de pacientes con HAS. V.3 Determinación de la inv-int22 Una vez obtenido y cuantificado el ADNg de los pacientes con HAS, se procedió a la detección de la inversión del intrón 22 mediante la técnica de PCR inversa, tal como se describió previamente (Sección IV.5). La I-PCR es una variante de la PCR convencional, en la que los cebadores están orientados en sentido inverso, por lo cual al digerir el ADN y formar anillos intramoleculares mediante ligación, se puede amplificar un segmento compuesto por dos regiones que pueden estar sumamente distantes en el cromosoma (Figura 12). 41 Figura 12. Esquema de la técnica de I-PCR empleada para la detección de la inv-int22, en base a la metodología descrita por Rossetti y colaboradores (2005). En el caso de la inversión del intrón 22, los anillos de interés que se forman variarán en tamaño y composición dependiendo de si está presente o no la inversión, ya que una muestra formará un anillo de 21,5 Kpb cuando no está la inversión, y uno de 20 Kpb en presencia de la misma. Esta diferencia en tamaño se debe a que cuando ocurre la inversión, la región que queda fusionada al gen del FVIII posee un sitio de reconocimiento para la enzima BclI más cercano, de manera que el anillo que se forma es más pequeño. Adicionalmente al tamaño, la composición del anillo cambia producto de la inversión, por lo que la secuencia colindante en uno de los extremos al sitio BclI presente en el anillo será diferente. Esto permite que con el uso de cebadores específicos para cada secuencia se pueda determinar si la inversión está presente o no. De esta manera, si el paciente no posee la inversión, el anillo que se forma de 21,5 Kpb contiene las secuencias que hibridan con los cebadores IU e ID (Tabla 3), los cuales amplifican un producto de 487 pb (Figura 12). Si el paciente posee la inversión, el anillo de 20 Kpb formado contiene las secuencias que hibridan con los cebadores IU y ED (Tabla 3), que amplifican un producto de 559 pb (Figura 12). Así, el tamaño del producto de PCR obtenido 42 con los cebadores específicos indicará si la inv-int22 está presente o no en la muestra analizada (Rossetti y col., 2005). En la Figura 13, se muestra la corrida electroforética de los productos de I-PCR de algunas muestras de los pacientes analizados para la detección de la inv-int22. En ella se puede apreciar la banda de 559 pb en los carriles 5, 6 y 8, que es indicativa de la presencia de la inversión, así como la banda de 487 pb en los carriles 2, 3, 4 y 7 que indica su ausencia en esos pacientes. Figura 13. Corrida electroforética de los productos de I-PCR para la detección de la inv-int22. M: Marcador de peso molecular de 100 pb; la banda más intensa corresponde a 500 pb. Carriles 2-4 y 7, pacientes negativos para la inversión. Carriles 5-6 y 8, pacientes positivos para la inversión. La muestra del carril 1 no amplificó. Para confirmar que el producto de I-PCR obtenido efectivamente correspondiera con el producto de amplificación esperado, se escogieron 4 productos (2 positivos y 2 negativos para la inversión) para ser secuenciados. El análisis de las secuencias obtenidas permitió confirmar la amplificación específica de los productos esperados y corroboraron el diagnóstico de cada uno de los pacientes (Anexo II). De los 55 pacientes con HAS analizados, se encontró que 22 de ellos eran positivos para la inv-int22, lo cual representa una frecuencia del 40 %. De estos pacientes, el 36,4 % desarrolló inhibidores de alta respuesta contra el tratamiento (8/22) (Tablas 8 y 9). Tabla 9. Lista de pacientes positivos para la presencia de la inversión del intrón 22. Pacientes positivos para la inv-int22 H-02 H-74 H-100 H-122 H-03 H-78 H-101 H-130 H-04 H-88 H-103 H-131 H-14 H-92 H-105 H-138 H-19 H-98 H-106 H-59 H-99 H-119 43 V.4 Determinación de la inv-int1 A los 33 pacientes que dieron negativos para la presencia de la inv-int22, se les realizó la determinación de la presencia de la inv-int1, la segunda alteración más frecuente en pacientes con HAS. Como se describió anteriormente, en el caso de esta inversión las copias homólogas involucradas en la recombinación (int1h-1 e int1h-2) son mucho más pequeñas que aquellas involucradas en la inv-int22 (1,9 Kpb vs. 9,5 Kpb), por lo cual su detección puede llevarse a cabo mediante una PCR convencional. En este caso, se realizan dos reacciones de PCR por cada muestra, en las que se amplifican cada una de las dos copias homólogas involucradas en la recombinación. Para la amplificación por PCR de cada una de las regiones homólogas, se emplearon tres juegos de cebadores en dos reacciones separadas (dos comunes y uno específico), que amplifican dos fragmentos de tamaño específico y permiten discernir entre la presencia o ausencia de la inversión en ambas regiones (Bagnall y col., 2002). De esta manera, si un paciente no posee la inversión, en la región homóloga int1h-1 los cebadores 9F y 9cR acotan una región de 1.908 pb, mientras que en la región homóloga int1h-2 los cebadores Int1h-2F e Int1h-2R acotan una región de 1.191 pb (Figura 14; Tabla 4). En presencia de la inversión, los tamaños de los productos obtenidos para ambas regiones se invierten, debido a que el cebador 9F ahora amplifica un producto con el cebador Int1h-2R en la región int1h-1 y el cebador Int1h2F amplifica con el cebador 9cR en la región int1h-2 (Figura 14). Figura 14. Esquema de la PCR para la detección de la inv-int1. Ver explicación en el texto. En la Figura 15, se muestra la corrida electroforética de los productos de PCR obtenidos para la detección de la inv-int1 de algunas muestras de los pacientes analizados. Se puede observar como todos los pacientes (carriles 1 al 6) poseen la banda de 1.908 pb cuando se 44 amplificó la región homóloga int1h-1 y la banda de 1.191 pb cuando se amplificó la región homóloga int1h-2, por lo cual ninguno de estos pacientes fue positivo para la inv-int1. Figura 15. Corrida electroforética de los productos de PCR para la detección de la inv-int1. M: marcador de peso molecular de 1 Kpb. Carriles 1 al 6, muestras de los pacientes analizados. Carril izquierdo de cada muestra: región int1h-1; Carril derecho de cada muestra: región int1h-2. De los 33 pacientes analizados que fueron negativos para la inv-int22, ninguno fue positivo para la presencia de la inv-int1, por lo que la frecuencia de la mutación en este estudio fue del 0 %. V.5 Amplificación del gen del FVIII En aquellos pacientes que no se detectaron las inversiones inv-int22 ni inv-int1, se procedió al análisis del gen completo del FVIII mediante amplificación por PCR. Para ello, previamente se analizaron los cebadores reportados por otros investigadores (Jayandharan y col., 2005; Williams y col., 1998), que permiten la amplificación de la región promotora del gen, los 26 exones y las regiones intrónicas aledañas a los exones, así como de la región 3´- no traducida. Los cebadores se ubicaron en la secuencia reportada del gen en la base de datos NCBI (número de acceso: NG005114), se verificó la homología mediante análisis en BLASTn y se compararon las características de cada par de cebadores mediante el uso del programa Oligo Explorer v.1.1.2. El resultado de dicho análisis permitió corregir y diseñar nuevos cebadores más específicos y con mejores características (Tabla 5, Sección IV.7). En total, se emplearon 40 pares de cebadores que fueron agrupados, según el tamaño del producto que generan y la temperatura de hibridación, en 13 grupos para realizar PCR múltiples (M-PCR) (Tabla 6, Sección IV.7), permitiendo así la amplificación simultánea de 2, 3 ó 4 regiones. En la Figura 16, se muestra la corrida electroforética de los productos de M-PCR obtenidos de la amplificación del GP-8 para las muestras de algunos de los pacientes 45 analizados, donde puede observarse la amplificación simultánea de las 3 bandas esperadas, correspondientes a los exones 16, 6 y 23 (carriles 1 al 9). Figura 16. Corrida electroforética de los productos de M-PCR del grupo GP-8. M: marcador de peso molecular de 100 pb. Carriles 1 al 9, muestras de pacientes con HAS. C-, control negativo. Banda superior: exón 16, de 526 pb; banda intermedia: exón 6, de 422 pb; banda inferior: exón 23, de 350 pb. La amplificación pudo realizarse de manera exitosa en todos los casos, excepto en aquellos donde se determinó la presencia de deleciones grandes. La falla repetida en la amplificación de exones particulares en los grupos de M-PCR fue indicativa de la presencia de una deleción que abarca dicha región. Dado que en cada grupo se analizan diferentes exones, la ausencia de una banda en el producto de M-PCR es indicativa de la deleción del exón correspondiente a esa banda, ya que la presencia de los otros productos de M-PCR en la misma reacción actúa como control positivo. Asimismo, ya que en cada grupo de M-PCR se amplifican exones que no necesariamente son consecutivos a su ubicación en el gen, en cada uno de los casos en que se encontraron deleciones grandes, la ausencia de las bandas correspondió con la extensión final de la deleción. En la Figura 17, se muestra la corrida electroforética de los productos de M-PCR del GP-6, en la que se puede observar la falla en la amplificación de la región 14D (exón 14) en las muestras de los carriles 5 y 9. El análisis de las M-PCRs permitió detectar en 3 de los pacientes con HAS la presencia de deleciones grandes, las cuales abarcan desde 6 hasta 8 exones del gen del FVIII. Este tipo de alteraciones representó una frecuencia del 5,5 % de todas las mutaciones encontradas. Específicamente, se determinó que el paciente H-21 posee una deleción que abarca desde el exón 14 hasta el exón 22; el paciente H-65 una deleción que incluye toda la región promotora del gen hasta el exón 6; y el paciente H-75 posee una deleción que va desde el exón 7 hasta el exón 14 del gen. Los tres pacientes desarrollaron inhibidores, el primero de baja respuesta y los dos restantes, de alta respuesta (Tabla 8). 46 Figura 17. Corrida electroforética de los productos de M-PCR del grupo GP6. M: marcador de peso molecular de 100 pb. Carriles 1 al 11, muestras de pacientes con HAS. C-, control negativo. En los carriles 5 y 9 se puede observar la deleción de la región 14D en los pacientes H-21 y H-75, respectivamente. Banda superior: exón 26 región EF, de 800 pb; banda intermedia: región P1, de 540 pb; banda inferior: exón 14 región D, de 345 pb. V.6 Análisis mediante CSGE Los productos obtenidos de la amplificación por M-PCR de cada grupo, que en conjunto abarcan todos los exones, la región promotora y región 3´-no traducida del gen del FVIII, fueron analizados mediante la técnica de CSGE, con la finalidad de detectar otras mutaciones. Esta técnica, descrita por Ganguly y colaboradores (1993), consiste en la formación de heterodúplex en los productos de PCR que poseen un cambio en la secuencia, de manera que al realizar corridas electroforéticas en geles ligeramente desnaturalizantes, migran diferencialmente con respecto a los homodúplex. La formación de los heterodúplex es posible gracias a que las hebras de ADN luego de ser desnaturalizadas, se renaturalizan al azar formando heterodúplex entre alelo normal/alelo mutado, además de los homodúplex compuestos por alelo normal/alelo normal y alelo mutado/alelo mutado. Los heterodúplex no hibridan en el sitio donde está presente una mutación, de manera que se forma una burbuja en esa región del producto amplificado, que provocará un cambio en su movilidad y en la corrida electroforética. La ubicación del gen del FVIII en el cromosoma X implica que los hombres sólo posean un alelo del gen y por ende, no formen heterodúplex en presencia de una mutación. Para la formación de heterodúplex fue necesario entonces mezclar cada producto de PCR obtenido de cada paciente con una cantidad igual de producto de un ADN control, antes de llevar a cabo la desnaturalización y renaturalización. Los ADN control utilizados fueron de mujeres sanas sin historia familiar de HA, que fueron amplificados y analizados previamente por CSGE para garantizar que todos los fragmentos a utilizar con los productos de PCR de los pacientes no 47 formaran heterodúplex, de manera tal que cuando se observara un cambio en la corrida electroforética, sea por cambios en la secuencia de ADN del paciente. En la Figura 18, se muestra la corrida electroforética mediante CSGE de algunos productos de M-PCR del GP-5 obtenidos de los pacientes con HAS, en la que se puede observar la aparición de dos o más bandas en algunos de los productos de PCR, que son indicativos de la presencia de heterodúplex en dicho producto (Carriles 1 y 5 -banda superior-, y carril 18 –banda inferior-). Figura 18. Análisis por CSGE de los productos de M-PCR del GP-5 de pacientes con HAS. Carriles 1 al 20, muestras de pacientes con HAS. Banda superior, exón 17; Banda inferior, exón 8. Los exones 25 y 4 no se muestran en esta figura. Los heterodúplex presentes (indicados con un asterisco *) en los carriles 1, 5 y 18 corresponden a los pacientes H-13, H-37 y H-135, respectivamente. De las muestras de los 30 pacientes con HAS que fueron analizados mediante CSGE, se detectaron cambios únicos en la corrida electroforética en 26 de ellos (86,7 %). En los cuatro pacientes restantes no se observaron heterodúplex (H-15, H-24, H-30 y H-115), por lo que la mutación causante de la HA no pudo ser determinada. Los fragmentos que generaron heterodúplex detectados mediante CSGE fueron secuenciados y su análisis permitió identificar cambios en todos los casos, con lo cual se pudo identificar cada una de las mutaciones presentes. Asimismo, se encontraron 3 polimorfismos presentes en estos pacientes: 3864A>C, 8348A>G, e IVS7 -27 G>A. El polimorfismo 3864A>C encontrado en el exón 14 del gen, no tiene efecto sobre la proteína, ya que mantiene la Ser en la posición 1296 intacta (mutación sinónima). Por su parte, el polimorfismo 8348A>G está presente en la región 3´-no traducida del gen, mientras que el IVS7 -27 G>A está presente dentro del intrón 7. La frecuencia genotípica de los polimorfismos en la población analizada fue de 0,241, 0,552 y 0,138, respectivamente. 48 En la Tabla 10 se indican las mutaciones encontradas por CSGE en las muestras de los pacientes con HAS analizados. La nomenclatura utilizada para reportar las mutaciones se basa en la secuencia de la proteína madura, donde el +1 es el primer aminoácido de la forma madura y la metionina representa el aminoácido -19. De manera similar, la numeración de los nucleótidos se basa en la secuencia del ARNm, donde el nucleótido +1 representa la adenina del ATG. Tabla 10. Mutaciones encontradas en los pacientes con HAS mediante la técnica de CSGE y secuenciación. Paciente Mutación Tipo de mutación Exón H-05 H-10 H-27 H-29 H-37 H-71 H-76 H-82 H-135 H-17 H-49 H-129 H-50 H-126 H-125 H-68 H-80 H-11 H-13 H-52 H-97 H-104 H-01 H-26 H-127 R1696X R2307X R1966X R427X E1896X R2147X S853X Q1079X S524X del_G 6535 Sin sentido Sin sentido Sin sentido Sin sentido Sin sentido Sin sentido Sin sentido Sin sentido Sin sentido Deleción 14 26 18 9 17 23 14 14 11 23 Dominio del FVIII B C2 A3 A2 A3 C2 B B A2 C2 del_A 3628-3637 Deleción 14 B del_TTGT 209-212 Deleción 2 A1 del_G 3006 ins_A 5466-5471 ins_A 2940-2945 G1994R C1858Y M2238V L172F G2325D IVS10 -2 A>T IVS13 -1 G>A IVS24 -1 G>A Deleción Inserción Inserción Pérdida de sentido Pérdida de sentido Pérdida de sentido Pérdida de sentido Pérdida de sentido Empalme Empalme Empalme 14 16 14 19 17 25 4 26 11 14 25 B A3 B A3 A3 C2 A1 C2 A2 B C2 Desarrollo de Inhibidores No No AR No AR No No No No No No No No No AR No No BR No No No No No No No # Reportes* 5 48 18 9 0 25 2 1 0 0 60 2 0 0 8 1 0 5 1 1 0 1 2 *Número de reportes en la base de datos HAMSTeRS, o en la literatura. V.6.1 Mutaciones sin sentido Las mutaciones del tipo sin sentido, donde cambia un aminoácido por un codón de terminación, fueron las mutaciones puntuales más frecuentes encontradas en los pacientes con HAS, ya que se encontraron presentes en 9 pacientes, que representan un 36 % del total de 49 mutaciones puntuales y un 16,7 % del total de mutaciones encontradas en los pacientes con HAS. Las mutaciones E1896X y S524X no están reportadas en la base de datos HAMSTeRS ni en la literatura, por lo que representan 2 nuevas mutaciones sin sentido asociadas con HAS. Como se describió anteriormente, los pacientes con este tipo de mutaciones tienen un riesgo mayor de desarrollar inhibidores que aquellos con otros tipos de mutaciones puntuales, como las de pérdida de sentido, deleciones o inserciones pequeñas y mutaciones que afecten el empalme. De los 30 pacientes con HAS analizados por CSGE, 6 desarrollaron inhibidores de alta respuesta, de los cuales 2 tienen mutaciones del tipo sin sentido (pacientes H-27 y H-37). De esta manera, la frecuencia de inhibidores dentro de los pacientes con este tipo de mutaciones fue del 22 %. V.6.2 Deleciones / Inserciones pequeñas Las deleciones o inserciones pequeñas (<50 pb), fueron el segundo tipo de mutaciones puntuales más frecuentemente encontradas en los pacientes con HAS, ya que estuvieron presentes en 8 pacientes. Esto representa un 32 % del total de las mutaciones puntuales y un 14,8 % del total de mutaciones encontradas en los pacientes con HAS. Las deleciones del_A 3628-3637 y del_TTGT 209-212 estuvieron presentes en dos pacientes, por lo que fueron las deleciones más comunes encontradas. Por otro lado, las deleciones del_G 3006 y del_G 6535, así como la inserción ins_A 5466-5471 se reportan por primera vez en este trabajo. En todos los casos analizados, las deleciones/inserciones conllevaron a la corrida del marco de lectura y a la formación de un codón de terminación prematuro, que generaron proteínas truncadas. El codón de terminación se generó antes de los 10 aminoácidos siguientes al sitio donde ocurrió la deleción/inserción en cada uno de los casos. Un sólo paciente con este tipo de mutaciones desarrolló inhibidores de alta respuesta, por lo que la frecuencia para la presencia de inhibidores en este tipo de mutaciones fue del 12,5 %. V.6.3 Mutaciones de pérdida de sentido Las mutaciones de pérdida de sentido representaron el 20 % del total de mutaciones puntuales y el 9,3 % del total de mutaciones causantes de HAS, ya que se encontraron 5 pacientes con mutaciones de este tipo. La mutación M2238V es la única que ha sido reportada más de una vez en la base de datos, mientras que la mutación C1858Y se reporta por primera 50 vez en este trabajo. El paciente H-11 que posee la mutación G1994R, es el único que desarrolló inhibidores del tipo de baja respuesta. Dicha mutación pudo ser corroborada al analizar uno de los hermanos del paciente, el cual no desarrolló inhibidores contra el tratamiento. El análisis in silico de las mutaciones de pérdida de sentido encontradas en este estudio, fue realizado con la finalidad de determinar el posible efecto de cada una de ellas sobre la estructura/función de la proteína. Dichos resultados se muestran en la sección de discusión (Sección VI.3.3.3). V.6.4 Mutaciones que afectan el empalme del ARNm De las mutaciones encontradas en los pacientes con HAS, tres casos presentaron mutaciones que conllevaron a la pérdida del sitio aceptor para el empalme del ARNm, por lo que los exones fueron probablemente removidos como parte del intrón. Este tipo de mutaciones representa el 12 % del total de mutaciones puntuales encontradas y el 5,5 % del total de mutaciones en los pacientes con HAS. La mutación IVS10 -2 A>T encontrada en el paciente H01 no ha sido reportada previamente. Ninguno de los tres pacientes presentó inhibidores contra el tratamiento. En total, se encontraron 7 mutaciones nuevas en los pacientes con HAS no reportadas previamente. En la Figura 19, se muestra un resumen gráfico de las mutaciones encontradas mediante la técnica de CSGE en los pacientes con HAS analizados, donde se puede observar que las mutaciones puntuales más frecuentes fueron las del tipo sin sentido y las deleciones/inserciones pequeñas, posteriormente las mutaciones de pérdida de sentido, y por último, las mutaciones que afectan el empalme del ARNm. 12,0% 20,0% Mutaciones sin sentido 36,0% Deleciones/Inserciones Mutaciones de pérdida de sentido 32,0% Mutaciones que alteran el empalme del ARNm Figura 19. Porcentaje de los diferentes tipos de mutaciones puntuales encontradas en los pacientes con HAS mediante la técnica de CSGE. 51 V.7 Determinación del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G A todas las muestras de los pacientes con HAS que fueron incluidos en este estudio, se les realizó el análisis molecular para la detección del alelo 134 pb del microsatélite IL10G presente en la región promotora del gen que codifica para la IL10, ya que son estos pacientes quienes tienen más probabilidad de desarrollar inhibidores frente al tratamiento con FVIII exógeno, tal como se describió previamente. La determinación del alelo 134 pb se realizó mediante PCR convencional, ya que el tamaño del producto de PCR obtenido puede indicar la presencia de dicho alelo. Así, al emplear cebadores que acoten al microsatélite, el tamaño del producto obtenido variará de acuerdo al número de repeticiones presentes. En la región contentiva del microsatélite se pueden presentar múltiples alelos, sin embargo, son de interés para este estudio aquellas muestras que presentaron un tamaño similar a 406 pb, que es indicativo de la presencia del alelo 134 pb, el cual ha sido asociado con el desarrollo de inhibidores. En la Figura 20, se muestra la corrida electroforética de los productos de PCR obtenidos de las muestras de algunos de los pacientes con HAS analizados, en la que puede observarse como las bandas obtenidas difieren en tamaño entre cada paciente y entre cada alelo de un mismo paciente. No obstante, ninguno de los 55 pacientes analizados mostró una banda cercana a los 400 pb, por lo que no se evidenció la presencia del alelo 134 pb. Figura 20. Corrida electroforética de los productos de PCR para la detección del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G en pacientes con HAS. M: Marcador de peso molecular de 100 pb. Carriles 1 al 12, productos obtenidos de algunos pacientes con HAS. 52 V.8 Determinación del polimorfismo -1082G>A en el gen IL10 Por su parte, a todas las muestras de los pacientes con HAS analizados, se les realizó el análisis molecular para la detección del polimorfismo -1082G>A presente en la región promotora del gen que codifica para la IL10, ya que aquellos pacientes que posean el alelo de riesgo -1082G tendrán más probabilidad de desarrollar inhibidores frente al tratamiento con FVIII exógeno, tal como se describió previamente. La determinación del polimorfismo -1082G>A se realizó mediante AS-PCR, de manera que la amplificación o no de cada alelo indica el genotipo del paciente. Adicionalmente, se empleó un cebador sentido adicional que sirvió como control positivo de la reacción, de manera que la falla en la amplificación del producto alelo específico, indica la ausencia de dicho alelo en el paciente. En la Figura 21, se muestra la corrida electroforética de los productos de ASPCR obtenidos de las muestras de algunos de los pacientes con HAS analizados, en la que puede observarse un genotipo heterocigoto (GA) en los carriles 2 y 3, y un genotipo homocigoto mutado (AA) en el carril 1. Figura 21. Corrida electroforética de los productos de AS-PCR obtenidos de los pacientes con HAS. M: marcador de peso molecular de 100 pb; Carriles 1: muestra de un paciente homocigoto mutado (AA); carril 2 y 3: muestras de pacientes heterocigotos (GA); carril 4: control positivo heterocigoto; carril 6: control negativo de la AS-PCR. Carril izquierdo de cada muestra: alelo G; Carril derecho de cada muestra: alelo A. Del total de pacientes con HAS analizados, tan sólo 5 presentaron el alelo de riesgo G, lo cual representa una frecuencia alélica de 0,286 y una frecuencia genotípica de 0,082. De los 50 pacientes restantes, 22 fueron heterocigotos (GA) y 28 homocigotos mutados (AA), representando una frecuencia genotípica de 0,408 y 0,510, respectivamente. De los pacientes con HAS que desarrollaron inhibidores contra el tratamiento, 5 presentaron el alelo -1082G en forma heterocigótica. La frecuencia del alelo G en los pacientes con inhibidores fue mucho menor que la encontrada en los pacientes sin inhibidores (0,165 vs. 53 0,340). Por ello, para determinar la posible asociación de este polimorfismo con el desarrollo de inhibidores, se realizó el cálculo del OR, el cual fue de 0,39 (IC 95% 0,21-0,71 p=0,001). Tal como se indica, el alelo -1082G estuvo asociado significativamente con la ausencia de inhibidores, por lo que podría ejercer un efecto protector. V.9 Determinación del polimorfismo -308G>A en el gen TNFA Otro de los polimorfismos asociados al desarrollo de inhibidores es el -308G>A presente en la región promotora del gen TNFA. De igual manera que en los casos anteriores, los pacientes con HAS fueron analizados para determinar la presencia de este polimorfismo y su posible asociación con el desarrollo de inhibidores. La detección del polimorfismo se realizó mediante PCR-RFLP, y los genotipos pudieron determinarse de acuerdo al tamaño de los productos de digestión obtenidos. De esta manera, cuando el alelo normal -308G está presente, la enzima de restricción reconoce la secuencia y genera dos fragmentos (87 y 20 pb). En cambio, si el alelo mutado -308A está presente, el sitio de reconocimiento para la enzima se pierde y por lo tanto, se observa únicamente la banda de 107 pb. Si el paciente analizado es heterocigoto para el polimorfismo, se observan las tres bandas correspondientes a 107, 87 y 20 pb. En la Figura 22, se muestra el resultado obtenido de la corrida electroforética de algunas de las muestras de digestión obtenidas para la detección del polimorfismo -308G>A en los pacientes con HAS, en la que se puede observar el patrón de bandas correspondientes a un genotipo homocigoto normal (GG) en los carriles 1-2, 4-5 y 7-8, así como el patrón de bandas correspondientes con un genotipo heterocigoto (GA), en los carriles 3 y 6. Figura 22. Corrida electroforética de los productos de digestión para la detección del polimorfismo -308G>A en el gen TNFA en pacientes con HAS. SD: producto de PCR sin digerir; Carriles 1-2, 4-5 y 7-8, muestras con genotipo homocigoto normal (GG); Carriles 3 y 6, muestras con genotipo heterocigoto (GA). 54 De los 55 pacientes con HAS analizados, 13 presentaron el alelo de riesgo A en forma heterocigótica, lo cual representa una frecuencia genotípica de 0,255 y una frecuencia alélica de 0,127. No se encontraron pacientes homocigotos mutados (AA) para el polimorfismo. Por otro lado, de los pacientes que desarrollaron inhibidores tan sólo 3 presentaron el alelo de riesgo -308A, lo cual representa una frecuencia de 0,090. La frecuencia obtenida en los pacientes con HAS que no desarrollaron inhibidores fue ligeramente mayor, con un valor de 0,145. Para poder determinar si existe una asociación entre el polimorfismo -308 G>A y el desarrollo de inhibidores, se realizó el cálculo del OR, el cual mostró un valor de 0,54 (IC 95 % 0,26 – 1,10 p=0,066). Aunque se observa una tendencia a que el alelo de riesgo A podría ejercer un efecto protector, el valor obtenido no fue estadísticamente significativo. Luego de realizado el análisis molecular a los 55 pacientes con HAS, se pudo determinar la mutación causante de la patología en el 92,7 % de los casos. Las principales alteraciones genéticas encontradas fueron aquellas que conducen a la formación de proteínas truncadas, como la inv-int22, las mutaciones sin sentido y las deleciones e inserciones pequeñas. De las mutaciones puntuales encontradas, se reportan 7 mutaciones nuevas que no habían sido reportadas previamente. Por otro lado, el tipo de mutación presente en el gen del FVIII que tuvo mayor asociación con el desarrollo de inhibidores fue las deleciones grandes, ya que el 100 % de los pacientes con este tipo de alteración los desarrollaron. Por su parte, el alelo -1082A del gen IL10 se asoció significativamente con el desarrollo de inhibidores en los pacientes con HAS, a diferencia de los otros polimorfismos analizados. 55 VI. DISCUSIÓN La respuesta fisiológica del organismo frente a daños en un vaso sanguíneo, es la activación secuencial de las proteínas plasmáticas que actúan como proteasas en el proceso de coagulación sanguínea, que conllevan a la producción localizada de trombina en el sitio donde ocurrió la lesión, con la subsecuente conversión del fibrinógeno soluble a fibrina insoluble. Como ya se describió anteriormente, la generación de trombina requiere de la interacción coordinada entre proteasas, cofactores y zimógenos que actúan como sustratos sobre la superficie fosfolipídica cargada negativamente de células dañadas y/o activadas, como el endotelio, el subendotelio y las plaquetas. La hemostasia requiere un balance preciso entre los procesos procoagulantes y anticoagulantes, de manera que se controle la hemorragia y a la vez, se evite el desarrollo de coágulos patológicos (Colman y col., 2006). Las alteraciones en la hemostasia que conllevan al padecimiento de enfermedades hemorrágicas pueden ser hereditarias, cuando alguno de los genes involucrados en el proceso de coagulación está alterado, de manera que la patología se transmite de generación en generación. Aunque la enfermedad de von Willebrand (EvW) y la Hemofilia son las enfermedades hemorrágicas hereditarias más comunes, existen otras deficiencias de factores de coagulación presentes en la población general, que por estar presentes sólo en un 3 a un 5 % son mejor conocidas como deficiencias raras (Federación Mundial de Hemofilia, 2009). En la figura 23 se ilustra la frecuencia de las deficiencias raras de los factores de coagulación, entre las que destacan como más frecuentes las deficiencias raras del FVII y FXI. Figura 23. Distribución de las deficiencias raras de los factores de coagulación. Datos obtenidos entre el año 2006 y 2007 (Tomado de la Federación Mundial de Hemofilia, http://www.wfh.org/index_SP.asp?lang=SP). 56 Aunque la deficiencia de FVII es la cuarta enfermedad hemorrágica más frecuente, apenas afecta a 1 de cada 500.000 personas. Su patrón de herencia, al igual que todas las otras deficiencias raras de los factores de coagulación, es autosómico recesivo, por lo que es necesario que los dos alelos del gen estén afectados para que se manifieste la patología. A diferencia de esto, en el caso de la Hemofilia (A y B), la enfermedad se transmite con un patrón de herencia recesivo ligado al cromosoma sexual X, ya que los genes que codifican para el FVIII y FIX, respectivamente, se encuentran ubicados en dicho cromosoma (Mannucci y Tuddenham, 2001). Su patrón de herencia podría explicar la alta frecuencia con la que se presenta esta enfermedad dentro de las enfermedades hemorrágicas, ya que al estar ligada al X son los hombres quienes padecen la patología, de manera que sólo necesitan heredar un alelo alterado para padecerla. En el caso de la EvW, cuya frecuencia es la más alta dentro de todas las enfermedades hemorrágicas, hay varios factores involucrados que podrían explicar su alta presencia en la población general. El primero, es que el gen que codifica para el FvW es grande, abarcando 178 Kpb con 52 exones, por lo cual la ocurrencia de mutaciones es más probable que en los otros genes de los factores de coagulación, que son en comparación más pequeños. Segundo, la proteína posee múltiples dominios de interacción, de manera que alteraciones en cualquiera de ellos van a conllevar a alteraciones en su función (Ginsburg, 1999). Como se describió anteriormente, el FvW no sólo le proporciona protección y estabilidad al FVIII al formar un complejo con éste, sino que además interactúa con el colágeno y las plaquetas durante el inicio del proceso de coagulación, cuando éstas últimas comienzan a adherirse al sitio donde ocurrió la lesión en el vaso sanguíneo. Asimismo, el FvW luego de ser sintetizado forma dímeros que luego se multimerizan hasta alcanzar una forma de alto peso molecular, que es secretada al plasma (Rodeghiero, 2002). De esta manera, dependiendo del efecto que posea la mutación sobre la proteína, el patrón de herencia será dominante o recesivo. El tipo más común de la EvW (la tipo 1), que comprende más del 70 % de los casos de esta enfermedad, se hereda con un patrón de herencia autosómico dominante, por lo cual es suficiente que un sólo alelo del gen esté alterado, para que se manifieste la patología (Rodeghiero, 2002; Ginsburg, 1999). Esto último, sumado a todo lo anterior, explicaría la alta frecuencia de la EvW dentro de la población general. 57 La frecuencia de las enfermedades hemorrágicas hereditarias como la Hemofilia, es relativamente constante y además está presente en todos los grupos étnicos a nivel mundial. Por esta misma razón, ha sido una de las enfermedades mejor reportadas a lo largo de la historia. En textos hebreos antiguos que datan del siglo II d.C., se puede encontrar cómo los rabinos de la época permitían que un niño varón no fuera circuncidado, cuando por lo menos dos de sus hermanos mayores habían muerto por hemorragias luego de realizarles dicho procedimiento. Sin embargo, la primera descripción moderna de la enfermedad, ha sido atribuida al doctor John Conrad Otto, quien en el año 1.803 publicó un tratado en el que describió claramente las tres características principales de la Hemofilia: “una tendencia hereditaria a las hemorragias en los varones”. Posteriormente, la Hemofilia fue conocida como la “enfermedad real” cuando los descendientes de la reina Victoria de Inglaterra comenzaron a padecer de la enfermedad. Actualmente, la Hemofilia es un ejemplo clásico de enfermedades ligadas al cromosoma X y ampliamente conocida debido a su alta frecuencia como enfermedad hemorrágica (Federación Mundial de Hemofilia, 2.009). VI.1 Hemofilia Los dos tipos de Hemofilia (A y B) son bastante similares, en cuanto a sus bases moleculares, patrón de herencia y manifestaciones clínicas. Ambas se deben a fallas en la fase de propagación del proceso de coagulación, debido a que el complejo tenasa intrínseco no puede actuar de forma adecuada para producir FXa sobre la superficie plaquetaria. El complejo tenasa intrínseco está conformado por el FIXa, que actúa como enzima proteolítica, junto al FVIIIa, que actúa como su cofactor. Se ha observado, que la unión del FVIIIa potencia varios órdenes de magnitud (109 veces) la actividad del FIXa sobre el FX (McMullen y col., 1995). Por lo tanto, deficiencias de cualquiera de estos dos factores conllevan a la aparición de hemorragias por fallas en la activación del FX (Colman y col., 2006). Debido a que el FVIII actúa únicamente como cofactor en el complejo tenasa intrínseco, se esperaría que en ausencia de éste, el FIXa pueda ejercer aunque ligeramente, su acción sobre el FX, de manera que la deficiencia de FIX resultaría en un fenotipo menos severo que la deficiencia de FVIII. Sin embargo, aún cuando siempre se ha pensado que las manifestaciones clínicas de la HA y HB son exactamente iguales, recientemente se han encontrado indicios que la severidad de la HA es mayor que la de la HB, a pesar que los niveles de ambos sean 58 clasificados de igual forma. De hecho, diversos estudios internacionales han determinado que los pacientes con HAS requieren de mayor profilaxis, tienen mayor frecuencia de hemorragias y requieren de mayor cirugías para el reemplazo de las articulaciones dañadas, que los pacientes con HB severa (Makris, 2009). Asimismo, se ha determinado que esta diferencia no se debe a la edad, a la presencia de infecciones como la Hepatitis C o VIH, ni a la presencia de inhibidores. No obstante, aún no está claro si la deficiencia de FVIII (comparada con la de FIX) resulta en mayores episodios hemorrágicos, si el sistema de coagulación responde menos adecuadamente al tratamiento, o si efectivamente, las hemorragias son más severas y perjudiciales en los pacientes con HA. Sin embargo, queda claro que aún cuando los pacientes son clasificados como severos (< 1 U/dL), existe una alta heterogeneidad fenotípica tanto a nivel del número de hemorragias como de su capacidad de generación de trombina, y que esto a su vez podría verse reflejado más en un tipo de Hemofilia que en la otra. Los estudios de los próximos años podrán confirmar o descartar estas observaciones, así como conseguir una explicación fisiopatológica a estos hechos (Tagariello y col., 2009; Makris, 2009). Anteriormente se describieron las razones que explican la alta frecuencia de la EvW y de las Hemofilias en la población general, con respecto a las deficiencias raras de los factores de coagulación. Aún cuando las Hemofilias son bastante frecuentes, debido a su herencia ligada al cromosoma sexual X, la HA es seis veces más frecuente que la HB. Existen 2 factores principales que explican esta diferencia entre ambos tipos de Hemofilia. El primero, es que el gen que codifica para el FVIII es 5,5 veces más grande que el gen que codifica para el FIX (187 vs. 34 Kpb), por lo cual la probabilidad de ocurrencia de mutaciones en el primero, es mucho mayor. El segundo, es que la presencia de secuencias repetidas (int22h e int1h) dentro y fuera del gen del FVIII, favorece procesos de recombinación intracromosómica que conllevan a la inversión y separación de gran parte del gen. Al estar el gen del FVIII ubicado hacia el extremo distal del cromosoma y las secuencias repetidas cercanas al telómero, el plegamiento intracromosómico es posible, y por ende, la recombinación. En el caso del gen que codifica para el FIX, éste está ubicado en posición más proximal al centrómero que el FVIII, y no posee secuencias repetidas que favorezcan dichos procesos de recombinación. La presencia de las secuencias repetidas no sólo explica la frecuencia de la HA dentro de las enfermedades hemorrágicas, sino que también explica el por qué la HAS representa el mayor porcentaje dentro de la HA (50-60 %). Debido a que las inversiones del intrón 22 e 59 intrón 1 están asociadas con fenotipos severos de la enfermedad, y que estas dos mutaciones ocurren de forma frecuente y espontánea en la población general, la mayoría de los pacientes con HA serán severos. Por esta misma razón, el diagnóstico molecular de HAS debe iniciarse con la detección de las inversiones del intrón 22 e intrón 1, debido a que con ello se logran identificar la mayoría de los pacientes con HAS, y por ser éstos los más frecuentes, a la mayoría de los pacientes con HA. VI.2 Beneficios y aplicaciones del diagnóstico molecular de HA Las manifestaciones clínicas de la HA están directamente relacionadas con el tipo de mutación presente en el gen del FVIII y con el efecto que ésta tenga sobre la proteína. Por ello, gracias a la identificación de las mutaciones que causan la HA ha sido posible desarrollar planes de prevención primaria, basados en el consejo genético. Éste último, ha ganado mucha importancia en los últimos años, ya que gracias al diagnóstico molecular, es posible aportar información valiosa adicional a las familias afectadas, en particular a las mujeres portadoras en dichas familias, las cuales sólo pueden ser confirmadas, mediante el diagnóstico molecular (Bermeo y col., 2007; Pandey y Mittal, 2001). Como se describió previamente, un gran porcentaje de los pacientes con HA son casos esporádicos, donde el paciente no posee historia familiar de la enfermedad. En estos casos, es difícil determinar si la madre es portadora de la HA, ya que sólo se considera portadora obligada, si su padre era hemofílico, si tiene más de un hijo afectado o si posee historia familiar de la enfermedad. Por ello, el consejo genético para estas familias se hace más difícil, ya que es imposible determinar si la madre es portadora de la patología por las técnicas convencionales. Esto es debido a que los resultados obtenidos de los exámenes de coagulación comunes no muestran resultados determinantes, ya que puede existir una alta variabilidad en la actividad del FVIII, a causa de la inactivación al azar del cromosoma X y de la lyonización2. En los últimos años, las técnicas de análisis del ADN han permitido realizar el diagnóstico molecular, tanto de mujeres portadoras como a nivel prenatal, lo que ha permitido en muchos casos, disminuir la recurrencia de la enfermedad en las familias afectadas (Pandey y Mittal, 2001) 2 La lyonización es el proceso en el cual ocurre la inactivación al azar de los cromosomas X en células somáticas durante las etapas tempranas del desarrollo. La inactivación se mantiene a lo largo de todas las células hijas, de manera que al finalizar el desarrollo, el organismo es una mezcla producto del azar (Klug y Cummings, 1999). 60 En la actualidad, en numerosos países las mujeres que son diagnosticadas como portadoras de HA pueden acceder a estrategias reproductivas alternativas que permitan que sus hijos nazcan libres de HA, gracias al uso de técnicas de biología molecular. Asimismo, el diagnóstico molecular facilita el diagnóstico neonatal y prenatal (a partir de muestras de vello coriónico o por amniocentesis) de la enfermedad, con lo cual se puede iniciar desde temprana edad el manejo terapéutico de la HA, se puede predecir el comportamiento de la misma y sus posibles complicaciones (Bermeo y col., 2007). El diagnóstico molecular puede realizarse mediante la detección directa de la mutación presente en el gen del FVIII o mediante el uso de marcadores polimórficos. Debido a la alta heterogeneidad de mutaciones y reorganizaciones complejas que se presentan en el gen del FVIII, la detección directa de las mismas ha hecho más difícil el diagnóstico molecular, ya que se requieren técnicas complejas, que actualmente no se pueden emplear para el diagnóstico rutinario en los laboratorios. En el caso de la HAS, se puede emplear la detección directa, ya que las inversiones del intrón 22 y 1, permiten un diagnóstico rápido en la mayoría de los casos. Sin embargo, muchos laboratorios han optado por emplear ensayos de ligación con marcadores polimórficos, ya sea mediante análisis de RFLP o de microsatélites. La detección por esta vía también puede ser complicada, ya que se deben emplear marcadores altamente informativos que pueden cambiar de acuerdo al origen étnico del grupo familiar analizado (Pandey y Mittal, 2001). Por otro lado, el diagnóstico molecular permite conocer los diversos mecanismos moleculares, los cambios conformacionales y mutaciones que ocurren en el gen que conllevan al desarrollo de la enfermedad. Por ello, en los casos donde se conoce la mutación que causa la enfermedad en un paciente, el diagnóstico de los familiares se puede hacer de manera directa. Así, el primer paso es determinar la alteración presente en un paciente con HA, para luego proceder al análisis familiar y al consejo genético. En el caso particular de los pacientes con HAS, se debe proceder a determinar en primer lugar la presencia de la inv-int22, y posteriormente la presencia de la inv-int1. En aquellos pacientes que no posean ninguna de las dos inversiones, así como en los casos de HA leve y moderada, se debe analizar el gen completo para determinar cuál es la alteración presente (Bermeo y col., 2007). Por último, el análisis de las mutaciones en pacientes con HA permite establecer la relación entre la alteración genética y la presencia de inhibidores, así como predecir su posible 61 desarrollo, ya que los pacientes con mutaciones que ocasionen una proteína ausente o truncada, frecuentemente los presentan (Bermeo y col., 2007). En base a todo lo anterior, en este estudio nos propusimos realizar el diagnóstico molecular a un grupo de pacientes con HAS, así como determinar la posible asociación entre diversos polimorfismos presentes en genes del sistema inmune y el desarrollo de inhibidores. VI.3 Diagnóstico molecular de HA El análisis del gen del FVIII en los pacientes con HAS se llevó a cabo mediante el uso de técnicas moleculares, que permitieron detectar la mutación causante de la patología en la mayoría de los casos analizados. El diagnóstico molecular de los pacientes se inició mediante la detección de la inversión del intrón 22, debido a que ésta es la única alteración que se encuentra de forma recurrente en los pacientes con HAS. Posteriormente, se realizó la detección de la inversión del intrón 1 a todos aquellos pacientes que dieron negativo para la inv-int22 y por último, a los pacientes que no dieron positivo para ninguna de las inversiones, se les analizaron todos los exones, la región promotora y región 3´-no traducida del gen del FVIII en búsqueda de mutaciones, mediante amplificación por M-PCR, análisis por CSGE y secuenciación. VI.3.1 Detección de la Inversión del intrón 22 El primer análisis realizado en las muestras de los pacientes con HAS fue la detección de la inversión del intrón 22 mediante la técnica de I-PCR (Rossetti y col., 2005). Aunque esta técnica no es la que se emplea regularmente, en un estudio realizado por Cutler y colaboradores (2006), se demostró que es más precisa que la PCR de larga distancia (LD-PCR), la técnica más empleada en la actualidad. Esta última técnica resulta complicada debido al alto contenido de GC de las regiones que se amplifican y al gran tamaño de los productos a obtener, lo que representa una gran limitante a la hora de lograr una buena estandarización de la LD-PCR. En este estudio se intentó realizar la detección de la inv-int22 mediante LD-PCR y comparar así las técnicas, pero no se obtuvieron resultados positivos, por lo que se empleó únicamente la I-PCR, descrita por Rossetti y colaboradores (2005). La estandarización de la I-PCR también puede ser laboriosa, y al haber tres pasos involucrados (digestión, ligación y amplificación) puede ser difícil establecer las condiciones óptimas para cada una. Diversos pasos resultaron críticos para lograr una amplificación exitosa 62 mediante I-PCR, entre las cuales se encontraron: emplear un ADNg de alto peso molecular íntegro y a gran concentración; realizar la digestión enzimática del ADNg por más tiempo; colocar las muestras en etanol a -20 °C antes de cada purificación; realizar la ligación en un volumen grande; y, realizar una PCR touchdown para favorecer la amplificación específica de las regiones de interés. Aún cuando en este estudio se analizaron exitosamente 55 muestras para la presencia de la inv-int22, otras muestras adicionales fueron procesadas sin lograr obtener resultados satisfactorios. Esto nos llevó a determinar que la calidad del ADNg a emplear es un factor fundamental para lograr un análisis efectivo mediante la I-PCR, ya que muestras con baja concentración de ADNg, que estuviesen ligeramente degradadas o mal almacenadas, interfirieron con la realización de un análisis exitoso. En este sentido, nuestros resultados coinciden con los obtenidos por Rossetti y colaboradores (2008), quienes en un estudio posterior sobre la mejora de la técnica de I-PCR, determinaron que el primer factor que determina la eficiencia en la formación de los anillos intramoleculares, es la calidad del ADN y su concentración. La frecuencia de la inv-int22 obtenida para los pacientes con HAS analizados (40 %) concuerda con las frecuencias reportadas para las distintas poblaciones a nivel mundial (Tabla 1, Sección II.4.1.1). Asimismo, coincide con el estudio realizado por Leiria y colaboradores (2009), en el cual se incluyeron los datos obtenidos de casi 6.000 pacientes con HAS de 14 países diferentes, y donde se encontró una alta homogeneidad en la frecuencia de la inv-int22, la cual varía entre un 40 a 49 %, independientemente del origen étnico de la población analizada. La alta frecuencia de esta mutación es explicada por la alta homología que existe entre las secuencias repetidas int22h, que favorece la recombinación intracromosómica durante la meiosis masculina. De hecho, se ha determinado que las secuencias homólogas int22h-2 e int22h-3 son un 99,93 % idénticas entre sí, mientras que la int22h-1 con respecto a la int22h-2 un 99,18 % y la int22h-1 con respecto a la int22h-3 un 99,24 %. La ubicación de las repeticiones y las diferencias que existen entre cada una de las copias homólogas apoyan la teoría del proceso evolutivo que dio origen a la duplicación de dichas secuencias hace más de 25 millones de años por conversión génica (De Brasi y Bowen, 2008). Cuando en un mismo cromosoma están presentes dos o más secuencias repetidas, la recombinación homóloga entre éstas pueden conllevar a rearreglos del genoma, cuyo resultado 63 dependerá de la orientación de dichas secuencias repetidas. En el caso de secuencias repetidas que se encuentran ubicadas en la misma orientación (repetidos directos), la recombinación va a generar la deleción de la secuencia que se encuentra en medio de ellas. La porción del genoma se pierde en forma de un anillo de ADN que incluye una de las copias repetidas, mientras que en el cromosoma permanece intacta la copia restante de la secuencia repetida (Figura 24). Por esta razón, la mayoría de las deleciones se dan en la cercanía de secuencias repetidas, como ocurre en los transposones. Por el contrario, cuando las secuencias repetidas se encuentran en orientación opuesta (repetidos invertidos), la recombinación entre ambas produce la inversión de la secuencia que se encuentra en medio de ellas (Figura 24). En este caso, las copias permanecen intactas en el genoma, disponibles para futuros eventos de recombinación, por lo que no producen ningún efecto perjudicial (Lewin, 2006). No obstante, cuando una de las repeticiones se encuentra ubicada en el medio de un gen y ocurre la recombinación homóloga, se produce la separación e inversión del gen, tal como ocurre con la inv-int22. Figura 24. Recombinación homóloga entre secuencias repetidas en la misma orientación o en orientación opuesta. En el caso de secuencias que están en orientación opuesta, la recombinación homóloga conlleva a la inversión del segmento presente entre ambas regiones, mientras que cuando están en la misma orientación, la recombinación conlleva a la deleción de la secuencia entre ambas regiones (Modificado de Lewin, 2006). 64 En el caso de las regiones homólogas int22h, la recombinación homóloga se da en la mayoría de los casos entre la copia presente en el gen y la copia que está ubicada más cerca al telómero, cuya orientación es siempre inversa a la primera (De Brasi y Bowen, 2008). Siguiendo el modelo descrito anteriormente, el proceso de recombinación conlleva a la inversión de toda la secuencia presente entre ambas. Debido a que la copia int22h-1 está presente dentro del intrón 22 del gen, una parte del gen (exones 1 al 22) se invertirá y quedará ahora ubicado hacia el extremo telomérico del cromosoma X, mientras que la otra porción (exones 23 al 26) quedarán en su posición original (Lakich y col., 1993). Anteriormente se pensaba que las dos copias homólogas int22h-2 e int22h-3 estaban en orientación opuesta a la copia presente en el gen del FVIII (Naylor y col., 1995; Lakich y col., 1993; Levinson y col., 1990), sin embargo, recientemente se determinó que son las 2 copias presentes en la región telomérica (int22h-2 e int22h-3) las que se encuentran opuestas una con respecto a la otra, lo cual deja una en orientación opuesta y otra en la misma orientación con respecto a la copia int22h-1. De esta manera, la recombinación que da origen a la inversión sólo se lleva a cabo con la copia distal, que está en sentido opuesto a la región int22h-1. Por otro lado, se ha observado que las copias int22h-2 e int22h-3 se encuentran en los extremos de un palíndrome imperfecto que abarca aproximadamente 50 Kpb. Cuando ocurren eventos de recombinación entre los extremos de este palíndrome, la posición de cada una de las copias se invierte, permitiendo así que la inv-int22 pueda ocurrir con cualquiera de las dos copias. La invint22 tipo I ocurre cuando recombinan las copias int22h-1 e int22h-3, y la inv-int22 tipo II cuando recombinan las copias int22h-1 e int22h-2. Para que ocurra la inv-int22 tipo II es necesario que primero haya ocurrido recombinación entre las copias int22h-2 e int22h-3, por lo que la frecuencia de este tipo de inversión es mucho más baja que la tipo I (20% vs. 80%). De esta manera, el que ocurra un tipo u otro dependerá de cuál de las dos copias homólogas está ubicada en la posición distal (Figura 25) (De Brasi y Bowen, 2008). El hecho de que la copia del int22h que queda en posición más proximal en el telómero posea la misma orientación que la copia int22h-1, permite que eventos de duplicación y deleción puedan ocurrir mediante recombinación en la meiosis femenina, o en la meiosis masculina, si el cromosoma X se pliega sobre sí mismo (De Brasi y Bowen, 2008). Los eventos de este tipo en pacientes con HA son sumamente raros, pero su posible presencia ha sido descrita por autores como Rossetti y colaboradores (2008). Estos autores que fueron quienes 65 desarrollaron la técnica de I-PCR para la detección de la inv-in22 empleada en este trabajo, realizaron modificaciones a la misma técnica para poder determinar la presencia de las duplicaciones o deleciones, además de la clásica inversión. La IS-PCR (Inverse Shifting - PCR) al igual que la I-PCR, permite la detección de las diferentes alteraciones de acuerdo al tamaño del producto de PCR obtenido, al usar juegos de cebadores específicos para cada caso. Figura 25. Esquema de los dos tipos (I y II) de la inv-int22. Ver explicación en el texto. La IS-PCR se puede emplear como método complementario para caracterizar totalmente los diversos rearreglos que pueden involucrar al int22h, ya que también permite distinguir entre las inv-int22 tipo I y II. Asimismo, permite realizar el diagnóstico acertado de mujeres portadoras ya que evita confundir una duplicación (no asociada con HA) con la inv-int22, así como una deleción (asociada con HA) con un alelo normal (Rossetti y col., 2008). Sin embargo, en una comunicación emitida por la UK-HCDO (United Kingdom Hemophilia Centre Doctor´s Organization) se determinó en base a una serie de evidencias, que los rearreglos adicionales descritos que involucran al int22h son extremadamente raros e incluso se duda de su existencia. En el caso de la duplicación, si ésta ocurriera, los marcadores polimórficos que se emplean regularmente para el diagnóstico por RFLP o microsatélites, deberían duplicarse también, y esto 66 no ha sido reportado hasta la fecha. Al no ser patológica la duplicación, debería estar presente no sólo en la población general sino también en los pacientes con HA y dicho evento, tampoco ha sido reportado. Por último, la deleción por recombinación causaría HAS y debería ser igual de recurrente que la inversión, lo cual no ha sido observado en los pacientes. Todo ello apoya que las técnicas convencionales para el diagnóstico de pacientes con HA y de mujeres portadoras son sumamente confiables (Green y col., 2007). El hecho de que las duplicaciones y deleciones por recombinación homóloga entre las secuencias int22h sean extremadamente raras o que en realidad no ocurran, no implica que otros eventos complejos de recombinación no puedan ocurrir. Tal como se describió previamente, existen reportes de pacientes que poseen copias adicionales de la región int22h y que pueden recombinar con la copia presente en el gen, generando de igual manera la inv-int22. De igual forma, la presencia de secuencias repetitivas dentro del gen del FVIII, como los LINEs, pueden favorecer que se den eventos de recombinación adicionales. Un ejemplo de ello, es el caso de un paciente con HAS reportado por Mühle y colaboradores (2007), en el que cuatro eventos de recombinación ocurrieron de forma consecutiva. En dicho caso, el primer evento ocurrió entre las copias int22h-2 e int22h-3, que conllevó a la inversión de la región entre ambas y a la ubicación de la copia int22h-2 en el extremo distal del cromosoma X. Luego, múltiples LINEs y SINEs (Short Interspersed Element) presentes fuera y dentro del gen se alinearon formando un loop, que permitió que un segmento del gen MPP1 (Proteína de Membrana Palmitoilada 1) se duplicara e insertara dentro del intrón 15 del gen del FVIII. Posteriormente, ocurrió la clásica, pero menos frecuente, inv-int22 tipo 2, por la recombinación entre las copias int22h-1 e int22h2. Finalmente, la recombinación entre las dos copias del segmento duplicado del gen MPP1, conllevó a la deleción de los exones 16 al 22 del gen del FVIII. De esta manera, el paciente posee la inv-int22, una inserción y una deleción grande en el gen del FVIII. El caso reportado por Mühle y colaboradores (2007), resalta aún más la inestabilidad de la región cromosómica Xq28, debido a la presencia de las copias int22h, en la que no sólo puede ocurrir la clásica inv-int22, sino que también pueden ocurrir deleciones e inserciones. La frecuencia de este tipo de eventos se desconoce, ya que la presencia de esta deleción puede pasar desapercibida en muchos casos, ya que la mayoría de las veces cuando se realiza la detección de la inv-int22 y el resultado da positivo, no se proceden a realizar otros análisis adicionales. Por ello, estos mismos autores analizaron 32 pacientes adicionales que mostraron 67 un patrón de bandas diferente en el análisis de la inv-int22 mediante Southern blot, logrando detectar 3 casos adicionales, similares al ya descrito anteriormente. La presencia adicional de la deleción en los pacientes con la inv-int22, aumenta significativamente el riesgo de desarrollar inhibidores, en comparación a los pacientes que sólo poseen la inv-int22, ya que a la proteína le faltarán 7 exones más. Por ello, en aquellos casos donde se obtienen resultados inesperados, el análisis posterior y detallado puede permitir la selección de la mejor terapia, así como una detección confiable de las posibles mujeres portadoras y de sus hijos, a nivel prenatal. Asimismo, el análisis detallado de casos como éste, permite entender los mecanismos moleculares que están detrás de los rearreglos cromosómicos que causan la HA. Dentro del grupo de pacientes que dieron positivos para la inversión del intrón 22 en este estudio, un alto porcentaje (36,4 %) desarrolló inhibidores de alta respuesta frente al tratamiento. La frecuencia de inhibidores en pacientes que poseen la inv-int22 varía ampliamente, ya que se han reportado valores distintos para las diversas poblaciones, tales como 5 % (España), 12 % (Argentina), 16 % (Portugal), 25 % (Italia), 43 % (México) y 51 % (Brasil) (Leiria y col., 2009; David y col., 2006). La variabilidad no sólo se ha observado entre las distintas poblaciones, sino también con respecto al tipo de inhibidores que desarrollan los pacientes positivos para la invt-int22. En el estudio realizado por Leiria y colaboradores (2009), al analizar 2 familias portadoras de la inversión del intrón 22 (3 individuos afectados en cada una), que recibieron el mismo tipo de tratamiento, observaron que el desarrollo de inhibidores variaba, ya que unos pacientes desarrollaron inhibidores de alta respuesta, otros de baja respuesta y algunos no los desarrollaron. Esta heterogeneidad en la frecuencia de inhibidores resalta la influencia que los otros factores de riesgo pueden tener en el desarrollo de los mismos en los pacientes con HAS, así como la importancia de obtener datos específicos para las distintas poblaciones y así, mejorar el entendimiento del origen de los mismos (Leiria y col., 2009). Por último, cabe la pena resaltar que adicionalmente a los pacientes con HAS analizados en este estudio, se encontró un paciente con HAM que dio positivo para la presencia de la invint22. Aunque en la mayoría de las poblaciones que han sido analizadas la inversión sólo ha sido encontrada en pacientes con HAS, algunos estudios han encontrado pacientes clasificados como moderados que son positivos para la inv-int22. En un estudio realizado por Yenchistsomanus y colaboradores (2003), diagnosticaron dos pacientes con niveles de actividad 68 del FVIII de 3,0 y 3,7 %, como positivos para la inversión. Asimismo, Poláková y colaboradores (1998), encontraron también un paciente con HAM positivo para la inversión. A pesar que los niveles de FVIII sean verificados, muchas veces es difícil establecer el límite exacto que separa a un paciente moderado de uno severo, de manera que es posible que en el paciente con HAM de este estudio los niveles hayan estado cercanos al 1 %. Más aún, por el efecto que genera la inv-int22 sobre la proteína es de esperarse que la actividad del FVIII esté por debajo del 1 %. Dado que los niveles para la clasificación de la HA son en base a la actividad del FVIII, y que muchas veces estos ensayos pueden no ser tan exactos, sería necesario determinar en el paciente con HAM analizado en este trabajo, los niveles de FVIII:Ag para verificar efectivamente si están presentes o no moléculas de FVIII circulantes, y por ende, si es un paciente con HA severa o moderada. VI.3.2 Inversión del intrón 1 La detección de la inversión del intrón 1 en los pacientes con HAS se realizó mediante la técnica de PCR, con la cual se amplifican las dos regiones homólogas int1h involucradas en la recombinación que conlleva a la inversión. A diferencia de la inv-int22, la detección de la invint1 es sumamente sencilla ya que los tamaños de las regiones int1h se pueden amplificar fácilmente, debido a que el tamaño del producto más grande no alcanza los 2 Kpb (Bagnall y col., 2002). Aún cuando en este estudio se lograron analizar exitosamente los 33 pacientes con HAS para determinar la presencia de la inv-int1, no se encontró ningún paciente positivo para la misma. En la Tabla 2 (Sección II.4.1.2), se puede observar cómo la frecuencia de la inv-int1 varía desde un 0 hasta un 5 %, independientemente de la población estudiada. El resultado obtenido en este estudio concuerda con los valores reportados en la mayoría de los estudios y coincide con algunos estudios en particular (Mantilla y col., 2007; Castaman y col., 2007; Andrikovics y col., 2003). Con una frecuencia tan baja, es posible que si se analizan más pacientes con HAS se encuentre algún paciente positivo para la inv-int1, ya que en este estudio el n analizado fue bajo. Sin embargo, si se observa nuevamente la Tabla 2, se puede notar como en el estudio realizado por Guillet y colaboradores (2006), donde se analizaron 241 pacientes no relacionados, la frecuencia de la inv-int1 fue del 1 %, mientras que en otro estudio donde se 69 analizaron 65 pacientes, la frecuencia fue de 4,6 % (Li y col., 2009), de manera que se explica el que no se hayan conseguido pacientes positivos para esta inversión en este estudio. La presencia de las secuencias repetidas como la int22h e int1h, favorecen la recombinación e inversión de parte del gen del FVIII, por lo que son las mutaciones más frecuentemente encontradas en los pacientes con HAS. Sin embargo, la frecuencia de la inversión del intrón 22 es mucho mayor que la del intrón 1. Aunque ambas inversiones son el resultado del mismo mecanismo, la recombinación intracromosómica durante la meiosis masculina, la ubicación y tamaño de las regiones homólogas puede explicar la diferencia en la frecuencia de ambas. Como se describió anteriormente, y contrario a lo que se pensaba en años anteriores, la inv-int22 sólo ocurre por recombinación entre la copia presente en el gen y la copia distal presente en el telómero. La distancia entre estas regiones homólogas es sumamente grande (550 Kpb), lo que facilita que cuando el cromosoma se pliegue sobre sí mismo, las copias se encuentren y ocurra la recombinación. Adicionalmente, las regiones int22h abarcan una gran extensión de ADNg, alcanzando los 9,5 Kpb. Todo ello favorece el proceso de recombinación, cuando en la meiosis masculina la región telomérica del cromosoma X se pliegue sobre sí misma (Figura 26, A). Figura 26. Explicación representativa de las causas que conllevan a una mayor frecuencia de la inversión del intrón 22 vs. la inversión del intrón 1. A) Plegamiento intracromosómico del X, ubicación y recombinación entre las copias homólogas int22h. B) Plegamiento intracromosómico del X, ubicación y recombinación entre las copias homólogas int1h. 70 De manera similar, la inversión del intrón 1 sólo se lleva a cabo entre la copia int1h presente en el gen y su copia homóloga ubicada 140 Kpb hacia la región telomérica. Como se aprecia en la Figura 26, la distancia entre ambas es mucho más pequeña que la de las copias int22h, por lo que es necesario que el plegamiento del cromosoma X sea mucho mayor para que la recombinación sea posible. Asimismo, el tamaño de la región int1h es mucho más pequeño, por lo que será más difícil el encuentro entre ambas copias homólogas, aún cuando ocurra el plegamiento (Figura 26, B). VI.3.3 Otras mutaciones en el gen del FVIII El análisis para determinar el resto de las mutaciones presentes en el gen del FVIII, en los pacientes negativos para las inv-int22 e inv-int1, se realizó de manera exitosa mediante la amplificación de la región promotora, todos los exones con las regiones intrónicas aledañas y la región 3´-no traducida, que en total abarcaron aproximadamente 14 Kpb de ADNg. El análisis posterior de los productos obtenidos mediante CSGE, permitió identificar 23 mutaciones distintas en los 26 pacientes a los que se les encontraron mutaciones. Dichas mutaciones están distribuidas a lo largo de los diferentes dominios del FVIII, a excepción del dominio C1 en el que particularmente en este trabajo, no se hallaron mutaciones, a pesar que en la base de datos HAMSTeRS si se encuentran reportadas mutaciones en este dominio (Figura 27). Figura 27. Distribución de las diferentes mutaciones puntuales encontradas en los diversos dominios del FVIII. La mayoría de las mutaciones encontradas estuvieron concentradas en los dominios B, A3 y C2 de la proteína, mientras que en el dominio C1 no se encontraron mutaciones. 71 Cabe la pena resaltar, que el dominio en el cual se presentaron el mayor número de mutaciones fue el dominio B, en el cual ocurrieron el 35 % de todas las mutaciones puntuales encontradas. Este dominio representa el 40 % de la secuencia codificante del gen y está codificado únicamente por el exón 14 del gen, el más grande de todos, por lo que es de esperarse encontrar un mayor número de mutaciones con respecto a los otros exones (Pipe, 2009). Los resultados encontrados coinciden con los de Lin y colaboradores (2008), en el que el 27 % de las mutaciones puntuales encontradas en los pacientes con HAS ocurrían en el dominio B. Por otro lado, Becker y colaboradores (1996) reportan que cerca del 25 % de las mutaciones puntuales ocurren en este dominio, principalmente en el codón 1192 donde está presente una serie de adeninas que abarca 9 pb. Si observamos el tipo de mutaciones que están presentes en este dominio, se puede notar que las deleciones e inserciones, así como las mutaciones sin sentido son las únicas que se dan en este dominio. Esto implica la poca importancia funcional del dominio B, ya que no se observaría un fenotipo hemofílico al menos que la proteína sea truncada, como ocurre con dichas mutaciones (Becker y col., 1996). Estos resultados concuerdan con el estudio realizado por Markoff y colaboradores (2009), quienes luego de analizar todas las mutaciones de pérdida de sentido reportadas en la base de datos HAMSTeRS, determinaron que dichas mutaciones ocurrían en cerca de un tercio de los aminoácidos de cada uno de los dominios con la siguiente frecuencia: A1 37,5%, A2 32,5%, A3 33,4%, C1 31,2% y C2 25%, a excepción del dominio B, donde la frecuencia de mutaciones de pérdida de sentido está confinada a pocos residuos aminoacídicos. Como se describió previamente, el FVIII en su forma inactiva es un heterodímero formado por una cadena pesada (A1, A2, B) y una cadena liviana (A3, C1, C2), unidas entre sí por un puente dependiente de ión metálico (Cu+). Tras su activación en el proceso de coagulación, el dominio B se pierde y el FVIII es convertido a un heterotrímero (Fay y Jenkins, 2005). La ausencia de mutaciones de pérdida de sentido en el dominio B, resalta la poca funcionalidad que posee este dominio para el FVIII. Sin embargo, el dominio B posee numerosos sitios de glicosilación (casi el 80 % de todos los sitios), que permiten que el FVIII sea procesado y transportado adecuadamente dentro de la célula. Los residuos glicosilados, principalmente de asparagina, interactúan con las proteínas chaperonas calnexina y calreticulina, presentes en el retículo endoplasmático. Asimismo, se han encontrado evidencias que el dominio B puede tener funciones a lo largo de todo el ciclo de vida del FVIII. Ciertos 72 hallazgos recientes sugieren que el dominio B podría modular al FVIII en el plasma, disminuyendo su afinidad por las plaquetas, reduciendo la proteólisis por parte de la PCa, y participando en su catabolismo (Pipe, 2009). Dado lo anterior, es posible que la presencia de mutaciones de pérdida de sentido en el dominio B no esté asociada con la forma severa de la HA y por ello no se encuentren en los pacientes analizados. No obstante, en la base de datos HAMSTeRS las mutaciones más frecuentes en el dominio B son las de tipo sin sentido, las inserciones, deleciones, y en menor grado, mutaciones de pérdida de sentido que afectan alguno de los sitios de activación por la trombina. VI.3.3.1 Mutaciones sin sentido Las mutaciones sin sentido, en las que cambia un aminoácido de la proteína por un codón de terminación prematuro, fueron las mutaciones puntuales más frecuentes encontradas en el gen del FVIII en los pacientes analizados en este estudio, con una frecuencia de 16,7 %. La frecuencia reportada para este tipo de mutaciones es ligeramente menor, variando entre un 812% según algunos estudios (Hwang y col., 2009; Green y col., 2008; Santacroce y col., 2008; Citron y col., 2002). Estas mutaciones ocurrieron en 9 sitios diferentes de la proteína, que incluyen los dominios A2, B, A3 y C2, y entre las cuales se encuentran dos mutaciones no reportadas previamente (E1896X y S524X). Debido a que las mutaciones sin sentido conllevan a la formación de proteínas truncadas, el riesgo de desarrollar inhibidores es mayor. Es de esperarse, que mientras más próximo al extremo 5´ se genere el codón de terminación (N- vs. C-terminal), mayor será el riesgo de desarrollar inhibidores, ya que el producto traducido será más pequeño. De los 9 pacientes que se encontraron con mutaciones sin sentido, 2 desarrollaron inhibidores de alta respuesta. Curiosamente, ambas mutaciones están presentes el dominio A3 del FVIII. Sin embargo, existen 5 mutaciones sin sentido que están ubicadas más próximas al extremo 5´ del transcrito del FVIII (2 en el dominio A2 y 3 en el dominio B de la proteína), ninguna de las cuales está asociada con la aparición de inhibidores contra el tratamiento. Esto concuerda con los resultados obtenidos por Green y colaboradores (2008), quienes luego de comparar sus resultados con los reportados en la base de datos HAMSTeRS, determinaron que mientras más cercano al extremo 5´ ocurriera la mutación sin sentido, menor era el riesgo de desarrollar inhibidores. En la Figura 28, se muestra el resumen de los resultados obtenidos por Green y 73 colaboradores (2008), donde se puede observar que el riesgo es menor en los dominios A1, A2 e inicio del B, y mucho mayor en los dominios A3, C1, C2 y al final del dominio B. Al igual que en nuestro estudio, el mayor riesgo de desarrollar inhibidores en presencia de mutaciones sin sentido, parece ser cuando ocurren en el dominio A3 del FVIII. Figura 28. Distribución de las mutaciones sin sentido en pacientes que desarrollaron inhibidores. Los números sobre las barras indican el número de mutaciones asociadas con inhibidores. Datos obtenidos del estudio y de la base de datos HAMSTeRS (Tomado de Green y col., 2008). Una posible explicación a estos resultados, es que si la mutación está muy cerca del extremo 5´ del ARNm, la traducción pueda iniciarse en otro sitio interno posterior a donde está el codón de terminación prematuro y se sintetice algún producto relacionado al FVIII que favorezca la tolerancia al FVIII administrado como tratamiento. Los codones AUG presentes en las posiciones 69, 614, 834, 1166, 1772 y 2255 del ARNm del FVIII representan posibles sitios internos de inicio de la traducción, que de ocurrir, no reducirían el efecto sobre el proceso de coagulación sino más bien, ejercerían un efecto beneficioso sobre el riesgo a desarrollar inhibidores (Green y col., 2008). Para corroborar esta teoría sería necesario determinar en cada uno de los pacientes la presencia del FVIII en plasma, y debido a que los productos pueden ser variados (si la traducción ocurre en un sitio adicional) no necesariamente las técnicas de purificación o análisis permitirán detectarlos (ausencia de los epítopes reconocidos por los anticuerpos, o sitios de interacción ausentes o alterados). Asimismo, el hecho que la traducción pueda iniciarse en algún sitio adicional interno en el ARNm no implica que el producto sintetizado sea secretado al plasma, por lo que los resultados encontrados seguirán sin una explicación clara por ahora. 74 VI.3.3.2 Deleciones / Inserciones pequeñas Las deleciones e inserciones pequeñas generan la corrida del marco de lectura, cuando no ocurren en múltiplos de 3 nucleótidos. En este estudio, este tipo de mutaciones representó el 14,8 % del total de mutaciones y en todos los casos conllevaron a la corrida del marco de lectura, por lo cual causaron la formación de proteínas truncadas. La frecuencia encontrada en este estudio coincide con la reportada por otros, en los que la frecuencia varía entre un 12 y 18,5 % (Awidi y col., 2009; Sirocova y col., 2009; Hwang y col., 2009). Curiosamente, dos deleciones estuvieron presentes cada una en dos pacientes: la del_A 3628-3637 y del_TTGT 209-212. La mutación del_A 3628-3637 en el exón 14 del gen (codones 1191-1194), representa uno de los pocos puntos calientes de mutaciones en el gen el FVIII. Oldenburg y colaboradores (2004), determinaron luego de analizar 846 familias con HA que cerca del 25 % de las deleciones pequeñas ocurrían en alguna de las dos series de adenina de 8 y 9 nucleótidos en el exón 14. Esto coincide con los resultados reportados por Becker y colaboradores (1996), los cuales postularon a estas regiones como regiones probables para inserciones o deleciones de A, debido a que es más posible que la polimerasa cometa errores o se “resbale” durante el proceso de replicación. En la base de datos HAMSTeRS, esta mutación ha sido reportada por más de 60 autores diferentes, lo cual confirma su carácter de punto caliente para la ocurrencia de mutaciones. En la mayoría de los casos, la mutación está asociada con el tipo severo de la enfermedad, no obstante, algunos estudios han reportado casos de pacientes con HA moderada en los que está presente dicha mutación (Sirocova y col., 2009). Otra mutación que puede ocurrir por mecanismos similares, es la inserción ins_A 2940-2945 encontrada en el paciente H80, que aunque no ocurre en una de las dos series de adenina mencionadas anteriormente, ocurre en una serie de 6 adeninas presente también en el exón 14 del gen. Por otro lado, la mutación del_TTGT 209-212 en el exón 2 del gen (codones 51-52), presentó una frecuencia igual a la encontrada para la del_A 3628-3637. Sin embargo y a diferencia de la mutación del_A 3628-3637, esta mutación no se encuentra reportada en la base de datos HAMSTeRS; aunque sí se ha reportado 8 veces una deleción de mayor extensión que incluye a los nucleótidos delecionados en la mutación del_TTGT 209-212 (TGTTTGT). No obstante, Leuer y colaboradores (2001) reportan una familia con la misma deleción encontrada en este estudio. El hecho de que haya sido reportada una sola vez anteriormente, indica que no 75 es un sitio frecuente de mutaciones. Esto podría sugerir que quizás los dos pacientes en los que se encontró la mutación puedan estar relacionados entre sí. Aunque no poseemos información de que esto sea así, sería útil corroborarlo si fuese posible. De las 6 mutaciones de este tipo que se encontraron en los pacientes con HAS (4 deleciones y 2 inserciones), 3 se reportan por primera vez en este trabajo, incluyendo 2 deleciones y 1 inserción. En la Figura 29 se muestra el efecto de cada una de estas últimas mutaciones, en la que se puede observar cómo ocurre la corrida del marco de lectura y posteriormente, la aparición de un codón de terminación prematuro que conlleva a la formación de proteínas truncadas. Figura 29. Secuencias normales y efecto de las mutaciones nuevas encontradas del tipo deleción e inserción. En la secuencia normal de cada región, se indica (subrayado y en negrillas) el aminoácido donde ocurre la deleción o inserción. En la secuencia mutada, se indica la corrida del marco de lectura (subrayado) y la aparición del codón de terminación prematuro (Stop). 76 El paciente H-125, que posee la mutación del_G 3006 fue el único con este tipo de mutaciones que desarrolló inhibidores frente al tratamiento. A pesar que la mutación genera una proteína truncada a partir del exón 14, debido a la función del dominio B en el procesamiento y transporte intracelular del FVIII, lo más probable es que el FVIII truncado no sea secretado y por ende, el riesgo de desarrollar inhibidores sea mayor. Sin embargo, la deleción del_TTGT 209-212 ocurre en el exón 2 del gen y ninguno de los dos pacientes desarrolló inhibidores. Nuevamente podría aplicarse la teoría propuesta por Green y colaboradores (2008) para el caso de las mutaciones sin sentido, en la que mientras más cerca del extremo 5´ ocurra la aparición del codón de terminación, menor es el riesgo de desarrollar inhibidores. Por otro lado, también habría que evaluar la participación de los otros factores de riesgo, como la presencia del polimorfismo -308G>A en el gen TNFA, para el cual el paciente H-125 es heterocigoto. Aunque en este estudio no se encontró asociación de dicho polimorfismo con el desarrollo de inhibidores, diversos estudios lo han asociado positivamente con un riesgo incrementado. Asimismo, también hay que tomar en cuenta los otros factores de riesgo tales como el tipo de tratamiento empleado en su terapia, la edad de inicio de la misma, las razones por las cuales ha sido tratado, entre otras. VI.3.3.3 Mutaciones de pérdida de sentido Las mutaciones de pérdida de sentido, donde cambia un aminoácido por otro en la proteína, representaron el 9,3 % de las mutaciones causantes de HAS en los pacientes analizados. Este tipo de mutaciones ha sido asociada más frecuentemente con la HAL, ya que al menos que ocurra en un sitio clave de la proteína como por ejemplo, el sitio de activación por la trombina, difícilmente causará un fenotipo severo (Green y col., 2008). Sin embargo, muchos residuos pueden ser sumamente importantes para la estabilidad y conformación de la proteína, de manera que alteraciones en éstos pueden conllevar a la degradación o mal plegamiento de la misma, conllevando a una falta total de actividad del FVIII. En este trabajo se encontraron 5 mutaciones de pérdida de sentido, de las cuales 1 se reporta por primera vez. Gly1994Arg La mutación G1994R encontrada en el paciente H-11, aunque no ha sido reportada en la base de datos HAMSTeRS, fue reportada por Repessé y colaboradores (2007) en un paciente 77 con HAS que no desarrolló inhibidores contra el tratamiento. En este caso, la mutación involucra el cambio de una glicina por una arginina en la posición 1994, presente en la hoja S55 del dominio A3 del FVIII. La glicina es un aminoácido polar sin carga, mientras que la arginina es un aminoácido básico cargado positivamente. La presencia de la Gly en la posición 1994 de la proteína está altamente conservada entre las especies animales, tal como se puede observar luego de comparar las secuencias proteicas del FVIII de 8 especies animales (Figura 30). Esto indica que la Gly cumple un papel importante en el dominio A3, ya sea para su conformación, estabilidad o actividad. Figura 30. Alineamiento de la secuencia proteica del FVIII de diversas especies animales. Se puede observar como la glicina 1994 está altamente conservada entre las especies. Repessé y colaboradores (2007), exponen que los residuos que no se encuentran expuestos en la superficie de la proteína, que son hidrofóbicos y que están altamente conservados, tienen una participación fundamental en la estabilidad de las proteínas globulares. Por ello, la presencia de una arginina en la posición 1994 podría afectar la conformación del FVIII y por ende, su estabilidad. No obstante, al analizar el modelo tridimensional del FVIII en base a su estructura cristalizada, se puede observar como la Gly1994 se encuentra cerca de uno de los sitios de unión a Ca2+ presente en el dominio A1 del FVIII (Figura 31, A). Este sitio está conformado por un loop cargado negativamente, gracias a la presencia de 3 residuos de ácido aspártico. En presencia de la Arg1994, cuya cadena lateral es larga y se encuentra cargada positivamente, el modelo tridimensional generado predice que este aminoácido estará ubicado 78 muy cercano al sitio de unión a Ca 2+ (Figura 31, B). De esta manera, la presencia de una carga positiva en el loop cargado negativamente, interrumpirá la unión de los iones calcio. Los iones Ca2+ modulan la actividad del FVIII, ya que al unirse alteran la conformación de la proteína, proporcionando la orientación apropiada para su interacción con el complejo tenasa intrínseco. La importancia de la unión del calcio en el FVIII ha sido demostrada por estudios de mutagénesis sitio-dirigida, en los que se demostró adicionalmente, la participación de los residuos Glu110, Asp116, Glu122, Asp125 y Asp126 en la formación del loop cargado negativamente, que permite la unión del Ca 2+ (Fay y Jenkins, 2005). Figura 31. Modelo tridimensional de la estructura del FVIII. A) Proteína con el aminoácido normal GLY1994, el cual es un aminoácido sin carga y sin cadenas laterales. B) Proteína con la mutación ARG1994, el cual es un aminoácido con cadena lateral larga cargada positivamente. En amarillo se muestran los iones Ca 2+ que se unen mediante las cargas negativas formadas por el loop compuesto por los residuos ASP116, ASP125 y ASP126, mostradas en rojo. 79 Si el efecto de la mutación G1994R fuese sobre la estabilidad de la proteína, tal como proponen Repessé y colaboradores (2007), de manera que no fuese secretada o se degradara rápidamente, la ausencia total de la misma en el plasma conllevaría a un riesgo aumentado de desarrollar inhibidores en el paciente. De hecho, el paciente H-11 desarrolló inhibidores de baja respuesta frente a la terapia con FVIII, lo cual no sería de esperarse si la proteína estuviese en circulación pero con su función alterada. Sin embargo, el hermano del paciente (al que se le detectó la misma mutación), así como el paciente reportado por Repessé y colaboradores (2007) no desarrollaron inhibidores. Esto podría sugerir, que la aparición de los inhibidores en el paciente H-11 haya sido el resultado de la interacción entre otros factores de riesgo, como el tipo de tratamiento, la causa por la que recibió el tratamiento, la intensidad del mismo y la edad a la que inició el tratamiento. El efecto de los factores de riesgo genéticos asociados con el sistema inmune estudiados en este trabajo fue descartado en dicho paciente, ya que no posee ninguno de los alelos de riesgo. Por otro lado, esto apoyaría la teoría de que el efecto de la mutación G1994R altera su actividad, al impedir la unión de los iones calcio en el dominio A1. De esta manera, el sistema inmune no reconocería como extraño el FVIII administrado como tratamiento y no se desarrollarían los inhibidores. Sería interesante poder corroborar la presencia del FVIII en el plasma del paciente mediante ensayos antigénicos, así como conocer la historia terapéutica y respuesta del paciente frente al tratamiento, para poder determinar así el efecto final de la mutación y su asociación con el desarrollo de inhibidores. Met2238Val Los últimos 159 aminoácidos del extremo C-terminal del FVIII comprenden el dominio C2 de la proteína, el cual es en gran parte responsable de la unión al FvW y a las membranas fosfolipídicas, como las de la superficie de las plaquetas. La unión a ambos es mutuamente excluyente, ya que como se describió previamente, el FvW se une a la forma inactiva del FVIII para darle estabilidad, mientras que la forma activa del FVIII es la que se une a las superficies fosfolipídicas para ejercer su función procoagulante. Por otro lado, el dominio C2 del FVIII también ha mostrado participar en la unión al FX y a la trombina, resaltando aún más su importancia. Asimismo, en este dominio se encuentran diversos epítopes para diversos anticuerpos, por lo que representa uno de los sitios calientes antigénicos de la proteína (Spiegel y col., 2004). 80 En la base de datos HAMSTeRS se han descrito más de 50 mutaciones de pérdida de sentido en el dominio C2 del FVIII, de las cuales más de la mitad ocurren en residuos que se encuentran expuestos hacia la superficie. La ocurrencia de mutaciones en estos aminoácidos puede causar la desestabilización de la proteína o el mal plegamiento de la misma, que conlleven a alteraciones en el transporte o secreción de la misma, por lo que no se esperarían niveles antigénicos detectables de FVIII. Asimismo, estas mutaciones también pueden afectar la interacción con el FvW o con las plaquetas. El residuo Met2238 se encuentra expuesto hacia la superficie de la hoja β7 del dominio C2, e interactúa mediante fuerzas de van der Waals con la Cys2326, de manera que podría favorecer la estabilidad de la región (Spiegel y col., 2004; Liu y col., 2000). Sin embargo, un estudio realizado por Spiegel y colaboradores (2004), demostró que la estabilidad del dominio C2 en presencia de la mutación Val2238 es similar que en presencia del residuo normal (Met). Asimismo, los autores también encontraron que la mutación no afecta la afinidad por las membranas fosfolipídicas, así como la unión con el FvW. No obstante, dichos resultados no demuestran que la mutación no pueda alterar otras regiones de la proteína o la interacción del dominio C2 con otros dominios del FVIII, así como la interacción del FVIII con el FIX o con la trombina (Spiegel y col., 2004). La mutación M2238V fue reportada en cuatro pacientes con HA leve-moderada por Arruda y colaboradores (1995). Estos autores consideraron la posibilidad de que dicha mutación representara un polimorfismo debido a su alta frecuencia dentro del grupo de pacientes que analizaron (9,5%). Sin embargo, al analizar dos grupos de individuos controles de origen holandés y brasilero, no encontraron la presencia de dicha mutación, por lo que sugirieron que el origen étnico de los pacientes que sí la poseen podría ser diferente al de los grupos control analizados. En un estudio realizado posteriormente, Williams y colaboradores (1998), encontraron la mutación M2238V en un paciente que adicionalmente posee la mutación IVS5 -2 A>G. Sin embargo, luego de analizar a varios familiares del paciente determinaron que todos poseían la mutación M2238V, incluyendo a su padre no hemofílico y a dos hermanas no portadoras de la patología. Al igual que Arruda y colaboradores (1995), los autores quisieron corroborar si la mutación efectivamente representaba un polimorfismo, por lo que analizaron otros 19 pacientes con HAS, así como 25 individuos control de origen Caucásico, en los que nuevamente, no se encontró ningún individuo con la mutación. Sin embargo, como la familia del paciente es de 81 origen jamaiquino, existía la posibilidad de que fuese un polimorfismo de origen Afro-caribeño. De esta manera, el origen étnico de la mutación pudo ser corroborado luego de analizar 31 individuos jamaiquinos no relacionados, en los que se encontró una alta prevalencia del alelo mutado (42%), representando así un polimorfismo para este grupo étnico. Su detección como marcador polimórfico puede ser de gran utilidad para analizar familias de origen africano, ya que es fácilmente detectable mediante análisis de restricción con la enzima BsrDI (Williams y col., 1998). El carácter polimórfico del residuo 2238 del FVIII se resalta luego de comparar las secuencias aminoacídicas reportadas para diversas especies animales (Figura 32), ya que se puede observar cómo la Met tanto como la Val, están presentes en la posición 2238. Esto sugiere que la función de la metionina dentro del dominio C2 de la proteína puede ser reemplazada por otro aminoácido apolar como lo es la valina. En este sentido, al observar los modelos tridimensionales generados en base a la estructura cristalizada de la proteína (Figura 33), se puede observar cómo la presencia de la Val2238 no causa la interacción o repulsión con otros residuos cercanos, ni genera impedimento estérico con ninguno de ellos. Figura 32. Alineamiento de la secuencia proteica del FVIII de diversas especies animales. Se puede observar como la metionina 2238, al igual que la valina, se ha conservado en diversas especies, por lo que cumplen funciones similares dentro de la proteína. 82 Figura 33. Modelo tridimensional de la estructura del FVIII. A) Proteína con el aminoácido normal Met2238, el cual es un aminoácido apolar. B) Proteína con la mutación Val2238, el cual también es un aminoácido apolar, con una cadena lateral más corta que la metionina. El origen étnico específico del polimorfismo M2238V fue corroborado en un estudio realizado por Viel y colaboradores (2007), al analizar 137 individuos sanos no relacionados pertenecientes a 7 grupos étnicos diferentes. Luego de analizar la región codificante del gen del FVIII, determinaron los diferentes polimorfismos presentes en los grupos analizados, encontrando que la mutación M2238V estaba presente exclusivamente en individuos de origen africano. El polimorfismo M2238V, así como otros tres polimorfismos no sinónimos encontrados (R484H, R776G y D1241G), demuestran que el FVIII es una proteína variable en población sana y no es monomórfica como se pensaba anteriormente. 83 En este sentido, Viel y colaboradores (2009), posteriormente estudiaron un grupo de 78 pacientes negros para determinar la presencia de los 6 posibles haplotipos conformados por los polimorfismos R484H, R776G, D1241G y M2238V en el FVIII (Figura 34). En dicho grupo sólo se encontró la presencia de los haplotipos H3 (R, R, E, V), H4 (H, R, E, M) y H5 (R, R, D, V), de los cuales el 24% posee el haplotipo H3 o H4. Por otro lado, la presencia de los haplotipos presentes en la población negra fueron asociados con un riesgo incrementado de desarrollar inhibidores, calculado con un OR de 3,6 (CI 95 % 1,1-12,3 p=0,04). Los autores proponen que el riesgo incrementado a desarrollar inhibidores en los pacientes negros, puede deberse a que el FVIII recombinante que se produce para el tratamiento de la HA, corresponde con los haplotipos H1 y H2, de manera que el sistema inmune podría reconocerlos como extraños. El estudio de Viel y colaboradores (2009) abre la puerta para nuevas investigaciones que quizá permitan conducir al desarrollo de productos terapéuticos más confiables y seguros, formulados en base al haplotipo del FVIII que posea el paciente. Figura 34. Polimorfismos no sinónimos presentes en el gen del FVIII de la coagulación y representación de los 6 haplotipos posibles. Los haplotipos H1 y H2 están presentes en todos los grupos étnicos, especialmente los de origen caucásico, mientras que los H3, H4 y H5 están presentes exclusivamente en pacientes negros, al igual que el haplotipo H6 está presente en pacientes chinos (Tomado de Viel y colaboradores, 2009). 84 Ya que la mutación M2238V ha mostrado ser un polimorfismo frecuente en la población negra, sería interesante conocer el origen étnico del paciente H-52, ya que fue el único que presentó la variante Val2238. Dado que no se detectó en este paciente ninguna otra variante, el haplotipo al que correspondería sería el H5. Aunque este haplotipo pueda aumentar su riesgo a desarrollar inhibidores, aún queda por determinar la mutación causante de la patología en este paciente, ya que podría esperarse que no se hayan desarrollado inhibidores sí la mutación que causa la patología no impide su secreción. Para determinar la mutación causante de la HAS en este paciente, sería necesario amplificar en reacciones individuales los 40 fragmentos empleados en la M-PCR, para enviarlos a secuenciar y analizar cada una de las regiones. Leu172Phe La mutación L172F que fue encontrada en el paciente H-97, fue descrita previamente por Bogdanova y colaboradores (2007), y es el único reporte que se encuentra en la literatura. El residuo Leu172 está presente en el dominio A1 del FVIII y se encuentra altamente conservado entre las diversas especies, tal como se puede observar luego de comparar las secuencias proteicas reportadas para distintas especies animales (Figura 35). Figura 35. Alineamiento de la secuencia proteica del FVIII de diversas especies animales. Se puede observar como la lisina 172 está conservada entre todas las especies analizadas. A pesar que Bogdanova y colaboradores (2007) no hacen mayor mención a la mutación L172P, comentan que ésta al igual que otra serie de mutaciones que determinaron en un grupo de pacientes, tiene efecto posicional, de manera que la mutación ejerce cambios en los ángulos 85 de torsión en la cadena polipeptídica en la que se encuentra. Este tipo de mutaciones, incluye la presencia de nuevos residuos cuya área de interacción es más grande, que aunque no afectan la conformación de la proteína, podrían ejercer impedimento estérico con otros residuos. Por otro lado, también podrían alterar los puentes de hidrógeno entre otros residuos adyacentes, con lo cual a su vez se podría afecta la estabilidad de la proteína (Bogdanova y col., 2007). Al analizar el modelo tridimensional basado en la estructura cristalizada del FVIII, se puede observar como la Leu172 se encuentra cercana a la Ser160 (Figura 36, A). Aunque la leucina es un aminoácido apolar al igual que la fenilalanina, ésta última contiene un anillo aromático. Si observamos el modelo tridimensional nuevamente, podemos notar cómo la presencia de la Phe172 podría ejercer un efecto de impedimento estérico con la Ser160, ya que se predice que el anillo aromático de la fenilalanina estará en estrecho contacto con la serina (Figura 36, B). Figura 36. Modelo tridimensional de la estructura del FVIII. A) Proteína con el aminoácido normal Leu172, el cual es un aminoácido apolar con una cadena lateral corta bifurcada. B) Proteína con la mutación Phe172, aunque también es un aminoácido apolar, posee una cadena lateral larga con un anillo aromático, que podría generar impedimento estérico con la Ser160. 86 De esta manera, el efecto por impedimento estérico que proponen Bogdanova y colaboradores (2007) tiene sentido luego de observar el modelo tridimensional del FVIII con el residuo normal y mutado. Aunque el paciente que reportan dichos autores está clasificado como moderado, en nuestro caso la mutación está asociada con una forma severa de la enfermedad. Esto resalta la importancia de la región en la cual se encuentran la Leu172 y Ser160, ya que un cambio en el residuo 172 por una fenilalanina conllevará a la aparición de la patología. En el dominio A1 del FVIII, donde están presentes los residuos 160 y 172, se encuentran los sitios de interacción con el ión Cu +, que permiten mantener la cadena liviana y pesada unidas entre sí (aumenta la especificidad de unión más de 100 veces). Esta interacción con el cobre representa más del 80 % de la estabilidad de ambas cadenas. Diversos residuos presentes en el dominio A1 y A3 del FVIII permiten que esta interacción sea posible, gracias a interacciones hidrofóbicas y electrostáticas (Fay y Jenkins, 2005). Aunque los residuos 172 y 160 no están involucrados directamente en la unión a Cu+, el efecto que podría ejercer la Phe172 sobre la región podría alterar la unión a este ión, y por ende, la interacción entre las 2 cadenas del FVIII. Gly2325Asp Como se describió previamente, el extremo C-terminal del FVIII comprende al dominio C2 de la proteína, el cual está involucrado en la interacción con el FvW y las membranas fosfolipídicas, así como con el FX y la trombina (Spiegel y col., 2004). De esta manera, la presencia de mutaciones en esta región puede alterar la conformación de la proteína y/o su estabilidad, así como su interacción con los otros componentes del complejo tenasa intrínseco. De las 5 mutaciones de pérdida de sentido encontradas en los pacientes con HAS, dos están presentes en el dominio C2 del FVIII. Aunque la mutación M2238V resultó ser un polimorfismo, la mutación G2325D encontrada en el paciente H-104 ha sido reportada una vez en la base de datos HASMTeRS en un paciente con HAS. El hallazgo de dicha mutación no ha sido reportado en la literatura, por lo que el efecto sobre la proteína aún no ha sido descrito. Para dilucidar el efecto que la mutación G2325D puede ejercer sobre el FVIII, se procedió a comparar las secuencias proteicas del FVIII de diversas especies animales, con lo cual se pudo observar que la Gly2325 está altamente conservada (Figura 37), sugiriendo que la presencia de este aminoácido en dicha posición es importante para el FVIII. De esta manera, el 87 cambio de una glicina, que es un residuo sin cadenas laterales, polar y sin carga, por un ácido aspártico, que posee una cadena lateral con carga negativa, debe afectar alguna propiedad importante del FVIII para causar un fenotipo severo en el paciente. Figura 37. Alineamiento de la secuencia proteica del FVIII de diversas especies animales. Se puede observar como la glicina 2325 está conservada entre todas las especies analizadas. Se excluyó la secuencia reportada para el conejo porque no estaba completa en los últimos aminoácidos. El residuo 2325 del FVIII está ubicado a 6 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína, en una región compuesta principalmente por residuos sin carga (~77%), al igual que los aminoácidos presentes en la hoja β7, que se encuentra muy próxima. Pratt y colaboradores (1999), sugieren que los aminoácidos cercanos a la Val2223 están involucrados directamente en la unión a las membranas fosfolipídicas. Particularmente, los aminoácidos hidrofóbicos y con cadenas laterales básicas, contribuyen con la energía de unión a dichas membranas. De esta manera, mutaciones en esta región conllevarían a una proteína con menor afinidad por las superficies cargadas negativamente, como la de las plaquetas. Aunque la Gly2325 está 100 residuos después que la Val2223, podría participar igualmente en la unión a las superficies fosfolipídicas. Bogdanova y colaboradores (2007), describen una mutación en el mismo residuo 2325, en el que cambia la glicina por una alanina. En dicho caso, comentan que la mutación puede alterar las interacciones entre las cadenas cercanas, al ejercer efecto sobre residuos distantes, modificando posiblemente los puentes de hidrógeno formados entre las cadenas laterales de los mismos. En el caso de la mutación G2325D encontrada en este estudio, la presencia de un ácido aspártico, cuya cadena lateral está cargada negativamente, podría tener un 88 efecto mayor sobre la afinidad del dominio C2 por las membranas fosfolipídicas, ya que al estar cargadas negativamente, habría repulsión de cargas. Si se observa el modelo tridimensional basado en la estructura cristalizada del FVIII, se puede notar como la Gly2325 no interactúa con ningún otro residuo (Figura 38, A), mientras que efectivamente, la presencia del Asp235 con carga negativa (Figura 38, B), podría desestabilizar el extremo C-terminal del FVIII, y por ende, su posible interacción con las superficies plaquetarias, donde ejerce su actividad procoagulante. Figura 38. Modelo tridimensional de la estructura del FVIII. A) Proteína con el aminoácido normal Gly2325, un residuo sin carga y sin cadenas laterales. B) Proteína con la mutación Asp2325, un residuo con cadena lateral cargada negativamente, que podría afectar la interacción del dominio C2 del FVIII con las membranas fosfolipídicas. 89 Cys1858Tyr Los puentes disulfuro son enlaces covalentes entre pares de cisteínas presentes en una proteína o cadena polipeptídica. Este tipo de enlaces ha tenido un rol importante en la evolución de las proteínas, ya que pueden tener un papel a nivel estructural o funcional en la proteína (Hogg, 2009). En el caso del FVIII, McMullen y colaboradores (1995) demostraron la presencia de siete enlaces disulfuro, que ayudan a mantener la conformación y estructura terciaria de la proteína. De los siete enlaces presentes, 6 están en los dominios A del FVIII. Uno de ellos, presente en el dominio A3 del FVIII, está formado por las cisteínas 1832 y 1858. La importancia de este enlace se resalta luego de realizar el alineamiento entre las secuencias proteicas reportadas del FVIII para diversas especies animales, en la que se puede observar que ambas cisteínas se encuentran altamente conservadas (Figura 39). Figura 39. Alineamiento de la secuencia proteica del FVIII de diversas especies animales. Las cisteínas 1858 y 1832 están altamente conservadas entre las especies animales. Ambas forman uno de los 7 puentes disulfuro presentes en el FVIII de la coagulación. La mutación C1858Y encontrada en el paciente H-13 no ha sido reportada previamente. En este caso, el cambio de la cisteína 1858 por una tirosina, conlleva a la pérdida del enlace disulfuro que se formaba con la cisteína 1832. La pérdida de este puente disulfuro podría alterar la estructura terciaria de la proteína, particularmente la del dominio A3. En este dominio, se encuentra la región de interacción con el FIXa, así como uno de los sitios de activación por la trombina (Arg1689) (Fay y Jenkins, 2005). De esta manera, la mutación C1858Y podría alterar la actividad procoagulante del FVIII, al cambiar la estructura terciaria del dominio A3, reduciendo su capacidad de interacción con el FIXa y la trombina. La importancia del enlace disulfuro 1832-1858 queda resaltada aún más por el fenotipo severo observado en el paciente 90 H-13. En la Figura 39 se representa el modelo tridimensional del FVIII, basado en su estructura cristalizada, en la que se puede observar la formación del enlace disulfuro entre las cisteínas 1832 y 1858 (Figura 40, A), así como la pérdida de éste cuando está presente una tirosina en la posición 1858 (Figura 40, B). Figura 40. Modelo tridimensional de la estructura del FVIII. A) Proteína con el aminoácido normal Cys1858, formando un enlace disulfuro con la Cys1832. B) Proteína con la mutación C1858T, en la que se pierde el enlace disulfuro por la presencia de la Tyr1858. VI.3.3.4 Mutaciones que alteran el empalme del ARNm A pesar que el gen del FVIII posee 50 sitios de empalme (25 intrones), la frecuencia de mutaciones en estos sitios es baja. Diversos estudios reportan frecuencias para este tipo de mutaciones en los pacientes con HAS, que varían entre el 2 y 6 % (Sirocova y col., 2009; Green y col., 2008; David y col., 2006; Jayandharan y col., 2005), lo cual coincide con los resultados obtenidos en este estudio, ya que la frecuencia encontrada en los pacientes fue del 5,5 %. 91 Las mutaciones que afectan el empalme pueden causar alteraciones variables en la actividad del FVIII, por lo que pueden causar HA leve, moderada y severa. Son pocos los estudios que han analizado el efecto de dichas mutaciones sobre el ARNm y la proteína, de los cuales en sólo 10 se han reportado los niveles antigénicos (en plasma) del FVIII. En 5 de esos 10 casos, los niveles de FVIII:Ag determinados mostraron ser mucho mayores que los niveles de FVIII:C, por lo que se presume que las mutaciones presentes en dichas muestras no afectaron los niveles de la proteína sino más bien su actividad (Gau y col., 2003). Aunque en este estudio no se realizó el análisis del ARNm de los pacientes con mutaciones que afectan el empalme, mediante el uso del programa “Splice Site Prediction Program” (SSPP) disponible en la web, se pudieron predecir los sitios aceptores de empalme en cada uno de los intrones en los que se encontraron las mutaciones, y poder así conocer el posible efecto de cada una de ellas sobre el ARNm. En la Figura 41 se muestran las secuencias intrónicas donde ocurrieron cada una de las mutaciones, y la predicción de la utilización de nuevos sitios aceptores de empalme en algunos de los casos (H-01 y H-127). A continuación se discute el efecto que podría tener cada mutación encontrada. Figura 41. Sitios aceptores del empalme del ARNm en los tres pacientes con mutaciones encontradas. En rojo y negrillas se muestran los sitios aceptores, el nucleótido subrayado indica donde ocurre la mutación. La secuencia en negro forma parte del intrón, mientras que la secuencia en azul corresponde al exón. En azul oscuro y negrillas se indican los posibles nuevos sitios aceptores de empalme. En morado y negrillas se muestran los sitios donadores de empalme. 92 IVS10 -2 A>T En el paciente H-01 se encontró la mutación IVS10 -2 A>T, en la que se altera el sitio aceptor del empalme en el intrón 10. Esta mutación no se encuentra reportada en la base de datos ni en la literatura, pero Jayandharan y colaboradores (2005) reportan por primera vez una mutación en la misma posición (IVS10 -2 A>G) en un paciente con HAS. Aunque los autores no analizaron el efecto de dicha mutación sobre el empalme del ARNm, la presencia de la mutación, al igual que la mutación encontrada en el paciente H-01 en nuestro estudio, conllevaría a la pérdida del exón 11 del FVIII. De esta manera, el empalme se llevaría a cabo entre el sitio donador del intrón 10 y el sitio aceptor del intrón 11. Para poder corroborar el efecto de la mutación sobre el empalme sería necesario analizar el ARNm del paciente y verificar si efectivamente ocurre la pérdida total del exón 11 en el mismo. Al analizar el efecto de la mutación con el programa SSPP, se predice la utilización de un sitio aceptor nuevo presente dentro del exón 11 (nucleótidos 1660-1661) (Figura 40). En caso de que el empalme ocurriera con este sitio, ocurriría la corrida del marco de lectura y se formaría un codón de terminación prematuro que conllevaría a la formación de una proteína truncada. De forma similar, si el efecto de la mutación conlleva a la pérdida total del exón 11, también conllevará a la corrida del marco de lectura y a la formación de un codón de terminación, ya que el exón 11 no se encuentra en marco de lectura abierto. Esto es debido a que los dos primeros nucleótidos del exón 11 forman parte del residuo Gly484 junto con el último nucleótido del exón 10, por lo que la pérdida del exón 11 generaría la aparición de un codón de terminación dentro del exón 12 y la formación de una proteína truncada. IVS13 -1 G>A En el paciente H-26 se determinó la presencia de la mutación IVS13 -1 G>A, que conlleva a la pérdida del sitio aceptor del empalme del intrón 13 del gen del FVIII. Al perderse este sitio, se emplearía el sitio aceptor del intrón 14, que conllevaría a la pérdida del exón 14. Como se describió anteriormente, el exón 14 del gen codifica para el dominio B de la proteína, que aunque no es funcionalmente activo, es importante para el procesamiento y transporte intracelular del FVIII, así como para su ciclo de vida en el plasma (Pipe, 2009). Al analizar la secuencia con la mutación, el programa no predice la utilización de otro sitio aceptor alternativo, por lo que el exón 14 efectivamente se perdería como parte de los intrones 13 y 14. 93 Aunque la mutación IVS13 -1 G>A fue reportada previamente por Liu y colaboradores (1998) en un paciente con HAS que desarrolló inhibidores, no se ha analizado el efecto de la misma sobre el ARNm, ya que los autores no realizan mayores comentarios sobre la misma. El exón 14 no se encuentra en marco de lectura abierto, ya que comparte los primeros dos nucleótidos con el último del exón 13 para formar la Gly686, y al final comparte los dos últimos nucleótidos con el primer nucleótido del exón 15 para formar la Arg1721. La pérdida del exón 14 no sólo conllevaría a la ausencia del dominio B del FVIII, sino que además conllevaría a la corrida del marco de lectura, de manera que en el exón 15 del gen se generará un codón de terminación prematuro. No obstante, con la sola ausencia del dominio B, el FVIII no podría ser secretado, ya que es este dominio el que permite su interacción con proteínas chaperonas en el retículo endoplasmático, de manera que el FVIII no podrá adquirir su conformación normal y tampoco podrá ser secretado. IVS24 -1 G>A En el caso de la mutación IVS24 -1 G>A encontrada en el paciente H-127, donde se pierde el sitio aceptor del empalme del intrón 24, el programa SSPP predice que en ausencia de éste se usará un nuevo sitio AG presente dentro del exón 25 (nucleótidos 6884-6885), de manera que se perderían los primeros 54 aminoácidos codificados por este exón, restando sólo 5 aminoácidos que permanecerían con el marco de lectura original (Figura 40). Sin embargo, la mutación fue reportada por primera vez y analizada por Gau y colaboradores (2003) en un paciente con HAS. La mutación fue detectada al analizar el ARNm de un paciente, en el que encontraron la presencia de una deleción que abarcaba 177 pb y que correspondía exactamente con la secuencia del exón 25 del gen. De esta manera, al analizar el ADNg del paciente, encontraron la presencia de una mutación en el sitio aceptor del empalme del intrón 24, en el que cambia el par AG por AA. Así, el exón 24 es erróneamente empalmado al exón 26, saltándose totalmente al exón 25. Posteriormente, David y colaboradores (2006), encontraron la misma mutación en otro paciente, y determinaron asimismo la pérdida total del exón 25, y el correcto marco de lectura en el resto de la secuencia correspondiente al exón 26. Por lo tanto, el empalme no ocurre en el sitio predicho por el programa SSPP y el exón 25 se pierde totalmente. 94 Para evaluar el efecto de la pérdida del exón 25 sobre la proteína, Gau y colaboradores (2003) midieron los niveles antigénicos del FVIII mediante ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) y determinaron en dos mediciones independientes, niveles normales de FVIII:Ag. Esto sugiere que el FVIII es sintetizado y secretado normalmente, y es estable en plasma, por lo que su interacción con el FvW no se ve afectada. No obstante, el exón 25 del gen codifica para la región central del dominio C2 del FVIII, abarcando los residuos 2223 al 2281. Como se describió anteriormente, esta región está involucrada directamente en la unión a las membranas fosfolipídicas (Pratt y col., 1999), por lo que la pérdida de este exón impediría que el FVIII ejerciera su actividad procoagulante en el complejo tenasa intrínseco. VI.3.3.5 Deleciones grandes La presencia de deleciones grandes y rearreglos cromosómicos en un gen, puede ser asumida cuando la amplificación de ciertos exones falla luego de haber realizado la PCR. Hasta la fecha, se han reportado más de 100 pacientes no relacionados que poseen deleciones grandes, en uno o más exones del gen del FVIII, lo cual representa una frecuencia del 5 % del total de mutaciones presentes en los pacientes con HAS (Pavlova y col., 2008; Nakaya y col., 2004). En nuestro estudio, se encontraron 3 pacientes con HAS que poseen deleciones grandes, que abarcan más de 6 exones del gen, representando una frecuencia del 5,5 %. Este tipo de alteraciones está altamente relacionado con el desarrollo de inhibidores frente al tratamiento, ya que cerca del 70-80 % de los pacientes los desarrollan. Asimismo, el riesgo de inhibidores está correlacionado con el tamaño de la deleción, ya que deleciones que involucran varios dominios de la proteína conllevan a un riesgo mayor (88 %), en comparación que aquellas deleciones en las que un sólo dominio se vea afectado (41 %) (Pavlova y col., 2008; Nakaya y col., 2004). Tanto la frecuencia de las deleciones grandes como la presencia de inhibidores coinciden con los valores reportados, ya que los tres pacientes desarrollaron inhibidores. Se sabe que las deleciones grandes ocurren principalmente en la línea germinal femenina, ya que cuando los cromosomas homólogos se aparean en la meiosis se pueden dar procesos de recombinación que conlleven a la deleción de grandes regiones genómicas. Generalmente, la recombinación ocurre gracias a la presencia de secuencias repetidas en el genoma, tales como los elementos repetitivos (Pavlova y col., 2008). Las secuencias de ese tipo más abundantes en el genoma, son las secuencias Alu, pertenecientes a la familia de los SINEs 95 y con un tamaño aproximado de 300 pb. Este tipo de elementos tienen un papel importante en el desarrollo de enfermedades, ya que pueden insertarse vía retrotransposición en diversos lugares del genoma y además, pueden promover procesos de recombinación homóloga. En este último caso, la recombinación puede conllevar a deleciones o duplicaciones de acuerdo a la orientación en la que se encuentren. En el caso del FVIII de la coagulación, se sabe que el gen contiene aproximadamente una secuencia Alu por cada 3,8 Kpb de ADN, lo cual representa un 6 % de la secuencia total del gen. Esta abundancia de secuencias Alu es el doble que las que se encuentran por ejemplo, en el gen del FIX, aunque en general está por debajo del promedio encontrado en el resto del genoma. Asimismo, el gen del FVIII contiene numerosas secuencias que forman repetidos directos e indirectos. Se sabe que existen 1.981 pares de secuencias repetidas únicas, así como 2.084 segmentos invertidos de más de 16 nucleótidos. De estas secuencias repetidas, el 59 % representan secuencias Alu, las cuales en su mayoría abarcan más de 16 pb. Por ello, el gen del FVIII es considerado un gen rico en secuencias Alu (Sommer y col., 2002). La participación de las secuencias Alu como mediadores de procesos de recombinación y causantes de deleciones en pacientes con HAS, fue descrita por primera vez por Vidal y colaboradores (2002). En dicho caso, el paciente poseía una deleción de aproximadamente 23 Kpb, en la que se perdieron los exones 24 y 25 del gen del FVIII. Aunque muchos trabajos describen la presencia de deleciones grandes en pacientes con HA, la determinación del punto exacto donde ocurrió sólo ha sido reportada en pocos casos, por lo que el mecanismo implicado en este tipo de rearreglos es poco conocido. En dicho estudio, los autores determinaron que la deleción era causada por una recombinación homóloga entre una secuencia Alu presente en el intrón 24 del gen del FVIII y otra presente en el intrón 25. Al recombinar, se perdió un segmento de 2.317 pb que incluye al exón 25, de manera que las secuencias que permanecieron intactas de los intrones 24 y 25 quedaron fusionadas. Al analizar mediante RT-PCR el ARNm del FVIII del paciente, determinaron que el empalme de los exones 24 y 26 ocurría correctamente, por lo que la deleción del exón 25 no afectaba el marco de lectura. La ausencia del exón 25 de apenas 177 pb, resulta en un FVIII a cuyo dominio C2 le faltan 59 aminoácidos. El paciente aunque sufría de HAS, no desarrolló inhibidores, quizás porque la proteína aún está presente en plasma. Sin embargo, los autores no realizaron la determinación de la proteína mutada en plasma. La recombinación que conllevó a dicha deleción, pudo haber ocurrido por la 96 formación de un loop intracromosómico, o por un apareamiento incorrecto de las cromátidas hermanas durante la meiosis (Vidal y col., 2002). De manera similar, Rossetti y colaboradores (2004b), reportaron el caso de un paciente con HAS que desarrolló inhibidores de alta respuesta, en el que determinaron la presencia de una deleción que abarca desde el exón 4 al exón 10 del gen del FVIII. Al analizar las secuencias aledañas al sitio donde ocurrió la deleción, determinaron la presencia de dos secuencias Alu, ubicadas una en el intrón 3 y la otra en el intrón 10 del gen. Por ello, proponen que la recombinación entre ambas secuencias Alu pudo haber sido la causa de la deleción de casi 6 Kpb en dicho paciente. Por otro lado, Nakaya y colaboradores (2004), caracterizaron la deleción del exón 24 en un paciente con HAS que desarrolló inhibidores. Determinaron que la deleción abarca 1.328 pb, y que ocurrió por recombinación homóloga entre una secuencia de 287 pb ubicada en el intrón 23 y una secuencia de 285 pb ubicada en el intrón 24, las cuales se encuentran en la misma orientación. Al analizar las secuencias, determinaron que eran un 85 % homólogas entre sí y que representaban secuencias Alu. El exón 24 se encuentra fuera del marco de lectura, ya que los dos primeros nucleótidos del mismo corresponden a la segunda y tercera base del codón 2.173, mientras que sí finaliza con un codón completo. De esta manera, al estar ausente el exón 24, el marco de lectura se corre ya que el exón 23 se fusiona ahora con la del exón 25, creando así un codón de terminación prematuro, en el tercer codón del exón 25. Así, el FVIII estaría compuesto sólo por los exones 1 al 23. En otro estudio, realizado por Fernández y colaboradores (2007), se describe el mecanismo por el cual ocurrieron deleciones grandes en 2 pacientes con HAS. En el caso del primer paciente, determinaron que la deleción abarcaba los exones 8 y 9 del gen del FVIII y que los sitios de ruptura estaban ubicados dentro de cada uno de los exones. Al analizar las secuencias aledañas encontraron que había homología en 3 pb entre los sitios donde debió ocurrir la recombinación homóloga y la posterior deleción. En el segundo paciente, determinaron que posee una deleción del exón 15 que abarca aproximadamente 7.300 pb, donde los sitios de quiebre están ubicados en los intrones 14 y 15 del gen. De manera similar, al analizar dichas regiones encontraron la presencia de secuencias ricas en A+T, así como dos copias en tándem de 9 pb. Aunque en este caso las deleciones no ocurrieron por recombinación entre secuencias Alu, este estudio representa uno de los pocos en donde se realizó la 97 caracterización de los eventos que conllevaron a la recombinación homóloga entre secuencias repetidas ubicadas dentro del gen del FVIII, y representa un ejemplo más de la importancia de las secuencias repetitivas en el desarrollo de la HA. En el caso de las deleciones encontradas en los pacientes analizados en este estudio, no se lograron acotar las regiones donde ocurrió cada una de las deleciones. En los pacientes H-21 (del_E14-E22) y H-75 (del_E7-E14) se intentó realizar la amplificación usando los cebadores más cercanos que sí amplificaron en la M-PCR, pero no se obtuvieron resultados satisfactorios. Aunque las condiciones de amplificación fueron modificadas, es posible que los productos a obtener sean sumamente grandes y no amplifiquen fácilmente mediante PCR, más aún cuando se trata de un producto del cual no conocemos su extensión. En el caso del paciente H-65 (del_RP-E6), no se contaban con otros cebadores que estuviesen ubicados más aguas arriba en la región promotora para intentar acotar la región donde ocurrió la deleción. Lo que debería hacerse en estos casos para lograr la caracterización de las deleciones, es diseñar varios pares de cebadores desde el último par que amplificó y hacia la región que se delecionó, hasta lograr obtener un par que esté lo más cercano posible al sitio donde ocurrió la deleción. De manera similar se hace por el otro extremo, y una vez que se tienen los dos pares de cebadores, se prueba amplificar usando el cebador sentido de uno con el antisentido del otro. Una vez que se logre obtener un producto de PCR, es necesario analizar la secuencia que dicho producto para lograr determinar el mecanismo que conllevó a la deleción. La presencia de deleciones en mujeres que pueden ser portadoras de HA es más complicada, ya que su detección no puede ser realizada por las técnicas convencionales de amplificación por PCR, debido a que la amplificación del alelo normal enmascara la deleción en el otro alelo del gen. Por ello, la detección de mujeres portadoras en estos casos requiere de técnicas más sensibles y precisas que permitan el diagnóstico adecuado de la enfermedad. En muchos casos, la detección es realizada mediante PCR cuantitativa, ya que los niveles de amplificación van a variar en comparación con una mujer cuyos alelos no poseen ninguna deleción. De manera similar, tal como reportan Pavlova y colaboradores (2008), se pueden combinar las técnicas de PCR y cromatografía líquida para lograr la cuantificación de los exones que fueron eliminados y diferenciar así, entre portadoras y no portadoras de dichas alteraciones. 98 Resumen de las mutaciones encontradas Los resultados encontrados en este trabajo, luego de realizar por primera vez en Venezuela la detección de las mutaciones presentes en el gen del FVIII en pacientes con HAS, coinciden con los datos reportados por Green y colaboradores (2008), en el que analizaron cerca de 840 familias con HA, las cuales representan 1/3 de los pacientes con esta enfermedad en el Reino Unido. En dicho estudio, encontraron que en los pacientes con HAS las mutaciones que predominan son las inversiones del intrón 22 y 1, las deleciones grandes, las mutaciones sin sentido y de corrida del marco de lectura (deleciones/inserciones pequeñas). En el caso de las mutaciones de pérdida de sentido, están más asociadas con la forma moderada y leve de la enfermedad, mientras que las mutaciones que afectan el empalme del ARNm, están presentes en las tres formas clínicas de la HA. Asimismo, en algunos casos de HA moderada, se pueden encontrar las inversiones del intrón 22 y 1, mutaciones sin sentido y de corrida del marco de lectura, pero la proporción es mucho más baja (Green y col., 2008). En la Figura 42 se muestra un resumen gráfico de las mutaciones encontradas en este estudio. Aunque no se encontraron pacientes positivos para la inversión del intrón 1, el bajo número de pacientes puede explicar que no se hayan conseguido pacientes con esta alteración. No obstante, de forma similar a los resultados de Green y colaboradores (2008) las mutaciones más frecuentes fueron la inversión del intrón 22, las mutaciones sin sentido y las deleciones o inserciones pequeñas. Inv-int22 Mutaciones sin sentido Deleciones/inserciones pequeñas Mutaciones de pérdida de sentido Deleciones grandes Mutaciones que afectan el empalme del ARN 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Figura 42. Resumen gráfico de la frecuencia de las mutaciones encontradas en los pacientes con HAS. 99 VI.3.3.6 Pacientes en los que no se detectaron mutaciones La técnica de CSGE empleada en este estudio para determinar la presencia de otras mutaciones en el gen del FVIII causantes de HAS fue efectiva en el 86,7 % de los casos, ya que no permitió identificar las mutaciones en 4 de los pacientes analizados. Es posible que la sensibilidad de la técnica no haya permitido detectar dichas mutaciones, tal como se ha reportado por otros estudios. Rossetti y colaboradores (2007) luego de analizar mediante CSGE las muestras de 33 familias no relacionadas con HAS, encontraron mutaciones en 29 de ellas, por lo que la eficiencia de la técnica fue de 88 %. Asimismo, Hwang y colaboradores (2009), luego de analizar 38 pacientes no relacionados con HA, no pudieron determinar la mutación causante de la patología en el 13,2 % de los pacientes. En el estudio realizado por Jayandharan y colaboradores (2005), donde analizaron 109 pacientes con HA mediante la técnica de CSGE, encontraron mutaciones en 101 de ellos (93%). La sensibilidad de la técnica fue mejor que aquella que normalmente se obtiene por otros métodos, tales como un 88 % por SSCP (Single strand conformation polymorphism), 60-80 % con DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) y 90% con secuenciación directa. Los autores explican que es posible que la M-PCR/CSGE haya pasado por alto algunas de las mutaciones, ya que la técnica no es sensible en los últimos 50 pb de cada producto de PCR. El tamaño óptimo para analizar por la técnica es entre 200 y 450 pb, por lo que es probable que el límite de la sensibilidad se haya excedido en algunos de los productos analizados (>450 pb). Es evidente del estudio de Jayandharan y colaboradores (2005), así como de otros investigadores (Hwang y col., 2009; Rossetti y col., 2007; Becker y col., 1996), que entre el 210% de las mutaciones no son detectadas en los pacientes con HA. Con los cebadores utilizados en este estudio, no es posible analizar cambios intrónicos más lejanos que podrían afectar la transcripción del gen o traducción del ARNm. También es posible que otros rearreglos diferentes a los de la inv-int22 e inv-int1 puedan estar presentes en los pacientes, y no ser detectados por amplificación por PCR y análisis mediante CSGE. Por otro lado, la presencia de mutaciones en los intrones que generen sitios crípticos de empalme ha demostrado ser la causa de numerosas patologías, por lo que sería necesario analizar el ARNm de cada paciente para descartar la presencia de las mismas. En este sentido, El-Maarri y colaboradores (2006) analizaron el ARNm de un grupo de pacientes en que no encontraron mutaciones en el gen del FVIII por las técnicas convencionales. 100 En uno de dichos pacientes, no se detectaron niveles de ARNm. Al analizar las posibles causas de dicha alteración, descartaron la presencia de mutaciones en la región promotora (3 Kpb) y región 3´-no traducida (2 Kpb); verificaron la inactivación del cromosoma X en la hermana y madre del paciente; descartaron el silenciamiento de la región Xq28 al comprobar la expresión de los genes F8B y HCBP6 (ubicado 5 Kpb aguas arriba); verificaron el patrón de metilación de una isla GC aguas arriba del promotor que podría actuar como represor si está metilado; y por último, descartaron la presencia de rearreglos cromosómicos grandes por análisis de cariotipo. Aún con todas las pruebas realizadas, no encontraron la mutación causante de la patología en el paciente. Por ello, los autores proponen dos posibles explicaciones al hecho: una, es que haya alguna alteración intrónica que desestabiliza el ARNm; o dos, que exista una mutación en un sitio de control aún no conocido, que actúe en cis sobre la expresión del gen del FVIII. Aunque la mayoría de los factores que actúan a distancia sobre la expresión de genes generalmente lo hacen en trans, en algunos casos se han reportado elementos que actúan en cis. En la enfermedad polidactilia preaxial, se reportó que un elemento regulador ubicado a 1 Mb del gen, cuando está alterado conlleva a la no expresión del gen Sonic Hedgehog (Shh). Aunque actualmente no se conoce la presencia de elementos lejanos que actúen en cis sobre el FVIII, su presencia no puede descartarse (El-Maarri y col., 2006). Por otro lado, incluso luego de secuenciar el gen del FVIII, la mutación causante de la patología en pacientes con HA no se logra identificar en cerca de un 2 % de los mismos (ElMaarri y col., 2006). Esto coincide con los resultados obtenidos por Uen y colaboradores (2003), en el que no pudieron determinar las mutaciones en cerca del 2 % de la población de pacientes con HA en Alemania (cerca de 6.000 pacientes), aún después de secuenciar toda la región codificante del gen. Existen tres posibles razones que pueden explicar la falla en la detección de las mutaciones: la primera, es la ausencia de niveles del ARNm, ya sea por degradación acelerada o por fallas en la transcripción; la segunda, es fallas en la traducción del ARNm o a nivel del proceso de secreción del FVIII; y la tercera, es una rápida o acelerada remoción del FVIII circulante, tal como en el caso de la EvW tipo 2 Normandy (2N) (El-Maarri y col., 2006; Uen y col., 2003). La EvW tipo 2N, se caracteriza por alteraciones en el sitio de interacción entre el FvW y el FVIII, en la que los niveles de FVIII están disminuidos aunque la actividad del FvW se encuentra normal. Muchos de los pacientes con este tipo de la enfermedad son confundidos con 101 una HA leve o moderada, ya que al verse afectada la interacción FvW-FVIII, el FVIII se degrada rápidamente, debido a que es el FvW quien le da estabilidad y lo protege de la degradación. El diagnóstico de la EvW tipo 2N puede confundirse con una HA, debido a que todas las pruebas, antigénicas, funcionales y estructurales del FvW dan normales (Michiels y col., 2009; Green y col., 2008). Asimismo, la HA también podría ser confundida por una EvW tipo 3, tal como el caso que reportan Mullah-Ali y colaboradores (2009), en el se determinó que un paciente que estaba clasificado como HAS, presentaba la forma severa de la EvW (tipo 3), que es la deficiencia total del FvW. Otro caso en el que no se identificaron mutaciones en algunos pacientes, es el reportado por Klopp y colaboradores (2002), en el que luego de analizar 600 pacientes con HA, no consiguieron mutaciones en 35 pacientes. Los autores consideran que la mutación puede estar presente en otras regiones (otros elementos reguladores en la región promotora o en los intrones), o en otras proteínas relacionadas que interactúan con el FVIII durante su síntesis en la célula o su función en la sangre. Un fenotipo similar a la HA es causada por mutaciones en el gen ERGIC53 que codifica para una proteína del compartimiento intermedio del retículo endoplasmático – Golgi. Esta proteína actúa como chaperona en el proceso de secreción tanto del FVIII como del FV. Por ello, mutaciones en el gen ERGIC53 conllevan a la pérdida de ambos factores de coagulación y a un fenotipo similar a la HA. Sin embargo, debido a que la herencia es autosómica recesiva y a que la deficiencia nunca es severa, esta alteración puede descartarse en muchos pacientes. En uno de los pacientes, Klopp y colaboradores (2002) determinaron la presencia de alteraciones en ERGIC53 que causaban la deficiencia de FVIII (más FV). No obstante, aún luego de secuenciar toda la región codificante, la región promotora y la región 3´-no traducida, no lograron identificar la mutación en 11 de los 35 pacientes. Otra explicación que Klopp y colaboradores (2002) proponen para no conseguir mutaciones en los pacientes con HA, es por la presencia de mosaicismo somático. Al ocurrir durante las primeras etapas de la embriogénesis, es posible que la mutación no se encuentre en el ADN de los linfocitos, de los cuales se extrae el ADN para el diagnóstico molecular. Sin embargo, esto podría explicar algunos casos de HA leve, ya que es poco probable que en los casos de HAS todas las células hepáticas estén afectadas y no se detecte en linfocitos. Por lo tanto, en el 2 % de los pacientes las mutaciones siguen sin ser identificadas. 102 En los 4 pacientes en los que no se detectaron mutaciones en el gen del FVIII en este estudio, sería necesario corroborar que se trata de una HA, chequear la historia familiar de cada paciente para verificar si existen otros familiares afectados o es un caso esporádico, en el que no se podría verificar el patrón de herencia; descartar la presencia de la EvW tipo 2N al analizar los exones 18-25 del gen que codifica para el FvW; analizar el ARNm para descartar la presencia de alteraciones que afecten su estabilidad o el empalme; secuenciar toda la región promotora, todos los exones y regiones intrónicas aledañas, así como la región 3´-no traducida; y en caso de que aún no se detecten las mutaciones, análisis más detallados como cariotipo, inactivación del cromosoma X y patrón de metilación. VI.4 Tratamiento de la Hemofilia A y desarrollo de inhibidores El tratamiento actual para la HA se basa en la administración periódica, mediante infusión intravenosa, de concentrados de FVIII obtenidos mediante la purificación de plasma sanguíneo o producidos en forma recombinante. Aunque recientemente han surgido nuevas preocupaciones sobre la seguridad del uso de concentrados plasmáticos, especialmente en relación a la posible contaminación con priones, que causan la enfermedad de CruetzfeldtJacob, la producción de FVIII recombinante ha permitido descartar estos problemas. No obstante, las proteínas recombinantes son más difíciles y costosas de producir, alcanzando hasta 200.000 dólares americanos al año, para un individuo con HAS. Asimismo, presentan el inconveniente de que pueden presentarse fallas en la producción que no permitan tener siempre el producto disponible (Youjin y Jun, 2009). El impacto del alto costo de las terapias para el tratamiento de la HA se ve reflejado principalmente en los países en vías de desarrollo, en los que no se logra tratar adecuadamente a los pacientes, y por ende, sufren de las secuelas propias de la enfermedad, como el daño y deformación de las articulaciones, dolor, incapacidad, e incluso la muerte. Stonebraker y colaboradores (2009), evaluaron el uso del FVIII en la terapia para la HA en 104 países y determinaron que su uso aumenta mientras mayor es la capacidad económica del país. En el caso particular de Venezuela, reportan que el uso promedio de FVIII durante los años 2.002 al 2.006 fue de 0.7924 UI per cápita, que es bastante menor que las 3,7-4,0 UI empleadas en Estados Unidos y Reino Unido, y de las 6,6 UI empleadas en Suecia, uno de los países pioneros en el tratamiento de la HA. Estas cifras contrastan con las estimaciones realizadas por la 103 Federación Mundial de Hemofilia, quienes reportan que de los 400.000 individuos con HA registrados a nivel mundial, cerca de 300.000 pacientes no ha recibido nunca, o ha recibido muy esporádicamente, tratamiento para la enfermedad. El uso y disponibilidad del FVIII en un país se refleja directamente sobre la calidad y esperanza de vida de los pacientes, por lo que es urgente encontrar una manera más económica y conveniente de tratar la HA (Youjin y Jun, 2009; Stonebraker y col., 2009). Por otro lado, la administración del tratamiento con FVIII en la mayoría de los casos se realiza en respuesta a un episodio hemorrágico, por lo que las hemorragias son tratadas, más que prevenidas. En consecuencia, las hemorragias repetidas originan el daño a las articulaciones, mientras que el riesgo de una hemorragia fatal se mantiene (Youjin y Jun, 2009). Más aún, aunque el tratamiento de la HA esté disponible, la expectativa de vida de los pacientes con HAS es 15 años menos (~63 años) en comparación con la de los hombres en la población general (75 años). Esta expectativa de vida reducida es principalmente el resultado de la aparición de hemorragias intracraneales (35%), o de hemorragias a consecuencia de traumas o heridas. La profilaxis, en la que se administra el tratamiento para prevenir la aparición de hemorragias, ha permitido disminuir significativamente los índices de mortalidad, especialmente en niños recién nacidos con HA (Darby y col., 2007). En una encuesta realizada por Walsh y Valentino (2009) en 10 centros de tratamiento para la HA en los Estados Unidos, determinaron que la profilaxis es sumamente eficaz en la prevención de episodios hemorrágicos y aparición del daño a las articulaciones en niños con HAS, en comparación que aquellos que son tratados por demanda. Lamentablemente, la profilaxis se deja de usar una vez que los pacientes han alcanzado la adolescencia, por lo que distintas organizaciones mundiales han recomendado considerar el uso de la profilaxis durante toda la vida de los paciente con HAS, ya que el riesgo de hemorragias traumáticas permanece, la severidad de la enfermedad se mantiene y el beneficio de la profilaxis es igual para todos los grupos de edades (Walsh y Valentino, 2009). En los países desarrollados, donde el costo y disponibilidad de la terapia generalmente no es un problema, la complicación principal en el tratamiento de los pacientes con HA es el desarrollo de inhibidores, ya que resulta en una ineficiencia parcial o total de la terapia. Esto no sólo conlleva a un aumento en los índices de morbilidad y mortalidad, sino a un aumento en el costo del tratamiento, el cual puede abarcar más del 98 % del total de los costos empleados para 104 la terapia de la HA. En el caso de los inhibidores de baja respuesta, el tratamiento generalmente se realiza administrando más dosis de concentrado de FVIII, mientras que en el caso de los inhibidores de alta respuesta se requiere el uso de otros agentes como el FVIIa recombinante (rFVIIa) o los concentrados de complejos de protrombina activados (aPCC). En el caso de niños con inhibidores, generalmente se realiza un tratamiento de inmunotolerancia, para eliminar los inhibidores y poder emplear la terapia convencional (Di Minno y col., 2009). Se ha debatido mucho sobre la conveniencia de usar niveles terapéuticos de FvW en la terapia con FVIII, para prevenir el desarrollo de inhibidores, ya que algunos estudios han demostrado un papel importante de la interacción entre el FVIII y FvW en la regulación del sistema inmune. Los anticuerpos inhibitorios contra el FVIII reconocen epítopes presentes en el dominio A2 de la cadena pesada y en el dominio C2 de la cadena liviana. En éste último, se encuentra un epítope que va desde el residuo 2.248 al 2.312. Cuando los anticuerpos se unen en esta región, la afinidad del FVIII por el FvW y por las membranas fosfolipídicas disminuye, mientras que si el FvW está unido la reactividad del FVIII a los anticuerpos es mucho menor (Terraube y col., 2009). Adicionalmente, el FvW previene la interacción entre el FVIII y las células presentadoras de antígeno (APC, antigen-presenting cells), como los macrófagos y las células dendríticas, inhibiendo de esta manera, la activación de las células T CD4+. Específicamente, el FvW impide la interacción del FVIII con el receptor CD206 presente en los macrófagos y células dendríticas, el cual media la endocitosis del FVIII, por lo que el FvW regula negativamente la capacidad del sistema inmune de reconocer al FVIII, y por tanto, reduce su inmunogenicidad (Terraube y col., 2009). VI.4.1 Desarrollo de inhibidores contra el FVIII El desarrollo de inhibidores contra el FVIII utilizado como terapia, se ha convertido en la complicación más importante en el tratamiento de la HA, ya que cerca del 25-30 % de los pacientes con HAS desarrollan inhibidores (Pavlova y col., 2009; Bafunno y col., 2009). Esto coincide con el grupo de pacientes analizados en este estudio, ya que un 30,9 % desarrolló inhibidores. En un paciente cuya deficiencia de FVIII es total y cuyo sistema inmune funciona normalmente, es de esperarse que desarrolle anticuerpos contra el tratamiento luego de repetidas exposiciones y más aún, cuando el tratamiento es administrado vía endovenosa. Lo que no aún 105 no está claro, es por qué algunos pacientes en condiciones similares no desarrollan inhibidores. Es por estos casos que surge la necesidad de conocer cuáles son los factores que determinan que el sistema inmune reconozca como propio o no al FVIII administrado como terapia (Hoots, 2006). La formación de anticuerpos anti-FVIII en pacientes con HA es un evento dependiente de las células T, que involucra a las células APC y a los linfocitos B, como se describió anteriormente. El FVIII exógeno se une a la superficie de las APC, donde luego es internalizado por endocitosis y procesado proteolíticamente. Péptidos específicos se unen a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II y son transferidos a la superficie celular para su interacción con el receptor de las células T (TCR) en las células T CD4 + (Paso 1, Figura 43). Posteriormente, las células T secretan citoquinas como la IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, TNFβ e interferon γ, que estimularán diversas respuestas inmunes, incluyendo la activación de las células B de memoria (Paso 2, Figura 43). Estas últimas, promoverán la activación de otras células B capaces de producir anticuerpos específicos contra el FVIII (Paso 3, Figura 43). Finalmente, estas células B plasmáticas secretarán anticuerpos anti-FVIII que neutralizarán el efecto de la terapia (Paso 4, Figura 43) (Astermark, 2006; Hoots, 2006). Figura 43. Proceso de formación de inhibidores contra el FVIII utilizado como tratamiento. Ver explicación en el texto (Tomado y modificado de Hoots, 2006). 106 El MHC clase II juega un papel importante en la respuesta inmune, ya que determina qué péptidos serán unidos a las células T. Variaciones en el fenotipo del MHC clase II podrían explicar la susceptibilidad individual a desarrollar inhibidores. De manera similar, el tipo de linfocitos T presente en un individuo representa otra fuente de variabilidad. Durante el proceso de gestación de un individuo sano, la respuesta inmune contra antígenos propios, como el FVIII, consiste en la eliminación de las células T que reconocen a este antígeno. En cambio, en un individuo con HA, donde no hay FVIII presente, no se generarán complejos con el MHC, por lo que las células T podrán reconocer al FVIII administrado en la terapia como exógeno (Astermark, 2006). No obstante, la influencia de ambos factores en el desarrollo de inhibidores ha mostrado ser poca, por lo que otros candidatos han sido sugeridos, entre los que se encuentran la IL10, el TNFα y el CTLA-4 (antígeno-4 asociado al linfocito T citotóxico) (Hoots, 2006). Efectivamente, Astermark y colaboradores (2006a; 2006b) encontraron una fuerte asociación entre polimorfismos presentes en la región promotora de los genes IL10, TNFA y CTLA4 con el desarrollo de inhibidores. Diversos estudios en pacientes relacionados, han mostrado que la respuesta inmune individual está determinada principalmente por factores de riesgo relacionados al paciente. La severidad de la enfermedad es el primer factor de riesgo asociado, ya que la mayor incidencia de inhibidores ocurre en los pacientes con HAS. De esta manera, el tipo de mutación en el gen del FVIII está asociado con el riesgo a desarrollarlos. Sin embargo, el tipo de mutación por sí sola no determina en todos los casos el desarrollo de inhibidores, ya que por ejemplo, los pacientes afro-americanos tienen dos veces más riesgo de desarrollarlos que aquellos pacientes caucásicos (Hoots, 2006). Así, el origen étnico del paciente también representa un factor de riesgo genético, como también lo son la historia familiar de inhibidores y el genotipo del sistema inmune (Bafunno y col., 2009; Hoots, 2006). Por su parte, existen factores de riesgo no géneticos o ambientales, que pueden modular la respuesta del sistema inmune contra el tratamiento. Entre estos factores se encuentran la edad a la que se realizó el primer tratamiento, el tipo de tratamiento, la intensidad y frecuencia con la que fue administrado y si el sistema inmune del paciente estaba comprometido en algún otro evento, como infecciones, cirugías o traumas (Bafunno y col., 2009; Hoots, 2006). El conocer los factores de riesgo asociados con el desarrollo de inhibidores y el poder predecir cuáles pacientes están en riesgo de desarrollarlos, facilitará la aplicación de una terapia 107 que permita evitar y controlar su aparición, así como la realización preventiva de tratamientos de inmunotolerancia (Bafunno y col., 2009). VI.4.1.1 Tipo de mutación presente en el gen del FVIII En particular, el tipo de mutación presente en el gen del FVIII ha mostrado contribuir considerablemente con el riesgo de desarrollar inhibidores, por lo que se considera el primer factor de riesgo asociado. La presencia de deleciones grandes, mutaciones sin sentido y aberraciones intracromosómicas, predisponen a un riesgo mayor, que aquellas mutaciones de pérdida de sentido, deleciones o inserciones pequeñas y mutaciones que afecten el empalme. Las mutaciones de alto riesgo, generalmente están asociadas con una incidencia de inhibidores que varía entre el 20-90 %, debido a que frecuentemente generan la ausencia total de FVIII (Astermark y col., 2009b; Bafunno y col., 2009; Astermark, 2006). Estos hallazgos coinciden perfectamente con los resultados obtenidos en este trabajo, ya que el tipo de mutación presente en el gen del FVIII que más se asoció con el desarrollo de inhibidores fue las deleciones grandes, donde el 100 % de los pacientes con este tipo de mutaciones los desarrollaron. Posteriormente, las otras mutaciones presentes con una alta frecuencia de inhibidores fueron la inv-int22 con un 36,4 % y las mutaciones sin sentido, con un 22 %. Aunque el paciente con la mutación G1994R desarrolló inhibidores, su asociación es débil, por las razones que se describieron previamente. De esta manera, las deleciones e inserciones pequeñas, las mutaciones de pérdida de sentido y que afectan el empalme encontradas en este estudio, se consideran de bajo riesgo debido a que la frecuencia de inhibidores en estos pacientes fue mucho menor. No obstante, muchos pacientes con mutaciones de alto riesgo no desarrollaron inhibidores: 14/22 con la inv-int22 y 7/9 con mutaciones sin sentido, lo que sugiere que otros factores genéticos o ambientales, influencian la respuesta inmune frente al tratamiento. Estos resultados coinciden con los obtenidos en el estudio MIBS, donde la concordancia de inhibidores fue del 70 % entre hermanos, y del 40 % entre familias que desarrollaron inhibidores. Más aún, este hecho también se ha observado incluso entre gemelos monocigóticos, lo cual resalta la importancia de los otros factores de riesgo en el desarrollo de inhibidores contra el FVIII (Bafunno y col., 2009; Astermark y col., 2009b) 108 VI.4.1.2 Polimorfismos en genes del sistema inmune La presencia de alguna infección o proceso inflamatorio en el paciente al momento en que se le administra el tratamiento, puede estimular la expresión de citoquinas proinflamatorias, que estimulen la producción de anticuerpos anti-FVIII (Bafunno y col., 2009). Aunque no se posee información sobre el manejo terapéutico de los pacientes con HAS analizados en este trabajo, ni la causa por la que fueron tratados, fue posible analizar el posible efecto de ciertas citoquinas sobre el desarrollo de inhibidores. Astermark y colaboradores (2006a; 2006b) fueron los primeros en sugerir que polimorfismos específicos en genes que codifican para componentes del sistema inmune, podrían influenciar el riesgo a desarrollar inhibidores. En dicho estudio, se encontró una fuerte asociación con el alelo 134 pb del microsatélite IL10G presente en la región promotora del gen IL10, y con el alelo -308A presente en la región promotora del gen TNFA. Posteriormente, Pavlova y colaboradores (2009) encontraron asociación entre el alelo -1082G en la región promotora del gen IL10 y el desarrollo de inhibidores. Sin embargo, recientemente un estudio realizado por Bafunno y colaboradores (2009) encontró resultados contradictorios, al no determinar asociación entre dichos alelos y el riesgo a desarrollar inhibidores en pacientes italianos con HA. Estos resultados podrían depender del origen étnico de la población analizada, por lo que se requieren más estudios para comprobar su asociación con el desarrollo de inhibidores. Interleuquina 10 La IL10 es una importante citoquina anti-inflamatoria, que posee un amplio espectro de actividades dentro del sistema inmune, que incluyen funciones inmunosupresivas, antiinflamatorias y estimulantes de las células B (Bafunno y col., 2009). Algunos estudios in vitro han demostrado que la IL10 estimula la producción de todos los tipos de inmunoglobulinas en pacientes con enfermedades autoinmunes, en las cuales la severidad ha sido correlacionada con la concentración de IL10 presente (Astermark y col., 2009b). El polimorfismo que ha tenido una implicación funcional más importante ha sido el alelo de 134 pb del microsatélite IL10G, el cual está presente en la región promotora del gen que codifica para la IL10 (Astermark y col., 2009b). En el estudio realizado por Astermark y colaboradores (2006a), la IL10 fue la única interleuquina que se asoció positivamente con el desarrollo de inhibidores. En dicho estudio, la frecuencia del alelo 134 pb del microsatélite 109 IL10G en la población de pacientes con HA fue de 0,268 con un OR de 4,4; al analizar únicamente el grupo de pacientes con HAS el OR aumentó a 5,4. Los resultados obtenidos en este estudio, contrastan con los de Astermark y colaboradores (2006a), ya que en el grupo de pacientes con HAS analizados, no se evidenció la presencia del alelo 134 pb, por lo que no hubo asociación con el desarrollo de inhibidores. Por otro lado, en la posición -1082 de la región promotora del gen IL10 se encuentra un polimorfismo bialélico (G>A), que ha sido asociado con la producción de diferentes niveles de IL10. Específicamente, la presencia del alelo -1082A ha sido asociada con una menor secreción de IL10 (Bafunno y col., 2009). En un estudio caso-control realizado por Pavlova y colaboradores (2009), en el que se incluyeron 260 pacientes con HAS, se determinó que el alelo -1082G se encontraba con mayor frecuencia en los pacientes que desarrollaban inhibidores, que en aquellos que no (0,55 vs. 0,43). A diferencia, en un estudio similar realizado por Bafunno y colaboradores (2009), donde analizaron un total de 443 pacientes italianos con HA, encontraron que no había diferencia significativa entre las frecuencias del alelo -1082G en los pacientes con y sin inhibidores (0,387 vs. 0,392), por lo cual el polimorfismo no estaba asociado. Aún más contrastante son los resultados obtenidos en este estudio, en el cual se encontró asociación significativa entre el desarrollo de inhibidores y la presencia del alelo -1082A. En la población de pacientes con HAS que desarrollaron inhibidores, la frecuencia del alelo G fue de 0,165 mientras que en la de pacientes sin inhibidores fue de 0,340. Por lo tanto, el alelo -1082G estaría asociado con un efecto protector contra el desarrollo de inhibidores, a diferencia de los estudios mencionados anteriormente. Las variaciones en la frecuencia del alelo 134 pb del microsatélite IL10G y del polimorfismo -1082 G>A encontradas en este estudio en comparación con estudios previos, parecen ser dependientes del origen étnico de la población analizada (Alemania, Italia, Venezuela), por lo que harían falta más estudios en otras poblaciones para determinar la verdadera influencia que estos polimorfismos pueden ejercer sobre la respuesta inmune de un individuo con HAS frente al tratamiento. Factor de Necrosis Tumoral alfa El TNFα es una citoquina proinflamatoria con actividad inmunomoduladora, que ha sido asociado con numerosas enfermedades infecciosas e inflamatorias, ya que es un importante 110 mediador de la respuesta inflamatoria. El polimorfismo más extensamente estudiado con efectos fisiopatológicos es el -308 G>A, ya que el alelo -308A se ha correlacionado con un incremento en los niveles de TNFα y con la formación de anticuerpos en pacientes que padecen de ciertas enfermedades autoinmunes (Bafunno y col., 2009; Astermark y col., 2009b). En el estudio MIBS, Astermark y colaboradores (2006b) encontraron que la presencia del alelo -308A estaba asociada con un incremento de 4,4 veces en el riesgo de desarrollar inhibidores en pacientes con HA. Al analizar únicamente pacientes con HAS, el riesgo incrementó a 19,2 veces. Dicha asociación se mantuvo aún después de corregir para la presencia del alelo 134 pb del microsatélite IL10G. Estos resultados fueron corroborados en el estudio realizado por Pavlova y colaboradores (2009), en el que se encontró que la frecuencia del alelo 308A era mayor en los pacientes con inhibidores que en los que no los desarrollaron (0,22 vs. 0,13). El genotipo homocigoto mutado (AA) estuvo asociado con un riesgo incrementado de desarrollar inhibidores de 4,7 veces. Por otro lado, Bafunno y colaboradores (2009) aunque no encontraron diferencias significativas entre los pacientes con y sin inhibidores, determinaron que la frecuencia del alelo -308A era ligeramente mayor en los pacientes con inhibidores (0,133 vs. 0,088). Nuevamente, los resultados encontrados en nuestro estudio no son consistentes con los estudios mencionados previamente, ya que aunque no se encontró asociación significativa entre el polimorfismo -308 G>A y el desarrollo de inhibidores, la frecuencia del alelo -308A fue ligeramente mayor en los pacientes que no desarrollaron inhibidores (0,145 vs. 0,090). Al igual que en el caso del polimorfismo -1082 G>A en el gen IL10, las inconsistencias encontradas pueden depender del origen étnico de las poblaciones analizadas, por lo que serán necesarios nuevos estudios que permitan determinar el papel de este polimorfismo en el desarrollo de inhibidores. VI.4.2 Terapia génica Otro de los beneficios de la realización de trabajos como éste, en donde se comprueba que la HA en los pacientes analizados es causada por la presencia de una mutación en el gen del FVIII que altera la estructura/función de la proteína, es que podría facilitar la aplicación de la terapia génica en dichos pacientes, cuando ésta llegase a estar disponible. La terapia génica resulta muy atractiva, en comparación con el tratamiento tradicional del FVIII, ya que permitiría curar completamente a los pacientes con HA. Para esta enfermedad, no es necesario que se restablezcan los niveles normales de FVIII, ya que la expresión de 111 niveles muy bajos del factor permitirá disminuir considerablemente los peores síntomas asociados con esta patología (Youjin y Jun, 2009; Terraube y col., 2009). La HA es una excelente candidata para la terapia génica por las siguientes razones: primero, es una enfermedad asociada a un sólo gen; segundo, es suficiente con aumentar 1-2% los niveles/actividad del FVIII para prevenir las complicaciones asociadas; tercero, la expresión tejido específica no es un requisito, siempre y cuando la proteína sufra las modificaciones posttraduccionales necesarias, por lo que cualquier tejido puede ser blanco para la terapia; cuarto, existen diversos modelos animales de HA que permiten estudiar la terapia, como perros que naturalmente sufren de la enfermedad y ratones knock-out para el FVIII; y por último, la determinación de los efectos terapéuticos puede ser fácilmente medida con pruebas como el PTT (tiempo de tromboplastina parcial activada) y actividad del FVIII (Youjin y Jun, 2009). La terapia génica consiste en la transferencia in vivo del gen del FVIII a través de un vector, ya sea viral o no, que permite la expresión de un FVIII funcional en un tejido blanco específico. El uso de los vectores virales predomina en los estudios de terapia génica para HA, debido a una alta eficiencia en la transferencia y una expresión mantenida en el tiempo. Los vectores AAV3 (adeno-associated virus) son uno de los más empleados, debido a su habilidad para infectar células que no están en división, mantener una expresión sostenida en el tiempo (varios años en modelos caninos) y reducir la inmunogenicidad, en comparación con otros vectores (Youjin y Jun, 2009). La terapia génica para el tratamiento de la HA ha estado rezagada en comparación con la de la HB, ya que el FVIII no se expresa tan eficientemente como el FIX, por lo que ha sido difícil expresarlo a niveles terapéuticos (Youjin y Jun, 2009). Sin embargo, algunos estudios recientes en modelos animales han mostrado una eficiente expresión a largo plazo del FVIII. Debido a que el FVIII requiere ser estabilizado por el FvW, diversos estudios han tratado de conducir la expresión y almacenamiento del FVIII en células y tejidos que naturalmente expresen el FvW. Algunas investigaciones in vitro han demostrado que esto es posible, logrando la co-localización de ambos factores (FVIII/FvW) en células endoteliales y megacariocitos. Esta estrategia resulta muy atractiva, ya que además eliminaría las limitaciones en el tratamiento de pacientes con inhibidores (Terraube y col., 2009). 3 El AAV es un virus pequeño, de ADN simple cadena, con una capacidad de aproximadamente 4.86 Kpb. No es patogénico, debido a que no tiene capacidad de auto-replicarse, pero posee alta capacidad de infectar y mantenerse estable en diferentes tejidos (Youjin y Jun, 2009). 112 Los pacientes con HAS que desarrollan inhibidores contra el tratamiento con FVIII, están continuamente en riesgo de sufrir de hemorragias severas, que afectan su calidad de vida y la ponen en peligro. Las consecuencias de esta problemática son aún mayores en los países en vías de desarrollo, ya que el costo del tratamiento de los pacientes con inhibidores es mucho mayor, de manera que los pacientes son más susceptibles a sufrir los efectos asociados con esta patología. Incluso en el área de la terapia génica, aún no se han logrado conseguir resultados prometedores, aunque los últimos estudios sugieren que una posible terapia podría estar disponible en los próximos años para los pacientes con HAS, incluso para aquellos que desarrollen anticuerpos anti-FVIII. Por otro lado, numerosos estudios realizados hasta la fecha indican que la aparición de inhibidores es el resultado de un complejo proceso que involucra factores tanto genéticos como ambientales. Por ello, el conocimiento de los factores de riesgo para el desarrollo de inhibidores permitirá descifrar el riesgo genético individual de un paciente, proporcionándole al médico tratante la información necesaria para aplicar la terapia adecuada, que permita reducir y controlar el riesgo de desarrollar inhibidores contra el tratamiento. VI.5 Consideraciones finales Luego de realizado el análisis molecular de 55 pacientes con HAS provenientes del Centro Nacional de Hemofilia (BMS), se reporta por primera vez en Venezuela el tipo y frecuencia de mutaciones presentes en el gen del FVIII causantes de la patología. Las técnicas aplicadas en este estudio, permitieron identificar 26 mutaciones distintas asociadas con HA, de las cuales 7 se reportan por primera vez en este trabajo. Los resultados encontrados en el grupo analizado reflejan en buena medida las características de la población de pacientes hemofílicos severos en nuestro país, las cuales a su vez concuerdan con numerosos estudios realizados en otros países y con mayor número de individuos. Las posibilidades de seguir ampliando y profundizando las causas genéticas que conllevan al desarrollo de HAS son numerosas, ya que de los pacientes analizados en este estudio aún faltan por determinarse muchos de los mecanismos que conllevan a la inestabilidad y/o disfuncionalidad del FVIII. En este sentido, sería sumamente interesante poder acotar los límites de las deleciones grandes encontradas, para así poder determinar qué elementos conllevaron a su aparición en cada caso. Asimismo, en el caso de las mutaciones que conllevan a proteínas truncadas que no han sido reportadas previamente, sería de gran utilidad analizar el 113 ARNm de dichos pacientes y determinar los niveles antigénicos de FVIII en los casos pertinentes. Por otro lado, el estudio de las mutaciones asociadas con el desarrollo de inhibidores, particularmente las presentes en ciertos genes del sistema inmune, abre la puerta para conocer cuáles son los factores de riesgo genéticos más importantes involucrados en la respuesta inmune del paciente contra el tratamiento. Asimismo, permitirá determinar si los resultados encontrados son específicos para determinadas poblaciones, resaltando aún más la importancia del origen étnico del paciente. Los resultados encontrados en este estudio contrastan con los pocos estudios que han sido realizados hasta la fecha, por lo que representan datos de gran interés para la comunidad médica y científica relacionada con el área. 114 VII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES - El análisis molecular del gen del FVIII permitió identificar la mutación causante de la patología en cerca del 93 % de los pacientes con HAS analizados. - La inversión del intrón 22 fue la alteración genética más frecuente encontrada en los pacientes con HAS, de los cuales un gran porcentaje desarrolló inhibidores contra el tratamiento con FVIII. - La inversión del intrón 1 no fue detectada en ninguno de los pacientes con HAS, posiblemente debido al bajo número de pacientes analizados. No obstante, su detección debe seguirse realizando en todos aquellos pacientes con HAS negativos para la inv-int22. - Las mutaciones puntuales más frecuentemente encontradas fueron las del tipo sin sentido, seguido por las deleciones/inserciones pequeñas, en las que de igual forma, se generan proteínas truncadas. Se encontraron 7 mutaciones que no han sido reportadas previamente en la base de datos HAMSTeRS o en la literatura. - Las deleciones grandes, de más de 6 exones, aunque no fueron las mutaciones más frecuentes, sí fueron las más asociadas con el desarrollo de inhibidores, ya que todos los pacientes con este tipo de alteración los desarrollaron. - En relación al análisis de los polimorfismos en genes del sistema inmune, sólo se encontró asociación estadísticamente significativa entre la presencia del alelo -1082A en la región promotora del gen IL10 y el riesgo de desarrollar inhibidores. - En los pacientes en los que no se encontraron mutaciones, se debe amplificar y secuenciar cada una de las regiones analizadas por M-PCR/CSGE, para tratar de identificar la mutación causante de la HAS. Asimismo, se debe confirmar el diagnóstico, y en caso de no conseguirse la mutación, se debe sospechar de alteraciones en otros genes involucrados con el FVIII. - Con los resultados obtenidos en este estudio, es posible realizar ahora el diagnóstico de mujeres portadoras en las familias de los pacientes analizados, así como predecir si los nuevos miembros afectados con la enfermedad en la familia podrían desarrollar inhibidores contra el FVIII empleado como tratamiento. 115 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abu-Amero, K., Hellani, A., Al-Mahed, M., Al-Sheikh, I. Spectrum of Factor VIII mutations in Arab patients with severe hemophilia A. Haemophilia 2008; 14; 484-488. Acquila, M., Pasino, M., Lanza, T., Bottini, F., Boeri, E., y Bicocchi, M. Frequency of factor VIII intron 1 inversion in a cohort of severe hemophilia A Italian patients. Haematologica 2007; 88; 83-83. Andrikovics, H., Klein, I., Bors, A. y otros. 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Dirección y teléfono actuales, en caso de requerir una segunda muestra o datos adicionales al estudio. Con su muestra de sangre se procederá única y exclusivamente al estudio de su molécula de FVIII, que permita conocer las alteraciones que causan la Hemofilia. La muestra será conservada en el Laboratorio de Genética Molecular Humana B de la Universidad Simón Bolívar bajo la responsabilidad de la Dra. Antonietta Porco hasta finalizar la investigación, después de la cual será desechada. Importancia y beneficios de su participación: Mediante este estudio, que podrá realizarse gracias a su valiosa colaboración con sólo proporcionar una muestra de su sangre, se podrá avanzar en el entendimiento de las causas de la Hemofilia, conocer las alteraciones más frecuentes en los pacientes con Hemofilia en Venezuela, y el diagnóstico preciso de las portadoras de su familia. Los resultados obtenidos en este estudio podrán ser publicados en revistas científicas especializadas. Riesgos: Su participación no implica riesgos ni inconvenientes para su salud ni la de sus familiares. Confidencialidad: Todos los datos obtenidos de la investigación serán mantenidos en absoluto secreto y toda la información sobre su persona será sólo accesible a los investigadores y médicos involucrados en el estudio. Su identidad no será hecha pública en ninguno de los manuscritos científicos o en las presentaciones que se realicen en eventos científicos. 126 (Hoja 2 de 3) Derecho a negarse a participar: La participación en este estudio es voluntaria. Usted puede negarse a participar en el estudio o interrumpir su participación en cualquier momento. Si usted se niega a participar en el estudio, esto no afectará el tipo de atención que recibirá usted o sus familiares por parte del médico tratante. Preguntas: Debido a que se utilizaron algunos términos técnicos en este formulario de consentimiento, si existe algo que usted no entienda, por favor pregunte sobre esto sin dudarlo. Por favor tome su decisión de participar en este estudio sólo después de haber examinado detenidamente el contenido de este formulario. Ante cualquier pregunta sobre este estudio, por favor contacte al médico tratante del Centro de Hemofilia, del Banco Municipal de Sangre: Dra. Boadas, Dra. Sáez, Dra. Bosch, Dra. Mijares. Teléfonos: 0212-5622325. 127 (Hoja 3 de 3) CONSENTIMIENTO Yo, ____________________________, portador de la cédula de identidad # ___________ he sido informada de manera amplia, clara y sencilla, y mis preguntas han sido contestadas con relación al estudio sobre la: “DETECCIÓN MOLECULAR DE ALTERACIONES EN EL GEN DEL FACTOR VIII EN PACIENTES QUE SUFREN DE HEMOFILIA A, PROVENIENTES DEL BANCO MUNICIPAL DE SANGRE (DC)”, que se llevará a cabo en forma conjunta entre el BMS y el Laboratorio de Genética Molecular Humana B de la USB, y por lo tanto manifiesto estar de acuerdo en participar en él, por lo que autorizo me sean tomadas las muestras sanguíneas necesarias para tal fin. He recibido una copia de este consentimiento. Nombre y apellido: _________________________________ Firma: ____________________ Fecha: ___/____/____ Representante (en casos de menores de edad) Nombre: ___________________________________ CI: _____________ __________________________________________________________________ Firma del investigador: Testigos: Nombre y apellido C.I. Firma 1.________________________________________________________________ 2._______________________________________________________________ 128 IX.2 Anexo II: Esquema de la formación de heterodúplex para la detección de mutaciones mediante la técnica de CSGE. Figura 44. Proceso de formación de heterodúplex para la detección de mutaciones mediante CSGE. 129 IX.3 Anexo III: Análisis de secuencias de los productos de I-PCR de pacientes positivos y negativos para la inv-int22. La secuencia obtenida por secuenciación automatizada del paciente H-88 (positivo) fue de 416 pb, que se muestra a continuación: >H88_IU_D05_007.ab1 gaccttagtaggacagatggcaaaaccaccttgaagataaggcgattcaatagtggtagatgataacataactaggtggatttgtaactggtttaat taccacaagagaacagtgacagttaatagatggttatcaacttaaagggagcattccggaaacagtgtagtacaacgattaccagttagggttctgg agcccaactatcagaatttgaattttggctcagtcacttattagccatgtgacttgggccacaataacctctctatgcttcaatttcattatctgaaatga agatgatagtaacatctacctcacaaggttgtagtaaggacttaacagcttgatttgtattgtgcacatactaaggaagtcttgtctacttcaatatttt gatcatgcttaacagaaccaa De la secuencia obtenida, 400 pb tienen 100% de homología con el gen del FVIII de la coagulación, donde los últimos pares de bases que tienen homología coinciden con el sitio de corte de la enzima de restricción BclI. > ref|NW_001842420.1|HsX_WGA1381_36 Homo sapiens chromosome X genomic contig, alternate assembly (based on HuRef SCAF_1103279188170) Length=869535 Features in this part of subject sequence: coagulation factor VIII isoform a precursor Score = 734 bits (397), Expect = 0.0 Identities = 399/400 (99%), Gaps = 0/400 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 Sbjct 311489 Query 61 Sbjct 311549 Query 121 Sbjct 311609 Query 181 Sbjct Query 311669 241 Sbjct 311729 Query 301 Sbjct 311789 Query 361 Sbjct 311849 GACCTTAGTAGGACAGATGGCAAAACCACCTTGAAGATAAGGCGATTCAATAGTGGTAGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACCTTAGTAGGACAGATGGCAAAACCACCTTGAAGATAAGGCGATTCAATAGTGGTAGA 60 TGATAACATAACTAGGTGGATTTGTAACTGGTTTAATTACCACAAGAGAACAGTGACAGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||| TGATAACATAACTAGGTGGATTTGTAACTGGTTTAATTACCACAAGTGAACAGTGACAGT 120 TAATAGATGGTTATCAACTTAAAGGGAGCATTCCGGAAACAGTGTAGTACAACGATTACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAATAGATGGTTATCAACTTAAAGGGAGCATTCCGGAAACAGTGTAGTACAACGATTACC AGTTAGGGTTCTGGAGCCCAACTATCAGAATTTGAATTTTGGCTCAGTCACTTATTAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTTAGGGTTCTGGAGCCCAACTATCAGAATTTGAATTTTGGCTCAGTCACTTATTAGCC ATGTGACTTGGGCCACAATAACCTCTCTATGCTTCAATTTCATTATCTGAAATGAAGATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGTGACTTGGGCCACAATAACCTCTCTATGCTTCAATTTCATTATCTGAAATGAAGATG ATAGTAACATCTACCTCACAAGGTTGTAGTAAGGACTTAACAGCTTGATTTGTATTGTGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATAGTAACATCTACCTCACAAGGTTGTAGTAAGGACTTAACAGCTTGATTTGTATTGTGC ACATACTAAGGAAGTCTTGTCTACTTCAATATTTTGATCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACATACTAAGGAAGTCTTGTCTACTTCAATATTTTGATCA 400 311888 311548 311608 180 311668 240 311728 300 311788 360 311848 130 La secuencia del sitio de corte de la enzima BclI, más los 16 pb restantes, tienen una homología del 100% con la secuencia presente en la región int22h-2, como se muestra en el siguiente resultado de BLAST. Esto confirma la presencia de la inversión del intrón 22 del gen del FVIII de la coagulación en este paciente. > ref|NW_001842420.1|HsX_WGA1381_36 Homo sapiens chromosome X genomic contig, alternate assembly (based on HuRef SCAF_1103279188170)Length=869535 Features flanking this part of subject sequence: 40724 bp at 5' side: chloride intracellular channel 2 6318 bp at 3' side: H2A histone family, member B3 Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.002 Identities = 22/22 (100%), Gaps = 0/22 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 Sbjct 788374 TGATCATGCTTAACAGAACCAA |||||||||||||||||||||| TGATCATGCTTAACAGAACCAA 22 788395 De los 559 pb que tiene el producto mutado de I-PCR, en la secuencia obtenida faltaron las primeras 63 pb del producto contando desde el cebador IU en el FVIII (azul claro); y los últimos 81 pb, que incluyen al cebador ED (verde) en la región extragénica int22h involucrada en la inversión. En amarillo se muestra la secuencia obtenida por la secuenciación, y subrayado y en negrillas el sitio de corte para la enzima BclI. cctttcaactccatctccatggtttattttataaagttacgagatctataaaaagtctagctggaccttagtaggac agatggcaaaaccaccttgaagataaggcgattcaatagtggtagatgataacataactaggtggatttgtaactgg tttaattaccacaagtgaacagtgacagttaatagatggttatcaacttaaagggagcattccggaaacagtgtagt acaacgattaccagttagggttctggagcccaactatcagaatttgaattttggctcagtcacttattagccatgtg acttgggccacaataacctctctatgcttcaatttcattatctgaaatgaagatgatagtaacatctacctcacaag gttgtagtaaggacttaacagcttgatttgtattgtgcacatactaaggaagtcttgtctacttcaatattttgatc atgcttaacagaaccaaataccattgcaaaggctttgaaatggaactaacaataaaacccccggtcagaacatgtgg cctgagcctaagtgactggg La secuencia obtenida por secuenciación automatizada del paciente H-115 (negativo) fue de 483 pb, que se muestra a continuación: >H115NOR_IU_B06_004.ab1 caactccatctccatggtttattttataaagttacgagatctataaaaagtctagctggaccttagtaggacagatggcaaaaccaccttgaagataa ggcgattcaatagtggtagatgataacataactaggtggatttgtaactggtttaattaccacaagtgaacagtgacagttaatagatggttatcaac ttaaagggagcattccggaaacagtgtagtacaacgattaccagttagggttctggagcccaactatcagaatttgaattttggctcagtcacttatta gccatgtgacttgggccacaataacctctctatgcttcaatttcattatctgaaatgaagatgatagtaacatctacctcacaaggttgtagtaaggac ttaacagcttgatttgtattgtgcacatactaaggaagtcttgtctacttcaatattttgatcattaacttgtgactaaaccgtatgta De la secuencia obtenida, el 100% tiene homología con el gen del FVIII de la coagulación. Los primeros 459 pb coinciden incluyen hasta el sitio de corte para la enzima de restricción BclI, como se muestra en el siguiente resultado del BLASTn: 131 > ref|NT_167198.1| Homo sapiens chromosome X genomic contig, GRCh37 reference primary assembly Length=6178498 Features in this part of subject sequence: coagulation factor VIII isoform a precursor Score = 829 bits (918), Expect = 0.0 Identities = 459/459 (100%), Gaps = 0/459 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 CAACTCCATCTCCATGGTTTATTTTATAAAGTTACGAGATCTATAAAAAGTCTAGCTGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 5044478 CAACTCCATCTCCATGGTTTATTTTATAAAGTTACGAGATCTATAAAAAGTCTAGCTGGA 60 61 CCTTAGTAGGACAGATGGCAAAACCACCTTGAAGATAAGGCGATTCAATAGTGGTAGATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTTAGTAGGACAGATGGCAAAACCACCTTGAAGATAAGGCGATTCAATAGTGGTAGATG 120 ATAACATAACTAGGTGGATTTGTAACTGGTTTAATTACCACAAGTGAACAGTGACAGTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATAACATAACTAGGTGGATTTGTAACTGGTTTAATTACCACAAGTGAACAGTGACAGTTA 180 ATAGATGGTTATCAACTTAAAGGGAGCATTCCGGAAACAGTGTAGTACAACGATTACCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATAGATGGTTATCAACTTAAAGGGAGCATTCCGGAAACAGTGTAGTACAACGATTACCAG 240 TTAGGGTTCTGGAGCCCAACTATCAGAATTTGAATTTTGGCTCAGTCACTTATTAGCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGGGTTCTGGAGCCCAACTATCAGAATTTGAATTTTGGCTCAGTCACTTATTAGCCAT 300 GTGACTTGGGCCACAATAACCTCTCTATGCTTCAATTTCATTATCTGAAATGAAGATGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGACTTGGGCCACAATAACCTCTCTATGCTTCAATTTCATTATCTGAAATGAAGATGAT 360 AGTAACATCTACCTCACAAGGTTGTAGTAAGGACTTAACAGCTTGATTTGTATTGTGCAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTAACATCTACCTCACAAGGTTGTAGTAAGGACTTAACAGCTTGATTTGTATTGTGCAC 420 Sbjct 5044537 Query Sbjct 5044538 5044597 Query 121 Sbjct 5044598 5044657 Query 181 Sbjct 5044658 5044717 Query 241 Sbjct 5044718 5044777 Query 301 Sbjct 5044778 5044837 Query 361 Sbjct 5044838 5044897 Query 421 Sbjct 5044898 ATACTAAGGAAGTCTTGTCTACTTCAATATTTTGATCAT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATACTAAGGAAGTCTTGTCTACTTCAATATTTTGATCAT 459 5044936 La secuencia del sitio de corte de la enzima BclI, más los 24 pb restantes, tienen homología igualmente con el gen del FVIII. Esto confirma la ausencia de la inversión del intrón 22 del gen del FVIII de la coagulación en este paciente. 132 > ref|NT_167198.1| Homo sapiens chromosome X genomic contig, GRCh37 reference primary assembly Length=6178498 Features in this part of subject sequence: coagulation factor VIII isoform a precursor coagulation factor VIII isoform b precursor Score = 60.0 bits (30), Expect = 7e-08 Identities = 30/30 (100%), Gaps = 0/30 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 Sbjct 5023322 TGATCATTAACTTGTGACTAAACCGTATGT |||||||||||||||||||||||||||||| TGATCATTAACTTGTGACTAAACCGTATGT 30 5023351 De los 487 pb que tiene el producto mutado de I-PCR, en la secuencia obtenida faltaron 4 nucleótidos, correspondientes al cebador IU (azul claro). El cebador ID se muestra en verde. En cursiva se muestra la secuencia obtenida para el paciente por secuenciación automatizada, y subrayado y en negritas el sitio de corte para la enzima BclI. cctttcaactccatctccatggtttattttataaagttacgagatctataaaaagtctagctggaccttagtaggac agatggcaaaaccaccttgaagataaggcgattcaatagtggtagatgataacataactaggtggatttgtaactgg tttaattaccacaagtgaacagtgacagttaatagatggttatcaacttaaagggagcattccggaaacagtgtagt acaacgattaccagttagggttctggagcccaactatcagaatttgaattttggctcagtcacttattagccatgtg acttgggccacaataacctctctatgcttcaatttcattatctgaaatgaagatgatagtaacatctacctcacaag gttgtagtaaggacttaacagcttgatttgtattgtgcacatactaaggaagtcttgtctacttcaatattttgatc attaacttgtgactaaaccgtatgt UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO NOMBRE DEL ESTUDIANTE: Silvia Elena Albánez Tinedo TÍTULO DE LA TESIS: Diagnóstico molecular de Hemofilia A y de mutaciones asociadas con el desarrollo de inhibidores del Factor VIII NOMBRE DEL ASESOR: Prof. Antonietta Porco MIEMBROS DEL JURADO: Dra. Belsy Guerrero (IVIC) y Prof. Thelma Slezynger (USB) PALABRAS CLAVE: Hemofilia A, alteraciones genéticas, Factor VIII, TNFa, IL10 SOBRESALIENTE: X GRADUADO CON HONORES: X N° DE PAGS: 148 FECHA DE GRADUACIÓN: 18/03/2010 MAESTRÍA EN: Ciencias Biológicas RESUMEN La Hemofilia A (HA) es una enfermedad hereditaria recesiva ligada al cromosoma sexual X, que se caracteriza por la aparición de hemorragias recurrentes. Es causada por deficiencias del Factor VIII (FVIII), una proteína plasmática que actúa en el proceso de coagulación sanguínea. Alteraciones en el gen que codifica para este factor que conlleven a deficiencias en cantidad o actividad del FVIII resultan en HA, la cual dependiendo de la severidad, puede clasificarse en leve, moderada o severa. Específicamente, para el caso de la HA Severa (HAS), se han descrito dos inversiones, que en conjunto abarcan cerca del 50% de las alteraciones genéticas que la causan: la inversión del intrón 22 (inv-int22) y la inversión del intrón 1 (invint1). El resto de las alteraciones son sumamente diversas y generalmente cada familia afectada posee su propia mutación. Por otro lado, es conocido que el tipo de mutación presente en el gen del FVIII puede predisponer a que el paciente desarrolle inhibidores (anticuerpos) contra el FVIII que se le administra como tratamiento. Recientemente, se ha encontrado que polimorfismos genéticos en los genes que codifican para la Interleuquina 10 (IL10) y para el Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNF) pueden tener también un papel importante en la respuesta inmune del paciente frente al tratamiento. Por lo anteriormente expuesto, el objetivo principal de este trabajo fue la detección de las alteraciones genéticas presentes en el gen del FVIII y el análisis de algunos polimorfismos genéticos asociados con el desarrollo de inhibidores en pacientes con HAS en Venezuela. Para ello, se determinó inicialmente a partir del ADNg extraído de la sangre de dichos pacientes, la presencia de la inv-int22 mediante PCR inversa; a los pacientes negativos para dicha inversión, se les analizó la presencia de la inv-int1 mediante PCR convencional; y a aquellos pacientes negativos para ambas inversiones, se les analizó el gen completo mediante Electroforesis en Geles Sensibles a la Conformación (CSGE) en busca de otras mutaciones. Las mutaciones más frecuentes en los pacientes con HAS fueron la inv-int22 (40%) y las mutaciones sin sentido (16,7%). Se encontraron 7 mutaciones nuevas, no reportadas previamente. En relación a la detección del alelo 134 pb en el microsatélite IL10G y del polimorfismo -1082AG en la región promotora del gen IL10, así como del polimorfismo -308GA en el gen TNFA, los cuales han sido relacionados con el desarrollo de inhibidores frente a la terapia con FVIII, a diferencia de otros estudios, se encontró asociación significativa entre el alelo -1082A en el gen IL10 y el desarrollo de inhibidores. Adicionalmente, el tipo de mutación presente en el gen del FVIII también pudo ser asociado con el desarrollo de inhibidores. El diagnóstico molecular de HA es una herramienta de suma importancia, ya que permite entender la fisiopatología de esta enfermedad y permite el análisis familiar de los pacientes, en las cuales se pueden detectar mujeres portadoras, que de otra manera no sería posible. Asimismo, es posible conocer si existe una predisposición genética al desarrollo de inhibidores contra el FVIII exógeno, lo cual permitirá aplicar el tratamiento más adecuado a cada paciente.
