Expresión diferencial de genes dioxigenasa de ruptura de

ACTAS DE HORTICULTURA Nº 60
Expresión diferencial de genes dioxigenasa de ruptura de carotenoides
en calabacín (Cucurbita pepo)
C.I. González Verdejo1, A. Obrero1, B. Román1, S. Nadal1, P. Gómez2
1
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IFAPA, Centro IFAPA Alameda del Obispo, Área de Mejora y Biotecnología, 14080 Córdoba, España.
IFAPA, Centro IFAPA La Mojonera, Área de Mejora y Biotecnología, 04745, Almería, España.
Palabras clave: dioxigenasa de corte de carotenoides, 9-cis epoxicarotenoide
dioxigenasa, PCR cuantitativa.
Resumen
El desarrollo de nuevas frutas y hortalizas con mayores contenidos en
carotenoides es un objetivo deseable por sus beneficios sobre la salud. Diversos
estudios indican que la baja acumulación de estos compuestos puede deberse a la
presencia de enzimas involucradas en la ruptura oxidativa de los mismos y que
conducen a su degradación. En consecuencia, los genes que codifican para dichas
enzimas son claros candidatos a estudiar y caracterizar. Por ello, el objetivo del
presente trabajo es la identificación y el análisis de la expresión de genes
implicados en la ruptura oxidativa de los carotenoides en calabacín (Cucurbita
pepo).
Los genes de interés seleccionados codifican para enzimas dioxigenasas de
ruptura de carotenoides (CCDs) que catalizan la ruptura oxidativa de carotenoides
generando estrigolactonas y varios derivados volátiles, y para enzimas 9-cis
epoxicarotenoide dioxigenasas (NCED) que se caracterizan por su implicación en
la biosíntesis de ácido abcísico (ABA). El estudio se llevó a cabo utilizando tres
variedades contrastantes de calabacín respecto al color de la piel, a partir de
tejidos de órganos vegetativos y del fruto en distintos estadios de desarrollo.
En esta comunicación se exponen los principales resultados obtenidos sobre
el aislamiento y estudio transcripcional de genes CCDs y NCEDs en calabacín.
Ello permitirá establecer la relación entre los genes implicados en la biosíntesis vs
degradación de estos compuestos, contribuyendo a elucidar los mecanismos
moleculares que conducen a la acumulación de carotenoides en este cultivo.
INTRODUCCION
El contenido en carotenoides en frutas y hortalizas puede estar influenciado por
la presencia de enzimas dioxigenasa de ruptura de carotenoides. Estas enzimas
intervienen en reacciones oxidativas que conducen a la ruptura de las cadenas
hidrocarbonadas de carotenoides y generan compuestos apocarotenoides. Entre los
apocarotenoides presentes en plantas destacan hormonas con importantes funciones
biológicas como el ABA y las estrigolactonas, así como apocarotenoides volátiles
responsables de aromas (Giuliano et al., 2003).
Dentro de las enzimas dioxigenasas de ruptura de carotenoides se diferencian
dos subfamilias dependiendo del sustrato carotenoide y de la posición de ruptura. Las
enzimas CCDs que generan estrigolactonas y varios derivados volátiles y las NCEDs
que se caracterizan por su implicación en la biosíntesis de ABA. La posible relación
entre la expresión de genes que codifican para estas enzimas y la baja acumulación de
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MEJORA GENÉTICA VEGETAL
carotenoides en el fruto ha sido recientemente estudiada en diversas plantas (Kato et al.,
2006; Campbell et al., 2010; Brandi et al., 2011).
En este sentido, ante la sospecha de que enzimas de degradación podrían
encontrarse actuando e impidiendo la acumulación de carotenoides en el fruto de
calabacín, nuestros estudios se han orientado hacia el estudio transcripcional de genes
CCD (CCD1 y CCD4) y NCED (NCED1, NCED2, NED3 y NCED9). Ya que los
valores de degradación de carotenoides no tienen sentido per se y la información no es
completa si no se consideran los valores de biosíntesis, los resultados del presente
trabajo fueron comparados con aquellos obtenidos para los genes de la ruta biosintética
de estos compuestos (Obrero et al., 2012).
MATERIAL Y METODOS
Para que fuera posible comparar la expresión de los genes de biosíntesis y de
degradación de carotenoides, se ha empleado el mismo material utilizado en el trabajo
de Obrero et al. 2012. La extracción de ARN y síntesis de ADNc se llevaron a cabo a
partir de hoja, flor, ovario y diferentes estadios de fruto. Se seleccionaron los tres
cultivares de calabacín contrastantes respecto a la acumulación de pigmento C. pepo ssp
ovifera 'Scallop' (blanco), C. pepo ssp pepo 'MU-CU16' (verde) y C. pepo ssp pepo.
'Parador' (amarillo-naranja).
Los cebadores específicos para los genes NCDE1, 2 y 3 fueron diseñados a partir
de secuencias disponibles en NCBI para C. pepo mientras que el resto (CCD1, CCD4 y
NCED9) se obtuvieron a partir de la base de datos ICuGI que incluye los resultados
publicados recientemente del transcriptoma de C. pepo (Blanca et al., 2011). La
normalización de la expresión se realizó empleando los genes fosfatasa 2A (PP2A) y el
factor de elongación 1% (EF1A) (Obrero et al., 2011). Posteriormente, se determinó la
expresión relativa normalizada de los genes candidatos mediante PCR cuantitativa
(qPCR) utilizando SYBR green en un equipo Mx3000P (Stratagene). El análisis de los
datos se llevó a cabo según el modelo de cuantificación relativa propuesto por
Hellemans et al., 2007.
RESULTADOS Y DISCUSION
Los resultados obtenidos en este estudio indicaron que los genes CCD y NCED
no presentan sobreexpresión en ninguno de los óganos de los cultivares analizados, con
la excepción de CpCCD1 y CpCCD4.
El transcrito de CpCCD1 aumentó sus niveles hasta cinco veces en los estadios
de maduración del fruto pero, al igual que ocurre en cítricos (Kato et al., 2006),
consideramos que es poco probable que la expresión de este gen afecte a la
concentración final de carotenoides en este órgano al no encontrarse diferencias
notables en sus niveles entre los cultivares coloreados y el blanco. Sin embargo la
enzima CpCCD1 podría estar implicada en la producción de compuestos volatiles como
ocurre en otras especies vegetales (Simkin et al., 2004), y, por tanto, en el aroma de la
flor de calabacín, pues la antesis de la flor coincide con un aumento en la actividad
transcripcional de este gen.
Por el contrario, CpCCD4 mostró expresión diferencial entre los tres cultivares,
siendo inducido hasta 16 veces más en el fruto de 20 días del cultivar blanco que en el
de los coloreados (Fig. 1). Estos resultados concuerdan con los obtenidos en estudios
llevados a cabo en melocotón y patata (Campbell et al., 2010; Brandi et al., 2011) donde
la actividad de genes ortólogos a CpCCD4 se encuentran controlando la degradación de
carotenoides.
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ACTAS DE HORTICULTURA Nº 60
Si se consideran conjuntamente los resultados correspondientes a los niveles de
expresión de los genes de biosíntesis y de degradación de carotenoides podemos
concluir que, los genes de la ruta de biosíntesis de carotenoides podrían estar regulando
la acumulación de estos pigmentos en el fruto de los cultivares coloreados. Los estudios
de expresión de los genes de biosíntesis mostraron que los niveles de transcritos, y en
especial los del gen fitoeno sintasa (PSY), fueron más elevados en el fruto amarilloanaranjado del cultivar parador que en el del cultivar verde (Obrero et al., 2012).
Sin embargo, la ausencia de color en el cultivar blanco, donde también se
expresan los genes carotenogénicos, podría explicarse por la actuación de enzimas que
degradan los carotenoides sintetizados e impiden su acumulación en el fruto.
Agradecimientos
Esta investigación ha sido financiada por el proyecto INIA RTA2011-00044C02-01, fondos FEDER Y FSE (EU). CI. González Verdejo disfruta de un contrato
INIA-CCAA (Subprograma DOC-INIA), que podrá ser cofinanciado en un futuro por el
FSE.
Referencias
Blanca, J., Canizares, J., Roig, C., Ziarsolo, P., Nuez, F. y Picó, B. 2011. Transcriptome
characterization and high throughput SSRs and SNPs discovery in Cucurbita pepo
(Cucurbitaceae). BMC Genom. 12:104.
Brandi, F., Bar, E., Mourgues, F., Horváth, G., Turcsi, E., Giuliano, G., Liverani, A.,
Tartarini, S., Lewinsohn, E. y Rosati, C. 2011. Study of ‘Redhaven’ peach and its
white-fleshed mutant suggests a key role of CCD4 carotenoid dioxygenase in
carotenoid and norisoprenoid volatile metabolism. BMC Plant Biol. 11:24.
Campbell, R., Ducreux, L.J.M., Morris, W.L., Morris, J.A., Suttle, J.C., Ramsay, G.,
Bryan, G.J., Hedley, P.E. y Taylor, M.A. 2010. The Metabolic and Developmental
Roles of Carotenoid Cleavage Dioxygenase4 from Potato. Plant Physiol. 154:656664.
Giuliano, G., Al-Babili, S. y von Lintig J. 2003. Carotenoid oxygenases: cleave it or
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Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F. y Vandesompele, J. 2007. qBase
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analysis of real-time quantitative PCR data. Genome Biol. 8:R19
Kato, M., Matsumoto, H., Ikoma, Y., Okuda, H. y Yano, M. 2006. The role of
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maturation in citrus fruit. J. Exp. Bot. 57: 2153–2164.
Obrero, A., Die, J.V., Román, B., Gómez, P., Nadal, S. y González-Verdejo, C.I. 2011.
Selection of reference genes for gene expression studies in zucchini using qPCR. J.
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Obrero, A., Die, J.V., Román, B., Gómez, P., Nadal, S. y González-Verdejo, C.I.. 2012.
Expresión de genes de la ruta de biosíntesis de carotenoides en calabacín. En este
volumen de Actas de Horticultura.
Simkin, A., Steven, H. Schwartz, S.H., Auldridge, M., Taylor, M.G. y Klee, H.J. 2004.
The tomato carotenoid cleavage dioxygenase 1 genes contribute to the formation of
the flavor volatiles b-ionone, pseudoionone, and geranylacetone. Plant J. 40:882–
892.
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MEJORA GENÉTICA VEGETAL
Niveles de transcrito
18
16
Scallop
MU-CU16
14
Parador
12
10
8
6
4
2
0
F
FA
H
O
E3
M3
E5
M5
E7
M7
E20
M20
Fig. 1. Cuantificación relativa en tres cultivares de calabacín (Scallop,
MU-CU16 y Parador) del transcrito CpCCD4 en flor antes de antesis
(F), flor en antesis (FA), hoja (H), ovario (O) y fruto (E-exocarpo, Mmesocarpo) de 3, 5, 7 y 20 días.
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