CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA Y MOLECULAR DE CEPAS DE

CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA Y MOLECULAR DE CEPAS DE
Fusarium spp. AISLADAS DE HUMANOS, ANIMALES Y PLANTAS:
APROXIMACIÓN AL MODELO MULTIHOSPEDERO.
Angela María Alvarado Fernández
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar por el título de
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
DIRECTORA
María Ximena Rodríguez Ph.D.
CODIRECTORA
Balkys Esmeralda Quevedo M.Sc
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTADO DE CIENCIAS
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C.
2010
TABLA DE CONTENIDO
1. RESUMEN ……………………………………………………………………… 1
2. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………..1
3. JUSTIFICACIÓN – PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ……………….. 2
4. MARCO TEÓRICO ……………………………………………………………...2
5. OBJETIVOS ……………………………………………………………………. 4
5.1.
Objetivo general ……………………………………………………….. 4
5.2.
Objetivos específicos …………………………………………………. 5
6. METODOLOGÍA ……………………………………………………………….. 5
6.1.
Recuperación de las cepas y establecimiento del banco
de trabajo……………………………………………………………………….... 5
6.2.
Caracterización enzimática ……………………………………………5
6.2.1. Determinación indirecta de la actividad amilolítica,
celulolítica y pectinolítica ……………………………………………………5
6.2.2. Determinación de la actividad proteolítica ………………………..6
6.3.
Caracterización molecular ……………………………………………...7
6.3.1. Extracción del ADN genómico de los aislamientos de
Fusarium spp ………………………………………………………………….7
6.3.2. Reacción RAPD – PCR ……………………………………………..7
6.4. Análisis de resultados ……………………………………………………….8
6.4.1. Actividades enzimáticas ……………………………………………. 8
6.4.2. Caracterización molecular …………………………………………..9
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ………………………………………………….9
7.1.
Caracterización enzimática ……………………………………………..9
7.1.1. Determinación de la hidrólisis amilolítica ………………………….9
7.1.2. Determinación de la hidrólisis celulolítica …………………………11
7.1.3. Determinación de la hidrólisis pectinolítica ………………………..13
7.1.4. Determinación de la actividad proteolítica …………………………14
7.2.
Caracterización molecular ……………………………………………….16
7.3.
Análisis comparativo de los resultados …………………………………23
8. CONCLUSIONES ………………………………………………………………….25
9. RECOMENDACIONES ……………………………………………………………26
10. REFERENCIAS …………………………………………………………………….27
11. ANEXOS …………………………………………………………………………….31
RESUMEN
En las últimas décadas, el género Fusarium ha representado un gran impacto a nivel
mundial ya que además de ser considerado como un agente fitopatógeno involucrando
una amplia variedad de plantas, se comporta como un patógeno emergente, capaz de
afectar tanto a humanos como animales, por lo que el estudio del mismo mediante
diferentes técnicas se hace necesario para el entendimiento de su capacidad
patogénica. El presente proyecto muestra una caracterización a nivel de perfiles
enzimáticos asociados como factores de virulencia (producción de amilasas, celulasas,
pectinasas y proteasas) en cepas aisladas de pacientes terminales con cáncer, así
como una caracterización molecular mediante la técnica de RAPD – PCR para la
evaluación de polimorfismos presentes en 40 cepas de Fusarium provenientes de
diferentes orígenes de aislamiento. Los resultados obtenidos permitieron asociar las
enzimas líticas evaluadas como un factor de virulencia importante en la patogenicidad
del hongo, mientras que los RAPDs fueron indicativos de la alta variabilidad genética
entre las especies evaluadas, encontrando que las agrupaciones obtenidas con el
algoritmo UPGMA se formaron en función de las especies independientemente del
origen de aislamiento; la determinación de estos dos perfiles permitieron llegar a una
aproximación al modelo Fusarium multihospedero.
2. INTRODUCCIÓN
Actualmente los microorganismos están siendo ampliamente estudiados debido a las
múltiples características que presentan y a la manera como se involucran en los
campos relacionados con la salud, la agricultura y la industria. Dentro de este grupo,
se encuentran los hongos, organismos eucariotas ampliamente distribuidos en la
naturaleza y protagonistas importantes en las áreas anteriormente mencionadas.
Además de estar relacionados con procesos agroindustriales, algunos hongos poseen
capacidades patogénicas que les permiten violar las defensas de hospederos
específicos tales como plantas, humanos y animales, lo cual representa pérdidas
económicas tanto a nivel agrícola, como en los campos relacionados con la salud,
donde las tazas de mortalidad pueden llegar a ser hasta del 80%. Pero no siendo
suficiente, algunos de ellos tienen la capacidad para afectar no solo a hospederos
específicos, sino que también poseen las herramientas necesarias para hacer saltos
entre reinos, actuando como patógenos emergentes.
Las especies pertenecientes al género Fusarium se presentan hoy en día como
patógenos emergentes. Aunque inicialmente se relacionaba al agente como el
principal causal del marchitamiento vascular, los reportes señalan la capacidad de este
hongo para causar enfermedades a animales y a humanos tanto inmunocompetentes
como inmunocomprometidos, por lo que se hace necesario realizar una
caracterización de dichas especies.
El presente proyecto se muestra como una aproximación al modelo Fusarium
multihospedero, realizada mediante una caracterización de perfiles enzimáticos
(amilasas, celulasas, pectinasas y proteasas) de cepas de Fusarium spp. aisladas de
pacientes terminales con cáncer, y una caracterización molecular mediante RAPDPCR de 40 cepas provenientes de los tres tipos de hospederos en los cuales se
encuentran involucrados los factores de virulencia del hongo: humanos, animales y
plantas. Es un estudio de dos tipos: descriptivo, ya que se muestran similitudes y
diferencias entre los aislamientos estudiados, y correlacional, ya que con los
1
resultados obtenidos se pretende mostrar como se relacionan los diferentes grupos
estudiados, teniendo en cuenta las especies trabajadas y los orígenes de aislamiento
de las mismas, llegando así a la aproximación al modelo multihospedero.
3. JUSTIFICACIÓN-PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los patógenos emergentes son definidos como agentes causantes de enfermedades
infecciosas cuya incidencia aumenta debido a la capacidad que tienen para aparecer
en nuevos hospederos, o para incrementar su ocurrencia en un hospedero específico
(1).
Fusarium spp. se presenta como un hongo fitopatógeno causante del marchitamiento
vascular en plantas, que tienen gran importancia económica (2). A pesar de ser un
hongo comúnmente encontrado en el suelo, estudios recientes han reportado que el
microorganismo se encuentra involucrado en el desarrollo infecciones sistémicas y
cutáneas, causando un porcentaje significativo en los casos de onicomicosis (3).
La capacidad de este patógeno para hacer saltos entre reinos se debe a factores de
virulencia como las enzimas líticas (celulasas, pectinasas, amilasas y xilanasas, entre
otras), que permiten la penetración y colonización del hospedero mediante la
degradación de las barreras y los constituyentes celulares de los mismos en el caso de
las plantas (4), así como proteasas y enzimas queratínolíticas, que junto con toxinas,
alteran el funcionamiento normal de las células de humanos y animales. Estas últimas
también se encuentran implicadas como factor de virulencia en plantas disminuyendo
la calidad y el rendimiento de las mismas (5).
Las herramientas de identificación comúnmente utilizadas para la detección de los
agentes etiológicos son los postulados de Koch, las pruebas bioquímicas que permiten
caracterizar la batería enzimática de los microorganismos y finalmente las pruebas
moleculares que permiten caracterizar genéticamente los aislamientos de estos
patógenos (6). Las herramientas de biología molecular empleadas comúnmente son
PCR, RFLPs (7) y RAPDs, siendo esta última una técnica rápida, de fácil ejecución y
que solo requiere pequeñas cantidades del ADN a analizar (8).
Dada la importancia de Fusarium como patógeno emergente en humanos y animales,
se hace necesario realizar una correcta caracterización del agente etiológico teniendo
en cuenta sus perfiles enzimáticos y moleculares, de tal manera que se pueda
informar y sensibilizar a la población, compartiendo los resultados obtenidos e
impulsando la realización futuros estudios en el tema, de tal manera que se llegue a
una aproximación al modelo multihospedero y al entendimiento de los patógenos
emergentes.
4. MARCO TEÓRICO
Los hongos son organismos eucariotas que se encuentran ampliamente distribuidos
en la naturaleza. Ubicados en el reino Fungi, estos microorganismos se caracterizan
porque además de ser ubicuos, son heterótrofos, por lo que necesitan encontrar las
fuentes alimenticias que no pueden sintetizar por si solos, comportándose como
saprófitos o como parásitos (9). Cuando se presentan como saprófitos, estos tienen la
capacidad de alimentarse de materia orgánica en estado de descomposición, por lo
que benefician al ecosistema. Sin embargo, las enzimas implicadas en la asimilación
de dicha materia orgánica también permiten la colonización de tejidos vivos, afectando
2
así a plantas, humanos y animales causando grandes pérdidas económicas en
producción agrícola y un impacto negativo en el campo de la salud humana y animal.
Teniendo en cuenta esto, se ha reportado que especies comúnmente encontradas en
el suelo tienen la capacidad de colonizar diferentes hospederos; tal es el caso de
Aspergillus, Chaetomium, Chrysosporium, Scopulariopsis y Fusarium, a los cuales se
les ha atribuido una actividad queratinolítica asociada a dermatofitosis (10).
Adicionalmente, estos microorganismos son oportunistas, por lo que causan
infecciones diseminadas por vía sistémica en pacientes que tienen un
inmunocompromiso severo (11).
A nivel agrícola, se considera a Fusarium como un hongo cosmopolita habitante
normal del suelo, por lo que está asociado principalmente a plantas como agente
causal del marchitamiento vascular (12), razón por la cual, junto con la diversidad de
formas especiales que presenta el organismo, se le atribuyen grandes pérdidas
económicas, teniendo así la capacidad de afectar cultivos de algodón, tomate, tabaco,
melón, garbanzo, plátano, caña de azúcar y café, entre otros (13). Pero su importancia
no se limita a este campo, ya que se ha reportado al hongo como un agente
involucrado en el desarrollo enfermedades en pacientes tanto inmunocompetentes
como inmunocomprometidos, tales como queratitis y onicomicosis e infecciones
diseminadas por vía sistémica y neumonía (14). Adicionalmente el hongo produce
toxinas que tienen efectos citotóxicos y neurotóxicos, tanto para humanos como para
animales (15), y presenta enzimas líticas, a las cuales se les atribuye su capacidad
para violar las defensas de hospederos tanto animales como vegetales (16; 17).
El ciclo infectivo del patógeno en las plantas comienza por el reconocimiento de
señales provenientes de las raíces de las mismas, dando paso a la adherencia del
hongo seguido por la diferenciación de las hifas de penetración, la invasión y la
degradación de las barreras físicas. Posteriormente el hongo realiza una adaptación al
nuevo entorno logrando violar las defensas de las plantas y la protección ante
compuestos antifúngicos presentes en los cultivos, lo cual permite que este colonice el
sistema vascular, transportándose por el xilema y secretando factores de virulencia
que se verán reflejados en la aparición de síntomas como el marchitamiento vascular,
la epinastia, el amarillamiento y la marchitez progresiva de hojas y tallo (13).
Dentro de los factores de virulencia implicados en la capacidad fitopatógena de
Fusarium se han considerado las enzimas líticas como amilasas, pectinasas, celulasas
y xilanasas, entre otras, las cuales permiten la depolimerización de los componentes
vegetales dando paso al crecimiento del patógeno a partir de los monómeros
liberados, y por tanto a la violación de las barreras físicas de las plantas (17).
Adicionalmente, se han considerado algunas toxinas como los tricotecenos, que
potencian la capacidad infectiva del hongo, llegando a inhibir la síntesis de proteínas e
induciendo una pérdida de los pigmentos de los cloroplastos a concentraciones casi
letales para las plantas (18).
En cuanto a la patogénesis en humanos, las infecciones causadas por el género
Fusarium pueden ser de dos tipos: localizadas o sistémicas. En el caso de las
primeras, la entrada del hongo se da por medio de heridas o traumatismos que pueden
originar queratitis y úlceras traumáticas de la piel (19), así como onicomicosis (20), las
cuales han sido relacionadas por la capacidad del microorganismo de producir
enzimas como proteasas y colagenasas (14). Por otra parte, las infecciones sistémicas
han sido asociadas a pacientes con inmunocompromisos severos, las cuales terminan
en la diseminación del agente y el desarrollo de enfermedades como la neumonía (14).
3
Finalmente, otro de los aspectos a tener en cuenta y que ha atribuido a Fusarium parte
de su capacidad patogénica es la secreción de toxinas como las fumonicinas, los
tricotecenos y las zearalelonas, las cuales pueden tener efectos neurotóxicos y
citotóxicos para la persona o el animal que los ingiere (15) y las monilimorfinas (por F.
moniliforme principalmente) que pueden causar problemas musculares, mialgias y por
tanto enfermedades cardiacas (21).
Referente a la caracterización del agente patogénico, esta se hace comúnmente por
determinación de características morfológicas, bioquímicas (22) y los rangos de
hospederos a los que afectan (23). Sin embargo, hay muchos patógenos de difícil
identificación y caracterización por los métodos anteriormente mencionados, por lo que
se han hecho necesarios estudios con marcadores moleculares como RFLPs
(Restriction Fragment Length Polymorphism), PFGE (pulsed field electrophoresis gel),
ITS, factor de elongación y RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) (24; 25; 26).
Los RAPDs constituyen una técnica de análisis del ADN, la cual emplea
oligonucleótidos de aproximadamente 10 pares de bases, que se unen de manera
aleatoria al DNA genómico para amplificar fragmentos cortos mediante PCR (27).
Estos tienen utilidad como marcadores moleculares para el mapeo genético, el estudio
de genética de poblaciones y el análisis de polimorfismos lo que permiten la
identificación de aislamientos que presenten fragmentos de DNA cromosómico
específicos (28) y adicionalmente no requieren un conocimiento previo del genoma,
por lo que constituyen una herramienta de fácil ejecución cuando se contemplan los
factores que pueden afectar el desarrollo de la técnica, tales como las condiciones de
la reacción, la longitud de los cebadores empleados, la concentración de ADN y otros
factores básicos de las PCRs convencionales (29).
A pesar de que se conoce la importancia de Fusarium como patógeno emergente, son
pocos los reportes en los que se evalúan los factores de virulencia del microorganismo
como herramienta asociada a la capacidad multihospedera del mismo.
Adicionalmente, las herramientas de biología molecular se han empleado para la
identificación del agente etiológico como tal, pero no han sido relacionadas como
técnicas para la caracterización de patógenos de tal manera que se puedan hacer
aproximaciones a modelos multihospedero. En España se han realizado estudios de
infección cruzada con el patógeno pero solo se realizó inoculando un aislamiento
proveniente de plantas de tomate en un ratón (2) y en Argentina existe un reporte de
un paciente con un caso de hialohifomicosis ocasionada por un traumatismo con una
hoja de hierba infectada con el hongo (30). Para el caso de Colombia, no existen
reportes de Fusarium como modelo multihospedero, aunque se han realizado estudios
de identificación de especies de Fusarium aisladas de pacientes con onicomicosis,
donde se reporta F. oxysporum f. sp. dianthi, determinado por pruebas moleculares
(3).
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
Caracterizar molecular y enzimáticamente aislamientos de Fusarium spp. provenientes
de diferentes orígenes con el fin de relacionar las características obtenidas al modelo
multihospedero.
4
5.2. Objetivos específicos
5.1.1
Determinar la producción de amilasas, celulasas, pectinasas y proteasas de 10
aislamientos de Fusarium spp. provenientes de pacientes terminales con
cáncer mediante pruebas enzimáticas cuantitativas.
5.1.2. Realizar la caracterización molecular de 40 aislamientos de Fusarium spp.,
provenientes de diferentes tipos de hospederos mediante RAPD-PCR.
5.1.3. Realizar un análisis comparativo a partir de los perfiles enzimáticos y
moleculares obtenidos que permitan llegar a la aproximación al modelo
multihospedero.
6. METODOLOGÍA
6.1. Recuperación de las cepas y establecimiento del banco de trabajo
Las cepas trabajadas fueron recuperadas en medio PDA suplementado con
cloranfenicol a partir de un banco de conservación en agua de cultivos monospóricos.
Con estas siembras se realizó un nuevo banco de trabajo aplicando la técnica de
discos de agar en agua destilada estéril (31). La información de las cepas, las cuales
fueron identificadas previamente por sus características morfológicas y por
secuenciación del factor de elongación 1 α (31) se presenta en el anexo 1.
6.2. Caracterización enzimática
6.2.1. Determinación indirecta de la actividad amilolítica, celulolítica y
pectinolítica
Las caracterizaciones enzimáticas se realizaron con las 10 cepas provenientes de
pacientes terminales con cáncer. Para la determinación de las actividades amilolítica,
celulolítica y pectinolítica los aislamientos fueron reconstituidos en medio PDA
suplementado con cloranfenicol. Posteriormente se realizó un pase a agar almidón,
celulosa y pectina con en fin de inducir cada una de las actividades enzimáticas
(anexo 2). A partir de estas siembras se inocularon los caldos almidón, celulosa y
pectina respectivamente, con tres discos de agar-hongo por triplicado, incubando en
agitación constante (150rpm) a 30°C durante 48 horas (shaker Ifalpac Ltda).
Teniendo en cuenta que los polímeros como la celulosa, pectina y almidón se
hidrolizan gracias a la presencia de enzimas formando glucosa, ácido galacturónico y
glucosa respectivamente, se miden estos azúcares como una medida indirecta de la
actividad enzimática.
Para las cuantificaciones de azúcares reductores por hidrólisis enzimática de los
sustratos, una vez cumplido el periodo de incubación, se separó la biomasa del caldo
de cultivo centrifugando dos veces a 5000rpm durante 15 minutos en una centrífuga
Becton Dickinson (Dylanc III). El sobrenadante se recuperó para determinar la
concentración de azúcares reductores presentes en el extracto aplicando la técnica de
DNS (32), por triplicado para cada montaje. Adicionalmente se montó un control
abiótico que tuvo el mismo tratamiento de los cultivos con el fin de evaluar la hidrólisis
espontánea de las fuentes de carbono, y un control positivo para cada una de las
actividades. Dichos controles fueron: Trichoderma harzianum para las actividades
amilolítica y celulolítica, y Colletotrichum lindemuthianum para la actividad pectinolítica.
5
Las curvas de calibración se realizaron con soluciones de 0,5 a 2g/L de glucosa en el
caso de las actividades amilolíticas y celulolíticas; para la actividad pectinolítica esta
se realizó con soluciones de 0,5 a 2g/L de ácido galacturónico.
Los resultados fueron expresados como concentración en g/L de glucosa o ácido
galacturónico liberados a las 48 horas. Adicionalmente se determinó el rendimiento
neto de glucosa (%RNG) o ácido galacturónico (%RNAG) aplicando las ecuaciones 1,
2 y 3.
%RNG =
%RNG =
%RNAG =
Concentración glucosa x 162
x100
Ecuación 1
x100
Ecuación 2
x100
Ecuación 3
Concentración almidón x 180
Concentración glucosa x 162
Concentración celulosa x 180
Concentración glucosa x 176
Concentración pectina x 194
6.2.2. Determinación de la actividad proteolítica
Para la determinación de la actividad proteolítica se reconstituyeron los aislamientos
en medio PDA suplementado con cloranfenicol a partir del cual se hizo un pase a agar
leche descremada. Posteriormente se tomaron tres discos de agar con el hongo para
inocular en caldo leche descremada por triplicado, incubando en agitación constante
(150rpm) a 30°C durante 48 horas (shaker Ifalpac Ltda). Pasado el periodo de
incubación se recuperó el extracto crudo por centrifugación (dos veces a 5000rpm
durante 15 minutos) para realizar la prueba de actividad proteolítica. Para ello se tomó
1mL del extracto crudo enzimático y se mezcló con 1mL de solución de caseína (1%
(p/v) en buffer fosfato 0,1M pH 7,0). La mezcla se incubó a 30°C por 60 minutos y se
frenó la reacción con la adición de 1mL de ácido tricloroacético al 15%(p/v) y se
centrifugó nuevamente a 5000 rpm durante 10 minutos (centrífuga Becton Dickinson
(Dylanc III)).
Además de las cepas evaluadas se tuvo un control abiótico, sometido a las mismas
condiciones de cultivo con el fin de evaluar la hidrólisis espontánea de la fuente de
carbono, y un control positivo correspondiente al hongo Trichophyton mentagrophytes.
Previo a la lectura de los resultados se elaboraron dos blancos: un blanco muestra que
contenía 1ml de la solución de caseína más 1ml de buffer fosfato 0,1M (pH 7,0) para
verificar la interferencia del sustrato, y un blanco sustrato con 1ml de muestra y 1 ml
de buffer fosfato 0,1M (pH 7,0) para verificar la presencia de otros compuestos en la
muestra que pudieran tener interferencia con la lectura; estos blancos tuvieron el
mismo tratamiento de las muestras, incluyendo la incubación y la precipitación con
ácido tricloroacético.
Finalmente se leyeron las muestras a una absorbancia de 280nm, empleando el
blanco muestra, y se leyeron los respectivos blancos sustrato empleando como blanco
6
buffer fosfato 0,1M (pH 7,0). Los resultados fueron expresados como unidades
proteolíticas (UP), donde una UP se definió como la cantidad de enzima capaz de
liberar 1 µmol de tirosina por minuto a las condiciones de prueba.
La curva de calibración se realizó empleando soluciones de 0,1 a 1,3 µmol/mL de
tirosina en buffer fosfato a una concentración de 0,1M pH 7,0.
6.3. Caracterización molecular
6.3.1. Extracción del ADN genómico de los aislamientos de Fusarium spp.
A partir del banco de trabajo previamente elaborado, se realizó una reconstitución de
los aislamientos en medio PDA suplementado con cloramfenicol y se incubó a 25°C
durante 8 días. Una vez crecido, se tomó el micelio del medio PDA para inocular en
caldo extracto de malta y se dejó en agitación constante durante 8 días a 120 rpm;
posteriormente se realizó una filtración al vacío en papel filtro, se colocó la biomasa
obtenida en frascos para liofilización y se congeló durante un día a -20°C. Luego se
realizó la liofilización durante 24 horas o hasta que el micelio se encontrara
completamente seco, y se maceró hasta convertirlo en un polvo muy fino (liofilizador
Labconco).
Para la extracción del ADN se transfirieron 100mg del polvo a un tubo eppendorf, al
cual se le agregaron 1000µL de buffer de lisis (2% CTAB, 3% SDS, 250mM NaCl,
200mM Tris-HCl pH 8.5, 25mM EDTA pH 8.0). La mezcla fue homogenizada por
inversión y por vortex. Posteriormente se agregaron 80µL de β – mercaptoetanol, se
homogenizó por vortex y se llevó a incubación en baño termostatado a 65°C durante 2
horas, homogenizando suavemente por inversión cada diez minutos. Cumplido este
tiempo, las muestras se centrifugaron a 13000 rpm durante 5 minutos y se dividió el
sobrenadante obtenido en dos tubos eppendorf nuevos. Seguido a esto se agregó un
volumen de fenol cloroformo isoamil alcohol (25:24:1) mezclando por inversión y vortex
y se centrifugó nuevamente bajo las mismas condiciones, tomando el sobrenadante de
los dos tubos eppendorf y colocándolos en un tubo nuevo, al cual se le agregó un
volumen de cloroformo isoamil alcohol (24:1) y se centrifugó nuevamente. El sobrenadante fue recuperado y se le adicionó un volumen de isopropanol frío (20°C), se mezcló suavemente por inversión hasta ver la aparición de una mota blanca
y se dejó a -20°C toda la noche. Luego de este tiempo se centrifugó a 13000rpm
durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y se lavó el pellet con 200µL de
etanol al 70% frío, se mezcló y se centrifugó a 13000rpm durante 5 minutos;
nuevamente se descartó el sobrenadante y se agregaron 100µl de buffer TE (0.1mM
Tris- HCl, 10mM EDTA); posterior a esto realizó un tratamiento con RNAsas
agregando 2µL de la enzima (1µg/mL), con posterior incubación a 37°C en baño
serológico por 2 horas para optimizar la actividad de la misma. Finalmente almacenó el
ADN a -20°C.
6.3.2. Reacción RAPD – PCR
La caracterización molecular se llevó a cabo por medio de RAPD-PCR. Para esto, se
evaluaron los cebadores Operon tipo A (OP-A, serie 1 a 20 a excepción del 10) con 6
aislamientos de Fusarium spp., correspondientes a las especies F. oxysporum (3
cepas), F. equiseti, F. verticillioides y F. nelsoni con el fin de observar diferentes
polimorfismos y mayor reproducibilidad entre los cebadores (anexo 3).
7
De acuerdo a los resultados obtenidos y a lo reportado en literatura se seleccionaron
los cebadores mostrados en la tabla 1, y con estos se realizó la caracterización de los
40 aislamientos de Fusarium spp.: 10 provenientes de lesiones dérmicas de humanos,
10 aislados de vías sistémicas de pacientes terminales con cáncer, 10 de lesiones
cutáneas en animales y 10 provenientes de plantas (anexo 1).
Para la reacción se emplearon 100 ng de ADN genómico en un volumen de reacción
de 25µl, que contenía buffer 1X, MgCl2 2mM, 0,2mM de mix de dNTPs, 0,4mM del
primer evaluado y 0,5 unidades de Taq polimerasa. El ciclo de amplificación consistió
en una denaturación incial a 94°C durante 3 minutos, seguida de 45 ciclos de 94°C 1
minuto, 36°C 1 minuto, 72°C 2 minutos, y una extensión final de 10 minutos a 72°C
(33).
La separación de las bandas para cada producto de PCR se realizó mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (p/v) en buffer TAE 1X, y fueron reveladas
posteriormente con bromuro de etidio (0,5µg/ml).
Tabla 1: Cebadores seleccionados par la caracterización molecular de los 40 aislamientos de
Fusarium spp.
Primer
OPA 2
OPA 3
OPA 4
OPA 9
OPA 11
OPA 13
OPA 14
OPA 15
Secuencia
TGCCGAGCTG
AGTCAGCCAC
AATCGGGCTG
GGGTAACGCC
CAATCGCCGT
CAGCACCCAC
TCTGTGCTGG
TTCCGAACCC
Fuente: Eurofins MWG operon. Acceso en: http://www.operon.com/default.aspx
6.4. Análisis de resultados
6.4.1. Actividades enzimáticas
Los resultados de actividad enzimática se analizaron por comparación de medias
ANOVA, con un valor de significancia del 95%, incluyendo los datos de actividad
enzimática de los aislamientos de origen animal, humano y vegetal reportados por
Valencia, 2009 (4), y aplicando un análisis de varianza con la prueba de Duncan,
empleando el programa SPSS versión 11.0. Adicionalmente se determinaron umbrales
de valores de actividad enzimática para construir una matriz binaria, valor 1 para
actividad enzimática positiva y valor 0 para actividad enzimática negativa. Dicha matriz
se empleó en el programa NTSYS versión 2,0 para construir un dendrograma, usando
el algoritmo UPGMA.
El criterio empleado para la construcción de las matrices se basó en el
comportamiento estadístico de los datos, para aquellos que se comportaban
normalmente se tomó la media como punto de referencia, mientras que para los que
no presentaron un comportamiento normal se tomó la mediana, de tal manera que los
datos que se ubicaban por debajo de estos valores fueron tomados como cero y los
que se encontraban por encima como 1.
8
6.4.2. Caracterización molecular
Los resultados de caracterización molecular por RAPD-PCR fueron analizados para
construir dendrogramas basados en índices de similitud. Para esto se construyeron
matrices de presencia (1) y ausencia (0) de bandas que representaban polimorfismos
con los 8 cebadores seleccionados, y se realizó el análisis con el programa NTSYS
versión 2,0 empleando el algoritmo UPGMA.
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. Caracterización enzimática
7.1.1. Determinación de la hidrólisis amilolítica
La caracterización enzimática cuantitativa para la actividad amilolítica se realizó de
manera indirecta aplicando la técnica de DNS para evidenciar presencia de azúcares
reductores en el caldo de cultivo, producto de la hidrólisis del almidón. Los resultados
obtenidos se muestran en la figura 1.
20
18
16
2,0
14
12
1,5
10
%RNG
Concentración azúcares reductores g/L
2,5
8
1,0
6
4
0,5
2
0,0
0
401
402
403
404
405
406
407
408
409
410
C. +
Cepas
Azúcares reductores
RNG
Figura 1: Determinación de la hidrólisis amilolítica. C.+: control positivo: Trichoderma
harzianum
Estos resultados muestran una baja actividad amilolítica por parte de las cepas
evaluadas respecto al control positivo, lo cual se evidencia en la baja concentración de
azúcares reductores y por tanto, el bajo porcentaje de RNG, siendo las cepas 405 y
406 las más activas en el proceso de degradación del almidón, con una liberación de
azúcares de 0,398 y 0,408 g/L respectivamente, concentraciones correspondientes al
9
3,5 y 3,6% de degradación del sustrato inicial, y las cepas 407 y 404 las cepas menos
amilolíticas, ya que el porcentaje de degradación fue del 0,04 y el 0% para cada caso.
Adicionalmente, se realizó un análisis de varianza ANOVA incluyendo los aislamientos
trabajados por Valencia 2009 (4), encontrando diferencias estadísticamente
significativas entre las cepas (P=0,000), por lo que se aplicó la prueba de Duncan, con
la que se obtuvieron 15 agrupaciones diferentes, siendo así los aislamientos
provenientes de humanos (vía sistémica) los menos activos enzimáticamente, y los
aislamientos provenientes de humanos (lesiones cutáneas) y de plantas los de mayor
actividad amilolítica (anexo 4.1).
El almidón es un polímero de glucosa conformado por dos unidades básicas (amilosa
y amilopectina), que constituye el principal polímero de reserva en las plantas jugando
un papel esencial para el desarrollo de las mismas (34). Al ser un compuesto que se
encuentra en las plantas, es una fuente nutricional para el crecimiento de
microorganismos fitopatógenos que sean capaces de alimentarse del mismo.
Para el caso de las cepas de Fusarium spp. evaluadas, aunque solamente se buscaba
presencia o no de la actividad enzimática, se esperaba obtener valores de hidrólisis
del compuesto mayores a los obtenidos, debido a que el hongo se presenta como un
agente fitopatógeno habitante común del suelo (12), sin embargo, se asume que las
condiciones de cultivo no fueron las adecuadas para la producción de las amilasas.
A pesar de que se realizó una inducción previa de las enzimas con los componentes
del medio de cultivo y el inóculo empleado, se ha confirmado que la producción de
amilasas está altamente influenciada por la presencia de fuentes orgánicas de
nitrógeno, tales como el extracto de levadura, el extracto de carne y las peptonas, así
como la combinación de las mismas con fuentes inorgánicas como el sulfato de
amonio (35). Adicionalmente, la concentración de fosfatos sugerida para la inducción
de las enzimas amilolíticas es de 0,2M (35). En ese orden de ideas, el medio de cultivo
empleado para el presente trabajo no fue del todo apropiado, ya que no poseía una
fuente de nitrógeno orgánica, y adicionalmente las concentraciones de fosfato
monobásico y dibásico empleadas fueron inferiores a las anteriormente mencionadas
(0,7 y 0,5 mM, respectivamente).
Por otra parte es importante resaltar que el pH y la temperatura son factores que
afectan directamente la producción de las enzimas; para el caso específico de F.
solani, se ha demostrado que las glucoamilasas son activas a pH alrededor de 4 a 6,
con un óptimo de producción a pH 5 (36; 37). Al no haber realizado un seguimiento al
pH durante el tiempo de cultivo (48 horas), se podría decir que este fue un factor
determinante para la baja producción de amilasas, ya que los cambios en el pH
pueden afectar la ionización de los residuos de aminoácidos presentes en las enzimas
y que son claves para el clivaje y la degradación del sustrato, y el pH final de las
muestras trabajadas osciló entre 2,8 y 3, lo cual sería concordante con lo
anteriormente dicho (36). Respecto a la temperatura, se han reportado cepas de F.
solani capaces de producir glucoamilasas en rangos de 25 a 45°C (37), sin embargo,
la temperatura óptima de las amilasas está relacionada con la temperatura de
crecimiento del microorganismo (35), por lo que en este caso no sería un factor
determinante en la falta de producción enzimática, ya que el hongo fue incubado
siempre bajo las mismas condiciones (30°C).
Al comparar los resultados con los reportados por Valencia, 2009, el cual fue realizado
con cepas de Fusarium spp. provenientes de diferentes orígenes de aislamiento, se
puede rectificar nuevamente que los resultados obtenidos en cuanto a concentración
de azúcares reductores fueron bajos, ya que en dicho estudio se reportan
10
concentraciones máximas de 1,4 g/L para las cepas provenientes de animales, 3,0 g/L
para las cepas provenientes de humanos y 1,8 g/L para las cepas provenientes de
plantas, todas tratadas bajo las mismas condiciones de prueba (4). Sin embargo, el
hecho de que exista actividad en las cepas provenientes de los tres orígenes de
aislamiento, incluyendo los provenientes de vía sistémica, podría ser un primer
acercamiento al modelo Fusarium multihospedero, ya que indicaría que cepas que no
son provenientes de plantas podrían degradar los polímeros de reserva de las mismas,
recordando que muy posiblemente en un proceso infectivo el patógeno podría
encontrar una mayor adaptación al entorno y por tanto una mejor expresión de las
enzimas, que como se comprobó con el estudio de Valencia 2009 y el presente, las
especies de Fusarium poseen.
Además de esto, los resultados obtenidos por Valencia 2009 (4), concuerdan con en
análisis estadístico reportado en el presente estudio, y aunque no era de esperarse
que los aislamientos de origen humano (lesiones cutáneas) fueran los más
amilolíticos, estos resultados representan una interesante teoría acerca de la forma de
adquisición del patógeno y de la posibilidad del mismo para tener enzimas que le
permitan aumentar su agresividad como patógeno de plantas. Finalmente, en el anexo
4.1 se puede observar también como la agrupación de los aislamientos se dio en
función de las especies, independientemente del origen de aislamiento, lo que
nuevamente sería indicativo de la capacidad del hongo para hacer saltos entre reinos.
7.1.2. Determinación de la hidrólisis celulolítica
8
0,6
6
0,5
0,4
4
0,3
0,2
%RNG
Concentración azúcares reductores g/L
0,7
2
0,1
0,0
0
401
402
403
404
405
406
407
408
409
410
C. +
Cepas
Azúcares reductores
RNG
Figura 2: determinación de la hidrólisis celulolítica. C. +: control positivo: Trichoderma
harzianum.
La figura 2 muestra los resultados obtenidos para la cuantificación de azúcares
reductores presentes en el caldo celulosa luego del periodo de incubación, así como el
%RNG correspondiente a la degradación del sustrato inicial. Como se puede observar,
las cepas estudiadas superaron la concentración de azúcares reductores liberados por
el control positivo (0,408 g/L), siendo nuevamente las cepas 405 y 406 las más activas
11
en el proceso de degradación del sustrato, con concentraciones de azúcares
reductores de 0,598 y 0,658 g/L, correspondientes al 6,65 y 7,31% de RNG
respectivamente. Las cepas que presentaron menor actividad fueron la 401 y la 408,
con un RNG de 5,40 y 5,39%, valores mayores al presentado por T. harzianum
(4,53%).
El análisis de varianza ANOVA mostró nuevamente diferencias estadísticamente
significativas entre las 40 cepas analizadas (P= 0,000), y la prueba de Duncan mostró
que en el grupo con mayor actividad hidrolítica se encontraban las cepas de origen
sistémico, mientras que el grupo donde la libración de azúcares reductores fue menor
se conformó por las cepas aisladas de animales y plantas (anexo 4,2), lo que platea un
primer interrogante para la consideración de Fusarium como patógeno multihospedero.
Las enzimas celulolíticas producidas por hongos como Fusarium juegan un papel muy
importante en el proceso infectivo de plantas, ya que permite la penetración e invasión
de las mismas mediante la degradación de las barreras celulares (38).
Para el caso de cepas de Fusarium oxysporum se han realizado diversos estudios en
los que se comprueba la capacidad del microorganismo para producir enzimas
celulolíticas a partir de sustratos vegetales, tales como maíz y trigo (39; 40), por lo cual
la degradación de la carboximetil celulosa (fuente de carbono trabajada en el proyecto)
era de esperarse, y aunque nuevamente las condiciones de cultivo mencionadas con
la producción de amilasas son indispensables para la inducción de las celulasas, para
el caso particular de estas enzimas no se considera que dichas condiciones hayan
afectado de manera negativa el cultivo, ya que se vio liberación de azúcares
reductores, lo cual es indicativo de la presencia de las mismas.
Lo que no era de esperarse es que fueran precisamente las cepas de origen sistémico
y no aquellas aisladas de plantas, las que presentaran la mayor actividad, lo cual pudo
deberse a diferentes factores. En primer lugar se debe considerar que las cepas de
origen sistémico corresponden en su gran mayoría a la especie Fusarium oxysporum,
la cual ha sido relacionada con enfermedades en plantas principalmente (41), por lo
que se podría suponer que antes de llegar a su hospedero final, el hongo pudo haber
estado en una planta o como habitante normal del suelo, y aunque las cepas aisladas
de plantas pertenecen a la misma especie, estas pueden haber perdido su actividad
enzimática durante el tiempo de conservación.
En segundo lugar, en el estudio de Valencia, 2009 (4), las cuantificaciones de
azúcares reductores no solamente se hicieron a los 2 días de cultivo, sino que fueron
evaluados también a los 4 días, cuantificación que dejó una mayor concentración de
azúcares reductores, con un máximo de RNG de 6,14% para las cepas provenientes
de animales, 6,0% para las cepas provenientes de humanos y 5,98% para las cepas
provenientes de plantas, por lo que se podría asumir que el metabolismo de dichas
cepas es más lento que las cepas evaluadas en el presente proyecto.
Finalmente, se debe resaltar que independientemente de que las concentraciones de
azúcares reductores para los aislamientos provenientes de plantas fueran menores, no
significa que la actividad de estos sea nula. Para que un patógeno pueda causar una
enfermedad existen tres factores básicos que pueden afectar su capacidad: el
patógeno en si, la susceptibilidad del hospedero y un ambiente que favorezca el
desarrollo de la misma (42). Teniendo esto en cuenta, no se puede asumir la
capacidad de degradación in vitro de la celulosa por parte del hongo como un factor
determinante para su patogenicidad, y por lo tanto a pesar de los resultados obtenidos,
se comprueba que la totalidad de los aislamientos de Fusarium estudiados poseen
12
actividad celulolítica, son capaces de degradar el sustrato y posiblemente serían
capaces de causar enfermedades en plantas susceptibles a los mismos.
7.1.3. Determinación de la hidrólisis pectinolítica
Para la actividad pectinolítica los aislamientos evaluados mostraron valores inferiores
respecto al control positivo empleado. Las cepas que presentaron mayor actividad
enzimática fueron la 401 (2,16 g/L y 19,6 % RNAG) y la 410 (1,55 g/L y 14,1% RNAG),
mientras que la cepa 407 no presentó actividad. Los resultados se muestran en la
figura 3.
6
60
5
50
4
40
3
30
2
20
1
10
0
%RNAG
Concentración azúcares reductores g/L
Por su parte, el análisis de varianza de Duncan mostró que los aislamientos menos
activos estaban distribuidos entre los tres orígenes de aislamiento, primando aquellos
de procedencia humana (lesiones cutáneas), y los grupos de los aislamientos con
mayor actividad enzimática estuvieron conformados igualmente por cepas de los tres
orígenes (nivel de significancia del 95%); para los dos casos la especie sobresaliente
fue Fusarium oxysporum (anexo 4.3).
0
401
402
403
404
405
406
407
408
409
410
C. +
Cepas
Azúcares reductores
RNAG
Figura 3: determinación de la hidrólisis pectinolítica. C.+: control positivo: Cholletotrichum
lindemuthianum
La producción de enzimas pectinolíticas es un factor de virulencia muy importante para
patógenos fúngicos como las especies de Fusarium ya que no solamente permiten la
penetración del tejido vegetal, sino que también están involucradas en la degradación
de los componentes celulares y la colonización del hospedero (43).
13
Al ser considerado como un patógeno de plantas, los estudios reportados sobre
diversas especies de Fusarium permiten confirmar la presencia de enzimas
pectinolíticas asociadas a la patogenicidad del agente; por ejemplo, Wanjiru W. y
colaboradores presentaron en el 2002 un estudio con F. graminearum para ver la
degradación de componentes celulares presentes en espigas de trigo, tales como la
pectina, el xilano y la celulosa, encontrando que efectivamente los sustratos eran
depolimerizados y que esto facilitaba la colonización del hospedero (44). Niture y Pant
en el 2007 reportaron la producción de enzimas degradadoras de pared de Fusarium
moniliforme, realizando un estudio de patogenicidad del hongo sobre plantas de
tomate y coliflor (45). Para el caso específico de F. oxysporum se ha reportado la
presencia de la endopoligaracturonasa, enzima encargada de romper el enlace
glucosídico entre las unidades de ácido galacturónico demetilado, demostrando la
importancia de la enzima durante el proceso infectivo del tomate (46). Teniendo en
cuenta lo anterior, los resultados obtenidos fueron los esperados para el 50% de las
cepas de vía sistémica, las cuales corresponden en su mayoría a la especie de F.
oxysporum (cepas 401, 408 y 410).
Cuando se hace el análisis de los 40 aislamientos y se determina que las cepas
provenientes de humanos (lesiones cutáneas) fueron las menos activas para la
producción de pectinasas y que no todas las cepas de origen sistémico presentaron
actividad, se podría decir que en este caso el origen de aislamiento puede influenciar
la producción de las enzimas, haciendo que estas sean de lenta expresión in vitro ya
que en los humanos de donde fueron aisladas inicialmente, no hay pectina y por tanto
no hay inducción de dichas enzimas como factor de virulencia, sin embargo, si esta
relación entre producción de enzimas – origen de aislamiento fuera obligatoria, para el
caso de las cepas aisladas de plantas se esperaría obtener valores altos de actividad
enzimática, sin embargo se presentaron cepas provenientes de dicho origen que no
tuvieron actividad.
Las enzimas pectinolíticas pueden ser clasificadas en dos grupos: las esterasas, que
liberan el grupo metilo presente en la molécula, y las enzimas de depolimerización,
que actúan sobre los enlaces α – (1,4) de la siguiente manera: la endopectin liasa
corta al interior de la molécula entre monómeros metilados, contrario a la
endopoligalacturonasa (endoPG) que a pesar de que actúa también al interior de la
molécula, esta solamente lo hace cuando el ácido galacturónico está demetilado, y
finalmente la exopoligalacturonasa (exoPG) actúa bajo las mismas condiciones que la
endoPG pero cortando por el extremo del polisacárido (47). Si se asocian las
características de estas enzimas a lo ocurrido con las cepas que no presentaron
actividad, se podría suponer la falta de enzimas como la pectin esterasa, que
demetilaran el sustrato inicial para permitir la posterior acción de las otras enzimas, lo
cual explicaría la falta de azúcares reductores. De ser cierta esta hipótesis, no se
podría descartar el potencial pectinolítico de las cepas, ya que no se estaría realizando
una caracterización a profundidad de las enzimas expresadas por los hongos bajo un
sustrato consistente en pectina metilada (como el empleado en el presente estudio) y
otro en pectina demetilada.
7.1.4. Determinación de la actividad proteolítica
Contrario a las enzimas anteriores, la determinación de la actividad proteolítica se llevó
a cabo de manera directa, por medio de una reacción enzimática que involucraba la
interacción entre las enzimas presentes en el extracto crudo y una solución de caseína
para cuantificar la concentración de tirosina liberada. Para este caso los resultados
14
fueron expresados como UP, como se muestra en la figura 4, siendo la cepa 404 la
más activa (11,03 UP) y la cepa 409 la menos proteolítica (3,79 UP).
12
10
0,6
8
0,4
6
UP
Concntración tirosina liberada µMol/ml
0,8
4
0,2
2
0,0
0
401
402
403
404
405
406
407
408
409
410
C. +
Cepas
Tirosina liberada
UP
Figura 4: determinación directa de la actividad proteolítica. C.+: control positivo: Trichophyton
mentagrophytes
El análisis de varianza ANOVA mostró diferencias estadísticamente significativas entre
las 40 especies evaluadas a un nivel de significancia del 95% (P=0,000), por lo que
nuevamente se realizó la prueba de Duncan, la cual agrupó dentro de los aislamientos
menos proteolíticos a la totalidad de las cepas de origen sistémico y el 90% de las
cepas provenientes de plantas mientras que en el grupo con mayor actividad
enzimática se ubicaron los aislamientos provenientes de humanos y animales (anexo
4.4).
Uno de los principales factores de virulencia más estudiados para las especies de
Fusarium es la producción de enzimas líticas que le permiten establecerse en un
hospedero, violar sus defensas y aprovechar los componentes celulares del mismo
como fuentes alimenticias. Las proteasas han sido asociadas como un factor de
virulencia tanto para plantas como para animales y humanos. En el caso de las plantas
se ha dicho que el patógeno las expresa constitutivamente, participando en la
degradación de proteínas secretadas por las plantas como mecanismos de defensa
(17), mientras que en humanos y animales permiten la colonización de tejidos, lo cual
ocasiona lesiones cutáneas en los dos tipos de hospedero (14; 17), por lo tanto, los
resultados obtenidos en el presente estudio fueron los esperados.
Es claro que al haber trabajado con aislamientos sistémicos se esperaba obtener
valores significativos de actividad proteolítica, ya que estos fueron capaces de
desarrollarse en un sustrato complejo como es la sangre, en la que no solamente se
encuentran proteínas provenientes de la nutrición del individuo, sino que también se
encuentra la hemoglobina, una proteína compleja en su estructura y de gran
estabilidad. Adicionalmente, los cultivos en agar leche descremada presentaron un
15
crecimiento rápido con halos de hidrólisis evidentes al día 2 de cultivo, lo cual fue un
primer indicativo de la actividad proteolítica (figura 5).
a
b
Figura 5: Cepa 405 (F. oxysporum) en agar leche descremada. a.) día 3 de cultivo; b: día 4 de
cultivo
Una vez comparados los datos del presente estudio con los reportados por Valencia
2009, se pudo encontrar que a pesar de que la actividad proteolítica de los
aislamientos de vía sistémica fueron mayores en relación al control positivo empleado,
se hizo evidente que las mejores actividades las presentaban las cepas de lesiones
superficiales en humanos y animales con un máximo de de 27,5 y 26,12 UP
respectivamente, lo cual concuerda con lo anteriormente dicho (4).
Los tejidos queratinizados tales como la piel, las uñas y el pelo se presentan como un
blanco para las cepas de Fusarium, independientemente del estado inmunológico del
hospedero; sin embargo, la patogenicidad de los mismos no depende enteramente de
dichas enzimas, ya que los hongos quertatinofílicos producen complejos de enzimas
proteolíticas involucradas en la hidrólisis de proteínas solubles como la caseína, la
albúmina y la gelatina, e insolubles como la queratina, el colágeno y la fibronectina
(48), lo cual permite afirmar que Fusarium se comporta como un patógeno emergente,
capaz de expresar factores de virulencia que le permiten colonizar los tres tipos de
hospederos.
Finalmente es importante recordar que las enfermedades causadas por el género
Fusarium pueden ser de 2 tipos: localizadas y sistémicas, estando estas últimas
íntimamente relacionadas con el estado de inmunocompromiso del paciente que
adquiere al agente, siendo los pacientes con cáncer y aquellos expuestos a
transfusiones sanguíneas, los más propensos a adquirir el patógeno, que puede llegar
a causar enfermedades como neumonía y enfermedades diseminadas (49; 14), lo cual
indica la agresividad de este patógeno de plantas y humanos.
7.2.
Caracterización molecular
La caracterización molecular de los 40 aislamientos de Fusarium spp. se realizó
mediante la técnica RAPD-PCR. Como se mencionó anteriormente en la metodología,
se evaluaron 19 cebadores Operon tipo A con las cepas F. oxysporum (160, 208, 310),
F. equiseti (111), F. verticillioides (156) y F. nelsonii (159), y teniendo en cuenta los
polimorfismos mostrados y la reproducibilidad de los resultados se seleccionaron los 8
cebadores referenciados en la tabla 1. Una vez obtenidos los resultados, se realizaron
matrices de presencia/ausencia (1/0) con las bandas polimórficas seleccionadas, y se
determinó la talla molecular de las mismas. Adicionalmente, se elaboraron tres
dendrogramas con las matrices generadas, tal como se muestra en las figuras 6, 7 y 8.
16
Los resultados obtenidos permitieron identificar que los cebadores OPA 2, 4 y 13,
reportados en literatura (3;33), fueron los que generaron mayor número de
polimorfismos, mientras que los cebadores OPA 14 y 15 mostraron un patrón de
bandeo más limitado (anexo 5).
Figura 6: Caracterización molecular de 40 aislamientos de Fusarium spp. con los
cebadores reportados en literatura (OPA 2, OPA 4 Y OPA 13).
La figura 6 muestra los clusters formados mediante la evaluación de las 40 cepas
empleando los cebadores reportados por Castro N. 2008 (3) y Achenbach L. 1996 (33)
y teniendo en cuenta una similitud del 70%. Como se puede observar, bajo este
porcentaje se forman 10 clusters en los que los aislamientos se agrupan según la
especie pero no de acuerdo al origen de aislamiento. Para el caso de F. verticillioides
las cuatro cepas existentes se agrupan en un mismo cluster presentando un 100% de
similitud, lo que es indicativo de que el patrón de bandas obtenido con los cebadores
evaluados fueron idéntico, mientras que en los clusters 2 y 8 se muestran las cepas
identificadas como Fusarium sp. que no se asocian con ningún otro aislamiento bajo el
parámetro del 70%. Contrario a esto, las tres cepas de F. nelsonii se asociaron con el
100% de similitud (cluster 3). Adicionalmente, las cepas de F. oxysporum, que
corresponden al 63,5% del total de los aislamientos evaluados, se distribuyen en su
mayoría en un cluster presentando una similitud del 77% e involucrando cepas de
humanos (sistémicas y cutáneas), de animales y plantas, a excepción de la cepa 311
que se ubica en el cluster 5 relacionada con F. equiseti, y la cepa 303 que se ubica en
el cluster 9 con un aislamiento de origen sistémico (Fusarium sp). Dentro de este
cluster se pueden observar agrupaciones con el 100% de similitud, de los cuales
17
solamente el cluster d presenta 2 cepas del mismo origen de aislamiento, mientras que
en el resto (clusters a,b,c y e) se evidencia que hay reunión de diferentes orígenes.
Para el caso de F. solani se observa que los 2 aislamientos provenientes de vía
sistémica se agrupan en un cluster con el 100% de similitud, mientras que la cepa 108
se encuentra sola, sin embargo se relaciona en un 57% con la cepa 403
correspondiente a Fusarium sp.
Figura 7: Caracterización molecular de 40 aislamientos de Fusarium spp. con los cebadores
seleccionados (OPA 3, OPA 9, OPA 11, OPA 14 y OPA 15).
Al comparar estos resultados anteriores con los obtenidos para el dendrograma
generado con los cebadores seleccionados (OPA 3, OPA 9, OPA 11, OPA 14 y OPA
15) se puede decir que el comportamiento general es el mismo al anterior (cebadores
OPA 2, OPA 4 Y OPA 13), ya que las agrupaciones se dan en función de las especies,
sin embargo se presentan algunas variantes. A pesar de que el número total de
bandas polimórficas evaluadas fue el mismo que el anterior (anexo 5), el número de
clusters aumentó a 12. De las tres cepas de F. nelsonii que anteriormente presentaban
el 100% de similitud, la 201 fue apartada para ubicarse en el mismo cluster pero con el
86%. La cepa 409 correspondiente a Fusarium sp. se ubicó sola en el cluster 5, sin
embargo las otras cepas de Fusarium sp. se ubicaron en un mismo cluster junto con F.
verticillioides presentando un 100% de similitud con las mismas. Por otro lado, las
cepas de F. equiseti se agruparon en el cluster 4 con un 82% de similitud, y el cluster
que anteriormente mostraba un 77% de similitud y agrupaba a 23 cepas de F.
oxysporum cambió, ya que solamente se agruparon 17 de estas cepas
correspondientes a todos los orígenes; sin embargo, se observa que se mantuvo el
cluster que muestra un 100% de similitud entre las cepas 313 y 314. El resto de
aislamientos de F. oxysporum se distribuyeron en clusters diferentes. Para F. solani la
18
cepa 108 se ubicó nuevamente sola en un único cluster, sin embargo se asoció con
las cepas 402 y 404 con un 48% de similitud, lo que no ocurrió con los cebadores OPA
2, 4 y 13 (figura 7).
Figura 8: Caracterización molecular de 40 aislamientos de Fusarium spp. con todos los
cebadores evaluados.
Finalmente, el análisis de los resultados se realizó también con un dendrograma que
involucró todos los cebadores evaluados en el estudio, y a pesar de que el número de
bandas polimórficas fue mayor a los anteriores (26 bandas), se formaron nuevamente
12 clusters. Las cepas de F. nelsonii presentaron igual comportamiento al visto con los
cebadores seleccionados, mientras que el porcentaje de similitud de las cepas de F.
equiseti disminuyó al 66% comparado con el caso anterior que era del 80%. El cluster
que agrupa a las cepas de F. oxysporum volvió nuevamente a abarcar las mismas 23
cepas que se habían agrupado con los cebadores reportados, manteniendo el cluster
con 100% de similitud de las cepas 313 y 314 presente en los tres casos. Las cepas
de F. verticillioides fueron agrupadas con un 85% de similitud, siendo los aislamientos
155 y 156 idénticos para las bandas evaluadas. Por último, las cepas de Fusarium sp.
fueron nuevamente separadas cada una en un cluster, y las cepas de F. solani
presentaron el comportamiento ya visto, en donde el aislamiento 108 se encuentra
solo en el cluster 1, mientras que las cepas 402 y 404 presentan el 100% de similitud
(figura 8).
Una vez se compararon los tres dendrogramas y teniendo en cuenta que la especie F.
oxysporum fue las más representativa en el estudio, se generaron tres dendrogramas
más en los que solo se incluyeron las cepas pertenecientes a dicha especie, con el fin
de ver la variabilidad entre las mismas (figuras 9, 10 y 11).
19
Figura 9: dendrograma generado para la caracterización molecular de las cepas de F.
oxysporum con los cebadores reportados (OPA 2, 4 y 13)
La figura 9 muestra el dendrograma generado con los cebadores reportados en
literatura (OPA 2, 4 y 13) para las especies de F. oxysporum evaluadas en el estudio.
Como se puede observar, la agrupación no se dio en un 100% para todas las cepas, lo
cual indica alta variabilidad genética de los aislamientos ya que se trataba de la misma
especie. El cluster 1, formado con un 77% de similitud abarca 23 cepas de F.
oxysporum de los tres orígenes de aislamiento y adicionalmente presenta 5
agrupaciones que muestran un patrón de bandeo idéntico, siendo particular que solo
uno de ellos está conformado por dos cepas del mismo origen (cluster 1d: aislamientos
313 y 314), mientras que el resto de clusters demuestran 100% de similitud entre
cepas de animales y humanos sistémicos (cluster 1 a), humanos cutáneos y humanos
sistémicos (cluster 1b) y humanos cutáneos y plantas (clusters 1c y 1e). Por otra parte,
las cepas 303 y 311 son ubicadas cada una en un cluster diferente bajo el parámetro
del 70% de similitud.
20
Figura 10: dendrograma generado para la caracterización molecular de las cepas de F.
oxysporum con los cebadores seleccionados (OPA 3, 9, 11, 14 y 15)
Cuando se evalúan estos mismos aislamientos con los cebadores seleccionados, se
puede observar un cambio en las asociaciones formadas (figura 10). En primer lugar,
el número de clusters aumentó a 5 presentando la siguiente distribución: un primer
cluster que muestra agrupación entre 16 cepas de las 25 evaluadas, en el cual,
solamente se forman 2 clusters que tienen el 100% de similitud, uno que corresponde
a las cepas 204, 205, 405 y 407 (cluster 1 a) y otro que recoge las cepas 209 y 210
(cluster 1b). Además de esto, la cepas 303 y 311 que anteriormente se encontraban
en un solo cluster cada una, fueron asociadas esta vez a la cepa 310 con el 75% de
similitud y a la cepa 309 con 80% respectivamente (clusters 2 y 4). Finalmente, el
cluster 3 muestra una agrupación del 100% entre los aislamientos 313 y 314 como se
había visto anteriormente, y la cepa 302 fue asociada a dichos aislamientos con un
80% de similitud.
21
Figura 11: dendrograma generado para la caracterización molecular de las cepas de F.
oxysporum con los todos los cebadores
El último dendrograma correspondiente a las agrupaciones obtenidas con todos los
cebadores evaluados. Se muestra nuevamente la formación de 5 clusters, pero
diferentes a los anteriores: por una parte el cluster 1 solamente agrupó 12 cepas, de
las cuales solo la 204 y la 407 presentaron un 100% de similaridad. Las cepas 303 y
311 fueron separadas nuevamente en un cluster cada una (clusters 4 y 5), y el
aislamiento 302 se asoció, la igual que en el caso anterior, con las cepas 313 y 314
que muestran el 100% de similitud entre ellas (cluster 3). En el caso del cluster 2, las
cepas provenientes de lesiones cutáneas de humanos, se relacionaron en un 73% con
cuatro aislamientos de plantas (figura 11).
Con estos tres análisis se pudo observar adicionalmente, que las cepas provenientes
de plantas tuvieron una tendencia a estar más separadas del grupo general,
encontrando mayor número de asociaciones entre los aislamientos de origen humano
sistémico, humano cutáneo y animal.
Los resultados obtenidos con la caracterización molecular para los 40 aislamientos
evaluados fueron los esperados para los fines del estudio, ya que las agrupaciones
encontradas en los tres casos planteados se dieron siempre a nivel de especie
independientemente del origen de aislamiento de las cepas, y aunque no hay reportes
del uso de RAPDs como un medio de aproximación a modelos multihospedero, los
dendrogramas generados demuestran su utilidad para el entendimiento de la relación
patogénica de las cepas evaluadas, ya que cuando se relacionan las agrupaciones
formadas con dicho modelo, se puede observar que en algunos de los casos existió un
100% de similaridad entre cepas de igual especie pero provenientes de plantas y
humanos (figura 6, cluster 7c), a partir de lo cual se plantea la posibilidad de que un
22
hongo que inicialmente se encuentra en una planta pueda causar enfermedad en un
humano y viceversa.
Al comparar los resultados con los obtenidos por Vega, 2009, en el que se trabajan las
mismas cepas de Fusarium a excepción de los aislamientos provenientes de vía
sistémica, con una caracterización mediante secuencias consenso repetitivas
intragénicas de enterobacterias (ERIC – PCR) y la amplificación de secuencias
repetitivas palindrómicas extragénicas (REP-PCR), se puede confirmar lo
anteriormente dicho, ya que la agrupación se dio igualmente a nivel de especie,
confirmando la alta variabilidad y la posibilidad del hongo para hacer saltos entre
reinos (31).
De la misma manera, Castro y colaboradores en el 2009, reportan alta variabilidad
entre cepas pertenecientes a la especie F. oxysporum, encontrando 26 patrones de
bandeo diferentes en 42 aislamientos evaluados con los mismos cebadores
empleados en el presente estudio (OPA 2, 4 y 13), lo que sugiere que la técnica
permite no solamente hacer diferenciación de especies, sino que posiblemente es útil
para la identificación de formas especiales (3), o como en el caso planteado por
Achenbach y colaboradores, permite distinguir entre cepas patógenas de aquellas que
no lo son (33). Estos reportes concuerdan con los resultados obtenidos para las
agrupaciones formadas con los tres dendrogramas generados con el análisis de las
cepas de F. oxysporum, donde se evidencia que a pesar de ser aislamientos de la
misma especie, no hay una asociación del 100% de similitud entre todos, resultado
indicativo de una alta variabilidad genética y por tanto, un número de polimorfismos
significativos, que permiten que dichas cepas sean separadas en clusters diferentes.
El -Fadly y colaboradores por otra parte, emplearon la técnica de RAPD para la
identificación de 6 especies diferentes de Fusarium previamente identificadas por sus
características morfológicas y patogénicas, encontrando que los resultados estaban
sujetos a los cebadores empleados, ya que unos cebadores demostraban 100% de
similitud entre los aislamientos, mientras que los otros los separaban en un cluster
cada uno (50). Si se relaciona la utilidad de la técnica para la identificación de especie
con los resultados obtenidos, se podría decir que las cepas que en el presente estudio
se muestran como Fusarium sp., podrían ser F. verticilliodes, ya que en la figura 7 se
muestra como estas se agrupan con las cepas de dicha especie en un cluster del
100% de similitud. Sin embargo, no es un resultado definitivo, ya que al igual que ElFadly y colaboradores, las agrupaciones dependieron de los cebadores evaluados y
este no fue repetitivo en los tres casos.
Finalmente, en todos los dendrogramas se observó que la especie F. solani se
encontró siempre alejada de las demás especies. Al relacionar este fenómeno con
estudios filogenéticos, se puede decir que dicho suceso era de esperarse ya que F.
solani ha sido catalogada como una especie divergente respecto a otras especies de
Fusarium, como F. graminareum, F. oxysporum y F. verticillioides, con las cuales
comparte una gran parte del genoma, pero difiere de ellos ya que posee regiones de
linajes específicos en los que se han encontrado genes relacionados con interacciones
patógeno – hospedero (51).
7.3.
Análisis comparativo de los resultados
Con el fin de realizar un análisis comparativo entre los resultados obtenidos con la
determinación de perfiles enzimáticos y la caracterización molecular, se generó una
matriz de presencia/ausencia para actividad enzimática teniendo en cuenta la
normalidad de los datos, tomando la media como punto de referencia para aquellas
23
actividades en los que los datos se comportaban normalmente, y la mediana para
aquellas actividades que presentaron datos no normales (anexo 6). El resultado
obtenido se muestra en la figura 12.
Figura 12: Dendrograma obtenido con los perfiles amilolíticos, celulolíticos, pectinolíticos y
proteolíticos para las 40 cepas de Fusarium spp.
El dendrograma generado muestra un patrón de agrupación diferente al presentado en
la caracterización molecular, ya que en este caso las agrupaciones se dieron en
función del origen de aislamiento en su mayoría. Como se puede observar, se
originaron 10 clusters diferentes bajo un porcentaje de similitud del 70%. Para el caso
del cluster 1 se evidencia que priman los aislamientos de procedencia animal, sin
embargo hay una relación con cepas provenientes de humanos hasta del 100%, lo
cual era de esperarse ya que los dos orígenes están relacionadas con lesiones
cutáneas; además de esto se muestra la presencia de cinco especies diferentes (F.
solani, F. equiseti, F. oxysporum, F. nelsonii y F. verticillioides) en este mismo grupo.
Un cluster interesante para el fin del estudio es el número 2, en el que hay reunión
tanto de especies diferentes como de orígenes de asilamientos diversos (humanos
cutáneos, animales y plantas). Por último es importante resaltar que los aislamientos
provenientes de vía sistémica se encuentran menos relacionados con los otros
orígenes, formando agrupaciones con un 100% de similitud (clusters 7b y 9), mientras
que para el caso de las plantas no se formó un cluster específico, sino que los
aislamientos provenientes de este origen se distribuyeron en diferentes grupos.
En el 2004, Ortoneda y colaboradores plantearon el modelo multihospedero con una
cepa de F. oxysporum capaz de causar enfermedades tanto en plantas como en
animales. Para tal fin, realizaron una inoculación con una suspensión de conidios de F.
oxysporum f.sp. lycopersici (patógeno de tomate) en un ratón inmunosuprimido,
demostrando la capacidad del hongo para causar una infección diseminada
24
evidenciada en la presencia de los propágulos en órganos como vaso, riñones, hígado
y pulmones, lo cual ocasionó la muerte del animal. Adicionalmente, complementaron
su estudio evaluando genes involucrados en la patogenicidad del hongo, indicando
que algunos genes como el Fmk1 son indispensables para la infección del patógeno
en tomate, pero no son necesarios para causar enfermedad en el ratón (2). Este
estudio representa el único reporte en el que se afirma que Fusarium es un patógeno
multihospedero.
Los resultados obtenidos para las dos caracterizaciones realizadas en el presente
estudio, se muestran como un soporte para el planteamiento de dicho modelo, ya que
por un lado se evidenció la presencia de enzimas líticas en todas las cepas evaluadas,
y por otra parte se mostró cómo cepas de la misma especie pueden provenir de
diferentes orígenes de aislamiento, lo que es indicativo de la capacidad patogénica de
las mismas y del amplio rango de hospederos que pueden ser afectados por este
género. Adicionalmente, las dos pruebas realizadas fueron complementarias y aunque
no se llevaron a cabo estudios de infección cruzada con las cepas evaluadas como en
el estudio anteriormente mencionado, se pudo mostrar una relación entre la
variabilidad genética de las cepas y los factores de virulencia presentes en las
mismas, lo cual es de gran importancia para el entendimiento de este patógeno.
De igual manera, es importante resaltar que la asociación de especies provenientes de
diferentes orígenes de aislamiento en un mismo cluster, así como las agrupaciones
formadas en función de la especie independiente del origen, puede deberse a la
capacidad de las cepas para adaptarse a diferentes condiciones, a mutaciones
espontáneas, a procesos de selección natural o por procesos de reproducción sexual
o parasexual que permiten a algunas especies de Fusarium presentar mayor
variabilidad genética y adquirir de alguna manera genes que le confieran
patogenicidad (41).
Para terminar, se han descubierto fenómenos aún más complejos implicados en la
variabilidad genética de las especies de Fusarium, como el reportado en marzo del
2010 por Ma y colaboradores, quienes afirman la presencia de cromosomas móviles
en F. oxysporum f.sp lycopersici, que contienen genes relacionados con patogenicidad
tales como el gen SIX1 y SIX2, involucrados en la expresión de proteínas secretadas
durante la colonización del xilema en plantas de tomate, y que además presentan una
gran cantidad de elementos transponibles que están involucrados en la transferencia
de dicho cromosoma a cepas no patógenas. Esta evidencia representa un avance
para el entendimiento de los orígenes de la especificidad de hospederos, y que de ser
estudiado más a fondo podría ser una clave importante para el seguimiento del modelo
multihospedero planteado con el presente proyecto (51; 52).
8. CONCLUSIONES
•
Se pudo demostrar la producción de enzimas líticas tales como amilasas,
celulasas, pectinasas y proteasas por parte de las 10 cepas de Fusarium spp.
aisladas de pacientes terminales con cáncer, lo cual es indicativo de que estas
cepas patógenas poseen algunos factores de virulencia necesarios para la
colonización de diferentes hospederos.
•
Al realizar el análisis comparativo entre los resultados obtenidos por Valencia
2009 y los informados en el presente estudio, se pudo encontrar que la
producción de enzimas estuvo presente en todas las cepas
25
independientemente del origen de aislamiento o del tiempo de cultivo, lo que
permitió asociar dichas enzimas como factores de virulencia importantes en el
planteamiento del modelo Fusarium multihospedero.
•
La caracterización molecular permitió evidenciar que con las tres formas
planteadas para la construcción de los dendrogramas, las agrupaciones se
generaron siempre a nivel de especie, involucrando diferentes orígenes de
aislamientos, y que estos resultados están sujetos a los cebadores que se
empleen.
•
Se pudo encontrar relación entre los polimorfismos encontrados y las enzimas
líticas como factores de virulencia, demostrando la variabilidad genética de las
cepas evaluadas lo cual permitió realizar la aproximación del modelo
multihospedero planteada con el proyecto.
9. RECOMENDACIONES
•
Se sugiere realizar pruebas de actividad directa para el caso de las amilasas,
celulasas y pectinasas con el fin de conocer las unidades enzimáticas
expresadas en cada caso.
•
Es importante considerar la optimización de medios de cultivo que permitan la
obtención de las enzimas evaluadas para posibles aplicaciones industriales de
las mismas.
•
Se propone realizar estudios moleculares dirigidos a la identificación de genes
relacionados con patogenicidad específicos para plantas, humanos y animales
en los cuatro orígenes de aislamiento.
•
Finalmente, es importante llevar a cabo pruebas de patogenicidad cruzada que
permitan confirmar la presente aproximación al modelo multihospedero.
26
10. REFERENCIAS
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30
11. ANEXOS
ANEXO 1: INFORMACIÓN DE LAS CEPAS TRABAJADAS
Codificación
Especie*
Fuente
108
F. solani
Bovino
111
F. equiseti
Canino
121
F. nelsonii
Canino
131
F. equiseti
Canino
155
F. verticillioides
Canino
156
F. verticillioides
Canino
159
F. nelsonii
Canino
160
F. oxysporum
Bovino
161
F. verticillioides
Canino
162
F. oxysporum
Canino
201
202
203
204
205
206
207
208
209
210
F. nelsonii
F. oxysporum
F. verticillioides
F. oxysporum
F. oxysporum
F. oxysporum
F. oxysporum
F. oxysporum
F. oxysporum
F. oxysporum
Humano
Humano
Humano
Humano
Humano
Humano
Humano
Humano
Humano
Humano
302
F. oxysporum
Vegetal
303
F. oxysporum
Vegetal
308
F. oxysporum
Vegetal
309
F. oxysporum
Vegetal
310
F. oxysporum
Vegetal
311
F. oxysporum
Vegetal
312
F. oxysporum
Vegetal
31
Origen
Hisopado de lesión en ojo de
vaca
Hisopado de lesión superficial
de extremidades anteriores de
canino criollo
Hisopado de lesión superficial
en lomo, zona anterior de
canino criollo
Raspado de lesión superficial
lomo zona anterior de canino
Raspado de lesión superficial
lomo zona anterior de canino
Raspado de lesión superficial
lomo zona anterior de canino
Hisopado de lesión superficial
en canino criollo, articulación
de extremidad posterior
Raspado de lesión cutánea en
zona media de lomo de bovino
Raspado de lesión cutánea en
cola, canino raza Pitbull
Hisopado de lesión cutánea en
lomo superior
Onicomicosis
Onicomicosis
Queratitis
Onicomicosis
Onicomicosis
Onicomicosis
Onicomicosis
Onicomicosis
Onicomicosis
Onicomicosis
Haces vasculares de planta de
clavel
Haces vasculares de planta de
tomate
Haces vasculares de planta de
tomate
Haces vasculares de planta de
tomate
Haces vasculares de planta de
tomate
Haces vasculares de planta de
tomate
Haces vasculares de planta de
tomate
Codificación
313
Especie*
Fuente
F. oxysporum
Vegetal
Origen
Haces vasculares de planta de
clavel
Haces vasculares de planta de
clavel
Haces vasculares de planta de
315
Vegetal
F. oxysporum
clavel
Hemocultivo
de
pacientes
401
Humano
F. oxysporum
neutropénicos
Hemocultivo
de
pacientes
402
Humano
F. solani
neutropénicos
Hemocultivo
de
pacientes
403
Fusarium sp
Humano
neutropénicos
Hemocultivo
de
pacientes
404
Humano
F. solani
neutropénicos
Hemocultivo
de
pacientes
405
Humano
F. oxysporum
neutropénicos
Hemocultivo
de
pacientes
406
Fusarium sp
Humano
neutropénicos
Hemocultivo
de
pacientes
407
Humano
F. oxysporum
neutropénicos
Hemocultivo
de
pacientes
408
Humano
F. oxysporum
neutropénicos
Hemocultivo
de
pacientes
409
Fusarium sp
Humano
neutropénicos
Hemocultivo
de
pacientes
410
Humano
F. oxysporum
neutropénicos
* La identificación a nivel de especie esta basada en el factor de elongación 1 α, según
los resultados obtenidos por Vega, 2009. Fuente: Camacho Ramírez, Nathalie; Gil
Gómez Julie Andrea. 2008 (48); Vega, Diana. 2009 (31).
314
F. oxysporum
Vegetal
32
ANEXO 2: MEDIOS DE CULTIVO:
Medio de cultivo
Componentes
Extracto de papa 4g/L
Glucosa 20g/L
Agar PDA
Agar- Agar 18g/L
Almidón hidrosoluble al 1%(p/V)
Sulfato de amonio 0,5g/L
Cloruro de cálcio 0,5g/L
Agar almidón
Fosfato monobásico de potasio 0,1 g/L
Fosfato dibásico de potasio 0,1 g/L
Cloramfenicol: 50mg/L
Agar- Agar 18g/L
Carboximetilcelulosa 1%(p/v)
Extracto de levadura 5g/L
Sulfato de amonio 0,5g/L
Agar
Cloruro de cálcio 0,5g/L
carboximetilcelulosa
Fosfato monobásico de potasio 0,1 g/L
Fosfato dibásico de potasio 0,1 g/L
Cloramfenicol: 50mg/L
Agar- Agar 18g/L
Skim milk 1%(p/v)
Sulfato de amonio 0,5g/L
Cloruro de cálcio 0,5g/L
Agar leche
Fosfato monobásico de potasio 0,1 g/L
Fosfato dibásico de potasio 0,1 g/L
Cloramfenicol: 50mg/L
Agar- Agar 18g/L
Pectina cítrica 1% (p/v)
Sulfato de amonio 0,5g/L
Cloruro de cálcio 0,5g/L
Agar pectina
Fosfato monobásico de potasio 0,1 g/L
Fosfato dibásico de potasio 0,1 g/L
Cloramfenicol: 50mg/L
Agar- Agar 18g/L
Fuente: Valencia, Maria Fernanada 2009 (4). Nota: los caldos fueron manejados con
las mismas proporciones sin el agar-agar. En el caso del caldo carboximetil celulosa
no se empleo el extracto de levadura.
33
ANEXO 3: SELECCIÓN DE LOS CEBADORES PARA LA CARACTERIZACIÓN
MOLECULAR
1
2
3
4
5
6
7
1
Figura 1: OPA 1; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II.
1
2
3
4
5
6
7
2
3
4
5
6
7
Figura 2: OPA 2; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II
8
1
Figura 3: OPA 3; Pozos: 1: High mass ladder
II; 2: cepa 111; 3: cepa 156; 4: cepa 159; 5:
cepa 106; 6: cepa 208; 7: cepa 310; 8: High
mass ladder III
2
3
4
5
6
7
Figura 4: OPA 4; Pozos: 1: High mass
ladder II; 2: cepa 111; 3: cepa 156; 4:
cepa 159; 5: cepa 106; 6: cepa 208; 7:
cepa 310
34
1
2
3
4
5
6
7
8
1
Figura 5: OPA 5; Pozos: 1: High mass ladder II;
2: cepa 111; 3: cepa 156; 4: cepa 159; 5: cepa
106; 6: cepa 208; 7: cepa 310; 8: High mass
ladder III
1
2
3
4
5
6
2
3
4
5
6
7
Figura 6: OPA 6; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II
7
1
2
3
4
5
6
7
8
Figura 8: OPA 8; Pozos: 1: High mass
ladder II; 2: cepa 111; 3: cepa 156; 4: cepa
159; 5: cepa 106; 6: cepa 208; 7: cepa 310;
8: High mass ladder III
Figura 7: OPA 7; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II
35
1
2
3
4
5
6
7
1
Figura 9: OPA 9; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II
1
2
3
4
5
6
7
2
3
4
5
6
7
Figura 10: OPA 11; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II
8
1
Figura 11: OPA 12; Pozos: 1: High mass
ladder II; 2: cepa 111; 3: cepa 156; 4: cepa
159; 5: cepa 106; 6: cepa 208; 7: cepa 310;
8: High mass ladder III
2
3
4
5
6
7
Figura 12: OPA 13; Pozos: 1: High mass
ladder III; 2: cepa 111; 3: cepa 156; 4: cepa
159; 5: cepa 106; 6: cepa 208; 7: cepa 310
36
1
2
3
4
5
6
7
8
1
Figura 13: OPA 14; Pozos: 1: High mass
ladder II; 2: cepa 111; 3: cepa 156; 4: cepa
159; 5: cepa 106; 6: cepa 208; 7: cepa 310;
8: High mass ladder III
1
2
3
4
5
6
2
3
4
5
6
7
Figura 14: OPA 15; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II
1
7
Figura 15: OPA 16; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II
2
3
4
5
6
7
Figura 16: OPA 17; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II
37
1
2
3
4
5
6
7
1
Figura 17: OPA 18; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II
1
2
2
3
4
5
6
7
Figura 18: OPA 19; Pozos: 1: cepa 111; 2:
cepa 156; 3: cepa 159; 4: cepa 106; 5:
cepa 208; 6: cepa 310; 7: High mass ladder II
3
4
5
6
7
8
Figura 19: OPA 20; Pozos: 1: High mass
ladder II; 2: cepa 111; 3: cepa 156; 4: cepa
159; 5: cepa 106; 6: cepa 208; 7: cepa 310;
8: High mass ladder III
38
ANEXO 4: ANÁLISIS ESTADÍSTICOS:
ANEXO 4.1. ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA LOS RESULTADOS OBTENIDOS
MEDIANTE LA EVALUACIÓN DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN.
ANOVA: significancia: 2,0526 E-32
CONSUMO
Duncan
N
F. solani
F. oxysporum
F. nelsonii
F. oxysporum
F. nelsonii
F. solani
F. equiseti
Fusarium sp
F. oxysporum
F. oxysporum
F. verticillioides
F. oxysporum
Fusarium sp
F. oxysporum
F. oxysporum
T. harzianum
F. oxysporum
F. oxysporum
F. equiseti
F. oxysporum
F. oxysporum
Fusarium sp
F. oxysporum
F. oxysporum
F. oxysporum
F. nelsonii
F. oxysporum
F. oxysporum
F. oxysporum
F. verticillioides
F. solani
F. oxysporum
F. oxysporum
F. oxysporum
F. verticillioides
F. oxysporum
F. verticillioides
F. oxysporum
F. oxysporum
F. oxysporum
F. oxysporum
T. harzianum
CEPA
404
407
159
160
121
402
111
403
311
308
203
310
409
410
401
10
408
309
131
209
405
406
162
210
302
201
312
202
303
161
108
315
208
207
156
314
155
313
206
204
205
20
Sig.
1
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
2
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
3
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
4
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
5
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
6
f
f
f
f
f
f
f
f
f
f
7
g
g
g
g
g
g
g
g
g
g
g
8
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
9
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
10
j
j
j
j
j
j
j
j
11
k
k
k
k
k
12
l
l
l
l
l
l
l
l
13
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
14
15
n
n
n
n
n
n
n
n
n
o
o
0,05 0,06 0,08 0,06 0,05 0,05 0,08 0,05 0,10 0,08 0,05 0,06 0,06 0,06 0,54
39
ANEXO 4.2: ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA LOS RESULTADOS OBTENIDOS
MEDIANTE LA EVALUACIÓN DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA CELULOSA.
ANOVA: significancia: 8,3826E-28
CONSUMO
N
Duncan
Cepa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
F. oxysporum
310
3 a
F. oxysporum
311
3 a
F. oxysporum
160
3 a
b
F. solani
108
3 a
b
F. equiseti
111
3 a
b
F. nelsonii
121
3 a
b
F. nelsonii
159
3 a
b
c
F. oxysporum
315
3 a
b
c
d
F. oxysporum
313
3 a
b
c
d
F. oxysporum
207
3
b
c
d
e
F. oxysporum
210
3
b
c
d
e
F. equiseti
131
3
b
c
d
e
f
F. oxysporum
308
3
b
c
d
e
f
g
F. oxysporum
208
3
c
d
e
f
g
h
F. oxysporum
205
3
d
e
f
g
h
F. oxysporum
204
3
d
e
f
g
h
i
F. nelsonii
201
3
e
f
g
h
i
F. oxysporum
303
3
e
f
g
h
i
F. oxysporum
209
3
f
g
h
i
j
F. oxysporum
309
3
g
h
i
j
T. harzianum
20
3
h
i
j
k
F. verticillioides
203
3
h
i
j
k
F. verticillioides
156
3
h
i
j
k
l
F. oxysporum
314
3
i
j
k
l
F. oxysporum
206
3
j
k
l
F. oxysporum
302
3
j
k
l
m
T. harzianum
10
3
j
k
l
m
F. oxysporum
408
3
j
k
l
m
F. oxysporum
401
3
j
k
l
m
F. oxysporum
312
3
j
k
l
m
N
F. verticillioides
155
3
j
k
l
m
N
F. oxysporum
162
3
k
l
m
N
o
F. oxysporum
410
3
k
l
m
N
o
F. verticillioides
161
3
l
m
N
o
F. solani
402
3
l
m
N
o
Fusarium sp
409
3
l
m
N
o
F. solani
404
3
m
N
o
p
F. oxysporum
407
3
m
N
o
p
Fusarium sp
403
3
m
N
o
p
F. oxysporum
405
3
N
o
p
F. oxysporum
202
3
o
p
406
3
Fusarium sp
Sig.
m
p
0,10 0,09 0,05 0,05 0,17 0,06 0,07 0,06 0,06 0,08 0,05 0,06 0,08 0,05 0,06 0,06
40
ANEXO 4.3: ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA LOS RESULTADOS OBTENIDOS
MEDIANTE LA EVALUACIÓN DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LA PECTINA.
ANOVA: significancia: 2,9882E-39
CONSUMO
Duncan
CEPA
302
F. oxysporum
303
F. oxysporum
310
F. oxysporum
407
F. oxysporum
205
F. oxysporum
Fusarium sp
403
308
F. oxysporum
208
F. oxysporum
203
F. verticillioides
312
F. oxysporum
206
F. oxysporum
405
F. oxysporum
315
F. oxysporum
404
F. solani
209
F. oxysporum
402
F. solani
161
F. verticillioides
156
F. verticillioides
207
F. oxysporum
309
F. oxysporum
204
F. oxysporum
131
F. equiseti
210
F. oxysporum
159
F. nelsonii
155
F. verticillioides
Fusarium sp
408
Fusarium sp
406
108
F. solani
201
F. nelsonii
121
F. nelsonii
160
F. oxysporum
202
F. oxysporum
311
F. oxysporum
313
F. oxysporum
162
F. oxysporum
409
F. oxysporum
410
F. oxysporum
401
F. oxysporum
111
F. equiseti
10
C. lindemuthianum
314
F. oxysporum
20
C. lindemuthianum
Sig.
N
1
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
2
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
3
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
4
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
5
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
6
f
f
f
f
f
f
f
7
g
g
g
g
g
g
8
h
h
h
h
h
h
h
9
i
i
i
i
i
i
10
11
12
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
K
K
K
K
l
0,07
0,06
0,05
0,06
41
0,05
0,08
0,07
0,05
0,09
0,06
0,18
1,00
ANEXO 4.4: ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA LOS RESULTADOS OBTENIDOS
MEDIANTE LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA.
ANOVA: significancia: 1,3043E15
UP
Duncan
N
CEPA
Fusarium sp
409
410
F. oxysporum
401
F. oxysporum
Fusarium sp
403
314
F. oxysporum
313
F. oxysporum
308
F. oxysporum
309
F. oxysporum
408
F. oxysporum
405
F. oxysporum
303
F. oxysporum
311
F. oxysporum
312
F. oxysporum
Fusarium sp
406
402
F. solani
302
F. oxysporum
407
F. oxysporum
162
F. oxysporum
20
T. mentagrpohytes
315
F. oxysporum
10
T. mentagrpohytes
404
F. solani
203
F. verticillioides
159
F. nelsonii
204
F. oxysporum
310
F. oxysporum
207
F. oxysporum
121
F. nelsonii
160
F. oxysporum
131
F. equiseti
209
F. oxysporum
205
F. oxysporum
161
F. verticillioides
208
F. oxysporum
156
F. verticillioides
108
F. solani
155
F. verticillioides
201
F. nelsonii
206
F. oxysporum
111
F. equiseti
202
F. oxysporum
210
F. oxysporum
Sig.
1
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
0,06
2
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
0,05
3
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
0,05
4
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
d
0,06
5
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
e
0,05
42
6
f
f
f
f
f
f
f
f
f
f
f
f
0,05
7
g
g
g
g
g
g
g
g
g
g
g
g
g
0,06
8
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
h
0,05
9
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
i
0,08
10
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
j
0,07
11
k
k
k
k
k
k
k
k
k
k
k
k
0,07
12
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
L
0,11
13
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
m
0,08
14
n
n
n
n
n
n
n
n
0,06
15
o
o
o
0,10
ANEXO 5: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS 40 AISLAMIENTOS DE
Fusarium spp PROVENITES DE HUMANOS, ANIMALES Y PLANTAS
OPA 2:
43
OPA 4
OPA 13:
44
OPA 3:
45
OPA 9:
OPA 11:
46
OPA 14:
47
OPA 15:
48
ANEXO 6: ANÁLISIS DE NORMALIDAD
ACTIVIDAD AMILOLÍTICA
Descriptives
CONSUMO
Mean
95% Confidence
Interval for Mean
Lower Bound
Upper Bound
5% Trimmed Mean
Median
Variance
Std. Deviation
Minimum
Maximum
Range
Interquartile Range
Skewness
Kurtosis
Statistic
,48930
,35943
Std. Error
,064205
,61916
,46543
,40348
,165
,406065
,000
1,637
1,637
,79231
,690
-,095
,374
,733
Tests of Normality
a
CONSUMO
Kolmogorov-Smirnov
Statistic
df
Sig.
,120
40
,155
Statistic
,918
Shapiro-Wilk
df
40
Sig.
,007
a. Lilliefors Significance Correction
ACTIVIDAD CELULOLÍTICA
Descriptives
CONSUMO
Mean
95% Confidence
Interval for Mean
Lower Bound
Upper Bound
5% Trimmed Mean
Median
Variance
Std. Deviation
Minimum
Maximum
Range
Interquartile Range
Skewness
Kurtosis
Statistic
,39403
,34820
Std. Error
,022657
,43986
,39462
,40429
,021
,143297
,140
,658
,519
,23954
-,102
-1,158
,374
,733
Tests of Normality
a
CONSUMO
Kolmogorov-Smirnov
Statistic
df
Sig.
,139
40
,049
a. Lilliefors Significance Correction
49
Statistic
,955
Shapiro-Wilk
df
40
Sig.
,112
ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA:
Descriptives
CONSUMO
Mean
95% Confidence
Interval for Mean
Statistic
,69505
,46770
Lower Bound
Upper Bound
Std. Error
,112402
,92241
5% Trimmed Mean
Median
Variance
Std. Deviation
Minimum
Maximum
Range
Interquartile Range
Skewness
Kurtosis
,63842
,42075
,505
,710890
,000
2,516
2,516
1,15387
,951
-,038
,374
,733
Tests of Normality
a
CONSUMO
Kolmogorov-Smirnov
Statistic
df
Sig.
,196
40
,001
Statistic
,854
Shapiro-Wilk
df
40
Sig.
,000
a. Lilliefors Significance Correction
ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA:
Descriptives
TIROSINA
Mean
95% Confidence
Interval for Mean
Statistic
,89674
,76777
Lower Bound
Upper Bound
Std. Error
,063761
1,02571
5% Trimmed Mean
Median
Variance
Std. Deviation
Minimum
Maximum
Range
Interquartile Range
Skewness
Kurtosis
,88346
,84462
,163
,403257
,228
1,941
1,713
,58110
,417
-,133
,374
,733
Tests of Normality
a
TIROSINA
Kolmogorov-Smirnov
Statistic
df
Sig.
,084
40
,200*
*. This is a lower bound of the true significance.
a. Lilliefors Significance Correction
50
Shapiro-Wilk
Statistic
df
,977
40
Sig.
,583