Universidad de Chile Facultad de Ciencias Químicas y
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Universidad de Chile Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas ESTRÉS DE RETÍCULO ENDOPLÁSMICO: UNA NUEVA VÍA PARA ACTIVAR LA AUTOFAGIA MEDIADA POR CHAPERONA Tesis para Optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica Área de Especialización: Proteínas y Biotecnología Memoria para Optar al Título de Bioquímica ANDREA ELÍZABETH RODRÍGUEZ VILLARROEL Director de Tesis Dr. Sergio Lavandero González 2008 Dedicada a mi Madre AGRADECIMIENTOS Quiero agradecer en primer lugar al director de la tesis Dr. Sergio Lavandero, por la confianza depositada en mí, por la preocupación por mi trabajo y mi bienestar personal, y por sus valiosos consejos. Mis sinceros agradecimientos a las integrantes de mi comisión. Dra. María Antonieta Valenzuela, Dra. Jenny Fiedler y Dra. Margarita Vega, por la discusión crítica pero constructiva de mi trabajo. Muchas gracias también por sus buenos consejos. Agradezco especialmente a todos mis compañeros de Laboratorio, por la generosidad con la que me han ayudado con sus conocimientos y por el cariño que me han brindado. Agradezco también a todos mis amigos y amigas por su apoyo incondicional, compañía y cariño. Finalmente quiero agradecer a mi familia, especialmente dar gracias a la lealtad y cariño de mi hermano René, mi sobrina Michelle y de mi mamá. Porque todo lo que he logrado en mi vida es gracias a ellos. ÍNDICE GENERAL ÍNDICE GENERAL iv ÍNDICE DE FIGURAS vi ÍNDICE DE TABLAS vii ABREVIATURAS viii RESUMEN x SUMMARY xii 1 INTRODUCCIÓN 1 1.1 Importancia y consecuencias de mantener la calidad de las proteínas 1 1.2 El Retículo Endoplásmico, un organelo clave en la síntesis de proteínas 1 1.3 El correcto plegamiento es dirigido por chaperonas moleculares 2 1.4 Perturbaciones en el RE generan agregación de proteínas 3 1.5 La célula posee vías de degradación para eliminar proteínas agregadas 6 1.6 La autofagia mediada por chaperonas es un mecanismo selectivo de degradación de proteínas 8 1.7 Mecanismos de degradación asociados al Retículo Endoplásmico 10 2 HIPÓTESIS 12 3 OBJETIVO GENERAL 12 4 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 12 5 MATERIALES Y MÉTODOS 13 5.1 Cultivo celular e inducción in vitro de estrés de retículo 13 5.2 Viabilidad celular 14 5.3 Ciclo celular y apoptosis 15 5.4 Western blot 15 iv 5.5 Densitometría 20 5.6 Fraccionamiento subcelular 20 5.7 Inmunocitoquímica 21 5.8 Producción y transducción lentiviral 21 5.9 Tratamiento de células MEF m5-7 23 5.10 Análisis estadístico 24 6 RESULTADOS 25 6.1 Estandarización de un modelo in vitro de ERE 25 6.2 Estudio de la autofagia mediada por chaperonas en células NIH3T3 expuestas a ERE 31 6.3 Estudio de la participación del ERE en la activación de la autofagia mediada por chaperona mediante la intervención de elementos de estos sistemas 38 7 DISCUSIÓN 45 8 CONCLUSIONES 51 9 REFERENCIAS 53 10 FINANCIAMIENTO 58 v ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Respuesta del retículo endoplásmico a proteínas mal plegadas 5 Figura 2 Diferentes subtipos de autofagia 7 Figura 3 Tapsigargina aumenta los niveles proteicos de Chop en células NIH3T3 27 Figura 4 Efecto de la Tapsigargina (estímulo de ERE) en la viabilidad de células NIH3T3 28 Figura 5 Efecto de la tapsigargina en la apoptosis de células NIH3T3 29 Figura 6 Ciclo celular en células NIH3T3 sometidas a ERE con tapsigargina 30 Figura 7 Tapsigargina aumenta los niveles de Lamp2A en células NIH3T3 32 Figura 8 El tratamiento con tapsigargina aumenta los niveles totales de Lamp2A 33 Figura 9 Tapsigargina aumenta la presencia de Lamp2A en la fracción lisosomal en células estimuladas con TG 0,1 µM por 8 h 34 Figura 10 Lamp2A se localiza en los lisosomas 35 Figura 11 El tratamiento con tapsigargina redistribución de Hsc70 hacia los lisosomas HSC70 36 Figura 12 El tratamiento con tapsigargina no cambia los niveles totales de HSC70 37 Figura 13 Generación de células knock down para Lamp2A 40 Figura 14 Efecto de la tapsigargina sobre los niveles de CHOP y LC3 I/II en células carentes de Lamp2A 41 Figura 15 Efecto de la doxiciclina en la expresión de ATG5 en células MEF m5-7 42 Figura 16 Efecto de la TG en los niveles de Lamp2A en células carente de ATG5 44 Figura 17 Modelo Propuesto 52 vi ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1 Fórmula de preparación de cada SDS-PAGE 17 Tabla 2 Volumen de Tampón Ripa según el tipo de placa de cultivo 18 Tabla 3 Anticuerpos primarios y secundarios usados en la tesis 19 Tabla 4 Cantidad de plasmidio usado para la transfección lentiviral 22 vii ABREVIATURAS ABA Acrilamida-bisacrilamida AMC Autofagia Mediada por Chaperonas AP-1 Proteína activadora ATF Factor que activa la transcripción ATG Proteínas relacionadas a la autofagia ATP Adenosina trisfosfato BIP Proteína que une la cadena pesada de la Inmunoglobulina BSA Albúmina de suero bovino CHOP Proteína homóloga a C/EBP DMEM “Dulbecco's Modified Eagle's Medium” DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico DOXI Doxiciclina ECL Sustrato quimioluminicente EDEM Proteína similar a α-manosidasa que aumenta la degradación del RE EDTA Acido etilendiamino tetraacético eIF Factor iniciador eucariótico ERAD Degradación asociada al Retículo Endoplásmico ERE Estrés de Retículo Endoplásmico ET Extracto total HSC Isoforma constitutiva de la familia de proteínas del shock térmico HSP Proteína del shock térmico IRE Proteína que requiere inositol iRNA Interferente de RNA I-kappaB Inhibidor del factor kappa B JNK Proteína quinasa del N-terminal de c-Jun L Lisosoma LAMP Proteína de membrana lisosomal LC3 Cadena liviana 3 LUC Luciferasa viii MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos MEF Fibroblastos embrionarios de ratón mRNA RNA mensajero NCS Suero de becerro recién nacido NF-kappaB Factor nuclear kappa B PBS Tampón fosfato salino PERK Quinasa de RE similar a PKR PVDF Fluoruro de polivinilideno PI Yoduro de propidio PKC Proteína quinasa C PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo PN Post-nuclear PSA Persulfato de amonio RE Retículo endoplásmico RNA Ácido ribonucleico RPM Revoluciones por minuto SDS Dodecilsulfato de sodio TBS Tampón tris salino TG Tapsigargina TRIS Tris borato EDTA UPR Respuesta a proteínas mal plegadas XBP Proteína que se une a la caja X ix RESUMEN Para mantener la integridad, la célula debe controlar la cantidad y calidad de las proteínas. El Retículo Endoplásmico (RE) es el organelo en donde se sintetizan todas las proteínas transmembrana y la mayoría de las proteínas secretadas. Cuando se altera la homeostasis del Retículo Endoplásmico se produce una acumulación de proteínas mal plegadas en su lumen. Como respuesta a este estrés se activa una vía de señalización RE-núcleo, en la que se bloquea la expresión general, aumenta la expresión de chaperonas y se activan las vías proteolíticas del proteasoma y macroautofagia. Un método para producir Estrés en el Retículo Endoplásmico (ERE) es la eliminación del calcio reticular, necesario para el correcto plegamiento proteico. La autofagia mediada por chaperonas (AMC) es un sistema proteolítico que requiere la acción de chaperonas citosólicas para seleccionar, desplegar y dirigir proteínas mal plegadas al interior del lisosoma. Sus actores principales son el receptor lisosomal Lamp2A y la chaperona Hsc70. Se ha descrito la activación de AMC durante la privación prolongada de suero y durante el estrés oxidativo, pero no existen antecedentes de la activación durante el ERE, lo cual constituye el objetivo de esta tesis. Se usó como modelo de estudio células NIH3T3. En estas células se indujo ERE con Tapsigargina (TG), eliminando el calcio en el RE. Mediante western blot se comprobó la aparición de Chop, un factor transcripcional usado clásicamente como marcador de ERE. TG no aumentó la muerte celular, pero produjo un bloqueo en la división celular, deteniendo el ciclo en la etapa G1. Lo anterior se observó mediante citometría de flujo, usando yoduro de propidio como trazador. Mediante inmunocitoquímica y western blot se observó un aumento en los niveles totales de Lamp2A. Esto se relaciona al aumento de Lamp2A en la fracción lisosomal. Además la chaperona Hsc70 se relocaliza hacia la fracción lisosomal en respuesta al estímulo con TG. Estos eventos, el aumento del receptor Lamp2A y relocalización de la chaperona Hcs 70, se han relacionado anteriormente con aumento en la actividad de AMC. x Células que expresan constitutivamente un iRNA contra Lamp2A, lo que las hace deficientes en AMC, aumentan la macroautofagia basal. La compensación de macroautofagia es mayor durante un evento de ERE. La mayor actividad de la macroautofagia se refleja en una menor expresión de Chop, que pudiese estar siendo degradado por macroautofagia. Células carentes de ATG5, que no activan macroautofagia, aumentan los niveles totales de Lamp2A. Este es un mecanismo compensatorio, que activa la AMC cuando la macroautofagia no está presente. Sin embargo, la TG disminuyó los niveles totales de Lamp2A. Este inesperado comportamiento puede estar ligado a la activación del proteasoma. En síntesis, esta tesis muestra el primer indicio de la activación de AMC durante un evento de ERE. Esta activación esta dada principalmente por un aumento en los niveles de Lamp2A, que solo se ha visto durante estrés oxidativo. Además muestra que las vías degradativas se comunican para eliminar las proteínas mal plegadas durante el ERE. xi SUMMARY To maintain the integrity, cells must control the quantity and quality of the proteins. Endoplasmic Reticulum (ER) is the organelle where all transmembrane protein and the most secretory protein are synthesized. Disturbances in the ER homeostasis lead to the accumulation of disfolding proteins in its lumen. In response to this stress a reticulum-nucleus signaling pathway is activated, inducing the selective expression of some genes (i.e. those related to chaperones) and the stimulation of proteolytic systems, including proteasome and macroautophagy. The removal of the calcium reticulum, necessary for the correct protein folding, produces ER stress. Chaperone-mediated autophagy (CMA) is another proteolytic system that requires the action of cytosolic chaperones to select, unfold and pull the unfolded substrate into the lysosomes. Its principal actors are the lysosomal receptor Lamp2A and the chaperone Hsc70. CMA is activated by long serum deprivation and oxidative stress. However it remains unknown whether CMA is stimulated during the ER stress, which it is the main aim of this thesis. The NIH3T3 cells were the study model used. In these cells, Thapsigargin (TG) induces ER stress through the removal ER calcium. Western blot showed an increase in the Chop level, a classic ER stress transcriptional factor. TG didn’t stimulate cell death but arrested cell cycle at G1 stage. This was showed through FACS, using propidium iodide dye. Immunocytochemistry and western blot studies showed that TG increases the Lamp2A total levels. Another observation is the increase of Lamp2A level in the lysosomal fraction. Also, we have seen increases in the hsc70 localization in to the lysosomal fraction. These events, the rise in Lamp2A levels and Hsc70 lysosomal localization, previously have being related with an increase in the CMA activity. Constitutive Lamp2A-siRNA cells, CMA deficient cells, increased basal macroautophagy. Also this macroautophagy compensation is most important during ER stress. The higher macroautophagy activity was associated with low expression of Chop, showing a probable degradation the Chop by macroautophagy. xii ATG5 knock out cells, macroautophagy deficient cells, showed an increase in the Lamp2A total levels. This cells revealing a compensatory effect of the CMA when the macroautophagy is inactive. However, TG produces a decrease of the levels of Lamp2A.This unexpected behavior is probably related to the proteasome activation. In synthesis, this tesis show by the first time the CMA activation during ER stress. This activation is related to the total Lamp2A increase, only before seen in oxidative stress. Also we show the connection between the proteolytic pathways in the unfolding protein degradation, during ER stress. xiii 1. INTRODUCCION 1.1. Importancia y consecuencias de mantener la calidad de las proteínas Para que las proteínas cumplan adecuadamente sus funciones celulares se requiere de mecanismos que controlen su síntesis, correcto plegamiento y degradación. Alteraciones en cualquiera de estos pasos conducen a la agregación de proteínas, trastornando la homeostasis hasta el punto de comprometer la viabilidad celular. Las células post-mitóticas son especialmente vulnerables al efecto dañino de los agregados y/o proteínas mal plegadas, debido a su incapacidad de diluir las especies potencialmente dañinas mediante la división celular. Un ejemplo clásico de patologías producidas por agregados proteicos son las enfermedades neurodegenerativas. En las enfermedades de Alzheimer, Huntington y priones, entre otras patologías, se produce acumulación de proteínas mal plegadas en inclusiones amiloidales, que tienen un efecto tóxico para las neuronas (1). Asimismo, el proceso de envejecimiento produce acumulación de proteínas, debido a una disminución en la actividad de las chaperonas moleculares y las vías degradativas (2). 1.2. El retículo endoplásmico, un organelo clave en la síntesis de proteínas El retículo endoplásmico (RE) tiene un papel central en la biosíntesis de lípidos y proteínas. Además actúa como un reservorio de calcio intracelular, necesario para variados eventos de señalización. El RE está formado por túbulos membranosos que continúan la membrana nuclear externa y que se extienden formando una red a través de todo el citosol. La membrana del RE es el lugar donde se producen todas las proteínas de transmembrana y la mayoría de los lípidos de los organelos subcelulares. Casi todas las proteínas secretadas, además de las destinadas al lumen del Golgi o lisosoma, tienen como primer destino el lumen del RE (3). Las proteínas que residen en el RE tienen una señal de retención, compuesta por 4 aminoácidos en su extremo C-terminal. Muchas de estas proteínas funcionan 1 como catalizadores, ayudando en el transporte co-traduccional hacia el RE, o bien en las modificaciones y plegamiento post-traduccional (3). En el lumen del RE, las proteínas se ensamblan y oligomerizan, se forman enlaces bisulfuro y se agregan Nglicosilaciones. Además se produce el corte de secuencias señal y la isomerización de aminoácidos (4). 1.3. El correcto plegamiento de proteínas es dirigido por chaperonas moleculares Si bien la secuencia peptídica posee toda la información necesaria para que las proteínas adopten su estructura terciaria, el ambiente celular hace que este proceso no sea espontáneo. Las chaperonas moleculares son las encargadas de escoger el lugar y el momento adecuado en que las proteínas deben plegarse (5). Las chaperonas son abundantes en el citoplasma, mitocondria y retículo endoplásmico, pudiendo aumentar sus niveles frente a condiciones de estrés. Existen 6 grandes familias de chaperonas moleculares llamadas Hsp (proteínas del shock térmico), que se clasifican por su peso molecular, Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40 y las pequeñas Hsp. Estas proteínas se unen a los polipéptidos y dirigen su plegamiento de una manera dependiente de ATP (2). BIP (proteína que une la cadena pesada de la Inmunoglobulina) es la chaperona molecular más importante del RE. BIP integra la familia de chaperonas Hsp70 y cumple diversas funciones, siendo la más importante ayudar al ingreso de las proteínas recién sintetizadas al lumen del RE (6). Además BIP reconoce proteínas incorrectamente plegadas, mediante la unión a secuencias expuestas que normalmente están ocultas en el interior de la estructura de la proteína (7). Otras chaperonas importantes del RE son la calnexina y la calreticulina, que son dependientes de calcio y que se unen carbohidratos de glicoproteínas incompletamente plegadas, reteniéndolas en el RE (3). Bajo ciertas condiciones de estrés donde las chaperonas no pueden resolver el mal plegamiento, estas despliegan y guían su sustrato hacia las vías de degradación de proteínas (2), mecanismo que es descrito más adelante en el texto. 2 1.4. Perturbaciones en el retículo endoplásmico generan agregación de proteínas Pese a la ayuda de las chaperonas, más del 80% de las moléculas proteicas ingresadas al RE, no logra su correcto estado de plegamiento (3). Cuando además se altera la homeostasis del RE, que impide que éste trabaje de manera óptima, se produce una acumulación excesiva de proteínas mal plegadas en su interior. Esta alteración se conoce como Estrés de Retículo Endoplásmico (ERE) y se produce por cambios en la concentración de calcio, alteraciones en el estado redox que impiden la formación de enlaces bisulfuro, alteraciones en la glicosilación o en el transporte al complejo de Golgi. Como UPR (en inglés “unfolded protein response”) se conoce a la respuesta celular en respuesta al ERE. La UPR es una vía de señalización entre el RE y el núcleo, que produce una inhibición general de la traducción, excepto por la expresión de chaperonas del RE, y elementos necesarios para degradación de proteínas (8). En células animales, PERK (quinasa de RE similar a PKR), IRE1 (proteína que requiere inositol-1) y ATF6 (factor que activa la transcripción 6) sensan la presencia de proteínas mal plegadas en el lumen del RE y traducen señales al citoplasma y al núcleo. En condiciones basales, los receptores se encuentran inactivos gracias a la unión de BIP (7) (Figura 1). Al activarse, PERK se oligomeriza y activa la función quinasa de su dominio citosólico. PERK fosforila al factor de iniciación traduccional eIF2α (factor iniciador eucariótico 2), un cofactor ubicuo requerido para el ensamblaje de la subunidad 80S del ribosoma al codón iniciador del mRNA. La fosforilación de eIF2α inhibe su función y disminuye la síntesis proteica en la célula (9, 10). Un pequeño grupo de mRNAs, que tienen un marco de lectura abierto en el extremo 5´ no traducido, aumenta su traducción cuando eIF2α está fosforilado. Entre estos mRNA se encuentra ATF4, un factor transcripcional cuyos blancos incluyen chaperonas del RE (11). IRE1 lidera la vía de señalización de la UPR filogenéticamente más conservada. La oligomerización y autofosforilación del sensor IRE1, activa un dominio endoribonucleasa en su porción citosólica. Este dominio genera el corte del mRNA de XBP1 en dos posiciones, produciendo la eliminación de un intrón. Los exones resultantes son unidos por una RNA ligasa, generando un mRNA para un factor 3 transcripcional que promueve la expresión de chaperonas y otros genes de la UPR (12, 13). En respuesta a ERE, ATF6 se moviliza desde el RE al Golgi, donde proteasas específicas cortan su dominio transmembrana, y el fragmento N-terminal migra al núcleo, actuando como factor transcripcional de genes que aumentan la capacidad de RE para plegar proteínas (14, 15). Cuando todos los esfuerzos pro-sobrevida fallan en corregir la acumulación de proteínas en el RE, se activan vías que llevan a la muerte por apoptosis. Entre estos eventos se encuentra la activación de JNK (proteína quinasa del N-terminal de c-Jun) por la vía de IRE1, la activación de la caspasa 12 y la actividad de Bax-Bak (16, 17). Chop (proteína homóloga a C/EBP) es otro factor proapoptótico que aumenta su expresión por acción de ATF4 y ATF6 (18). Es un factor transcripcional que contiene un dominio B-ZIP (cierre básico de leucina), que promueve la apoptosis inhibiendo la expresión de la proteína Bcl2 (19). Chop puede formar heterodímeros con otros factores trancripcionales miembros de la familia C/EBP y fos-jun (20, 21) 4 Núcleo Bloqueo Traduccional Expresión Génica Síntesis y transporte de aminoácidos Respuesta a Estrés Reacciones Redox Chop Expresión Génica Chaperonas XBP1 Chop Expresión Génica Chaperonas Degradación de Proteínas P58IPK Figura 1. Respuesta del retículo endoplásmico a proteínas mal plegadas. Durante la agregación de proteínas en el RE, BIP (Grp78) se disocia de los receptores de stress, PERK, ATF6 e IRE1, permitiendo su activación. Esta activación desencadena una vía de señalización desde el RE hacia el núcleo, la cual es mediada por los factores transcripcionales ATF4, ATF6 y sXBP1. El objetivo de esta señalización es aumentar la capacidad de plegamiento de RE y activar vías degradativas para eliminar las proteínas mal plegadas (22). 5 1.5. La célula posee vías de degradación para eliminar proteínas agregadas Las vías proteasomal y lisosomal son los principales mecanismos proteolíticos de la célula. El proteasoma es una gran proteasa multicatalítica citoplasmática que degrada proteínas poliubiquitinadas para generar pequeños péptidos (23). El lisosoma es un organelo ácido rodeado de membrana que contiene enzimas hidrolíticas y que está implicado en procesos de degradación de proteínas y partículas exógenas, así como proteínas y organelos intracelulares. La vía que degrada proteínas intracelulares asociada al lisosoma se denomina autofagia (23). La autofagia en su forma más simple, se puede definir como un mecanismo de adaptación a la privación de nutrientes, en donde la célula devora sus elementos prescindibles para sobrevivir. Asimismo la actividad de la autofagia es necesaria para eliminar proteínas dañadas y agregados proteicos. Se conocen tres subtipos de autofagia: macroautofagia, microautofagia y autofagia mediada por chaperonas, las cuales difieren en sus mecanismos y funciones (24) (Figura 2) 6 Figura 2. Diferentes subtipos de autofagia. La microautofagía es un mecanismo constitutivo, en donde componentes citosólicos son secuestrados por los lisosomas mediante la invaginación de su membrana. La macroautofagia degrada proteínas de vida media larga, proteínas agregadas y organelos en exceso o defectuosos. En la macroautofagia, una membrana cuyo origen aún se discute, rodea áreas del citoplasma para formar el autofagosoma, el que posteriormente se fusiona con el lisosoma. Las macromoléculas resultantes de la degradación son devueltas al citosol a través de permeasas. La macroautofagia es una vía no selectiva de degradación, regulada por la actividad de las proteínas ATG (proteínas relacionadas a la autofagia). Durante la autofagia mediada por chaperonas, proteínas son reconocidas específicamente y translocadas directamente al interior del lisosoma (24). 7 1.6. La autofagia mediada por chaperonas es un mecanismo selectivo de degradación de proteínas La autofagia mediada por chaperonas (AMC) es un subtipo de autofagia en donde proteínas citosólicas son específicamente reconocidas, desplegadas y destinadas al lisosoma para su degradación. Sus principales requisitos son: la presencia de una secuencia específica en la proteína sustrato, la existencia de un grupo de chaperonas citosólicas que identifiquen esta secuencia, un receptor lisosomal que ligue al complejo y permita la translocación al interior del organelo y chaperonas al interior del lisosoma que ayuden en la internalización el sustrato (25) (Figura 2). Las proteínas sustratos de la vía poseen un motivo conservado, bioquímicamente relacionado a la secuencia KFERQ (26). El motivo consiste de una Q flanqueada en cualquiera de sus lados por 4 aminoácidos, uno ácido, uno básico, uno hidrofóbico y finalmente uno ácido o hidrofóbico (27). Como esta secuencia está presente en un gran porcentaje de proteínas, es muy posible que sea generada por modificaciones post-traduccionales, como la deamidación (28). El complejo de chaperonas citosólico está compuesto por la chaperona principal Hsc70 y las cochaperonas Hsp90, Hsp40, Hop, Hip y Bag-1 (29). Hsc70 es el integrante constitutivo de la familia Hsp70 y se encarga de reconocer específicamente la secuencia KFERQ (30,31). Las cochaperonas modulan la interacción de Hsc70 y su sustrato. El papel específico de cada una de las cochaperonas en la AMC se desconoce, pero se tienen antecedentes de su acción en otros procesos fisiológicos. Hsp40 estimula la actividad ATPasa de Hsc70, Hip ayuda al ensamblaje de Hsc70, Hsp40 y el sustrato, Hsp90 mantiene al sustrato plegado, Hop liga a Hsc70 y Hsp90; y Bag-1 consiste de isoformas que regulan positiva o negativamente a Hsc70 (28, 25). La contraparte lisosomal de la chaperona Hsc70, es indispensable para que el sustrato sea translocado al interior del lisosoma y la presencia de esta chaperona al interior, capacita al lisosoma para tener actividad de AMC (32). Sin embargo, aún no está claro el mecanismo de internalización de Hsc70 al lisosoma y si requiere de otras cochaperonas lisosomales para llevar a cabo su función (25). 8 La glicoproteína Lamp2A (proteína de membrana lisosomal 2, isoforma A) es el receptor de la membrana lisosomal, encargado de la internalización del sustrato durante la AMC (33). Lamp2A es una proteína con un dominio transmembrana, una pequeña región citoplasmática, clave en la unión del sustrato y una región luminal muy glicosilada. Se genera por splicing alternativo junto a otras dos isoformas, Lamp2B y Lamp2C (34). La interacción de Lamp2A con el complejo sustrato/chaperonas es la etapa limitante de la AMC (35) y su presencia en la membrana lisosomal depende de su degradación y reinserción desde la matriz lisosomal (36). Se han descrito microdominios lipídicos en la membrana plasmática que concentran a Lamp2A durante condiciones normales y de los cuales se libera al ser activada AMC. En estos dominios lipídicos se produce la degradación del receptor por catepsina A (37, 25). Se ha observado que el sustrato se liga al monómero de Lamp2A, mientras que su translocación requiere la formación de un complejo compuesto por varias subunidades del receptor (38, 36). La AMC es responsable de la degradación del 30% de las proteínas citosólicas en condiciones de privación prolongada de nutrientes y aunque se activa en la mayoría de los tipos celulares, se ha estudiado principalmente en fibroblastos, hígado y riñón (28). La AMC se activa durante la privación prolongada de suero, aportando aminoácidos esenciales para sobrevivir (39). El estrés oxidativo activa la vía, involucrando un aumento en la expresión de Lamp2A, mecanismo que no se observa para ningún otro estímulo (40). La AMC disminuye su actividad en ratas de edad avanzada, lo que se relaciona con menores niveles de Lamp2A en la membrana (41). Se ha logrado bloquear Lamp2A usando iRNA, observando una sobreactivación de la macroautofagia, aunque este proceso es incapaz de compensar todas las funciones de AMC (42). Además se han estudiados los eventos tempranos luego del bloqueo, y se ha observado que existen alteraciones funcionales en la macroautofagia y en el sistema ubiquitina-proteasoma, que son progresivamente corregidos hasta lograr su sobreactivación (43). Por otro lado, en células deficientes de ATG5, una molécula clave para la macroautofagia, se ha observado una sobreactivación basal de la AMC (44). La alteración general de los sistemas proteolíticos, argumenta a favor de 9 un funcionamiento coordinado de todos ellos, aunque resta por descubrir las vías transduccionales que los comunican entre si. 1.7. Mecanismos de degradación asociados al retículo endoplásmico La vía de Degradación Asociada al Retículo Endoplásmico (ERAD) es el mecanismo que se encarga de eliminar las proteínas que se acumulan en la membrana o el lumen del RE durante el ERE, mediante su transporte (retrotranslocación) hacia el citosol (45). El ERAD puede dividirse en 3 pasos: reconocimiento y unión del sustrato mal plegado al aparato de translocación, transporte a través de la membrana del RE, y la liberación y degradación del sustrato. El mecanismo de cada uno de estos pasos todavía no se conoce a cabalidad, pero existe un creciente número de reportes que intentan caracterizar su maquinaria (20). El reconocimiento de sustrato y su unión a la maquinaria de retrotranslocación es mediado, al menos en parte, por el grado de glicosilación. Las glicoproteínas interactúan con las chaperonas calnexina/calreticulina durante su plegamiento, las que monitorean el procesamiento cíclico de N-glicanos. Si se altera este ciclo, el sustrato es reconocido por la proteína EDEM (proteína similar a α-manosidasa que aumenta la degradación del RE) que lo guía hacia la retrotranslocación a través de Derlin-2 y Derlin-3 (46, 47, 48). La unión de BIP a proteínas no glicosiladas, las conduce hacia el retrotranslocón compuesto por Derlin-1, Herp, p97 y Hrd1 (49). Sec-61 es el canal por el cual las proteínas recién sintetizadas ingresan al lumen del RE pero también se le ha relacionado con la salida de sustratos del ERAD, mostrando una bidireccionalidad (50). El siguiente paso del ERAD es la degradación del sustrato. Se ha descrito que las dos vías degradativas principales, proteasomal y lisosomal, actúan eliminando la sobrecarga de proteínas durante el ERE. El proteasoma es la vía degradativa clásicamente estudiada que se encarga de la eliminación de los sustratos del ERAD. Existen enzimas que conjugan ubiquitina en la membrana del RE. Luego de la retrotranslocación, una serie de proteínas que ligan ubiquitina guían el sustrato ubiquitinado desde la membrana del RE hacia el proteasoma (45). 10 La única via lisosomal que se ha estudiado durante el ERAD es la macroautofagia. La primera relación se estableció en levaduras por Yoritmitsu y cols. (51), quienes demostraron que tunicamicina y ditiotreitol estimulan el ensamblaje de estructuras preautofagosomales y que esta inducción depende de la proteína ATG11. Posteriormente se ha observado la activación de macroautofagia en diversos tipos de eucariontes superiores, lo cual muestra que este mecanismo de degradación es conservado (52,53). La fosforilación de eIF2 es necesaria para la estimulación de macroautofagia inducida por repeticiones patogénicas de poliglutamina y su activación contrarresta la muerte gatillada por estos agregados citoplasmáticos (54). Otro trabajo ha mostrado que la desfosforilación de eIF2α, ausencia de ATG5, además del uso de inhibidores de las hidrolasas lisosomales producen la acumulación de la mutante de disferlina en el RE (55). Adicionalmente se ha caracterizado el proceso denominado Retículo Endoplásmico-Fagia, en el cual levaduras expuestas a ERE y que, por lo tanto, han generado UPR, aumentan 5 veces el tamaño de su RE. Este aumento de tamaño se acompaña de la activación de macroautofagia, la cual actuaría reduciendo el tamaño del organelo (56). Actualmente existen pocos trabajos que estudien el mecanismo que activa la macroautofagia en respuesta a ERE. Se ha descrito que PKC (Proteína quinasa C) theta se fosforila en respuesta a ERE, induciendo su colocalización con autofagosomas. Además se ha observado que la inhibición de PKC theta previene activación de la autofagia en respuesta a ERE. Esta activación es dependiente del tipo de estímulo y no requiere la actividad de la vía de señalización de la UPR (57). Por otro lado, BIP se requiere para que se active la macroautofagia en respuesta a ERE. En células en las que se han interferido la expresión de BIP, estudios de microscopia electrónica muestran que el RE se expande y se desorganiza (58). Si bien comienzan a ser sólidos los antecedentes que vinculan a la macroautofagia con el ERE, no existen trabajos que establezcan el papel de la AMC durante el ERAD. Dado que la acumulación de proteínas mal plegadas en el RE lleva 11 a la activación de vías degradativas, en esta tesis se propuso dilucidar si la AMC cumple alguna función en este evento. 2. HIPÓTESIS “Células NIH3T3 (línea celular de fibroblastos de ratón) sometidas a estrés de retículo presentan activación de la autofagia mediada por chaperonas”. 3. OBJETIVO GENERAL Establecer una relación entre la autofagia mediada por chaperonas y el estrés de retículo en células NIH3T3. 4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 4.1 Estandarizar un modelo in vitro de ERE. 4.2 Estudiar la AMC en células NIH3T3 expuestas a ERE. 4.3 Estudiar la participación del ERE en la activación de AMC mediante la intervención de elementos de estos sistemas. 12 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Cultivo celular e inducción in vitro de estrés de retículo Reactivos y soluciones Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM). Sigma, (St. Louis, EEUU). Newborn calf serum (NCS). GIBCO, Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU). Antibióticos: Penicilina 10 U/mL y Streptomicina 10 µg/mL. Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Israel). Presente en todos los medios de cultivos, a menos que se indique lo contrario. Dimetilsulfóxido (DMSO). Merck (Darmstadt, Alemania). PBS pH 7,2 estéril. Para 1 L: NaCl 80g y KCl 2g, ambos Winkler (Santiago, Chile); Na2HPO4 14,4 g y KH2PO4 2,4 g ambos Merck (Darmstadt, Alemania). Este tampón se utilizó en la mayoría de los métodos que se describen en la presente tesis, en los cuales solo se menciona como PBS. Tripsina-EDTA 10x. Biological Industries (kibbutz beit haemek, Israel). Se lleva a la solución de trabajo 1x con PBS estéril. Tapsigargina. Biomol Inc. (Plymouth Meeting, PA, EEUU). La solución stock tiene una concentración 1 mM en DMSO. A partir de este stock fueron preparadas soluciones de trabajo 200 µM y 2 µM, en PBS y medio de cultivo, respectivamente. Azul de Tripán. Sigma-Aldrich, CO. (St. Louis, MO, EEUU). 13 Método El stock de células NIH3T3 (pasaje 14) se mantuvo en medio DMEM 10% NCS con DMSO al 5% en nitrógeno líquido. A partir del stock, las células se descongelaron periódicamente. El proceso de descongelado se realizó rápidamente, poniendo el tubo en un baño a 37°C y en seguida traspasando las células a una placa de 10 cm con medio DMEM 10% NCS. Para sembrar las células, la placa se lavó 1 vez con PBS y luego se agregó 1 mL de tripsina 1x, hasta que se observaban células en suspensión. La tripsina se inactivó agregando medio con suero a la placa. Para sembrar la cantidad indicada para cada método, las células viables se contaron mediante el método de azul de tripán y se sembraron 24 h antes del estímulo en medio DMEM 10% NCS. Al realizar el estímulo, el medio de cultivo se renovó para llevarlas al mismo estado metabólico. Para ello se agregó el volumen de medio necesario, dependiendo del tipo de placa, y una hora después se adicionó la TG disuelta en medio de cultivo. Se cuidó que los distintos tiempos de estímulo tuviesen el mismo tiempo de sembrado. 5.2. Viabilidad celular Reactivos y soluciones Yoduro de propidio. Sigma-Aldrich, CO. (St. Louis, MO, EEUU). La solución stock usada tenía una concentración de 1 mg/ml en agua nanopura. Método Para este ensayo se siembran 30.000 células por pocillo en placas de 12 pocillos y se estimulan con TG. Luego las células se suspendieron agregando 200 µL de tripsina, la que se inactivó con el mismo medio de cultivo. Después de centrifugar a 1000 x g por 5 min a temperatura ambiente, la pella celular se resuspendió en 400 µL 14 de PBS. La tinción se lleva a cabo justo antes de pasar las células por el citómetro de flujo, agregando 4 µL de la solución stock de yoduro de propidio. 5.3. Ciclo celular y apoptosis Reactivos y soluciones Etanol. Merk (Darmstadt, Alemania). RNasa A Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU) El stock tiene una concentración de 50 mg/mL. Método Para este ensayo se sembraron 100.000 células en placas de 6 pocillos. Luego de estimular, las células se soltaron con 200 µL de tripsina y se inactivó la tripsina con el mismo medio de cultivo. Las células se centrifugaron a 1000 x g por 5 min, a temperatura ambiente. El pellet se resuspendió en 1 mL de etanol 100% con agitación constante y posteriormente se dejó a -20°C, al menos 24 h y no más de 48 h. Después el pellet se centrifugó a 1000 x g por 5 min y se resuspendió en 500 µL de PBS. Para poder eliminar el RNA que interfiere en la determinación, se le agregó 1 µL del stock de RNAsa A, se incubó 1 h a temperatura ambiente y luego se mantuvo en hielo. Justo antes de pasar por el citómetro de flujo se agregó 4 µL de yoduro de propidio 1 mg/ml. 5.4. Western blot Reactivos y soluciones Tampón RIPA pH 7,2. NaCl 150 mM, Winkler (Santiago, Chile); Tris 10 mM pH 7,2, Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU); Ácido deoxicólico 1% Sigma-Aldrich, CO. 15 (St. Louis, MO, EEUU); EDTA 5 mM, Winkler (Santiago, Chile); SDS 0,1%, Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU); Tritón X100 1%, Merk (Darmstadt, Alemania). Inhibidores: PMSF 1 mM, Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU); Leupeptina 2 µg/ml, Amresco Inc. (Solon Industrial Parkway Solon, Ohio, EEUU); Aprotinina 5 µg/ml, Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU); Ortovanadato de sodio 100 µM (Sigma). Bio-Rad Protein Assay (Reactivo de Bradford). Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU). La reacción se realizó en placas de 96 pocillos, mezclando 159 µL de agua nanopura, 40 µL de Reactivo de Bradford y 1 µL de muestra. Se determinó la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro de placa. Tampón de carga 4x. Para 100 mL: Glicerol Puro 25,2 g, Merck (Darmstadt, Alemania; 2-Mercaptoetanol 10 mL, Merck (Darmstadt, Alemania); SDS 5 g, Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU); Tris base, 1,51 g, Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU); Azul de Bromofenol 0,01 g, Sigma-Aldrich, CO. (St. Louis, MO, EEUU). PageRuler, Pretained Protein Ladder (Estándar de proteínas). Fermentas International Inc. (Burlington, Ontario, Canada) Acrilamida-bisacrilamida (ABA): Para 100 mL: Acrilamida 29,2 g y bisacrilamida 0,8 g; ambas compradas a Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU). Lower 4x pH 8,8. Para 100mL: Tris base 1,5 M, Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU); SDS 10%, Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU). Upper 4x pH 6,8. Para 100 mL: Tris base 1,5 M, Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU); SDS 10%, Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU). TEMED Winkler (Santiago, Chile). Persulfato de Amonio (PSA). Merck (Darmstadt, Alemania). Tampón de electroforesis 10x. Para 1 L: Tris base 30,25 g, Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU; Glicina 144 g, Winkler (Santiago, Chile); SDS 10g, (Solon, Ohio, EEUU). A partir de esta solución se preparó la solución 1x con agua destilada. 16 Tampón de transferencia 10x: Para 1 L: Tris base 30,25 g, Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU); Glicina 144g, Winkler (Santiago, Chile). A partir de esta solución se preparó la solución 1x con agua destilada. Metanol. Merk (Darmstadt, Alemania). TBS Tween 20 pH 7,4. Para 1 L: NaCl 80 g y KCl 2 g, ambos Winkler (Santiago, Chile); Tris base 30 g Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU); Tween 20 0,1%,Winkler (Santiago, Chile). En la metodología se menciona sólo como TBS Leche libre de grasas Anticuerpos: los antecedentes de los anticuerpos se muestran en la Tabla 3. Además se indica la cantidad de proteínas que es necesario cargar y la concentración del gel concentrador y separador usados para observar cada proteína. ECL Western Blotting Substrate. Pierce (Rockford, IL, EEUU). BioMax MR Film. Kodak (Rochester, NY, EEUU) Solución de revelado. Kodak (Rochester, NY, EEUU) Solución de fijación. Kodak (Rochester, NY, EEUU) Tabla 1. Fórmula de preparación de cada SDS-PAGE. Acrilamida Concentrador Separador Agua Temed PSA 5% 0,8 mL 1,3 mL - 2,9 mL 5 µL 45 µL 10% 2,5 mL - 1,9 mL 3,1 mL 4 µL 34 µL 12% 3 mL - 1,9 mL 2,6 mL 4 µL 34 µL 15% 3,75 mL - 1,9 mL 1,85 mL 4 µL 34 µL 17 Método Para este ensayo se utilizaron distintos tipos de placas dependiendo de la cantidad células que se debía sembrar, las cuales a su vez dependían de la cantidad de proteínas a cargar (se detalla en Tabla 3) . La placa estimulada se lavó dos veces con PBS frío y se agregó un volumen de tampón RIPA con inhibidores, dependiendo del tipo de placa: Tabla 2 Volumen de tampón RIPA según el tipo de placa de cultivo. Placa 10 mm 60 mm 6 pocillos 12 pocillos Volumen de RIPA 100 µL 80 µL 60 µL 40 µL El lisado se transfirió a tubo plástico de 1,5 mL y se centrifugó a 10.000 x g por 10 min a 4°C para eliminar las células integras. La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford y el volumen de muestra necesario se hirvió por 5 min junto al tampón de carga 1x. La muestra se cargó en el SDS-PAGE elaborado según se indica en la Tabla 1. Las proteínas se resolvieron realizando la electroforesis a voltaje constante de 100V. Luego se realizó la electrotransferencia hacia membranas de nitrocelulosa o PDVF a 0,45 mA por 90 min. Las membranas se trataron con tampón de bloqueo con leche al 5% en TBS por media hora e incubadas con el anticuerpo primario durante toda la noche. A continuación la membrana se lavó 3 veces con TBS y se incubó con el anticuerpo secundario por 1 h. Ambos anticuerpos se disolvieron en leche al 5% en TBS, llevándolos a la concentración que se indica en la Tabla 3. Luego, la membrana se lavó 3 veces con TBS e incubada con ECL, el tiempo necesario para que la reacción de quimioluminicencia se llevara a cabo. Finalmente la membrana se expuso a una placa fotográfica, reveló y fijó en la oscuridad. 18 Tabla 3. Anticuerpos primarios y secundarios usados en la tesis Anticuerpos primarios Proteína Peso Isotipo Reconoce Hecho en Proveedor Clonalidad Rabbit Dilución WB Proteína a cargar Concentración Gel Dilución IF Bip 78 KDa 1 en 5000 20 µg (ET) 5/10 % - Chop 32 KDa IgG H-M-R Rabbit Santa Cruz Polyclonal 1 en 2500 20 µg (ET) 5/10 % - β-actina 42 KDa IgG H-M-R Mouse Calbiochem Monoclonal 1 en 1000 20 µg (ET) 5/10 % - Hsc70 70 KDa IgM M-H Mouse AbCam Monoclonal 1 en 5000 20 µg (ET) 5/10 % 1 en 500 Lamp2A 96 KDa IgG R Rabbit Zymed Policlonal 1 en 5000 30 µg (L) - 100 µg (ET) 5/12 % 1 en 300 Lamp1 120 KDa IgG M Goat RyD Policlonal 1 en 5000 30 µg (L) 5/12 % 1 en 200 Atg5 55 KDa IgG H-M-R Rabbit Cell Signaling Policlonal 1 en 500 50 µg 5/10 % - LC3 14-16KDa IgG H-M-R Rabbit Cell Signaling Policlonal 1 en 1000 30 µg 5/15% 1 en 100 ET: extracto total, L: extracto lisosoma Anticuerpos secundarios Anticuerpo Dilución Enzima Marca Anticuerpo Color Dilución Fluoróforo Marca Rabbit 1 en 30000 Peroxidasa Calbiochem Rabbit Rojo 1 en 500 Cy3 Molecular Probes Mouse 1 en 40000 Peroxidasa Calbiochem Rabbit Verde 1 en 500 FitC Molecular Probes Goat 1 en 10000 Peroxidasa Jackson Mouse Rojo 1 en 500 Cy3 Molecular Probes Mouse Verde 1 en 500 FitC Molecular Probes Goat Verde 1 en 200 FitC Jackson IgM Rojo 1 en 300 Cy5 IgM 1 en 5000 Peroxidasa 19 5.5. Densitometría Las placas fotográficas se escanearon y el análisis densitométrico se realizó usando el programa UN-SCAN-IT de Silk Scientifics, Inc. 5.6. Fraccionamiento subcelular Reactivos y soluciones Sacarosa. Winkler (Santiago, Chile). Método Para realizar este ensayo se utilizaron 4 placas de 10 cm a un 80% de confluencia. Luego de terminado el estímulo, las placas se trataron con tripsina, la cual se inactivó con el mismo medio de cultivo y se colectó en tubos de 10 mL. Las células se centrifugaron a 500 x g por 5 min a 4ºC y se eliminó el sobrenadante. Se lavó con 3 volúmenes de sacarosa 0,25 M y se repitió la centrifugación, cuidando siempre mantener en hielo. Las células se homogeneizaron en 3 volúmenes de sacarosa 0,25 M en un homogeneizador vidrio-teflón a 1000 rpm, mediante 10 golpes de 5 seg. En seguida, se realizaron dos centrifugaciones a 6800 x g por 5 min a 4 °C, lavando el pellet con 3 volúmenes de sacarosa 0,25 M. Los sobrenadante se recolectaron y centrifugaron a 17000 x g por 12 min a 4°C. El pellet se resuspendió en la mitad de volumen de sacarosa 0,25 M y se centrifugó nuevamente a 17000 x g por 12 min a 4 °C. El pellet resultante es la fracción lisosomal-mitocondrial, que se resuspendió en 50 µL de sacarosa 0,25 M. 20 5.7. Inmunocitoquímica Reactivos Metanol. Merk (Darmstadt, Alemania). Albúmina de suero bovino (BSA). Winkler (Santiago, Chile). Anticuerpos: los antecedentes y diluciones de los anticuerpos se muestran en la Tabla 3 DAKO. Dako (Via Real Carpinteria, CA, EEUU) Tinción Hoechst Método Este ensayo se realizó con 100.000 células sembradas en placas de 6 pocillos con cubreobjetos, en medio DMEM 10% NCS. Terminado el estímulo, cada pocillo se lavó 2 veces con PBS frío y se les adicionó 2 mL de metanol durante 20 min a -20°C. Terminada la incubación, los pocillos se lavaron con PBS 2 veces y las células trataron con BSA-PBS al 5% por 1 h. Terminado el bloqueo, cada pocillo se lavó 2 veces con PBS e incubado toda la noche con 12 µL de anticuerpo primario diluido en BSA/PBS 5% estéril. Posteriormente, el cubreobjeto se lavó 2 veces con PBS e incubado durante 1 h, esta vez con el anticuerpo secundario y en la oscuridad. Finalmente, el cubreobjeto se lavó 2 veces con PBS y montado sobre un portaobjeto con 12 µL de DAKO. El portaobjeto se mantuvo en una caja oscura a 4°C, hasta ser observado en microscopio de fluorescencia y/o confocal. 5.8. Producción y transducción lentiviral Reactivos Fetal Bovine Serum (FBS). HyClone (Logan, Utah, EEUU) Lipofectamina 2000. Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU) 21 Bromuro de hexadimetrino (Polibrene). Sigma-Aldrich, CO. (St. Louis, MO, EEUU). La solución stock tenía una concentración de 8 mg/mL en agua nanopura estéril. Plamidios: Se detallan en la Tabla 4 y se obtuvieron por colaboración de la Dra. Ana María Cuervo, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, EEUU. Además se muestra el volumen de solución de plasmidio 0,1 µg/µL que se usó para la transfección. Tabla 4. Cantidad de plasmidio usado para la transfección lentiviral. Plasmidio Control Luciferasa (-) Lamp2A (-) pMD2VSV.G 3,8 µL 3,8 µL pMDLg/pRRE 19,1 µL 19,1 µL pRSV-Ver 19,1 µL 19,1 µL Luc (-) 38,2 µL L2A (-) 38,2 µL Medio 419,8 µL Medio 419,8 µL Soluciones A. 8 µg de DNA en 500 µL de DMEM sin antibióticos. (según Tabla 4) Mezclar suavemente. B. 16 µL de lipofectamina (mezclar antes de usar) en 484 µL de medio DMEM sin antibióticos. Mezclar suavemente e incubar por 5 min. 22 Método Células 293T se sembraron en placas de 60 mm en 5 mL de medio DMEM 10% FBS, 24 h antes de la transfección. Se cuidó especialmente que el pasaje de las células no fuese superior a P12-P15 y que las células tuviesen una confluencia de 90%, en el momento de la transfección. Dos horas antes de la transfección, las células se lavaron con 2 mL de PBS y se les agregó 4 mL de medio DMEM sin antibióticos. A continuación, las soluciones A y B se mezclaron suavemente e incubadas por 20 min a temperatura ambiente. Luego la mezcla se agregó suavemente sobre las células, incubando por 4 h a 37ºC. Finalizada la incubación, el medio se reemplazó por 3 mL de DMEM 10%FBS con antibióticos (Penicilina y Streptomicina), el cual fue mantenido por 48 h. En último lugar, el medio se pasó a través de un filtro de 0,45 µm y se utilizó de inmediato para la transducción. La transducción se realizó en placas de 6 pocillos, sembradas con 100.000 células NIH3T3 por pocillo. Se añadió 1 mL del sobrenadante que contenía el vector lentiviral y para mejorar la eficiencia de la infección se utilizó polibrene a una concentración de 8 µg/mL. Las células se mantuvieron en este medio a 37ºC por 24 h, luego el medio se cambió por 2 mL de medio DMEM 10%FBS por 72 h. La expresión de GFP se verificó mediante microscopia óptica de fluorescencia o mediante citometría de flujo. 5.9. Tratamiento de células MEF m5-7 Reactivos Hidroclorohemietalonato de doxiciclina hemihidratado (Sigma) 10 mg/mL en agua nanopura. Dihidroclorhidraro de Puromicina (Sigma) 1 mg/mL en agua nanopura. 23 Método Las células MEF m5-7 se mantuvieron en medio DMEM 10% FBS con puromicina 4 µg/mL, para mantener la selección generada en la construcción del sitema Tet-off que poseen. Para eliminar la expresión de ATG5 se agregó diariamente durante una semana doxiciclina 100 ηg/mL. Terminada la semana de tratamiento las células se trataron con tripsina y sembraron en dos placas, una de las cuales mantuvo el tratamiento con doxiciclina y la otra se mantuvo en DMEM 10% FBS con puromicina, durante 24 h más. 5.10. Análisis estadístico El software GraphPad Prism 4 fue usado para hacer el análisis de Anova y TTest y el post-test de Tukey. Cada experimento se realizó 3 veces independientes y los resultados son expresados como el promedio más la desviación estándar. 24 6. RESULTADOS 6.1. Estandarización de un modelo in vitro de estrés de retículo endoplásmico El primer desafío de esta tesis consistió en estandarizar las condiciones experimentales de estrés de retículo endoplásmico (ERE) en las células NIH3T3 de ratón. Este tipo celular se escogió como modelo debido a que estos fibroblastos embrionarios de ratón “Swiss” han sido ampliamente utilizados tanto en el estudio de ERE como en la autofagia mediada por chaperonas (59, 42). Entre los compuestos típicamente utilizados para inducir ERE están A23187 y Tapsigargina (TG) que intervienen en la homeostasis del calcio, tunicamicina que suprime la glicosilación y brefeldina A que inhibe el transporte al Golgi (8). Para inducir ERE se eligió a TG, inhibidor de bombas de Ca2+ de membranas intracelulares. A concentraciones de 0,1 µM es un efectivo inhibidor de la bomba Ca2+ATPasa del retículo sarcoplásmico (SERCA). Se descartó el uso de tunicamicina ya que la proteína Lamp2A es fuertemente glicosilada en el RE y el Golgi (60). Las células NIH3T3 se expusieron a ERE, evitando que se produzca muerte por apoptosis y así poder observar la etapa adaptativa frente al ERE. Esta etapa adaptativa se caracteriza por la activación de mecanismos que aumenten la capacidad plegadora de proteínas del RE y de mecanismos degradativos que eliminan la sobrecarga de proteínas mal plegadas en el RE. La estrategia experimental contempló dos pasos principales, el seguimiento de marcadores de ERE a través de western blot y la determinación de la viabilidad y ciclo celular mediante citometría de flujo. Durante la primera parte de este objetivo, nos enfocamos en asegurar que efectivamente se produjera ERE por la TG. Con este fin se evaluaron los niveles proteicos del factor transcripcional Chop, un marcador clásico de ERE. La Figura 3A-B muestra los cambios en los niveles de Chop entre las 2 y las 24 h. El aumento de Chop fue transitorio, teniendo un máximo entre las 6 y 8 h, para las 3 concentraciones de TG estudiadas. Además se observó la cantidad de este marcador en función de la confluencia de las células en la placa (Figura 3C), indicando que debe mantenerse la confluencia entre un 70 y 80% para que la inducción de ERE sea efectiva. 25 Otro marcador de ERE es el aumento en la expresión de la chaperona BIP, que seguimos mediante western blot. Los niveles de esta chaperona tendieron a aumentar a tiempos de exposición más tardíos, pero estos cambios no fueron estadísticamente significativos (datos no mostrados). Estos resultados revelaron que la inducción de la expresión de este marcador debe estudiarse a nivel de mRNA, porque en general todas las células tienen altos niveles proteicos de BIP. En seguida nos enfocamos en evaluar la muerte celular en presencia de TG. Tanto para la viabilidad como para determinar el ciclo celular, se utilizó como trazador el yoduro de propidio (PI). PI es una sonda que emite fluorescencia al intercalarse al DNA, pero que es impermeable a la membrana celular, por lo que sólo las células que tienen alterada la integridad de su membrana lo incorporan. Para determinar la viabilidad total, las células se estimularon con TG durante el tiempo y utilizando las concentraciones indicadas en la Figura 4 y en seguida las células vivas se incubaron con PI. No se observó un aumento en la muerte a ninguna de las concentraciones de TG ensayadas. Luego se evaluó el ciclo celular para investigar si hay apoptosis y cambios en la proliferación celular durante el evento de ERE. Para este fin, las células se permeabilizaron con etanol e incubaron con PI, de manera de teñir el DNA de todas las células y clasificar las distintas subpoblaciones por citometría de flujo de acuerdo a la cantidad de DNA que poseen. La población apoptótica se muestra en el perfil del ciclo celular como la fracción sub G1, ya que la fragmentación del DNA es característica para este tipo de muerte. La Figura 5 muestra que no aumentó la población apoptótica en las concentraciones y tiempos analizados. Además se cuantificó el porcentaje de células en etapa G1 y G0 del ciclo celular, como una manera de evaluar proliferación. La Figura 6 muestra que hubo un aumento significativo de la población en esta fase, lo cual fue más evidente a medida que se incrementó el tiempo de exposición a TG. Este efecto ya había sido observado por Brewer et al (61) y es un evento anexo a la generación de ERE por la TG. 26 A Chop β -actina 0 0,1 0,5 B 0,1 0,5 2 Niveles Relativos de Chop C 1 1 0,1 0,5 4 1 0,1 0,5 6 1 0,1 0,5 8 1 0,1 0,5 12 1 0,1 0,5 18 1 (µM) 24 (h) 25 20 15 10 5 0 C 2 4 6 0 8 12 18 24 2 4 6 8 12 18 24 2 4 0,1 0,5 C h 6 8 1218 24 M 1 Niveles de CHOP (u) 15 Chop β -actina 10 5 100% 80% 50% C (80) 30% C (80%) 0 0 30 50 80 0,1 100 (% Confluencia) (M TG) Figura 3. Tapsigargina aumenta los niveles proteicos de Chop en células NIH3T3. La presencia de este marcador se evaluó mediante western blot. Panel A muestra un western blot representativo de los niveles proteicos de Chop y β-actina. Panel B muestra el gráfico que representa la densitometría de los niveles proteicos de Chop, normalizado por -actina y relativizado por la cantidad de Chop a las 4 h. Los estímulos usados son 0,1, 0,5 y 1 µM de TG entre 2 y 24 h. Como control se utilizó DMSO a una concentración equivalente a la que se encuentra en 1 µM de TG (promedio ± DS, n=3). Panel C muestra los niveles proteicos de Chop en función de la confluencia celular para el estímulo de TG 0,1 µM por 8 h. 27 A B Figura 4. Efecto de la Tapsigargina (estímulo de ERE) en la viabilidad de células NIH3T3. La viabilidad celular se cuantificó mediante el uso de citometría de flujo (FACS) y usando PI como trazador. Panel A se muestran los histogramas representativos para el control DMSO y TG 1 µM por 24 h. P4 corresponde a la población de células vivas, que no incorporan PI. P5 es la población que incorpora PI, por lo que aumenta su fluorescencia. Panel B muestra el porcentaje de células positivas para PI con los estímulos de 0,1, 0,5 y 1 µM de TG, durante 8-12-18-24 horas (promedio ± DE, n=3). Se utilizó como control DMSO a una concentración equivalente a la que se encuentra en 1 µM de TG durante 24 horas y como control positivo peróxido de hidrógeno al 1% durante 8 h. 28 A B C Células en Sub G1 (%) 100 80 60 40 20 0 C 0 8 12 0,1 18 24 8 12 18 0,5 24 8 12 18 1 24 (h) (M TG) Figura 5. Efecto de la Tapsigargina en la apoptosis de células NIH3T3. Para este ensayo, las células permeabilizadas con etanol y teñidas con PI, se analizaron mediante citometría de flujo. Panel A esquema que muestra el perfil del ciclo celular para este tipo de ensayos. Panel B histogramas representativos para el control con DMSO y TG 1 µM por 24 h. P3 corresponde a la población de células apoptóticas. Panel C muestra el porcentaje de células sub-G1 con los estímulos de 0,1, 0,5 y 1 µM de TG, durante 8-12-18-24 h (promedio ± DE, n=3). Como control se utilizó DMSO a una concentración equivalente a la que se encuentra en 1 µM de TG durante 24 h. 29 A B ** Células en G1/G0 (%) 100 80 60 40 20 0 C 0 8 12 0,1 18 24 8 12 18 0,5 24 8 12 18 1 24 (h) (M TG) Figura 6. Ciclo celular en células NIH3T3 sometidas a ERE con Tapsigargina. Mediante citometría de flujo se analizaron células permeabilizadas y teñidas con PI. Panel A muestra histogramas representativos para el control con DMSO, TG 0,1 µM por 8 h ó TG 1 µM por 24 h. P4 corresponde a la población en fase G1 y G0, P5 en fase S y P6 en fase G2 del ciclo celular. Panel B muestra el porcentaje de células en G1 y G0 del ciclo celular con los estímulos de 0,1, 0,5 y 1 M de TG entre 8 y 24 h (promedio ± DE, n=3) **p<0,01 con respecto al control, ANOVA seguido de post-test de comparación múltiple de Tukey. Como control se utilizó DMSO a una concentración equivalente a la que se encuentra en 1 M de TG, durante 24 h. 30 6.2. Estudio de la autofagia mediada por chaperonas en células NIH3T3 expuestas a estrés de retículo endoplásmico Luego de haber estandarizado las condiciones de trabajo, el paso siguiente fue demostrar la hipótesis de trabajo mediante el estudio de AMC en células NIH3T3 expuestas a ERE. Para esto se utilizaron dos aproximaciones experimentales principales. En primer lugar se evaluó la localización de los lisosomas mediante inmunocitoquímica durante el evento de ERE y en segundo lugar se determinaron los niveles proteicos de marcadores de la AMC, en extracto total y fracción lisosomal mediante Western blot. Se ha descrito que un aumento en los niveles de Lamp2A en la membrana y en los niveles de Hsc 70 en lumen del lisosoma se relacionan directamente con la actividad de la AMC. Además se ha observado una relocalización de los lisosomas activos para AMC hacia zonas perinucleares, pero se desconoce su causa (39, 35). La inmunocitoquímica para Lamp2A de la Figura 7 muestra un aumento en la expresión del receptor para los tiempos ensayados (4 y 8 h). Es menos evidente la redistribución hacia zonas perinucleares debido a que en estado basal la mayoría de las células muestran una tinción fuerte en esa zona. Este aumento en los niveles de Lamp2A es significativo para el estímulo con TG 1 µM, analizado en western blot de extracto total (Figura 8). El aumento de Lamp2A se refleja en una mayor presencia en la fracción lisosomal, en donde es funcional (Figura 9). En cuanto a la redistribución de Hsc 70 hacia los lisosomas, la Figura 11 muestra que si bien en condiciones basales Hsc 70 se encuentra en regiones similares con Lamp2A, esta ubicación se acentúa durante el evento de ERE. Además se quiso tener certeza que el anticuerpo contra Lamp2A estuviese marcando lisosomas, para lo cual se incubó junto al marcador de este organelo Lamp1 y se observó una alta colocalización (Figura 10). Finalmente se estudió la expresión de Hsc70 en extracto total mediante western blot. No se observaron cambios en los niveles de Hsc70 hasta las 24 h de estímulo. La Figura 12 muestra un gráfico representativo para las 8 h de estímulo. 31 CONTROL 20µM DMSO 20µM TG 4 h 20µM TG 8 h 20µM 20µM Control anticuerpo Secundario Alexa488 Figura 7. Tapsigargina aumenta los niveles de Lamp2A en células NIH3T3. Inmunocitoquímica de células estimuladas con 0,1 µM Tapsigargina (TG) por los tiempos indicados. Como control se utilizó DMSO a una concentración equivalente a la que se encuentra en 0,1 µM de TG, durante 8 h. Se incubó con anticuerpo antiLamp2A y secundario Alexa Fluor 488. Los núcleos se tiñeron con Hoechst. La captura de imágenes se realizó mediante un microscopio confocal Carl-Zeiss. En el inserto se muestra el control de la especificidad del anticuerpo secundario. 32 A Lamp2A B Niveles de Lamp2A Relativos β-actina * 3 2 1 0 0 0,1 1 M TG Figura 8. El tratamiento con Tapsigargina aumenta los niveles totales de Lamp2A. El nivel del receptor lisosomal Lamp2A se estudió mediante western blot de extracto total. Panel A muestra un western blot representativo de la cantidad de Lamp2A y de β-actina, frente al estímulo. Panel B muestra el análisis densitométrico de los niveles proteicos de Lamp2A, normalizado por los niveles de -actina y relativo al control. Se estimuló con TG 0,1 y 1 µM por 8 h. (Promedio ± DS, n=5) *p<0,05 con respecto al control 0 µM TG. ANOVA seguido de post-test de comparación múltiple de Tukey. 33 A Lamp2A Lamp1 L PN L B Niveles Relativos de Lamp2A 0 2 PN 0,1 (µM TG) * 1 0 0 0,1 M TG Figura 9. Tapsigargina aumenta la presencia de Lamp2A en la fracción lisosomal en células estimuladas con TG 0,1 µM por 8 h. Los niveles proteicos del receptor lisosomal Lamp2A se estudiaron mediante western blot de fracción lisosomal generada por centrifugación diferencial. Panel A muestra un western blot representativo de los niveles de Lamp2A y Lamp1, frente al estímulo. L es fracción lisosomal, PN es fracción post-nuclear. Panel B muestra el análisis densitométrico de Lamp2A, normalizado por Lamp1 y en relación al control. Los valores representan el promedio ± DS, n=3, *p<0,05 con respecto al 0 µM de TG t-test. 34 Lamp1 Lamp2A 20µM 20µM Colocalización Control anti-Lamp1 con ab secundario para Lamp2A Control anti-Lamp2A con ab secundario para Lamp1 Figura 10. Lamp2A se20µM localiza en los lisosomas. Inmunocitoquímica de células NIH3T3. Se incubó con anticuerpo anti-Lamp2A y anti-Lamp1, seguido por la incubación con sus respectivos anticuerpos secundarios. La captura de imágenes se realizó mediante un microscopio confocal Carl-Zeiss. En el inserto se muestran los controles de la especificidad de los anticuerpos. 35 Hsc70 C Lamp2A 20µM C TG 0,1 µM 20µM TG 0,1 µM TG 1 µM 20µM TG 1 µM Control anti-Hsc70 con ab secundario para Lamp2A Colocalización 20µM 20µM 20µM C 20µM TG 0,1 µM TG 1 µM 20µM 20µM Control anti-Lamp2A con ab secundario para Hsc70 Figura 11. El tratamiento con Tapsigargina produce una redistribución de Hsc70 hacia los lisosomas. Inmunocitoquímica de células NIH3T3 estimuladas con TG 0,1 y 1 µM durante 8 h. Como control se utilizó DMSO a una concentración equivalente a la que se encuentra en 1 µM de TG. Se incubó con anticuerpo anti-Lamp2A y anti-Hsc70 seguidos de sus respectivos anticuerpos secundarios. La captura de imágenes se realizó mediante un microscopio confocal Carl-Zeiss. 36 A Hsc70 β-actina 0 C 0,1 0,5 1 2 0,1 0,5 1 0,1 0,5 4 1 6 0,1 0,5 1 8 0,1 0,5 1 12 0,1 0,5 18 1 0,1 0,5 24 1 µM) (h) 3 2 1 M TG 1 M 0, 5 TG 0, 1 TG 0 TG M 0 M Niveles relativos de Hsc70 B Figura 12. El tratamiento con Tapsigargina no cambia los niveles totales de Hsc70. Se evaluó la cantidad de esta chaperona mediante western blot de extracto total. Panel A muestra un western blot representativo de la expresión de Hsc70 y de βactina, frente al estímulo. Panel B muestra el gráfico que representa la densitometria de la expresión de Hsc70, normalizado por la expresión de β-actina y relativo al control. Se graficaron los estímulos con TG 0,1, 0,5 y 1 µM durante 8 h (promedio ± DS, n=3). 37 6.3. Estudio de la participación del ERE en la activación de la autofagia mediada por chaperona mediante la intervención de elementos de estos sistemas. Existen indicios claros que las vías de degradación de proteínas se mantienen interconectadas, ya que si alguna no está operativa, las otras se activan para mantener a la célula libre de proteínas dañadas y agregadas. Se ha observado esta intercomunicación entre la AMC y macroautofagia durante eventos de estrés nutricional (42, 43), pero no se ha estudiado si ocurre durante el ERE. Se ha reportado que una disminución en los niveles de Lamp2A produce a su vez una disminución en la actividad de AMC, tanto cuando existe una transfección con el siRNA (42), así como en células que tienen una disminución permanente del receptor (43). Para estudiar este fenómeno durante un evento de ERE, se utilizaron células deficientes en Lamp2A. La Figura 13A muestra que el 85% de las células expresan GFP, incluso 6 meses después de producida la transducción. La GFP está codificada en el plasmidio de expresión que contiene el iRNA para Lamp2A. Este aumento del número de células fluorescentes se refleja en la disminución en un 81% de la presencia de Lamp2A en la fracción lisosomal (Figura 13B). En seguida se investigó si la ausencia de AMC desencadenaba mayor ERE, para lo cual se analizó la expresión de Chop por western blot en células carentes de Lamp2A. La Figura 14A muestra que contrariamente a lo esperado, las células control tratadas con TG muestran mayor cantidad de Chop que las células que no expresan Lamp2A. Este resultado podrían deberse a que el aumento en la actividad de la macroautofagia hace que las células Lamp2A resuelvan de mejor manera el ERE que las células control. Para evaluar esta hipótesis estudiamos la conversión de LC3 I a LC3 II, lo que habitualmente es usado como un marcador de macroautofagia (62). Los resultados muestran que la disminución de la AMC causa un aumento en la actividad de macroautofagia a niveles basales (Figura 14B). También en esta última figura se observa que el tratamiento con TG produjo una mayor activación de la macroautofagia en las células que no expresan Lamp2A en comparación con las que si lo expresan. 38 Las células m5-7 son fibroblastos embrionarios (MEF) generados a partir de ratones “knock out” para ATG5, que regulan la expresión de ATG5 mediante un sistema Tet-off/on. La molécula ATG5 es clave en la generación de autofagosoma por lo que su ausencia (células tratadas con doxiciclina) lleva a la inactivación de la macroautofagia. En cambio, las células controles (células no tratadas con este antibiótico) poseen ATG5 y responden normalmente a los estímulos autofágicos (63) (Figura 15A). La Figura 15 B muestra la expresión del complejo ATG5/ATG12 como control del tratamiento de las células m5-7. Las células tratadas con doxiciclina no muestran expresión del complejo ATG5, mientras que la eliminación del antibiótico por 24 h fue suficiente para restaurar su expresión. La Figura 16 muestra los niveles totales de Lamp2A en las células m5-7 sometidas a ERE. Se observa que las células que expresan ATG5 responden de manera equivalente a las células NIH3T3 frente al estresor TG (Figura 16A). Las células m5-7 tratadas con doxiciclina, es decir carentes de ATG5, muestran un aumento significativo en los niveles totales de Lamp2A comparado con células controles que expresan el ATG5 (Figura 16A). Estos resultados sugieren que podría estar produciéndose un aumento compensatorio de la AMC cuando la macroautofagia está inactiva. Un resultado sorprendente se observó cuando las células m5-7 carentes de ATG5 se trataron con TG, en donde se observó una importante disminución de los niveles de Lamp2A (Figura 1 B). 39 A GFP B Lamp2A Ponceau Lamp2A (+) Lamp2A (-) Figura 13. Generación de células Knock down para Lamp2A. Células NIH3T3 se transducieron con vectores lentivirales, producidos por cotranfección en células HEK293T. Además del iRNA para Lamp2A, el plasmidio de expresión codifica la proteína fluorescente verde (GFP). Como control se generó una línea que expresa un iRNA para luciferasa. Panel A Se siguió el éxito de la infección lentiviral mediante citometria de flujo. Se observa que un 85% de las células Lamp2A (-) expresan GFP. Panel B Se muestra un western blot de Lamp2A en la fracción lisosomal generada por centrifugación diferencial. Se observa una reducción de un 81% de Lam2A en las células infectadas con el iRNA para Lamp2A. Como control de carga se muestra la membrana teñida con rojo Ponceau. 40 A Chop β-actina B LC3 I LC3 II β-actina Lamp2A(+) 0 0,1 Lamp2A(-) 0 0,1 (µM TG) Figura 14. Efecto de la Tapsigargina sobre los niveles de Chop y LC3 I/II en células carentes de Lamp2A. Células NIH3T3 se transducieron con un lentivirus que expresa un iRNA para luciferasa (Luc -) como control o para Lamp2A (Lamp2A -). Luego ambos tipos celulares se trataron con TG 0,1 µM por 8 h, se prepararon lisados de extractos proteicos y se determinaron por western blot los niveles de Chop (panel A), de LC3 I/II (panel B) y de -actina como control de carga. Los western blot mostrados son representativos de n=3-4, en los cuales se observaron similares resultados. 41 A B Atg5/Atg12 55 KDa -actina ATG (-/-) ATG (+/+) Figura 15. Efecto de la doxiciclina en la expresión de ATG5 en células MEF m5-7. Panel A Para eliminar la expresión de ATG5 en células m5-7 se agregó diariamente durante una semana doxiciclina 100 ηg/mL. Luego, las células se separaron en dos placas, unas continuaron su tratamiento con doxiciclina, mientras que las otras se cultivaron en medio sin doxiciclina por 24 h. Panel B La figura muestra un western blot donde las muestras se cargaron por duplicado. El anticuerpo usado identifica el complejo ATG5/ATG8 y se muestra -actina como control de carga. Además se observa que el complejo está presente en las células NIH3T3. Los resultados muestran que las placas tratadas con Doxiciclina no expresan ATG5. 42 A Lamp2A Niveles Relativos de Lamp2A Ponceau 3 ** 2 * 1 0 0 0,1 ATG5 (+/+) 0 M TG ATG5 (-/-) B Lamp2A Niveles Relativos de Lamp2A Ponceau 2 * 1 0 0 0,1 M TG ATG5 (-/-) 43 Figura 16. Efecto de la TG en los niveles de Lamp2A en células carente de ATG5. Células MEF m5-7 se trataron como se explica en la Figura 15. Panel A Muestra un western blot representativo y el gráfico donde se compara los niveles de Lamp2A para células Atg5 (-/-) en relación a las células Atg5 (+/+). Panel B Muestra un western blot representativo y el gráfico donde se compara los niveles de Lamp2A para células Atg5 (-/-) al ser estimuladas con TG 0,1 µM por 8 h. Como control de carga se muestran la membrana teñida con rojo Ponceau. Los valores mostrados corresponden al promedio ± DS (n=3). *p<0,05 con respecto al control. ANOVA seguido de post-test de comparación múltiple de Tukey. 44 7. DISCUSION 7.1. Estandarización de un modelo in vitro de ERE Mediante el primer objetivo se confirmó que la Tapsigargina produce ERE en las células NIH3T3, evidenciado por el aumento en los niveles de Chop, el cual no se expresa basalmente en este tipo celular. Además se observa la desaparición de Chop a las 24 h post-estímulo, indicando que la célula sobrellevó el evento de estrés de retículo y que probablemente existe un mecanismo degradativo que controla los niveles de Chop. Además las células NIH3T3 mostraron ser muy resistentes al estímulo proapoptótico Tapsigargina. Aunque se mantuvo la expresión de Chop, un factor transcripcional apoptótico durante 18 h de estímulo, las células no presentaban muerte celular aunque en evidente estado de arrresto de su ciclo celular en la etapa G1. Este efecto ha sido observado con anterioridad y se debe a un bloqueo en la expresión de la ciclina D1 (61). Entre los experimentos que profundizan en este objetivo está la evaluación del ciclo celular luego de retirar el estresor, para poder confirmar que efectivamente la célula se recuperó y que pudo reactivar su ciclo replicativo. Por otro lado, como se menciona en los resultados, la evaluación de BIP mediante western blot si bien mostró una tendencia a aumentar sus niveles en respuesta a ERE, éstos no fueron significativos, por lo que se debe evaluar su mRNA mediante RT-PCR. 7.2. Estudio de AMC en células NIH3T3 expuestas a ERE Los datos de la tesis establecen las primeras señales de una posible activación de la AMC seguido a un evento de ERE. Esta activación tendría por objeto ayudar en la eliminación de las proteínas mal plegadas que se están generando en el RE. Para esto la maquinaria del ERAD, en la cual intervienen varias chaperonas, luego de retrotranslocar sus sustratos al citosol, los pondría en manos de las chaperonas de la AMC. Naturalmente las proteínas blanco de la vía, deben cumplir con el requisito de exponer la secuencia de reconocimiento KFERQ. 45 El resultado más importante que se obtuvo en la tesis, fue que el tratamiento con Tapsigargina lleva a un aumento en el nivel total de Lamp2A. Este aumento podría estar dado por un aumento en la expresión total de Lamp2, y por ende de todas sus isoformas, Lamp2A, Lam2B y Lamp2C, por igual. La otra posibilidad que existe, es que se esté favoreciendo el splicing de Lamp2A. Para resolver esta pregunta, es necesario observar si las otras isoformas de Lamp2, aumentan su expresión. No hay reportes que describan los mecanismos que controlan la expresión de Lamp2, ni bajo que condiciones se favorece el splicing de alguna de las isoformas. Una muy interesante posibilidad sería que se esté produciendo un mecanismo similar al que ocupa IRE1 para producir el splicing de XBP1. El sensor IRE1, tiene un dominio endoribonucleasa en su porción citosólica, que genera el corte del mRNA de XBP1 en dos posiciones, produciendo la eliminación de un intrón. Los exones resultantes son unidos por una RNA ligasa (12, 13). Otra posibilidad es que el aumento en la expresión del receptor pueda deberse a la alteración en el calcio citosólico, que provoca la Tapsigargina. Con relación a este punto, un experimento clave será quelar el calcio citosólico en conjunto al estímulo con Tapsigargina, para poder estudiar el eventual papel del calcio en este proceso. Sin embargo, una de las principales características del ERE es que se reduce al mínimo la traducción general (8). Si el aumento en los niveles de Lamp2A es debido a una mayor expresión del gen Lamp2, deben estar implicados factores que eviten el bloqueo de traducción producido por la acción de eIF2α durante el ERE. De esta manera se podría descartar una posible intervención de los mecanismos normales de control de la expresión génica, que pudiesen depender de calcio. Luego de observar que se producía un aumento en los niveles totales de Lamp2A, se buscó en el promotor de este gen elementos de respuesta a alguno de los factores de transducción clásicos que son inducidos durante ERE. Mediante el uso del programa TESS, Transcription Element Search System (http://www.cbil.upenn.edu/cgibin/tess/tess), observamos que existen varios sitios de consenso para los factores transcripcionales que pertenecen a la familia AP1 y NF-kB. Existen reportes que indican la activación de estos factores durante el ERE (64, 65, 66, 67, 68). Un ejemplo es la expresión de manganeso superóxido dismutasa, una enzima antioxidante que se 46 ubica en la mitocondria, y que aumenta su expresión en respuesta a la activación de AP1 y NF-kB, inducidos por ERE. La activación de estos factores es dependiente de la vía de IRE1 (64). AP1 es una familia de factores transcripcionales que controlan principalmente la proliferación, diferenciación y apoptosis. La familia de factores transcripcionales AP1, está integrada de las subfamilias Jun y Fos. La activación de AP1 requiere de la fosforilación de JNK y p38 MAPK (69). JNK es clásicamente activado por la vía de IRE1 durante el ERE, y media la muerte por apoptosis (22). La utilización de inhibidores de p38 MAPK reduce en un 40% la actividad de la AMC frente a la privación de nutrientes (70). Recientemente se va visto que la fosforilación mediada por JNK1 de Bcl2, activa la macroautofagia inducida por privación de nutrientes (71). Sería importante evaluar inhibidores de JNK para observar si también tiene un rol en la regulación de la AMC. NF-kB es un factor transcripcional compuesto de dos subunidades p50 y p65, que regula principalmente el sistema inmune e inflamatorio (72). La retención citosólica de NF-kB requiere la acción de inhibidor IkB (72). Se ha reportado que durante un evento de estrés nutricional, este inhibidor es sustrato de la AMC, degradación que es revertida por antioxidantes (73). Se ha descrito un aumento en los niveles de Lamp2A total solo con estímulos que producen estrés oxidativo (40), pero no se ha indagado en el mecanismo que produce este aumento en la transcripción. Los factores AP1 y NF-κB, han mostrado actividad durante el estrés oxidativo (68) La Tapsigargina es un inductor de ERE que en general muestra un poco reproducibilidad en sus resultados. Una explicación para que 0,1 µM de TG no sea significativo (Figura 8), es que esta concentración no sea suficiente para inducir ERE suficiente en todas las repeticiones. Sin embargo la tendencia siempre fue a mostrar un aumento en el total de Lamp2A, lo que se hace estadísticamente concreto para la concentración de 1µM. Por otro lado es importante mostrar que el aumento total de Lamp2A se produce con otros inductores de ERE. Sin embargo, existen varias limitantes para la 47 elección de alguno de los inductores clásicos de ERE. La tunicamicina un inhibidor de la glicosilación en el RE, fue descartada debido a que Lamp2A es una proteína muy glicosilada, lo cual da cuenta de más de la mitad de la masa de Lamp2A. Lamp2A de humano tiene 16 N-glicosidaciones y otras tantas O-glicosilaciones (34). Por este mismo motivo se descarta la brefeldina A, que inhibe el tráfico desde el RE y el aparato de Golgi, en donde se producen la O-glicosidación de proteínas. Una posibilidad a estudiar, es el uso de ditiotreitol, el cual genera un estrés reductivo, en el RE que impide la formación de enlaces bisulfuro. Las inmunofluorescencias corroboran lo observado mediante western blot, en cuanto al aumento de total de Lamp2A. Sin embargo no es tan evidente la relocalización de los lisosomas hacia zonas perinucleares que se ha observado con otros estímulos de AMC (29, 35, 40). Esto puede ser una característica particular de la respuesta frente a ERE. Es importante indagar en el acercamiento entre los lisosomas y el RE, para establecer si el aumento de volumen durante del RE durante el ERE desencadena una mayor interacción entre ambos organelos, que pudiese ser importante en la activación de AMC. El aumento total en los niveles de Lamp2A se ve reflejado en una mayor presencia de este receptor en la fracción lisosomal generada por centrifugación diferencial. Estos resultados muestran que el aumento en la expresión de Lamp2A, no altera los mecanismos que destinan al receptor hacia los compartimientos lisosomales en donde es funcional. La ubicación de Lamp2A puede ser en el interior del lisosoma, formando parte de la fracción inactiva o en la membrana del lisosoma, donde a su vez puede estar multimerizado o secuestrado en los dominios lipídicos en donde es inactivo (38, 37, 25). La manera de averiguar la localización del receptor es obteniendo lisosomas puros mediante separación en gradiente de densidad, ya que la centrifugación diferencial entrega una fracción contaminada con mitocondrias. Otro de los resultados fue la ausencia de cambios en la expresión total del otro marcador y actor clave de la AMC, Hsc70. Como existe una gran cantidad de esta chaperona en la célula, posibles cambios en la expresión total podrían estar siendo enmascarados, por lo que es importante indagar a nivel de mRNA. 48 Si bien las aproximaciones utilizadas en esta tesis para evaluar AMC, solo involucran el estudio en la expresión de los marcadores, el aumento de Lamp2A y su localización en los lisosomas, es un fuerte indicio que la actividad de AMC aumenta. La actividad de la AMC se puede determinar evaluando la degradación de proteínas marcadas, en presencia de un inhibidor de la macroautofagia. Otra manera de medir la actividad es mediante ensayos de transporte de sustratos de la vía, al interior de lisosomas aislados (44). Este tipo de ensayos entregan la certeza que la vía esta activa, pero son difíciles de implementar, por lo que durante a tesis se optó por la estrategia ya descrita. 7.3. Estudio de la participación del ERE en la activación de AMC mediante la intervención de elementos de estos sistemas El bloqueo de la AMC nos permitió observar los eventos compensatorios que se activan, cuando esta vía degradativa selectiva no esta operando normalmente. Se ha descrito que se produce la activación de la macroautofagia a niveles basales en células que expresan iRNA de Lamp2A (43). Esto lo pudimos comprobar al observar un aumento en los niveles de procesamiento de LC3 a su forma lipidada LC3 II, en células Lamp2A(-) comparadas con las células control Luc(-). Además el evento de ERE en las células luc(-) provocó un aumento en el procesamiento de LC3, de acuerdo con lo que ha sido descrito (51), pero el mismo tratamiento en las células Lamp2A(-) produce un aumento de LC3 II aún mayor. Esta sobreactivación de la Macroautofagia para las células carentes de AMC, indica que la AMC se encarga de un porcentaje importante de toda la carga degradativa celular durante este evento de estrés. Además este ensayo demostró la comunicación entre estas dos vías degradativas durante el ERE, que se suma a los estresores ya descritos (42). Por otro lado durante este objetivo obtuvimos que al contrario de lo esperado, hay una mayor expresión de Chop en las células Luc(-) que en las Lamp2A(-) para las 8 h de estímulo. Como se mencionó en los resultados previos, ésto podría tener relación con el aumento en la actividad de la macroautofagia, que podría estar regulando los niveles proteicos de Chop. Es necesario seguir la cinética de expresión de Chop para observar si la carencia de AMC altera del patrón mostrado en la Figura 6. 49 Para la segunda parte de este objetivo, se trabajó con las células MEF m5-7 ATG5 (+/+), las cuales mostraron similar comportamiento que las células NIH3T3, para la inducción de la expresión de Lamp2A (Figura 16A), esto aboga a favor de que la activación de la AMC en respuesta a ERE sea un mecanismo conservado. Se ha reportado que células carentes de ATG5 y que por lo tanto no producen macroautofagia presentan una activación constitutiva de la AMC (44).Para nuestro estudio contamos con las células MEF m5-7 que poseen un sistema tet-off para la expresión de ATG5 (63), lo que permite tener a partir de una mismo tipo celular una población que es capaz de producir macroautofagia y otra que no. Gracias a esta herramienta corroboramos lo observado por Kaushik y cols (44), en cuanto a que se produce un aumento en los niveles proteicos basales de Lamp2A, en células incapaces de activar la macroautofagia, lo que se traduce en una mayor actividad de la AMC. Lo paradójico se observa cuando las células ATG5 (-/-) son sometidas a ERE, ya que el tratamiento revierte los niveles basales de Lamp2A de las células ATG5 (-/-) sin estimular, mientras que lo esperado era ver un aumento en sus niveles totales. Esto puede deberse a que alguno de los mecanismos de degradación de Lamp2A se está activando. Otra posibilidad es que la activación del proteasoma, descrito en eventos de ERE, degrade a algún factor transcripcional implicado en la regulación positiva de Lamp2A. Si esto es cierto, la inhibición del proteasoma debiera al menos llevar los niveles del receptor en las células ATG5 (-/-) estimuladas a los de las células ATG5 (-/-) sin estimular. Además podría suceder que se esté dando una disminución de los lisosomas, lo cual llevaría a una disminución de Lamp2A, lo que se puede evaluar observando la masa total de lisosomas con lisotracker. 50 8. CONCLUSIONES TG detiene el ciclo en células NIH3T3 en la etapa G1. TG aumenta la expresión de Lamp2A y en la colocalización de Lamp2A con Hsc70. Esto indica que la actividad de la AMC podría estar aumentada. El aumento en los niveles totales de Lamp2A se refleja en un aumento de su localización en los lisosomas, lo cual indica que el mecanismo de destinación de Lamp2A no se ha alterado. TG produce que el aumento en la actividad de Macroautofagia sea mayor en las células deficientes en AMC que en las células control. Lo cual indica que la ausencia de AMC es compensada con la activación de MA, durante un evento de ERE. TG provoca que células deficientes en AMC tengan niveles menores de Chop que el control estimulado. Esto muestra que las células que tienen la macroautofagia sobreactivada generan menos, o pueden resolver antes el ERE. En células Knock out para ATG5, TG revierte el aumento basal de Lamp2A. 51 Figura 17. Modelo propuesto. Se ha descrito que durante un evento de Estrés de Retículo se activan las vías proteolíticas del proteasoma y macroautofagia. También se ha observado que se detiene el ciclo celular, lo que se corroboró en nuestro análisis. El principal hallazgo de la tesis fue que la TG provoca un aumento en los niveles de Lamp2A y una redistribución de Hsc70 a los lisosomas, lo cual es el primer indicio de un aumento en la actividad de la Autofagia Mediada por Chaperonas. Además existen antecedentes que muestran la activación de factores de la familia AP1 y NF-kappaB durante el Estrés de Retículo, para los cuales existen sitios en el promotor de Lamp2A. El bloqueo de la Macroautofagia provoca un aumento constitutivo de Lamp2A y en consecuencia de la Autofagia Mediada por Chaperonas. Este aumento en Lamp2A es revertido por la TG, lo cual podría deberse a una sobreactivación del proteasoma que pudiese estar degradando algún factor que promueva la expresión de Lamp2A. El bloqueo de la Autofagia Mediada por Chaperonas produce una sobreactivación basal de la Macroautofagia y una disminución en los niveles de Chop, lo que podría indicar que Chop es degradado por la Macroautofagia. 52 9. REFERENCIAS 1. Chiti F, Dobson C. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu Rev Biochem 75:333-366, 2006. 2. Muchowsky P, Wacker J. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nat Rev Neurosci 6:11-22, 2005. 3. Albert B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the Cell, Garland Science USA 5th Edition, 2008. 4. Brodsky J. 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![[9 de Marzo] Movilización de lxs trabajadorxs afectadxs por _______________](http://s2.studylib.es/store/data/003925574_1-c5e2d989de27ee7e58820b2034b2f502-300x300.png)
