El descubrimiento de los microARNs

Capítulo
1
El descubrimiento
de los microARNs
■ Introducción
Con el reciente descubrimiento de los microARNs (miARNs), ARNs que no codifican para
proteínas, un gran número de laboratorios han centrado sus investigaciones en esta familia de ARNs
de pequeño tamaño. Los miARNs se encuentran
en los genomas de plantas, animales y virus regulando la expresión génica, a nivel post-transcripcional, mediante su unión a la región 3´ no traducida
(3´-UTR) de mARNs específicos. Dependiendo
del grado de complementariedad entre un miARN
determinado y su transcrito diana, el miARN puede desencadenar la degradación del transcrito diana
(cuando la complementariedad es casi perfecta) o a
la inhibición de la traducción de la proteína. Aunque la primera publicación sobre un miARN apareció hace más de 20 años, en los últimos años se ha
producido un incremento en el número y diversidad
de esta clase de ARNs reguladores. Actualmente se
está realizando un gran esfuerzo para determinar
cuándo, cómo y dónde se producen los miARNs y
sus funciones en las células, tejidos y organismos.
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Se piensa que cada miARN puede regular múltiples
genes y que, en eucariotas superiores, existen más
de mil genes de miARN.1 Algunos investigadores
ya han mostrado evidencias de que los miARNs
pueden actuar como reguladores de procesos biológicos tan diversos como el desarrollo embrionario,
el metabolismo graso, la secreción de insulina, la
hematopoyesis, el desarrollo del músculo, la proliferación y muerte celular, el desarrollo del cerebro
y la diferenciación y mantenimiento de las células
madre.2,3
■ La revolución de los ARNs de pequeño
tamaño
Desde el descubrimiento de la estructura en doble hélice del ADN por Watson y Crick en 1953, la
ruta estándar de flujo de información en una célula
va desde ADN a ARN y posteriormente a proteína.
La célula lee la información codificada en el ADN
de los genes y usa el ADN como molde para sintetizar una hebra de ARN en un proceso denomina-
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El papel de los microARNs en el cáncer
do “transcripción”. Este ARN mensajero, o mARN,
viaja a través de la célula hasta los ribosomas, que
son los sitios en donde se sintetizan las proteínas.
Posteriormente los ribosomas leen el mARN para
determinar qué aminoácidos deben ser secuenciados juntos en una misma proteína en un proceso
denominado “traducción”. En esta ruta estándar de
flujo de información, inicialmente el ARN es considerado como un intermediario. Se llegó a pensar
que las enzimas y otros catalizadores biológicos
eran exclusivamente proteínas. Posteriormente
llegó la primera revolución del ARN en los años
1980 con los estudios realizados por Cech en donde
descubrió la actividad enzimática del ARN.4 Este
hallazgo permitió a los investigadores postular la
“Teoría del mundo del ARN” en la cual el origen
de la vida en la tierra pudo proceder a partir del
ARN, en donde el ADN y las proteínas aparecerían
posteriormente.5
En los últimos años los descubrimientos del
ARN de interferencia (iARN) y microARN
(miARN) desencadenaron la segunda revolución del
ARN.6 El iARN interviene en un proceso de silenciamiento de la expresión génica mediante ARN de
doble cadena (dsARN, doble strand RNA).7 Desde su
descubrimiento se convirtió rápidamente en una herramienta experimental muy poderosa para descifrar
la función de los genes. Los descubrimientos de los
mecanismos del iARN no sólo clarificaron la ruta del
ARN de interferencia, en donde el mARN de los
genes que van a ser silenciados están marcados por
pequeños ARN de interferencia (siARN), sino que
también aportó conocimientos sobre otros mecanismos para silenciar genes como es el caso del bloqueo
de la transcripción por metilación de la cromatina
y la inhibición de la traducción. Un descubrimiento
clave de los mecanismos bioquímicos del iARN es
que los dsARN exógenos son convertidos a moléculas de ARN de pequeño tamaño 21-22 nucleótidos
(siARN). Los siARNs posteriormente dirigen la
escisión y degradación de dianas de mARN complementarias. En experimentos diseñados para encontrar la distribución de los siARNs generados a partir
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de los dsARN, los científicos se sorprendieron cuando encontraron ARNs de pequeño tamaño codificados de forma endógena, incluido el let-7, el segundo
miembro de la familia de miARN descubierto en el
año 2000. Posteriormente, y gracias al gran esfuerzo
para la clonación de este tipo de ARNs, se consiguió
mostrar la gran variedad de miARNs existentes en
metazoos.8-10 Actualmente se sabe que la regulación
de la expresión génica por los miARNs es un fenómeno natural y muy extenso, pues en genomas de
más de 38 especies regulan rutas genéticas complejas.
A continuación, en el siguiente apartado, se describe una breve historia sobre el descubrimiento de los
miARNs.
■ Historia
miARNs
del descubrimiento de los
El descubrimiento de los miARNs surgió en
los años setenta de la estrecha colaboración entre
científicos, en concreto los tres científicos que descubrieron el primer miARN (lin-4) en C. elegans
fueron Lee, Feinbaum y Ambros.11-14 En un principio estos autores estaban interesados en un mutante
de lombriz lin-4 descubierto en el laboratorio de
Brenner en Sydney en los años setenta. Por aquel
entonces no se cuestionaban la posible existencia de
ARNs no codificantes o la regulación antisentido.
La clonación de lin-4 comenzó durante el verano
de 1988 y el grupo de Ambros fue capaz de clonar
un fragmento de 700 pb. Estos científicos secuenciaron una y otra vez el fragmento varias veces pero
no consiguieron encontrar una ORF (Open Reading
Frame) o pauta abierta de lectura en todo el fragmento. A pesar de los experimentos realizados con
este fragmento no fueron capaces de eliminar su
función. Fue entonces cuando se dieron cuenta de
que lin-4 no podía codificar para ninguna proteína,
pues ellos no se esperaban que pudiese transcribirse
a un transcrito de tan sólo 22 pb. En este sentido
estos autores no prestaron demasiada atención a la
señal que aparecía en el fondo de los geles en sus
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ensayos de protección de la RNasa. A pesar de que
ellos comprobaron que no codificaba para ninguna
proteína, sí comprobaron que lin-4 era esencial para
la sincronización del desarrollo posembrionario de
los gusanos. Este descubrimiento fue muy sorprendente, ya que se sabía que la regulación génica en
eucariotas era llevada a cabo por proteínas y no por
moléculas de ARN. Fue en mayo de 1992 cuando finalmente los ensayos de protección de RNasa
confirmaron que el mayor producto génico de lin-4
constaba de 22 pb.
Al mismo tiempo el grupo de Ruvkun mapeó
la mutación lin-14 en su región no traducida 3´ o
UTR (untranslated region). Después de que ellos
se intercambiasen las secuencias de lin-4 y lin-14,
Ambros y Ruvkun reconocieron simultáneamente
la complementariedad antisentido de lin-4 y lin-14;
pues existen múltiples sitios en la región no traducida 3´ de lin-14 que son complementarios a lin-4.
Los resultados de este descubrimiento fueron publicados en 1993.13, 15
El segundo miARN, let-7 (LETha1), implicado
también en el desarrollo de C. elegans fue descubierto en el año 2000.16, 17 Sin embargo, la búsqueda
de homología usando la secuencia de let-7 contra
todas las secuencias genómicas de D. melanogaster y humanas que por aquel entonces se estaban
descubriendo, reveló que let-7 está conservado.18
De hecho, se vio que let-7 está filogenéticamente
conservado en muchas especies, incluidos los metazoos.19 Además, la diana de let-7, denominada
lin-41, también está filogenéticamente conservada
entre las especies.19, 20 Esto provocó un inicio masivo
en la búsqueda e identificación de microARNs en
otras especies animales. El descubrimiento de let-7
coincidió con una etapa en la que los estudios mecanísticos y genéticos empezaban a revelar no sólo
los mecanismos del ARN de interferencia, sino
también la relación entre ambas rutas. Estos descubrimientos permitieron la creación de un nuevo
campo de investigación en biología, la regulación
génica mediante ARNs no codificantes de pequeño tamaño.21 La identificación de las características
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■ estructurales de los miARNs inició el desarrollo de
estrategias de clonaje más eficientes que concluyeron con el aislamiento de docenas de miARNs a
partir de diferentes especies eucariotas. En el año
2000 ya se empieza a tener un mayor conocimiento
sobre las generalidades de los miARNs y en el año
2001, tres grupos de investigación clonaron cientos
de miARNs del nemátodo C. elegans.8-10 Mientras
tanto, muchos proyectos genómicos se fueron completando y los genomas clonados sirvieron como
plataformas para predecir los miARNs basándose
en sus propias características.22 Este hecho supuso
un incremento significativo en el número de genes
de miARNs. Actualmente existen un gran número
de laboratorios que realizan actividades relacionadas con la investigación de los miARNs, las cuales a menudo proporcionan nuevos e importantes
descubrimientos que son publicados simultáneamente. Hasta ahora, los estudios realizados con C.
elegans indican que los miARNs desempeñan un
papel importante en el desarrollo celular. En este
sentido, los animales que portan mutaciones tanto en
el miARN lin-4 como en el let-7, muestran cuerpos
anormales. Otros estudios revelaron que los miARNs
son importantes para asegurar la expresión asimétrica
de un receptor del gusto en C. elegans. 23, 24 Además, la
alteración de miARNs específicos provoca defectos
mayores tales como una inapropiada proliferación
celular y diferenciación tisular, de gran importancia
para el desarrollo del animal.25 Así, estos estudios
indican que la alteración de las funciones de los
miARN conduce a una diferenciación y proliferación celular inadecuadas, constituyendo una marca
o señal para el desarrollo tumoral. Recientemente
se descubrió que dentro de las funciones de los
miARN se incluyen el control de la proliferación
celular, muerte celular, y metabolismo graso en
moscas; desarrollo neuronal en nemátodos; modulan la diferenciación del linaje hematopoyético en
mamíferos26; y controlan el desarrollo de las hojas y
las flores en plantas.27-29
Una vez demostrada la implicación de lin-4 y
let-7 en la regulación de la sincronización de las eta-
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pas de desarrollo larvario en C. elegans, estos ARNs
minúsculos se empezaron a denominar ARNs temporales pequeños (stRNAs, small temporal RNAs).
Posteriormente, con el descubrimiento de nuevos
miARNs implicados en otros muchos procesos, se
empezó a emplear un término más general para este
tipo de ARNs de pequeño tamaño, microARN o
miARN.
La ineficiencia obtenida en la búsqueda de genes de miARN mediante métodos genéticos puede
ser justificada por varios motivos. En primer lugar
debido al pequeño tamaño de los miARNs y a su
capacidad de tolerancia a las mutaciones (pues éstas no le afectaban) hizo que los genes de miARNs
fuesen difíciles de mutar mediante mutagénesis inducida o espontánea. Incluso si un miARN es mutado, los investigadores pueden incluso perderlo, ya
que todos los esfuerzos realizados para el mapeo de
una mutación se centran en las regiones codificadoras de proteínas. Por último, muchos mutantes de
miARN no pueden ser reconocidos en la búsqueda
de fenotipos asociados a esa mutación debido a la
gran redundancia de un mismo fenotipo asociado a
diferentes mutantes de miARN.30
■ Definición clásica de un miARN
Desde su descubrimiento los miARNs fueron
definidos como ARNs no codificantes que cumplían los siguientes criterios de expresión y biogénesis.31 En primer lugar, un miARN maduro debía
ser expresado como un tránscrito de aproximadamente 22 pb que fuese detectable por análisis de
ARN (Northern blot) o por otros métodos experimentales tales como la clonación a partir de librerías de ARN de pequeño tamaño. En segundo
lugar, los miARNs maduros debían originarse a
partir de precursores con una estructura secundaria
característica. En tercer lugar, los miARNs maduros debían ser procesados a través de la ruta Dicer,
ya que se comprobó que en los mutantes deficientes
de la ruta Dicer se producía una acumulación del
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precursor. Otro criterio ampliamente utilizado es
que la secuencia del miARN maduro y la estructura secundaria, en forma de horquilla, estimada para
cada miARN debía estar conservada en diferentes
especies. Un miARN, para ser considerado como
tal, debía reunir todos estos criterios. En la práctica
existen posibles variaciones, pero para que una secuencia sea clasificada como un miARN es necesario que se exprese, aunque sea a muy bajos niveles, y
que sea originada a partir de un precursor en forma
de horquilla.
Todas las aproximaciones para el descubrimiento de miARNs están basadas: a) en métodos
experimentales, primero se establece la expresión
de los ARNs de pequeño tamaño y, posteriormente, se utiliza la bioinformática para identificar
ARNs que reúnen los requisitos estructurales; b)
en aproximaciones bioinformáticas, primero se
predicen los posibles genes de miARN de todas
las secuencias del genoma y, posteriormente, se
emplean técnicas experimentales para validar estas
predicciones y demostrar la expresión de las secuencias correspondientes.32
En la literatura, los miARNs con frecuencia se
definen como moléculas de ARN de aproximadamente 18-24 nucleótidos que se originan a partir de
largos precursores y pueden regular la expresión de
los genes. Esta definición biológica implica que los
miARNs deberían tener una función demostrada.
Sin embargo, sólo se conoce la función biológica de
unos pocos miARNs, y el criterio establecido para la
clasificación de los miARNs31 no incluye el requisito de que un ARN pequeño tenga que tener una
función demostrada para ser considerado como un
miARN. No obstante, se propuso la conservación
filogenética (una indicación indirecta de una posible función) como una evidencia que le permita ser
considerado como un miARN. Por tanto, el término
“miARN candidato” debería emplearse cuando no se
conozca la función del miARN. Esto puede que no
sea práctico, pues una vez que se obtengan evidencias
sobre su expresión y biogénesis el término “candidato” puede ser suprimido sin que se le haya asignado
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El descubrimiento de los microARNs
una función específica a ese gen. La terminología
“miARN candidato” será empleada correctamente
cuando el único criterio conocido sea la expresión de
ese gen mediante la secuenciación de un único clon y
la presencia de una horquilla no conservada.
Dejando a un lado la función de los miARNs, el
objetivo principal de todos los expertos en biología
molecular consiste en el establecimiento de un sistema uniforme para la consideración de los miARNs
y prevenir clasificaciones erróneas de otros tipos de
ARNs de pequeño tamaño como miARNs. Hasta
día de hoy esta clasificación se está realizando correctamente, pero dada la gran cantidad de datos
que actualmente se están generando en el campo de
los ARN de pequeño tamaño, es posible que en el
futuro sea necesario establecer otro sistema de clasificación o modificar el ya existente.
Una de las preguntas que más les inquieta a los
científicos es saber qué evidencia debe ser considerada para poder generar una definición de miARN
que sea precisa y ampliamente aplicable. Conociendo las funciones de los miARNs es de esperar
que un miARN real regule un mARN diana. En
este sentido no se quieren excluir de la definición
a aquellos miARNs que activan un mARN diana,
tampoco a aquellos que se unan a su mARN diana
pero que no afecten su expresión. Estudios recientes
muestran que las señales externas pueden funcionar
liberando al mARN de su unión al miARN.33, 34 De
este modo, un miARN puede afectar a la expresión
de una diana sólo bajo condiciones in vivo específicas y/o en algunos tejidos o líneas celulares, pero
puede que los efectos reguladores no sean observados bajo las condiciones experimentales empleadas.
El criterio de que un miARN necesita, para ser
considerado como tal, interaccionar con una diana es
muy probable que no sea apropiado, pues se sabe que
diferentes copias de un mismo mARN en la misma
célula pueden estar ocupados por un conjunto diferente de miARNs.35-37 Sin embargo, el criterio más
apropiado posiblemente sea el de que un miARN
tenga que ser procesado mediante la ruta Dicer. Se
sabe que existen otros ARNs reguladores de pequeño
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■ tamaño pero que son procesados por otras nucleasas,
es por ello por lo que no son incluidos en la definición de miARNs. De hecho, este criterio es preciso y
se corresponde con la definición biológica intuitiva,
aunque la ruta Dicer pueda convertirse en un miembro de la familia de las rutas de ARN de pequeño
tamaño en cuyo caso este criterio definido tendría
que ser reconsiderado. Demostrar que un ARN de
pequeño tamaño se procesa en la ruta Dicer 38-40 o el
hecho de que un miARN sea entregado al complejo
proteico RISC (RNA-induced silencing complex) puede ser otra característica general de los miARNs, que
pueda ser utilizada para su discriminación.
En el futuro las nuevas tecnologías, como por
ejemplo la secuenciación masiva, permitirán el
descubrimiento de un mayor número de ARNs de
pequeño tamaño que se expresen y que, sin lugar a
dudas, muchos de ellos resultarán ser identificados
como candidatos de miARNs. El criterio más aceptado a día de hoy para una clasificación de miARNs
auténtica se sigue basando en la propia definición
de miARN, aunque cada vez es más obvio que muchos de los criterios seleccionados presentan limitaciones. Sin embargo, es prematuro y casi imposible proponer un conjunto absoluto de criterios que
sean aplicables a todos los sistemas. Para avanzar
en el conocimiento de los miARNs y para poder
proporcionar una estimación real del número total
de miARNs codificados por el genoma humano o
cualquier otro genoma de mamíferos, es imprescindible realizar ensayos de validación que establezcan
la funcionalidad de cada uno de ellos.
■ Identificación de miARNs
El primer paso que debería de darse para poder
entender los miARNs y sus funciones consistiría en
el aislamiento e identificación de los miARNs expresados en las células y organismos de interés. Hasta día
de hoy se vinieron empleando cuatro aproximaciones
para aislar y predecir miARNs. Además del primer
miARN, lin-4, investigaciones genéticas posteriores
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El papel de los microARNs en el cáncer
han identificado dos miARNs a mayores (let-7 y
lsy-6) en Caenorhabditis elegans16, 41 y dos miARNs
(Bantam y miR-14) en Drosophila.42, 43 La clonación
de cADN y el posterior análisis de la secuencia han
permitido la identificación de más de un ciento de
miARNs en una gran diversidad de especies, desde
nemátodos hasta mamíferos.44 Se desarrollaron un
gran número de algoritmos informáticos que permiten predecir miARNs a partir del genoma. Estas
aproximaciones bioinformáticas rápidamente estimaron la existencia de 2000 miARNs, incluyendo
100-300 miARNs en C. elegans, 96-124 miARNs
en Drosophila, y más de 1000 en humanos.45, 46 Los
análisis mediante Northern blot y microarray se emplean con frecuencia para ensayar la expresión de
ciertos miARNs en células específicas o tejidos. En
este sentido, la creación de un organismo mutante
puede ser la forma óptima de determinar la función
normal de una molécula de miARN. Sin embargo,
el análisis de mutantes no es aplicable en un gran
número de mamíferos. Además, la sobreexpresión
o la interacción de miARNs en células cultivadas
también pueden proporcionar información acerca
de la función de los miARNs.
En humanos aproximadamente el 50% de los
miARNs ya han sido confirmados y se ha demostrado que están localizados en la región intrónica del
gen huésped, supuestamente transcrito con el gen
huésped a partir del mismo promotor.47 Además, la
mayoría de los miARNs en Drosophila y humanos
están agrupados en los genomas y son coexpresados.48,49 Los miARNs también están conservados
en especies cercanas, como en ratón y humanos.50
Además, con frecuencia los miARNs están localizados en sitios frágiles del genoma, indicando su
implicación en el desarrollo de enfermedades.51
■ Identificación de miARNs en librerías
de ARN de pequeño tamaño
La aproximación utilizada para la identificación
de miARNs de novo es el empleo de librerías de
Micro ARNs.indd 6
cADN de pequeño tamaño. Inicialmente se ideó un
protocolo para la clonación de moléculas de ARN
de interferencia de pequeño tamaño,52 aproximadamente 22 pb, que resultó ser útil para identificar
ARNs de pequeño tamaño endógenos, muchos de
los cuales resultaron ser miARNs. Independientemente se produjeron variaciones de este protocolo
aunque todas ellas siguen el mismo principio53 (Figura 1-1): una muestra de ARN se separa en un gel
de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes
y se recupera la fracción de un tamaño de entre
20-25 pb. A continuación, los adaptadores 3´y 5´
se unen a los ARNs, se realiza una RT-PCR y los
fragmentos resultantes se clonan en vectores para
crear una librería de cADN. Los clones individuales
posteriormente se secuencian y se analizan para determinar el origen genómico del ARN de pequeño
tamaño.
Para la síntesis de la primera hebra, el adaptador
3´necesita unirse al miARN maduro para introducir
un sitio al cual se pueda unir el cebador empleado
mediante transcriptasa reversa. Para prevenir la recircularización de los miARNs maduros y el adaptador, generalmente se desfosforilan los ARNs de
pequeño tamaño antes del ligamiento y el terminalhidroxil 3´del adaptador 3´ se bloquea por incorporación de un grupo no nucleótido durante la síntesis
química del oligonucleótido.54 En otras variaciones
del protocolo, el adaptador 3´ es preadenilado, eliminando por tanto la necesidad de desfosforilar el
ARN de pequeño tamaño.9, 55 De forma alternativa,
la unión del adaptador 3´ puede ser sustituido si se
le añade una cola poli(A) a los ARNs de pequeño
tamaño usando una polimerasa poli(A).56 En este
caso es imprescindible emplear oligo(dT) como cebador para la transcripción reversa.
Antes de la reacción de transcripción reversa,
el adaptador 5´ se liga al producto del ligamiento
del adaptador 3´purificado en gel y, si es necesario,
fosforilado. El ligamiento del adaptador 5´puede
ser omitido en aquellos protocolos que utilicen
para la clonación del cADN la tecnología SMART
(Clontech).10
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2
unión adaptador 3´
AR
N
2b
2c
iad
pol
eni
lad
o
O-L3´
ATP
Poly(A)polimerasa
App
Figura 1-1 Protocolo general empleado para la clonación de miARNs.32
fracción de 12-25nt
OH 3´
O-L3´
O-L3´
no ATP
T4 ligasa
s´p
5p
do
s´p
5´ HO
rila
1
o
adaptador 3´
Preadenilado
Nd
AR
fo
Fos
ARN
Total
Fraccionamiento
de tamaño
lad
fori
esfo
s
OH 3´
unión
adaptador 5´
3
to
3a
T4 ligasa, ATP
OH 3´
Transcriptasa
Reversa
GGG
adaptador 5´
3b
mien
Liga
Micro ARNs.indd 7
2a
5´ HO
CCC
Secuenciación
Transcripción
Reversa
GGG
CCC
Secuenciación
directa de una
única molécula
4
Amplificación
PCR
cADN
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■ Mol
de
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■
El papel de los microARNs en el cáncer
Finalmente, los cADNs amplificados por PCR
se clonan en vectores para incrementar la longitud
de la secuencia informativa obtenida a partir de
cada clon secuenciado.8, 9, 54 El análisis en serie de
la expresión génica (SAGE, Serial Analysis of Gene
Expression) se empleó para incrementar el número
medio de tags (pequeña secuencia nucleotídica de
un transcrito) de ARNs de pequeño tamaño por
clon desde 5 a 35, incrementando por tanto el rendimiento y reduciendo los costes de la secuenciación de las librerías de ARN de pequeño tamaño.57
Existen nuevas aproximaciones que están reemplazando a las técnicas de secuenciación convencionales.58 Lu et al.59 aplicaron la secuenciación masiva
para analizar los ARNs de pequeño tamaño del
transcriptoma de Arabidopsis thaliana, permitiéndoles la secuenciación de miles de estos pequeños
tags (de aproximadamente 17 pb) por reacción. Una
tecnología alternativa emergente puede producir
la lectura del mismo número de tags pero con una
mayor longitud (100-150 pb) en un único análisis.60
Las limitaciones más importantes de este protocolo
son la dificultad de encontrar miARNs que estén
expresados a muy bajos niveles, en etapas muy específicas o en tipos celulares raros y la imposibilidad
de clonar miARNs debido a sus propiedades físicas, composición de la secuencia o a modificaciones
postranscripcionales, tales como la metilación.61-63
Por último, se debe prestar especial atención para
distinguir los miARNs de otros tipos de ARN de
pequeño tamaño endógenos 53, 64 y de productos de
degradación de mARNs o ARNs estructurales.
■ Predicción bioinformática de genes de
miARN
Tras los grandes esfuerzos realizados para clonar
secuencias genómicas, el paso siguiente consiste en
la predicción bioinformática de genes de miARN.
En un principio existe mucha información disponible sobre las propiedades de los miARNs como
para poder reconocer un conjunto de caracterís-
Micro ARNs.indd 8
ticas distintivas de miARNs.65,66 Se desarrollaron
numerosas aproximaciones para la predicción de
miARNs que pueden ser catalogadas en base a: la
estructura secundaria, la conservación filogenética,
la estabilidad termodinámica de las horquillas, la similitud entre estructura y secuencia, e información
sobre la localización genómica en relación con los
miARNs conocidos.
Los primeros métodos de predicción de miARN
se basan en el criterio de conservación. El software
MirScan identificó y alineó horquillas conservadas
en base a su similitud con miARNs, confirmados
experimentalmente, y estimó 35 nuevos candidatos de miARN en C. elegans 67 y 107 en humanos,68
muchos de los cuales fueron confirmados experimentalmente. Posteriormente las predicciones en
C. elegans se mejoraron por la incorporación en
el algoritmo de la conservación de un motivo característico en el extremo 5´ de las estructuras en
forma de horquilla.69 Otro software basado en la
conservación, Snarloop, se empleó para estimar 214
candidatos de miARN en C. elegans70 y ha proporcionado las bases para estimar entre 140 y 300, o
más, genes de miARN en el genoma de C. elegans.
En D. melanogaster se estimaron 48 candidatos de
miARN por medio del software miRSeeker,71 que
no usa sólo la conservación sino que también reconoce los patrones de conservación específicos del
miARN. Una aproximación similar, basada en los
patrones de conservación de los miARNs ya conocidos, fue utilizada para estimar más de 800 nuevos
candidatos de miARN que están conservados entre
humanos y roedores.72
Xie et al.77 analizaron motivos conservados y
altamente representados en las regiones 3´UTRs
(Untranslated Regions) de genes y encontraron que
algunos de ellos se correspondieron con secuencias
seed de miARNs conocidos. La secuencia seed está
formada por siete u ocho nucleótidos del miARN
maduro, empezando por el primer o segundo nucleótido, y es la más importante para la interacción
entre el miARN y su diana.73-76, 35-37 Usando motivos
que no emparejaron con miARNs conocidos, Xie et
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El descubrimiento de los microARNs
al.77 estimaron 129 nuevos candidatos de miARN
en humanos. Posteriormente se aplicaron aproximaciones similares para la predicción de miARNs
en A. thaliana,78 moscas y gusanos.79
Con respecto a la estabilidad termodinámica de
las estructuras secundarias, Bonnet et al.80 demostraron que los miARNs, a diferencia de los tARNs
y rARNs, tienen energías libres de plegamiento que
son significativamente inferiores. El software RNAz
combina la estabilidad termodinámica y la conservación de la estructura secundaria para predecir
ARNs no codificantes.81, 82 Este programa informático fue utilizado con éxito para estimar miARNs
en varios organismos.83-85
Recientemente se desarrollaron varios métodos
basados en alineamientos, para identificar homólogos de miARNs ya conocidos.86-88 En concreto, lo
que buscan son secuencias genómicas que puedan
ser alineadas con miARNs originales, tanto a nivel
estructural como a nivel de secuencia. De esta forma no sólo se pueden identificar homólogos cercanos sino también homólogos distantes.87
Los métodos que se basan en la conservación
filogenética de la estructura y la secuencia de un
miARN no pueden predecir genes no conservados. Para solventar este problema, varios grupos
de investigación han desarrollado aproximaciones
para la predicción de miARNs 89-91 que usan sólo
características estructurales intrínsecas de miARNs y no información externa. Cada uno de estos
métodos construye una serie de clasificadores que
pueden medir cómo un candidato de miARN es
similar a los miARNs conocidos en base a varias
características. Por ejemplo, Sewer et al.90 distinguieron 40 características, entre ellas la energía libre
de plegamiento. Una vez que se define el conjunto
de características, se emplea un método informático denominado support vector machine que se utiliza
para construir un modelo basado en conjuntos de
formación negativos y positivos. Con este método
predictivo se descubrieron y confirmaron experimentalmente muchos miARNs no conservados en
virus55 y humanos.89
Micro ARNs.indd 9
■ Una forma muy útil de descubrir miARNs es
explorando secuencias genómicas que rodean a los
miARNs ya conocidos, ya que muchos miARNs
están agrupados o localizados muy cerca unos de
otros.9 Numerosos miARNs de humanos y ratones han sido identificados de este modo92, 93 y todo
parece indicar que serán descubiertos muchos más
empleando esta aproximación.90
■ Validación
candidatos
experimental de los miARNs
Los candidatos de miARNs que se estiman
mediante métodos bioinfomáticos necesitan ser
validados experimentalmente. En principio, un
miARN se puede considerar que ha sido validado cuando se demuestra la expresión de su forma
madura de aproximadamente 22 pb. Las aproximaciones de validación pueden ser divididas en
dos categorías: aquellas que determinan los extremos exactos del ARN maduro, y aquellas que
demuestran la expresión pero no identifica los
extremos exactos (Figura 1-2). El establecimiento
de los extremos del miARN maduro, especialmente el extremo 5´, es esencial para aplicaciones
posteriores como, por ejemplo, la predicción de
las dianas de miARN. Por esta razón, las aproximaciones de validación basadas en la clonación
y secuenciación de pequeño tamaño son las más
informativas.
La combinación de la clonación al azar a partir de librerías de ARN de pequeño tamaño y la
predicción de miARN es una aproximación que
simplifica el análisis de las secuencias clonadas.53
Las aproximaciones por clonación directa basadas
en la PCR facilitan la amplificación de clones de
cADN específicos a partir de una librería de ARN
de pequeño tamaño.67, 68 En otro método de clonación directa se emplean oligonucleótidos biotinilados con los miARNs estimados, con el fin de
producir un enriquecimiento de cADNs específicos antes de la construcción de la librería.89
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10 ■ El papel de los microARNs en el cáncer
Muestra
ARN
Clonación directa
basada en PCR
PCR
Secuenciación
da
son
eño fica
Dis specí
e
Diseño
sonda
1
2
ión l
Muestra
ARN
ibrer
ía
Secuenciación
3
B
Comparación con las
predicciones de
candidatos de miARN
1
trucc
Candidato
miARN
er
prim co
o
ñ
fi
e í
Dis espec
2
Selección
Selección
al azar
al azar
Cons
A
Construcción
librería
Librería
Enriquecimiento
de ARN específico
Hibridación in situ
Microarrays
RAKE
Primer Extension
Análisis ARN blot
Extensión
Hibridar
Muestra
ARN
Figura 1-2 Validación experimental de los candidatos de miARN estimados mediante métodos bioinformáticos. Empleo de estrategias basadas en la clonación (A) y en métodos de hibridación (B).32
Para demostrar la expresión de los miARNs
estimados se pueden emplear diferentes métodos
basados en la hibridación. El análisis del ARN
mediante Northern blot es una técnica robusta que
puede proporcionar información no sólo del tamaño sino también de la expresión de los miARNs
estimados. También es frecuente su uso para confirmar la expresión de miARNs clonados a partir
de librerías de cADN de pequeño tamaño.8-10 Las
desventajas de la hibridación del ARN son su bajo
rendimiento y su limitada sensibilidad para la detección de miARNs raros.
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Otro método basado en la hibridación es el
primer extension. En esta aproximación, un cebador,
que es varios nucleótidos más corto que el miARN
estimado, es hibridado con la muestra de ARN y
gracias a la enzima transcriptasa reversa es posible
sintetizar una hebra complementaria al ARN molde. Posteriormente, la electroforesis en gel se emplea para detectar los productos sintetizados.92 Sólo
el extremo 5´ de un miARN puede ser identificado
de esta manera. En el ensayo RAKE (RNA-primed
array-based Klenow extension) se emplea una versión
inversa de esta aproximación, en la cual los miARNs
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El descubrimiento de los microARNs ■ 11
son hibridados con sondas en un microarray y son
utilizados por la enzima Klenow como cebadores en
una reacción de extensión.94 Originalmente, RAKE
fue desarrollado para estudiar perfiles de expresión
de miARNs conocidos, pero puede ser adaptado
para mapear los extremos 3´de los miARNs estimados con un alto rendimiento.
Finalmente, los métodos de hibridación in situ
para la detección de miARN que se desarrollaron
recientemente pueden ser utilizados para determinar patrones de expresión espacio-temporales de
los miARNs candidatos. La hibridación in situ no
proporciona información sobre el tamaño o los extremos de los miARNs detectados, y es por ello por
lo que presenta ciertas limitaciones para validar los
miARNs estimados.
■ Estructura de los genes de miARN y sus
localizaciones en el genoma
Empleando las últimas bases de datos de unidades de transcripción y secuenciación se pudo identificar la posición genómica de los genes de miARN
en humanos y ratones.47 De entre los 232 miARNs
conocidos de mamíferos se observó que más del
70% están localizados en unidades de transcripción definidas, pudiendo ser categorizados en tres
grupos:95, 47
1. miARNs exónicos en transcritos no codificantes, por ejemplo miR-21, miR-155 y el
grupo miR-23a-27a-24-2.
2. miARNs intrónicos en transcritos no codificantes, por ejemplo el grupo miR-15a-16-1
en el ARN no codificante del gen DLEU2.
De los 232 miARNs estudiados, 27 miARNs se encuentran dentro de esta categoría.
3. miARNs intrónicos en transcritos que codifican para proteínas, por ejemplo, miR-26b
y el grupo miR-106b-93-25. De los 2.323
miARNs estudiados, 90 miARNs pertenecen a esta categoría.
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Además, se determinó que un pequeño número de miARNs humanos se encuentran en el
extremo 3´ UTR de mARNs codificantes.96 En
mamíferos también existe un subconjunto de
miARNs convencionales que derivan de repeticiones genómicas.97, 98 Otra característica de los
miARNs es que aproximadamente el 50% de los
miARNs conocidos están agrupados y se encuentran cerca de otros miARNs.8-10 Estas diferencias
estructurales tienen profundas implicaciones para
sus regulaciones y biogénesis. Por ejemplo, el grupo de miARNs que son transcritos a partir de una
única unidad de transcripción policistrónica y los
miARNs intrónicos poseen diferentes mecanismos de biogénesis.99
■ Aplicaciones
del
ARN
de interferencia
El descubrimiento del silenciamiento génico
inducido por ARNs de pequeño tamaño, como
por ejemplo miARN y siARN, han revolucionado
los estudios de genética funcional en el campo de
investigación básica, así como las aproximaciones
de terapia génica en el campo de la medicina. Una
vez concluidos los proyectos de secuenciación del
genoma humano y del ratón, existe una gran necesidad de revelar las funciones de tal cantidad de
genes que intervienen en el desarrollo embrionario
de mamíferos. Sin embargo, los métodos de manipulación génica tradicionales suponen una labor
intensa que no sólo llevarían mucho tiempo sino
que también llevarían asociados un alto coste. La
inactivación génica usando ARNs de pequeño tamaño son aproximaciones simples, eficientes, y de
bajo coste. Dependiendo del diseño experimental,
el ARN de interferencia (iARN) basado en siARN
es capaz de reducir la expresión de genes individuales o de múltiples genes simultáneamente o consecutivamente en todo el animal y a nivel celular. Por
lo tanto, los iARNs proporcionan una herramienta
genómica funcional para estudiar las funciones génicas en mamíferos.
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12 ■ El papel de los microARNs en el cáncer
Existen dos tipos de siARNs para inactivar la
expresión génica en mamíferos. Los siARNs producidos in vitro que son introducidos de forma exógena en los animales y los siARNs que son producidos
de forma endógena a partir de un ADN molde que
expresa ARNs de horquilla corta (shARNs, short
hairpin ARN). En condiciones in vitro los siARN
pueden ser sintetizados de forma química y transcritos a partir de un ADN molde o a partir de un
largo dsARN mediante una enzima perteneciente
a la familia de la RNase III. Además, los siARN
pueden ser expresados dentro de las células a partir
de un casete de expresión de siARN procedente de
PCR o un plásmido de expresión de siARN o un
vector viral. La efectividad de estos métodos depende en gran parte de la elección de los genes, el sistema experimental utilizado, y la duración deseada
de la inactivación.
Diferentes autores100 inyectaron siARNs producidos por digestión con endoribonucleasa en el
lumen del tubo neural a un embrión de ratón de 10
días, y usaron electroporación directa para repartir
los siARNs en las células neuroepiteliales. Estos
autores demostraron que la población mixta de
siARNs diseñados frente a la proteína fluorescente
verde (GFP, green fluorescent protein) redujo eficientemente la expresión de GFP exógena así como la
endógena. La electroporación también puede ser
empleada para introducir dsARN en blastocistos
intactos para obtener una supresión génica sistémica.101 Estos estudios sugieren que la electroporación
basada en dsARN es una herramienta muy útil para
estudiar la función génica a nivel del embrión. Sorensen et al.102 emplearon la inyección intravenosa
basada en liposomas catiónicos para inactivar la expresión génica endógena en ratones adultos.
Numerosos grupos de investigación han estudiado el efecto de la inactivación génica mediante transfección de células con siARN de síntesis
química o plásmidos que expresaban siARN, en la
diferenciación de células madre embrionarias,103-105
células madre mesenquimales adultas,106-109 músculo,110-114 condrocitos,115-118 osteoblastos,119-120 adi-
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pocitos,121-122 células endoteliales,123-125 así como en
neuronas.126 Aunque la inactivación es transitoria y
generalmente realizada fuera del contexto fisiológico, estos estudios proporcionan un conocimiento
de primera mano sobre la función individual de los
genes en un ambiente de cultivo in vitro. Las librerías de siARN también pueden ser empleadas
para estudiar la función de múltiples genes simultáneamente, proporcionando los medios necesarios
para revelar las funciones interactivas de las rutas de
señalización.127
Los siARN también son de gran utilidad en
aproximaciones terapéuticas para la prevención de
enfermedades y para el tratamiento de las mismas.
En este sentido se demostró una reducción del
mARN de la apolipoproteína B (ApoB) mediante la liberación sistémica de siARN específicos de
ApoB empleando liposomas en monos.128 Este sistema produjo un descenso en los niveles de ApoB
en plasma.
Aunque la tecnología de los siARNs representa
una nueva estrategia con múltiples aplicaciones clínicas destinadas a disminuir el número de enfermedades, es obvio que se precisa de una investigación
mucho más detallada de los problemas obtenidos
tras su aplicación con el fin de alcanzar resultados
satisfactorios desde el punto de vista clínico.129
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