sistemas de analisis de la actividad de la neurotrofina.

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : C12N 15/12
11 Número de publicación:
2 170 056
7
51
ESPAÑA
C07K 14/00
C12N 5/10
G01N 33/68
A01K 67/027
A61K 38/00
k
12
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
kNúmero de solicitud europea: 92912036.8
kFecha de presentación: 23.04.1992
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 589 961
kFecha de publicación de la solicitud: 06.04.1994
T3
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87
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k
54 Tı́tulo: Sistemas de análisis de la actividad de la neurotrofina.
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30 Prioridad: 23.04.1991 US 690199
26.07.1991 US 736559
REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
777 Old Saw Mill River Road
Tarrytown, NY 10591-6707, US
k
72 Inventor/es: Squinto, Stephen P.;
k
74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.08.2002
ES 2 170 056 T3
k
73 Titular/es:
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
01.08.2002
Aviso:
k
Glass, David;
Aldrich, Thomas H.;
Distephano, Peter;
Stitt, Trevor;
Furth, Mark E.;
Yancopoulos, George D.;
Maisonpierre, Peter C.;
Masiakowski, Piotr y
Ip, Nancy
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 170 056 T3
DESCRIPCION
Sistemas de análisis de la actividad de la neurotrofina.
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La presente invención se refiere a la clonación de un nuevo receptor de tirosina quinasa.
El desarrollo y mantenimiento del sistema nervioso de los vertebrados depende de proteı́nas especı́ficas,
denominadas factores neurotróficos, que originalmente se definieron por su capacidad de mantener la supervivencia de las poblaciones neuronales (Snider and Johnson, 1989, Ann. Neurol. 26:489). Los factores
neurotróficos también han sido implicados en procesos que participan en la proliferación y diferenciación
de neuronas (Cattaneo and MacKay, 1990, Nature 347: 762-765; Lindsay and Harmar, 1989, Nature
337:362-364), y pueden jugar papeles adicionales, hasta el momento no explorados, tanto dentro, como
fuera, del sistema nervioso. Recientemente se han clonado molecularmente el factor neurotrófico derivado
de cerebro (BDNF) y la neurotrofina-3 (NT-3), y se ha visto que están estructuralmente relacionados con
la molécula de supervivencia neuronal prototı́pica, el factor de crecimiento nervioso (NGF; Leibrock et
al., 1989, Nature 341: 149-152; Hohn et al., 1990, Nature 344:339-341; Maisonpierre et al., 1990a, Science
247:1446-1451; Rosenthal et al., 1990, Neuron 4: 767-773; Ernfors et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 87:5454-5458; Jones and Reichardt, 1990, Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 87:8060-8064). Estos tres
factores relacionados (denominados “neurotrofinas”) no presentan ninguna homologı́a estructural con un
cuarto factor neurotrófico, el factor neurotrófico ciliar (CNTF; Lin et al., 1989, Science 246:1023-1025;
Stockli et al., 1989, Nature 342:920-923).
El receptor y las rutas de transducción de señal utilizadas por el NGF han sido ampliamente estudiadas, en gran parte debido a la disponibilidad de una lı́nea de células de feocromocitoma (PC12), la
cual se diferencia en respuesta al NGF (Greene and Tischler, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
73:2424). Estos estudios han dado por resultado la clonación de una proteı́na de transmembrana (denominada “LNGFR” , por receptor de NGF de baja afinidad), la cual se une a NGF con relativamente baja
afinidad (Chao et al., 1986, Science 232:518-521; Radeke et al., 1987, Nature 325:593-597). Además de
la LNGRF, aparentemente se requiere otra proteı́na (denominada “HNGFR” , por receptor de NGF de
elevada afinidad), la cual está implicada en la formación de un sitio de unión de elevada afinidad para el
NGF, para iniciar la transducción de la señal inducida por NGF (Zimmerman et al., 1987, J. Supramol.
Struc. 9:351-361; Sutter et al., 1979 en Transmembrane Signalling (N.Y. Alan Liss) pp. 659-667; Bernd
and Greene, 1984, J. Biol. Chem. 259:15509-15516; Hempstead et al., 1989, Science 243: 373-375). Esta
HNGFR es fosforilada en la tirosina en respuesta al NGF, y aparentemente contiene actividad intrı́nseca
de tirosina quinasa (Meakin and Shooter, 1991a, Neuron 6:153-163). Además, las ERK quinasas (también
conocidas como las quinasas MAP2), intermediarios tempranos en las cascadas de señales activadas por
tirosina quinasa, son rápidamente activadas y fosforiladas en la tirosina, en respuesta al NGF. Ası́, como
muchas otras respuestas a factores de crecimiento, la transducción de señal por NGF puede iniciarse por
la activación de una tirosina quinasa unida a receptor.
Estudios recientes han revelado que el producto del protooncogén trk, el cual se parece a un receptor
de factor de crecimiento (es decir, es una proteı́na de transmembrana que contiene un dominio de tirosina
quinasa intracitoplasmático), para el cual no se ha identificado ningún ligando, es rápidamente fosforilado
en respuesta al tratamiento con NGF en células PC12 (Kaplan et al., 1991, Nature 350:156-160; Klein
et al., 1991, Cell 65:189-197), y se une directamente a NGF con relativamente elevada afinidad cuando
se expresa en células heterólogas (Klein et al. supra). Este descubrimiento, junto con la restringida
distribución neuronal de la proteı́na trk in vivo, sugiere que trk puede ser el componente de la HNGFR
responsable de iniciar la transducción de señal por NGF.
En contraste con el amplio estudio de receptores y rutas de transducción de señal del NGF, los receptores y las rutas de transducción de señal utilizadas por los otros factores neurotróficos solo recientemente
han comenzado a ser exploradas. Sin embrago, la BDNF parece unirse a la LNGFR con una afinidad
similar a la del NGF (Rodrı́guez-Tebar et al., 1990, Neuron 4:487-492). Aunque los receptores para
BDNF tanto de baja afinidad, como de elevada afinidad, existen en neuronas que responden a BDNF,
los hallazgos de que BDNF y NGF actúan en diferentes neuronas y de que las neuronas que responden
a NGF no expresan receptores de BDNF de elevada afinidad, sugieren que BDNF utiliza un receptor de
elevada afinidad diferente del NGF (Rodrı́guez-Tebar and Barde, 1988, J. Neurosc. 8:3337-3342).
Una diversidad de hallazgos parecen unir a BDNF y NT-3, a la vez que distinguen a ambas neurotrofinas del NGF. La expresión de NT-3 y BDNF (pero no de NGF) manifiesta relaciones recı́procas
notorias durante el desarrollo, siendo expresado NT-3 más destacadamente temprano y BDNF más destacadamente tarde, durante el desarrollo de algunas de las mismas regiones del cerebro (Maisonpierre et
al., 1990, Neuron 5: 501-509). De forma interesante, los perfiles de distribución que por último alcanzan
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BDNF y NT-3 (pero no NGF) en varias regiones de cerebro de adulto, son bastante similares. Id. En los
ganglios periféricos, tanto BDNF como NT-3 (pero no NGF), tienen sus efectos principales en los ganglios
de la raı́z dorsal y ganglios nudosos, aunque NT-3 parece tener efectos menores en los ganglios simpáticos
(Maisonpierre et al., 1990a, Science 247:1446-1451). Por el contrario, el NGF afecta predominantemente
a los ganglios de la raı́z dorsal y ganglios simpáticos.
Estos hallazgos condujeron a la sugerencia de que BDNF y NT-3 pueden actuar en algunos casos
sobre las mismas poblaciones neuronales, y que un efecto temprano del NT-3 en estas neuronas pueden
ser sustituido por un efecto tardı́o del BDNF (Maisonpierre et al., 1990b, Neurons 5:501-509). Además, el
hallazgo de que BDNF y NT-3 (pero no NGF) son los factores de crecimiento más altamente conservados
hasta ahora descritos, condujeron a la suposición de que ambos factores podı́an estar interaccionando
con múltiples receptores y que se requerı́a su estricta conservación para mantener la especificidad de sus
interacciones con estos receptores múltiples.
Kelin et al. (1989, EMBO J. 8:3701-3709) describieron el aislamiento de trkB, que codifica un nuevo
miembro de la familia de receptores de tirosina (proteı́na) quinasa, que se encontró que estaba altamente
relacionado con el protooncogén trk humano. A nivel de aminoácidos, se encontró que los productos
de trk y trkB compartı́an un 57 por ciento de homologı́a en sus regiones extracelulares, incluyendo 9 de
las 11 cisteı́nas presentes en trk . Se encontró que esta homologı́a incrementaba a 88 por ciento dentro
de sus respectivos dominios catalı́ticos de tirosina quinasa. En ratones adultos, se encontró que trkB se
expresaba preferentemente en tejido de cerebro, aunque también se observaron niveles significativos de
RNA de trkB en pulmón, músculo y ovarios. Además, se detectaron transcriptos de trkB en embriones de
gestación mediana y tardı́a. Los análisis de hibridación in situ de embriones de ratón de 14 y 18 dı́as de
edad indicaron que los transcriptos de trkB se localizaban en los sistemas nerviosos central y periférico,
incluyendo cerebro, médula espinal, ganglios espinales y craneales, tronco paravertebral del sistema nerviosos simpático y diversas rutas de inervación, sugiriendo que el producto génico de trkB puede ser un
receptor implicado en la neurogénesis y el desarrollo neural precoz, ası́ como que puede jugar un papel
en el sistema nervioso de adultos.
En 1990, Klein et al., (Cell 61:647-656) describieron que el locus trkB de ratón codifica al menos
dos clases de moléculas de tipo receptor, las cuales denominaron gp145trkB y gp95trkB . Estas moléculas
parecen tener idénticos dominios extracelulares y de transmembrana, pero se encontró que solamente
gp145trkB contenı́a una larga región citoplasmática que incluı́a un dominio de proteı́na quinasa catalı́tico.
Se observaron transcriptos de trkB que codifican esta proteı́na en la corteza cerebral y la capa de células
piramidales del hipocampo, mientras que se encontró que los transcriptos que codifican gp95trkB en los
revestimientos ependimarios de los ventrı́culos cerebrales y en el plexo coroideo. Además, Middlemas et
al. (1991, Mol. Cell. Biol. 11:143-153) describieron la existencia de dos receptores distintos truncados en
el extremo C-terminal, los cuales comparten la región extracelular completa y el dominio de transmembrana con gp95trkB , pero los cuales difieren de gp95trkB (de aquı́ en adelante denominado simplemente
como trkB) en sus cortas colas citoplasmáticas.
La presente invención se refiere a un nuevo receptor de tirosina quinasa, denominado aquı́ en este
documento Rtk-2.
45
Por consiguiente, la presente invención proporciona una proteı́na purificada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos humana contenida en el plásmido
pBluescript SK que contiene Rtk-2, depositada en la American Type Culture Collection (ATCC) y a la
que se asignó el número de entrada 75052.
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La presente invención además proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de
nucleótidos la cual codifica la proteı́na de la invención.
La presente invención también tiene utilidades terapéuticas y de diagnóstico.
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Abreviaturas
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BDFN
BSA
CNTF
DSS
HNGFR
LNGFR
NGF
NT-3
Factor neurotrófico derivado de cerebro
Seroalbúmina bovina
Factor neurotrófico ciliar
Suberato de disuccinimidilo
Receptor de factor de crecimiento nervioso de elevada afinidad
Receptor de factor de crecimiento nervioso de baja afinidad
Factor de crecimiento nervioso
Neurotrofina-3
Utilizando un método para identificar moléculas receptoras, se clonó una molécula huérfana semejante
al receptor de tirosina quinasa, denominada aquı́ en este documento como Rtk-2, la cual es homóloga al
receptor de trk y a la familia de receptores de insulina.
El método comprendió (i) amplificar secuencias de ácido nucleico que codifican tirosina quinasa mediante la reacción en cadena de la polimerasa, utilizando una colección de moléculas de cDNA como
molde, y utilizar cebadores oligonucleotı́dicos que corresponden a regiones de moléculas de tirosina quinasa conocidas, estando asociadas dichas regiones con actividad de tirosina quinasa; y (ii) clonar el ácido
nucleico amplificado en un plásmido.
A continuación se secuenció mediante técnicas estándares el DNA amplificado y clonado por este
método. A continuación se compararon las secuencias resultantes con las secuencias de moléculas de
tirosina quinasa conocidas, con el fin de identificar clones de particular interés.
En consecuencia, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos humana contenida en el plásmido pBluescript SK que contiene Rtk-2, según se
depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), y asignó el número de entrada 75052. En una
realización de la presente invención, también se proporcionan partes del ácido nucleico que comprenden
al menos diez residuos de ácido nucleico.
La presente invención además proporciona una proteı́na purificada que comprende una secuencia de
aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos humana contenida en el plásmido pBluescript SK
que contiene Rtk2, según se depositó en la American Type Culture Collection, y asignó el número de
entrada 75052. En una realización de la presente invención, también se proporcionan partes de la proteı́na
que comprenden al menos seis moléculas de aminoácidos, o moléculas funcionalmente equivalentes.
Moléculas funcionalmente equivalentes incluyen aquellas en las cuales los residuos de aminoácidos
están sustituidos por residuos contenidos en la secuencia, dando por resultado un cambio silencioso.
Por ejemplo, se puede sustituir uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia, por otro
aminoácido de una polaridad similar, el cual actúa como un equivalente funcional, dando lugar a una
alteración silenciosa. Los sustitutos para un aminoácido contenido en la secuencia se pueden seleccionar
de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares
(hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina.
Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteı́na, tirosina, asparagina, y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina. Los
aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.
También están incluidas dentro del objetivo de la invención las proteı́nas, o fragmentos, o derivados
de los mismos, los cuales son modificados de forma diferencial durante, o después de, la traducción, p.e.,
mediante glicosilación, escisión proteolı́tica, enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular,
etc.
La presente invención también proporciona un vector recombinante que comprende el ácido nucleico
de la invención.
La presente invención además proporciona células y microorganismos que portan las moléculas de
ácido nucleico de la invención. En realizaciones particulares, la célula que lleva el ácido nucleico recombinante es un fibroblasto. En otras realizaciones, la célula es una bacteria.
La presente invención también proporciona un método para producir una proteı́na Rtk-2, que com4
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prende crecer una célula recombinante que contiene el vector de la invención, de forma que la proteı́na
Rtk-2 codificada por el vector es expresada por la célula, y recuperar la proteı́na Rtk-2 expresada. La
presente invención también proporciona el producto purificado del método.
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Se puede utilizar fragmentos de ácidos nucleicos amplificados, aislados utilizando el método de clonación según se describió antes, para identificar clones de cDNA de longitud total. En realizaciones
preferidas de la invención, se utiliza un fragmento de DNA amplificado de interés, para identificar un
tejido o lı́nea celular que expresa niveles relativamente abundantes de un correspondiente mRNA, por
ejemplo, utilizando análisis de transferencia Northern o hibridación puntual. A continuación se puede
utilizar dicho tejido o lı́nea celular para generar un banco de cDNA el cual puede servir como fuente
superior de cDNA de longitud completa, el cual comprende la secuencia y el fragmento amplificado.
Ejemplo
15
Clonación de moléculas huérfanas semejantes a receptor de TPK
Materiales y métodos
20
Se llevó a cabo la clonación mediada por PCR, utilizando cDNA de la lı́nea de células de neuroblastoma humano SY5Y como molde y los cebadores oligonucleotı́dicos que se muestran en la Tabla I, infra.
Resultados y discusión
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El objetivo de este trabajo fue identificar, mediante PCR, las secuencias de DNA estrechamente
relacionadas con los genes trk y trkB. Ası́, se diseñaron cebadores oligodesoxinucleotı́dicos, los cuales corresponden a regiones proteicas fuertemente conservadas en todas las proteı́nas quinasas, pero las cuales
al mismo tiempo predisponen fuertemente a la reacción de amplificación hacia las secuencias relacionadas
con trk. Por ejemplo, el cebador decámero-trk corresponde a la -PIRWMPPE-, en la cual trk y trkB son
idénticos, si bien incluso sus parientes conocidos más cercanos, receptores de insulina y de factores de
crecimiento semejantes a insulina, tienen dos sustituciones de aminoácidos.
Utilizando cDNA de la lı́nea de células de neuroblastoma humano SY5Y como molde, se realizaron
reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) con varias combinaciones de cebadores. Los productos
de DNA se digirieron con enzimas de restricción las cuales cortan secuencias trk y trkB, y el material
resistente se volvió a amplificar y se clonó. A continuación se secuenciaron los clones individuales. Las
secuencias de aminoácidos deducidas de estas secuencias de DNA revelaron la presencia de fragmentos
de cuatro nuevos receptores potenciales en el conjunto. Estos fragmentos se denominaron Rtk-2, Rtk-3,
Rtk-4 y Rtk-5.
Los siguientes cebadores oligodexosiribonucleotı́dicos se utilizaron en la preparación de los fragmentos mediante PCR (el sitio de restricción “cola” utilizado para clonación se muestra en cursiva, y la
degeneración en una posición concreta se indica mediante las letras en paréntesis):
TABLA I
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Rtk-2 y Rtk-3
TRK-9
TRK-decámero
ACGTCTCGA-GC(TCAG)-GG(TCAG)-ATG-GT(TCAG)-TA(TC)-(TC)T
CATGTCTAGA-GGC-ATC-CA(TCAG)-C(GT)(AGT)-AT(TCAG)-GG
50
Rtk-4
TRK-5
TRK-decámero
ACGTCTCGAG-AA(AG)-AT(TCA)-GG(TCAG)-GA(TC)-TT(TC)-GG
CATGTCTAGA-GGC-ATC-CA(TCAG)-C(GT)(AGT)-AT(TCAG)-GG
Rtk-5
55
TRK-9
TRK-hexámero
60
ACGTCTCGAG-GC(TCAG)-GG(TGAC)-ATG-GT(TCAG)-TA(TC)-(TC)T
CATGTCTAGA-CC-(GA)AA-(GA)TC-(CTGA)CC-(TGA)AT-(CT)TT
Las secuencias Rtk-2 y Rtk-3 fueron de particular interés. Cuando se utilizaron las secuencias deducidas de aminoácidos para buscar en las bases de datos GenBank, Release 67.0 (03/91) y EMBL
(Modificado) Release 26.0 (02/91) con TFASTA, las puntuaciones más elevadas se obtuvieron para se5
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cuencias trkB y trk. Rtk-2 y Rtk-3 contienen la secuencia YxxDYY, caracterı́stica para la subfamilia
trk/insulina-R. Ambas secuencias tienen una sustitución de L por F en el motivo DFG, el cual está fuertemente conservado en todas las quinasas.
5
Cuando las sondas Rtk-2 y Rtk-3 se hibridaron con transferencias Northern, no se obtuvo ninguna
señal con RNA de SY5Y. Rtk-2 hibridó con una banda de 6-7 kb en RNA de otras lı́neas, en particular
de células CHP100, SKES y LAN5. Rtk-3 hibridó con una banda de 5 kb en RNA de células SKN-SH y
LAN5. El rastreo de 1,5 x 106 clones del banco de cDNA SY5Y en lambda ZPA II con la sonda Rtk-2
dio 5 clones positivos, con insertos en el intervalo de 1,4 a 3 kb.
10
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Los datos de secuencia para Rtk-2 muestran nucleótidos que parecen codificar un dominio de transmembrana, nucleótidos que parecen contener un dominio de tirosina quinasa; y nucleótidos que codifican
un marco de lectura continuo abierto que comprende un dominio de unión a ligando. Un tramo de
180 aminoácidos sigue al dominio de tirosina quinasa, al contrario que los trk, los cuales terminan poco
después del dominio de tirosina quinasa.
La secuencia parcial de aminoácidos de Rtk-3, la cual también muestra la presencia de este tramo
más allá del dominio de tirosina quinasa, y muestra una fuerte homologı́a con Rtk-2.
20
La alineación de la secuencia Rtk-3 con las secuencias para Rtk-2, trk, IGFR y receptor de insulina
indica que Rtk-2 y rtk-3 comparten la mayor homologı́a, sugiriendo que son miembros de una nueva
subfamilia de receptores de tirosina quinasa.
Depósito de nmicroorganismos
25
Los siguientes microorganismos se han depositado en la American Type Culture Collection, 12301
Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852.
Número de entrada
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pBluescript SK que contiene Rtk-2
pBluescript SK que contiene Rtk-3
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REIVINDICACIONES
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1. Un método para producir una proteı́na Rtk-2 que comprende hacer crecer una célula recombinante
que contiene un vector, vector que contiene un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos
humana contenida en el plásmido pBluescript SK que contiene Rtk-2, según se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC) y a la que se asignó el número de entrada 75052, de forma que
la proteı́na Rtk-2 codificada por dicho vector es expresada por la célula, y recuperar la proteı́na Rtk-2
expresada.
10
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente purificar la proteı́na
Rtk-2 expresada recuperada.
3. El producto purificado del método de las reivindicaciones 1 ó 2.
15
20
4. Una proteı́na purificada que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia
de nucleótidos humana contenida en el plásmido pBluescript SK que contiene Rtk-2, según se depositó
en la American Type Culture Collection (ATCC) y a la que se asignó el número de entrada 75052.
5. Un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos humana contenida en el
plásmido pBluescript SK que contiene Rtk-2, según se depositó en la American Type Culture Collection
(ATCC) y a la que se asignó el número de entrada 75052.
6. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos, la cual codifica la proteı́na
de la reivindicación 4.
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7. Un vector recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5 ó 6.
8. Una célula hospedante recombinante que contiene el vector de la reivindicación 7.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
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