Modificación de la técnica crioscópica de Beckmann

Rev. de Med. E. C. Narnrra IV: 128, 1960
FACULTAD DE MEDICINA· ESTUDIO GENERAL DE NAVARRA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA
Modificación de la técnica crioscópica de Beckmann
con 6ncs clínicos
:J.
M.ª Macarulla y Blanca Mendía
RESUMEN
Se modifica la técnica de Beckmann de medida del descenso crioscópico
con objeto de aplicarla al análisis diario de la clínica. Por medio de un
pequeño sobreenfriamiento previo controlado y modificación del aislamiento
térmico durante la cristalización se consigue una notable reducción de la
cantidad de muestra empleada, del tiempo de operación y del error por
concentración de la muestra al separarse hielo. Se comprueba el método
mediante series de disoluciones de substancias puras y mezclas y se aplica
al estudio del plasma, suero y orina.
La medida del descenso crioscópico,
cuya importancia como método de investigación clínica es sobradamente conocida 5, no se ha utilizado plenamente en el
análisis diario de laboratorio por dificultades de orden técnico, principalmente
por la cantidad de tiempo y muestra necesarios para obtener resultados precisos.
Con el objeto de resolver estos y otros
inconvenientes hemos realizado un estudio experimental.
Aunque esta determinación ha sido sustituída por la medida de la densidad de la OTina
(imprecisa al crecer de distinto modo según
el tipo de soluto) o por el análisis de alguna
sustancia representativa, es indudable que para efectos osmóticos, únicamente interesa el
número total de partículas disueltas por Kg
de agua, valor que puede sólo presumirse de
la medida de esta densidad o de una concentración parcial 1, conociéndose en cambio con
exactitud mediante la determinación del descenso crioscópico.
La aplicación clínica del método clásico de
Beckmann 6, presenta varios inconvenientes
perfectamente subsanables: a) neces,idad de
una notable cantidad de muestra para bañar
el termómetro y agitador; b) empleo de cierto
tiempo en el enfriamiento lento de las muestras en la cámara de crioscopía; c) variación
del punto crioscópico en función del sobreenfriamiento y la cantidad de hielo, separado.
El apartado a) lo resolvemos empleando
tubos de ensayo uniformes de 145 mm de longitud y 13 mm de diámetro medio, de capacidad tal que 2 ml de muestra cubran holgadamente el bulbo del termómetro Beckmann;
éste mismo sustituye con ventaja al agitador
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de acero, homogeneizando mejor el líquido.
Este análisis, si bien emplea una cierta cantidad de líquido problema -2 mi- no lo consume, pudiéndose éste utilizar en los restantes
análisis clínicos. Si se usa una cantidad menor de 2 ml el resultado obtenido por este
método no es tan seguro.
El tiempo del análisis y la oscilación del
punto crioscópico -referidos en los apartados
b) y c)- los reducimos al mínimo, produciéndose un sobreenfriamiento previo de la muestra, pequeño y constante, en baño aparte, y
también del termómetro por separado, de tal
modo que, al pasar aquélla al vaso de crioscopía con doble cámara de aire e introducirle
el termómetro se oroduce una cristalización
inmediata. Reducier{do la difusión térmica al
129
mm1mo -por la doble cámara de aire y por
el pequeño gradiente de temperatura del baño
al tubo problema- se calcula teóricamente la
cantidad de hielo separada, que resulta ser menor del 2 por ciento de la muestra líquida,
cuando se alcanza el equilibrio. La ligera elevación térmica, producida por la agitación mecánica, viene a favorecer esta situación final.
MÉTODO
Material
Disponemos de algunos vasos Dewar
de distintas capacidades y fines (fig. 1):
Termómetro
Beckmann
Termómetro
- tºc.
Beckmann
-1.5ºC.
13mm
doble
cómoro de
fJire
mezcla
mezcla
friqorífica
o -2.Sºc.
friqoríficfJ
de ·10ºrJ ·16ºc.
Tubo VfJCÍo
soporte
de r¡omo
Papel de
filtro
VASO!
VASO 11
VASOlll
Fig. 1.-Las muestras de plasma u orina son enfriadas en el vaso I a una temperatura
algo inferior a su punto de congelación manteniéndose líquidas gracias al fenómeno de
la sobrefusión. En el vaso III el termómetro se enfría, después de cada lectura, a Ja temperatura de -1 a --2° C. Al pasar las muestras del vaso I al II e introducirles el termómetro frío, se produce la congelación i1nmediata con la estabilización de la temperatura en
el punto crioscópico. Las pérdidas de calor y la cantidad de hielo separado en la cristalización son mínimas
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J. M. MACARULLA Y BLANCA MENDIA
1) Vaso I.-De unos 1.000 mi de capacidad; se llena hasta la mitad de una
mezcla de hielo, agua líquida y algo de
sal equilibrándose para la temperatura
aproximada de 0.5 a 1o c por debajo
de los puntos a determinar. Para plasmas
y orinas corrientes es conveniente utilizar
un vaso I, con esta mezcla frigorífica estabilizada a unos -1.5º C. Para orinas
muy concentradas se prepara otro vaso I
con mayor proporción de sal, a temperatura de -3º C. En estos vasos se pone
un termómetro que aprecie l/2º c y un
máximo de 25-40 tubos de ensayo de los
citados, conteniendo 2 mi de agua bidestilada o de las diversas muestras a analizar, para que se sobreenfríen a la temperatura del baño.
2) Vaso II.-De unos 250 ml de capacidad; se llena hasta más de la mitad
de la misma mezcla de hielo, agua y sal,
equilibrándose para -2.5º C. El tapón
de caucho está atravesado por dos tubos
anchos concéntricos, separados por una
cámara de aire de unos 4 mm de espesor. Casi en el fondo del tubo interno
hay un disco de caucho perforado que
permite escurrir el agua al fondo de éste,
y en la boca otro disco con una perforación mayor que sirve de apoyo al tubo de
ensayo con la muestra a congelar, creando simultáneamente la segunda cámara
aislante de aire. Con estas dos cámaras
y la pequeña diferencia de temperaturas
decrece al mínimo la tendencia a enfriarse la muestra dentro del vaso II.
3) Vaso III.-De unos 125 ml de capacidad; se llena con una mezcla de hielo
y sal que se equilibra para la temperatura de -10 a -16º C. Un tapón de caucho
es atravesado justamente por un tubo seco con un cilindro de papel de filtro en
el fondo. En él se puede introducir el termómetro Beckmann hasta apoyarse en el
papel de filtro.
Técnica de la determinación
I)
2 ml de las muestras a analizar se
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colocan en los tubos de 13 mm de diámetro y se introducen en el vaso I, enfriándose sin congelar hasta la temperatura del mismo. El termómetro se prepara de la forma clásica para operar entre
+ l y -5º c aproximadamente y se deja
en el vaso III hasta que se enfríe a unos
2º c por debajo de cero.
2) Se pasa el primer tubo con agua
bidestilada, ya frío, al vaso II y cuando
el termómetro Beckmann presumimos está algo más bajo de Oº C se introduce
en su interior, con lo que se rompe el sobreenfriamiento y se produce la cristalización inmediata. La temperatura sube
primero rápida y luego lentamente. Por
último se estabiliza marcando un máximo.
La escala termométrica está graduada
en centésimas de grado pudiéndose distinguir las milésimas aproximadas. La
media de cuatro o más determinaciones
concordantes hechas con agua bidestilada a lo largo de la serie de análisis, nos
da el cero efectivo de la escala para aquel
día. Durante el proceso de cristalización
se debe agitar el líquido con el termómetro, primero activamente y, cerca del máximo, con suavidad, para no producir sobrecalentamientos locales. Anotada la
temperatura de este máximo se extrae el
termómetro con cristalitos de hielo adheridos. Se seca con papel de filtro y se pasa a III hasta la siguiente lectura.
3) Se quita el tubo de agua de II y
en su lugar se introduce una muestra problema de I. Al pasarle el termómetro
frío (-1 a -2º C) también congela inmediatamente; se agita y anota la temperatura del máximo. Después de alcanzado éste, la temperatura puede bajar
unos 0.005º c y seguir después bajando
muy lentamente por concentrarse el líquido a medida que se separa el hielo
casi puro. La figura 2 recoge la variación
de temperaturas de diversos líquidos de
análisis a partir del momento de la inmersión del termómetro en ellos.
Si se agita adecuadamente, el máximo
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CRIOSCOPIA CL!N!CA
suele presentarse durante los 30 primeros
segundos de la inmersión. Por tanto el
tiempo de una determinación completa,
líquido y se puede extraer el termómetro
para otras determinaciones. En este caso
se invierte un tiempo algo mayor en cada una (unos 3 minutos por lectura).
RESULTADOS
TIEMPOS
Fig. 2.-Variación de la temperatura en las
muestras a analizar durante el fenómeno de la
congelación de las mismas. El origen de abscisas corresponde al momento de inmersión
del termómetro (enfriado a -2° C) en la
muestra. El máximo se alcanza antes de los 30
segundos de agitación suave. La temperatura se
estabiliza un cierto tiempo y lentamente empieza a descender. Se pueden hacer más de 40
determinaciones en una hora
trabajando en serie, no llega a los 90 segundos -comprobando bien el punto de
congelación-, pudiéndose pues hacer
más de 40 lecturas seguidas en el plazo
de una hora.
El tubo seco del vaso III sublima algo
de escarcha del vapor atmosférico, asimismo el termómetro en su interior también capta microcristalitos de hielo que
garantizan la congelación instantánea del
líquido subenfriado al ser introducido
aquél en éste.
Si interesa utilizar posteriormente la
muestra de plasma con otros fines analíticos, el termómetro, lavado con agua
fría destilada y secado antes de ponerlo
en III, se introducirá en el problema pero no se deberá extraer de él para no separar hielo aumentando la concentración
de la mezcla remanente. Entonces se saca conjuntamente tubo y termómetro; se
calienta aquél con la mano hasta la fusión total del hielo, se agita un poco el
De acuerdo con la bibliografía3 consideramos Kc= 1,858º C / mol soluto / Kg
agua, y aplicamos la expresión
m=538L..Tc
que nos da la concentración total de solutos m en un líquido determinado expresada en miliosmoles/Kg de agua. Los valores que se obtienen por este método
son totalmente reproducibles y se ajustan bien a los teóricos, como veremos a
continuación.
En efecto, hemos determinado los descensos crioscópicos de una serie de disoluciones de urea, glucosa y cloruro sódico
purísimos cuyos resultados, consecuencia
de medidas cuadruplicadas plenamente
concordantes figuran respectivamente en
las Tablas I, Ir y III.
En ellas se observa que la osmolalidad
ideal medida por pesada y la real por
crioscopía son prácticamente idénticas en
la zona de las concentraciones fisiológicas y, aunque se advierte la influencia del
factor de actividad o coeficiente osmótico
a concentraciones elevadas, éste es despreciable para efectos clínicos en las mediciones corrientes.
Asimismo hemos determinado descensos crioscópicos en mezclas de electrolitos y solutos orgánicos observándose que
la osmolalidad total es una magnitud aditiva en disoluciones diluídas y decrece
sobre el valor ideal en las concentradas.
Para acabar de contrastar el método,
de un lote de muestras a distintas diluciones se tomó 2, 4 y 8 mi de cada una
de ellas en tubos de capacidad creciente
y se determinó su punto de congelación,
resultando una concordancia plenamente
satisfactoria dentro del error experimental, concordancia que se hizo extensiva
al punto de congelación que determina-
Vol. IV
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132
TABLA I
Determinación de las concentraciones osmolales de seis disoluciones de urea por medida
cuadruplicada del descenso crioscópico y por pesada de precisión.
Temperatura media de
congelación leída en la
escala del Termómetro
Bcckmann
Substancia
(2ml)
6.017
5.809
5.604
5.266
5.090
4.888
4.286
Agua
Urea C 1
e2
Ci
e4
es
e6
11 Te
Concentración real
deducida según
la fórmula
11 Te. 1000
Concentración ideal
por pesada
(müsm/Kg agua)
m
1.858
(müsm/Kg agua)
ü=1;*
o
o
o
0.208
0.413
0.751
0.927
1.129
1.731
111.9
222.3
404.2
498.9
607.6
931.6
109.2
215.0
406.8
496.6
613.7
935.1
es el número de partículas en que se rompe la molécula.
*
TABLA II
Determi,nación de las concentraciones osmolales de seis disoluciones de glucosa por medida cuadruplicada del descenso crioscópico y por pesada de precisión.
Temperatura media de
congelación leída en la
escala del Termómetro
Beckmann
---------
Substancia
(2ml)
Agua
Glucosa e1
e2
C3
e4
e,
e,
5.053
4.934
4.779
4.634
4.307
3.867
3.353
11 Te
Concentración real
deducida según:
11 Te. 1000
m
1.858
(müsm/Kg agua)
Concentración ideal
por pesada
(müsm/Kg agua)
(i=l)•
o
o
o
0.119
0.274
0.419
0.746
1.186
1.700
64.0
147.5
225.5
401.5
638.3
915.0
59.5
133.9
210.2
394.6
630.0
909.5
es el número de partículas en que se rompe la molécula.
*
TABLA HI
Determinación de las concentraciones osmolales de seis disoluciones de cloruro sódico por
medida cuadruplicada del descenso crioscópico y por pesada de precisión.
Temperatura media de
congelación leída en la
escala del Termómetro
Beckmann
Substancia
(2ml)
e2
e,
e4
es
Cn
*
Concentración ideal
por pesada
(müsm/Kg agua)
(i=2)*
-----
----~
Agua
Sal e1
11 Te
Concentración real
deducida según:
11 Te. 1000
m
1.858
(müsm/Kg agua)
6.029
5.927
5.856
5.790
5.579
5.277
4.433
o
o
o
0.102
0.173
0.239
0.450
0.752
1.596
54.9
93.1
128.6
242.2
404.7
859.0
47.9
88.8
118.8
240.3
429.9
936.5
es el número de partículas en que se rompe la molécula.
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CRIOSCOPIA CLINICA
mos en las mismas por el método de
Beckmann clásico.
Con nuestra técnica el plasma normal
suele dar un 6. Te de 0.56 a 0.58º C 4 que
corresponde a la concentración de 301 a
312 müsm/Kg agua; la orina presenta
una oscilación mucho mayor siendo su
valor medio aproximado de 1.2º C. Hemos hecho la comprobación en ellos, determinando cationes (Na, K, Ca, Mg,
NH,), aniones (CI, C03H, fosfatos, proteinatos), urea, creatinina, aminoácidos,
glucosa, etc.; y la adición de las concentraciones osmolares de todas estas sustancias da aproximadamente la concentración total deducida mediante el descenso crioscópico 2 •
Procediendo con rigor científico deberíamos pasar las concentraciones molares
de cada partícula a molales pero esta
modificación puede omitirse por la compensación que supone el despreciar el
coeficiente osmótico g 3 que en los electrolitos no llega a la unidad.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
La determinación del punto de conge-
133
lación de un líquido biológico da la cifra
de su concentración osmolal, con mayor
precisión y garantía que la medida de su
densidad. La única dificultad de la técnica crioscópica reside en la adquisición
de un buen termómetro tipo Beckmann;
por lo demás este análisis puede competir
con la densimetría, pues reúne, en cuanto
a tiempo y cantidad de muestra, las ventajas del densímetro y del picnómetro, no
arrastrando sus inconvenientes respectivos.
El pequeño sobreenfriamiento previo
controlado, permite hacer el análisis totalmente reproducible y con error mínimo -como demuestran las tablas I, II y
III- al no irradiarse calor durante la experiencia (el baño II actúa más como aislante que como congelante) y no separarse una cantidad notable de hielo que
cambiaría la concentración final.
La concentración total medida en Osmoles /Kg agua permite controlar indirectamente otras determinaciones ya que
la suma de cationes, más aniones, más
substancias no iónicas debe dar precisamente esta osmolalidad. Una diferencia
notable denota un error de análisis u omisión de alguna substancia importante 7• 8 •
SUMMARY
lmprovements of Beckmann's Chryoscopic Descent MetLod
for CHnical Purposes
The method of Beckmann's Chryoscopic
Descent is adonted with sorne modifications
in mder to obtain the greatest accuracy in the
results, using the mínimum time and amount
of sample.
Three Dewar Vessels are employed (Fig. 1).
In I a refrigerant mixture, composed of ice,
water and salt, is used. The temperature obtained is about -1.5° e (aproximately 0.5 1o e below the freezing point of liquids to be
analized). 2 mi of sarnple are dropped into a
standard test-tube with an average diameter of
13 mm and it is cooled in Vessel I to the
temperature of the refrigerant mixture.
A similar mixture is placed in Vessel II and
it is brought to -2.5° C. There are two concentric tubes in it forrning a double air pocket
in order to avoid a heat irradiation.
In III a mixture of ice and salt is placed
which gives --10 or -16° C and a dry testtube (with sorne filter paper in the bottom)
in order to cool the Beckmann's Therrnometer.
For the reading of freezing point of samples, the cold test-tubes are changed from I
to H. The Thermorneter is put in, and the
sample is well shaken until the ternperature
goes up to a rnaxirnurn where it remains for
a certain length of time (Fig. 2). The Ther.morneter dried with filter paper is introduced
in III for the next reading ..
134
J. l\L MACARULLA Y BLANCA MEND!A
Analysis time in urine is less than 90 seconds far each sample; consequently in an
hour more than 40 analysis can be done.
When plasma is needed in further analysis
it should be melted by hand heat befare
taking out the Thermometer from it in order
to avoid changes in its concentration. In this
case the required time is a little more (about
3 minutes).
Many concentrations of pure substances have
Vol. IV
been determinated using this method, resulting
values being in satisfactory concordance with
the theoretical ones (by weighting) in the zone
of physiological concentration (Table I, II,
and III).
Equation m=538 .6. Te is applied, m being
the concentration expressed in miliosrnols/Kg
wate'f.
Mean values of .6. Te for plasma are 0.56 0.58° C. corresponding to 301 - 312 mOsm/l.
BIBLIOGRAFÍA
l.
2.
DARROW, D. c. y F. L. PRATT. J. A. M. A.
143: 365, 1950 y 143: 432, 1950.
CAMELE, J. L. Chemical Anatomy, Physio·
6.
logy and Pathohlogy of Extracellular Fluid.
3.
4.
5.
Cambridge, 1953.
GEIGY, R. J. Tablas Científicas, 1958.
GRAM, H. C. Am. !. Med. Sci. 168: 511,
1924.
HAMBURGER, J., G. RICHERT y J. CROSNIER,
7.
8.
Techniques de Reanimation Médicale et Controle de !'Equilibre Humoral. París, 1954.
HENNING, N. Ií.linische Laboratoriumsdiagnostik. München, 1959.
JEANNERET, P., H. RosEMUND y A. F.
ESSELLIER. Helv. Med. Acta. 21: 291, 1954.
RAPOPORT, S., W. BRODSKY y C. D. WEST.
Am. J. Phys. 157: 357, 1949.