Trazabilidad en las Mediciones Microbiológicas

Workshop sobre el rol de las mediciones microbiológicas
trazables y confiables para asegurar la calidad y seguridad
de los alimentos.
Disertante: Dr. Celia Puglisi
Departamento de Metrología Cientíca e Industrial
La reunión se abrió con una presentación del
Dr. Robert Kaarls quien dio la bienvenida y
expuso sobre el rol y las actividades del
CCQM.
La competitividad e innovación sostenida, el crecimiento la
distribución global de las industrias y los servicios, requiere
incrementar la exactitud y comparabilidad de las mediciones.
El movimiento de las personas alrededor del
mundo, los productos alimenticios que se
trasladan en las diversas regiones, la
diseminación global de enfermedades, los
cambios climáticos y ambientales, requieren
nuevas áreas en la metrología tales como,
química, biotecnología, microbiología, materiales
de avanzada, nanotecnología e información
tecnológica
La calidad de vida exige un crecimiento de las demandas metrológicas
•Seguridad de los alimentos y contenido nutricional
•Cuidado de la salud y protección.
•Ambiente, control de la contaminación y cambio climático.
•Seguridad y mediciones forénsicas.
•Antidoping.
•Metrología “sensorial” (olor, color, gusto, forma, etc.)
“Una vez medido, aceptado en todos lados”
Requiere comparabilidad a través de la trazabilidad
Trazabilidad Metrológica
Propiedad del resultado de una medición, por el cual este resultado
puede ser relacionado a una referencia a través de una cadena
ininterrumpida de calibraciones, cada una de las cuales contribuye a
la incertidumbre de medición.
JCGM 200:2008 (VIM3)
Esquema para establecer la comparabilidad internacional
El VIM aclara luego que la “referencia” puede ser
la definición de una unidad de medida a traves de
su realización práctica, un procedimiento de
medición incluyendo la unidad de medida, o un
material de referencia
A continuación el Dr. Betts de la
empresa Campden (Food and
Drink Innovation) describió los
problemas involucrados en las
determinaciones microbiológicas.
• Algunos microorganismos pueden deteriorar la comida
cuando crecen: color, defectos visuales, olor.
• Algunos organismos implican un riesgo para la salud
humana, simplemente por estar presentes o por crecer a un
numero importante.
•Deterioro de los alimentos: Se estima que un 20 a
30% del total de la producción de alimentos en el
mundo se pierde debido al deterioro
microbiológico.
Gran parte de esto se debe a problemas con la materia
prima para los alimentos. La tendencia a producir
alimentos más “frescos” con menor contenido de sal,
azúcar y preservantes, hace que los alimentos estén
más propensos al ataque microbiológico. Se debe
pagar un gran precio social y económico por el
deterioro biológico de la comida.
Las estimaciones de los casos de envenenamiento por alimentos
de la European Food Safety Authority se resumen en la siguiente
tabla:
Microorganismo
Europa 2009
USA 2011
Salmonella
108614
1027561
Campylobacter
198252
854024
Listeria
1645
255 muertos
VTEC E.coli
3573
2100 hospitalizados
Yersinia
7595
Los futuros cambios que impactan en la contaminación de la comida
están dados por la tendencia a usar menor cantidad de preservantes,
reducir el procesamiento proveyendo comida más fresca y la
distribución del suministro de alimentos en forma globalizada.
Que se requiere para el control:
• Poder evaluar en forma reproducible los indicadores de higiene, de
microorganismos que deterioran los alimentos y los patógenos.
• Detectar patógenos en dosis bajas de infección.
• Métodos para organismos emergentes, para determinación de
patógenos, toxinas, etc. Para todos los tipos de alimentos.
Para producir alimentos en forma saludable se utiliza el sistema de
HACCP, pero los ensayos sirven para verificar que el diseño del
control implementado esta funcionando correctamente.
Que se necesita
Un método debe considerar los siguientes aspectos:
•Muestreo
•enriquecimiento (crecimiento)
• enumeración de los microorganismos, detección,
aislación, confirmación de la identidad y
caracterización.
Importancia del Muestreo
Es difícil hacer un muestreo representativo de un
alimento dado que la población microbiológica se
distribuye en forma no homogénea, de modo que
puede tomarse una porción del alimento en la que
no se encuentran los microorganismos.
Otro problema es la lentitud de los ensayos
microbiológicos debido a que en algunos casos se
necesita un resultado rápido.
Los métodos de referencia se basan en el crecimiento de
microorganismos y este crecimiento lleva tiempo.
Existen métodos rápidos pero no dan resultados
equivalentes al del conteo en placa (impedancia,
conductancia, turbidez y conteo de células).
Detección rápida
Los métodos de referencia requieren varios días para el crecimiento,
los nuevos métodos disponibles son los de Inmunoensayo y métodos
basados en ensayos de DNA (Ej: PCR)
Por PCR se puede detectar, teóricamente, una copia simple de DNA en
menos de 4 horas.
En muchos ensayos de patógenos se trata de detectar la presencia de
un microorganismo en 25 gramos, mientras que muchos ensayos de
PCR requieren un volumen de reacción menos que 10 microL, por lo
cual es difícil asegurar que el microorganismo se encuentra presente en
ese volumen.
Se cuestiona que los nuevos métodos generen resultados
equivalentes.
Por otro lado cabe cuestionarse que es necesario buscar, si el
organismo o su toxina.
Los hongos y levaduras crecen más lentamente que las bacterias por
lo cual los métodos basados en el crecimiento requieren más tiempo.
Si hay microorganismos que son muy potentes como para deteriorar el
alimento, una detección rápida previene mejor, pero hay muy pocos
métodos rápidos.
Los virus son patógenos muy importantes, pero son parásitos
intracelulares. Y los métodos de determinación son pobres.
Entre otros problemas que deben enfrentarse, se pueden mencionar,
que el alimento tiene una estructura química, casi idéntica a la del
microorganismo.
Que los microorganismos son todos diferentes, tienen un
crecimiento diferente, pueden estar dañados o pueden estar vivos pero
no reproducirse (estado de latencia). Para saber si un método funciona,
se requeriría un material de referencia, pero no están disponibles.
Otro problema es la incertidumbre de medición en microbiología.
Los usuarios nunca lo consideran y este problema es importante en el
caso de la Legislación.
Se cuestiona si existen los métodos necesarios para encontrar
patógenos, para encontrar organismos que deterioran el alimento, para
establecer el estado de higiene, para establecer la fecha de
vencimiento, y establecer si puede producir enfermedades o deterioro.
Incertidumbre de medición y cumplimiento de las
especificaciones
Límite de
control
superior
Resultado e
incertidumbre
fuera del límite
Resultado fuera del
límite
Incertidumbre
dentro
www.ILAC.org Guia G8:1996
Resultado dentro
del límite pero
incertidumbre
fuera
Resultado e
incertidumbre
dentro del límite
La Dra. Marie-Pierre Copin. de la empresa 3M. Francia, hizo una
presentación de los kits para ensayos rápidos que involucran sólo
3 pasos:
•inoculación
•incubación
• interpretación.
Aclaró que debe mostrarse evidencia que el método rápido se comporta
de manera equivalente al de referencia, pero con la ventaja práctica de
su rapidez y fácil utilización.
Los métodos tienen que estar validados y aceptados por las
regulaciones y las directivas.
Los métodos alternativos deben compararse con los métodos de
referencia siguiendo los protocolos internacionalmente aceptados. Debe
establecerse si se sigue la norma ISO 16140 para la validación de su
comportamiento u otro protocolo internacionalmente aceptado.
Referencia: Regulación de la Comunidad Europea Nro 2073/2005, art.5
Existen varias organizaciones que garantizan la validación de los
métodos rápidos, como por ejemplo Microval, Afnor, la AOAC
internacional entre otras. Pero se necesita armonización global,
métodos de referencia y protocolos de validación armonizados.
Miembros de la Federación
Internacional de Lecherías hicieron
una presentación sobre las necesidades
del sector con énfasis en el conteo de
células somáticas.
Se mencionó la estadística del
incremento de la producción mundial
de lacteos y de la magnitud de las
exportaciones.
Cuando las mercaderías se transportan
los resultados analíticos deben ser
comparables y equivalentes en todo el
mundo y a lo largo del tiempo y deben
establecerse las equivalencias de los
diferentes métodos de medición.
Se mencionaron los métodos para hacer el conteo de células
somáticas en leche y se destacó que los materiales de referencia
tienen problema con la homogeneidad durante el almacenamiento y su
fecha de vencimiento.
Se mostró un esquema del sistema de referencia para el conteo de
las células somáticas.
Jean McClure de la firma Unilever hablo sobre la
necesidad de mediciones microbiológicas confiables
para el control del procesamiento de alimentos
(HACCP).
Paul Cook de la Empresa Head Microb.
Food SafetyBranch, UK, presentó la
problemática de los alimentos para
animales
Destacó la importancia de controlar los
alimentos ya que posibles
contaminaciones pueden pasar luego a la
carne y por lo tanto generar un peligro
para el consumidor.
Nuevamente se habló sobre la
importancia del muestreo sobre todo
para muestras con baja contaminación.
Thomas Hammack de la Food and Drug Administration de EEUU
expuso sobre las regulaciones existentes en Estados Unidos y
mencionó las áreas que regula la asociación.
Dió información de las estadísticas sobre intoxicaciones en Estados
Unidos por contaminación de distintos alimentos.
Nuevamente mencionó que los métodos que se exigen para
aceptación o rechazo en EEUU son los de cultivo, que requieren
mucho tiempo y mencionó las ventajas y desventajas de los métodos
moleculares.
.
Los métodos de referencia tampoco están
armonizados en EEUU hay métodos de la Food
and Drug Administration, de la USDA, de la EPA
y los internacionales de la ISO.
Mencionó también las guías de validación.
Destacó la necesidad de armonización para
facilitar el comercio internacional y la mayor
confianza en los resultados.
Arlene Fox de la AOAC hizo una presentación sobre la
organización (AOAC) y el desarrollo de normas y
metodologías de validación.
Mencionó las tareas de armonización que ellos realizan y
destacó la cantidad de métodos de referencia que
existen para alimentos.
Para la validación de métodos mencionó que se
requiere cultivos internacionalmente reconocidos,
como por ejemplo ATCC u otra fuente “trazable”
equivalente.
No explicó el significado de la palabra trazable, aunque
se sobreentiende que esta trazabilidad está relacionada
a un reconocimiento comercial.
R Smith del LGC, UK, hizo una presentación de los
ensayos Interlaboratorio que ellos realizan.
Describió como preparan las muestras, como evalúan la
estabilidad y la homogeneidad, y como evalúan los
resultados.
J. Anthony de ATCC hizo un resumen de lo discutido
anteriormente, mencionando que alguno de los
objetivos a tener en cuenta son los siguientes:
• Mejorar la calidad y credibilidad de las mediciones
microbiológicas.
• Entender cómo puede ayudar la metrología para lograr
este fin.
• Lograr cooperación entre la metrología y los expertos
microbiólogos.
• Definir las necesidades de trazabilidad en mediciones
microbiológicas.
Agregó que basandose en las discusiones mantenidas
en este Workshop es imposible cuestionar que es
necesario afrontar los aspectos metrológicos, teniendo
en cuenta que del 20 al 30% de la producción de
alimentos se destruye por deterioro microbiológico.
Hay un esfuerzo y recursos considerables dedicados a
este tema, tal como fueron presentados aquí y se está
gastando considerable cantidad de dinero en esta área.
• Existe un gran deseo de lograr el desarrollo de un enfoque más
globalizado para la estandarización de métodos microbiológicos.
• En este momento se puede decir que hay 2 desafíos claves para los
microbiólogos, uno es la enumeración (cuanto hay) y el otro es la
identificación. La complejidad de este tema se debe a que estamos
trabajando con un sistema vivo y por lo tanto inherentemente variable,
por lo cual hay un apreciable desafío metrológico.
• Hay una importante actividad en la industria, tendiente a encontrar
nuevas maneras de medir los 2 parámetros antes mencionados. Pero
compararlos con los métodos tradicionales genera grandes desafíos.
• Hay diferentes opiniones respecto de lo que representa un método
estándar para la comparación, ejemplo: las células somáticas pueden
considerarse como microbiología? Y como podemos generar materiales
de referencia para estas mediciones? Qué organismos estamos tratando
de detectar: esporas?, virus?, toxinas?, patógenos específicos?
• Cómo explicar los diferentes parámetros que cada ensayo mide?,
ejemplo: unidades formadoras de colonias versus número real de
células. En este caso se usan logaritmos pero 11=99 y en cambio 101
no lo esH lo cual complica la evaluación de la incertidumbre.
• Las experiencias en ensayos de aptitud muestran las discrepancias en
respuestas de distintos laboratorios.
Al final del Workshop, se les pidió a los laboratorios
nacionales de 6 países entre ellos, Australia, China, EEUU,
Corea, Argentina e Inglaterra que hagan una presentación
muy corta de la problemática en ese país.
En la discusión final se concluyó que el problema es tan
serio que para enfrentarlo el CCQM generará un grupo
de trabajo específico.
MUCHAS GRACIAS !!!